JPS6131093A - Preparation of l-leucine - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To prepare a remarkable amount of L-leucin, by using a microorganism having an ability to convert 2-ketoisocaproic acid into the L-leucine in the presence of fumaric acid and ammonium ions or urea in preparing the L- leucine from the 2-ketoisocaproic acid. CONSTITUTION:A microorganism, belonging to the genus Escherichia, Citrobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Brevibacterium or Bacillus, etc., and having the ability to convert 2-ketoisocaproic acid into L- leucine in the presence of (1) fumaric acid and (2) ammonium ions or urea is used. The above-mentioned microorganism is cultivated in the presence of the 2- ketoisocaproic acid, (1) and (2) or the resultant microbial cells obtained by cultiation or treated microbial cells are reacted in a solution containing the 2-ketoisocaproic acid, (1) and (2) to produce the L-leucine in the aqueous solution, and the resultant L-leucine is collected.

Description

【発明の詳細な説明】 亙１ユ±泗」遣！ 本発明は微生物を用いるＬ−ロイシンの製造法に関する
。[Detailed description of the invention] 亙 1 ゆ 泗” sent! The present invention relates to a method for producing L-leucine using microorganisms.

従来の技術 ２−ケトイソカプロン酸を原料としてＬ−ロイシンを製
造する方法としては、２−ケトイソカプロン酸、ギ酸お
よびアンモラムイオンを基質とする酵素的製造法が知ら
れている（バイオテクノロジー　アンド　バイオエンジ
ニアリング、２３巻。BACKGROUND ART As a method for producing L-leucine using 2-ketoisocaproic acid as a raw material, an enzymatic production method using 2-ketoisocaproic acid, formic acid, and ammolum ion as substrates is known (Biotechnology and Bioengineering, Volume 23.

２７８９頁、１９８１年）。2789, 1981).

発明が解決しようとする問題点 従来の方法においては、Ｌ−ロイシンの収量はまだ満足
すべきものではない。常に優れたし一ロインンの製造法
が求められている。Problems to be Solved by the Invention In the conventional methods, the yield of L-leucine is still not satisfactory. There is always a need for better methods of making loins.

問題点を　決するための　段 本発明によると、フマール酸及びアンモニウムイオン又
は尿素の存在下、２−ケトイソカプロン酸をＬ−ロイシ
ンに変換する能力を有する微生物を用いることにより著
量のＬ−ロイシンを得ることができる。According to the present invention, a significant amount of L-leucine is obtained by using a microorganism capable of converting 2-ketoisocaproic acid into L-leucine in the presence of fumaric acid and ammonium ions or urea. be able to.

本発明に用いられる微生物としては、フマール酸及びア
ンモニウムイオン又は尿素の存在下に、２−ケトイソカ
プロン酸をＬ−ロイシンに変換できる能力を有するエシ
ェヒア属、シトロバクター属、アエロモナス属、アグロ
バタテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバクタ−
属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、コリネバクテ
リウム属、エルビニア属１エンテロバクタ−属、フラボ
バクテリウム属、クルイベラ属、ミクロコツカス属、パ
ラコッカス属、シュードモナス属、サルモネラ属又はセ
ラチア属に属する微生物であれば、野性株、変異株、細
胞融合法あるいは遺伝子操作法その他の遺伝的手法で誘
導される組換え株のいずれもがあげられる。The microorganisms used in the present invention include the genus Eschechia, Citrobacter, Aeromonas, and Agrobatatherium, which have the ability to convert 2-ketoisocaproic acid to L-leucine in the presence of fumaric acid and ammonium ions or urea. , Alcaligenes spp., Arthrobacter
Microorganisms belonging to the genus Brevibacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Enterobacter, Flavobacterium, Kluybella, Micrococcus, Paracoccus, Pseudomonas, Salmonella or Serratia; Examples include wild strains, mutant strains, and recombinant strains induced by cell fusion, genetic manipulation, or other genetic techniques.

具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）＾ＴＣＣ９６３７，ントロバクター・フ
ロインディー　（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎ
ｄｉｉ）ＡＴＣＣ６７５０，アエロモナス、　ハイドロ
フィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）
＾Ｔ［Ｃ１３１３７，アグロバクテリウム・ツメファシ
ェンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ　）　ＡＴＣＣ４４５２，アルカリゲネス・フ
ァエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ
）＾ＴＣＣ８７５０，アルスロバクタ−・グロビホルミ
ス（八ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉ
ｓ）＾ＴＣＣ８０１０゜ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Ｂｒｅｖｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏ
ｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１，バチルス・メガ
ｆ　’Ｊ　’７　ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅ
ｒｉｕｍ　）　ＡＴＣＣ１０７７８゜コリネバクテリウ
ム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃＬｅｒｉｕｍ
　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）＾ＴＣＣ１３０３２，エルビ
ニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　　ｈｅｒｂ＋ｃｏ
ｌａ）ＡＴＣＣ２＋４３４゜エンテロバクタ−・クロア
カニ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ　）＾
Ｔ［：［：１３０４７　、　　フラボバクテリウム、エ
ステロアＤ？チウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
　ｅｓｔｅｒｏａｒｏ−ｍａｔｉｃｕｍ　）＾ＴＣＣ８
０９１，クルイベラ・クリオクレセセンス（Ｋｌｕｙｖ
ｅｒａ　ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ　）　ＡＴＣＣ１４
２３７，ミクロコツカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）＾ＴＣＣ４６９８，パラコッカ
ス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅ
ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ１９３６７、ンユー
ドモナス・アルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）＾’ｒ［：Ｃ１０１４５、サルモネ
ラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）　ＡＴＣＣ１９５８５、セラチア°マ
ルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
　）　ＡＴＣＣ１３８８０等があげられる。Specifically, Escherichia coli
iacoli)^TCC9637, Citrobacter freun
dii) ATCC6750, Aeromonas hydrophila
^T[C13137, Agrobacterium tumefaciens (^grobacterium tumefac
iens) ATCC4452, Alcaligenes faecalis
)^TCC8750, Arthrobacter globiformis
s)＾TCC8010゜Brevi-bacterium ammo
niagenes) ATCC6871, Bacillus megaf'J'7
Corynebacterium glutamicum) ATCC10778゜Corynebacterium glutamicum
glutamicum) ^TCC13032, Erwinia herb+co
la) ATCC2+434゜Enterobacter cloacae ＾
T[:[:13047, Flavobacterium, Esteroa D? Flavobacterium
esteroaro-maticum )^TCC8
091, Kluyvella cryochrescens
era cryocrescens) ATCC14
237, Micrococcus luteus
cus 1uteus)^TCC4698, Paracoccus denitrificans (Paracoccus de
nitrificans) ATCC19367, Pseudomonas ae
ruginosa)^'r[:C10145, Salmonella typhimurium (Salmonella typh
imurium) ATCC19585, Serratia marcescens
) ATCC13880 etc.

これらの微生物が、フマール酸とアンモニウムイオン又
は尿素の存在下で２−ケトイソカプロン酸を効率よくＬ
−ロインンに変換することの理由の詳細は明らかではな
いが、これらの微生物が、フマール酸とアンモニウムイ
オン又は尿素からアミン基共与体を生成する能力および
生成したアミン基供与体と２−ケトイソカプロン酸とか
らＬ−ロイシンを生成する能力にすぐれていること、さ
らに基質を細胞内へ取込む能力や生成したＬ−ロイシン
を細胞外へ排出する能力にすぐれていること、さらにＬ
−ロイシンを代謝分解する性質が弱いこと等が理由とし
て考えられる。These microorganisms efficiently synthesize 2-ketoisocaproic acid in the presence of fumaric acid and ammonium ions or urea.
- Although the details of the reason for the conversion to loin are not clear, the ability of these microorganisms to generate an amine group donor from fumaric acid and ammonium ions or urea, and the ability of these microorganisms to generate an amine group donor and 2-ketoisocaproic acid. It has an excellent ability to produce L-leucine from
- Possible reasons include weak ability to metabolize leucine.

これらの微生物を培養する培地としては、炭素源、窒素
源、無機物その他の栄養物を含むものであれば天然培地
１人工培地のいずれでもよい。The medium for culturing these microorganisms may be either a natural medium or an artificial medium as long as it contains a carbon source, nitrogen source, inorganic matter, and other nutrients.

炭素源としては、グルコース、フラクトース。Carbon sources include glucose and fructose.

ソルビトール、グリセロール、しょ糖、でんぷん。Sorbitol, glycerol, sucrose, starch.

でんぷん加水分解物、糖蜜、果汁などの炭水化物。Carbohydrates such as starch hydrolysates, molasses, and fruit juices.

ギ酸、酢酸、フマール酸、乳酸１グルコン酸、コハク酸
等の有機酸、エタノール、メタノール等のアルコール類
等が使用される。Organic acids such as formic acid, acetic acid, fumaric acid, lactic acid, gluconic acid, and succinic acid, and alcohols such as ethanol and methanol are used.

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩類、尿素、アミ
ン類、その他の含窒素化合物、ベフトン、肉エキス、酵
母エキス、コーン・スチーブ・リカー、カセイン加水分
解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化
物などが用いられる。Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium formate,
Ammonium salts such as ammonium phosphate, urea, amines, other nitrogen-containing compounds, Beftone, meat extract, yeast extract, corn stave liquor, casein hydrolyzate, soybean meal hydrolyzate, various fermentation bacteria and their Digested products are used.

無機物としては、リン酸第１カリウム１　リン酸第２カ
リウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネンウム、塩化
ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウ
ムなどが使用される。As the inorganic substance, potassium phosphate, dibasic potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. are used.

勿論本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養
素を必要とする場合には、その栄養素を適晴培地中に存
在させなければならないが、これらの物質は窒素源とし
て例示した天然物に含まれて添加される場合には別に加
える必要はない。Of course, if the microorganisms used in the present invention require specific nutrients for growth, those nutrients must be present in the suitable medium, but these substances can be added to the natural products listed as nitrogen sources. If it is included and added, there is no need to add it separately.

２ケトイソカプロン酸、フマール酸及びアンモニウムイ
オン又は尿素は前記培地に最初から加えられてもよいし
、又微生物の培養途中でくわえられてもよい。2-ketoisocaproic acid, fumaric acid, and ammonium ion or urea may be added to the medium from the beginning, or may be added during the cultivation of the microorganism.

２−ケトイソカプロン酸及びフマール酸はアンモニウム
塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルンウム塩等の各種
の塩として使用される。2-ketoisocaproic acid and fumaric acid are used in the form of various salts such as ammonium salt, sodium salt, potassium salt, and carunium salt.

アンモニウムイオンは、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸
アンモニウム、ギ酸アンモニウム。Ammonium ions include ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium acetate, and ammonium formate.

フマール酸アンモニウム、リンゴ酸アンモニウム等の塩
類として、あるいはアンモニア水あるいはアンモニアガ
スとして供給される。It is supplied as salts such as ammonium fumarate and ammonium malate, or as ammonia water or ammonia gas.

培養条件としては２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０
℃の温度で振盪・通気攪拌等の好気的条件下で、ｐＨ３
〜１０．好ましくは６〜９の範囲で１〜３日間培養する
。かくして、培養液中にＬ　ロイシンが生成する。Culture conditions are 20-60°C, preferably 30-40°C.
Under aerobic conditions such as shaking and aeration stirring at a temperature of ℃, pH 3.
~10. Preferably, the culture is carried out for 1 to 3 days in the range of 6 to 9. Thus, L leucine is produced in the culture medium.

次に、前記微生物の菌体を得る場合の培地組成及び培養
条件としては、前記組成の培地及び培養条件が用いられ
る。Next, as the medium composition and culture conditions when obtaining the cells of the microorganism, the medium composition and culture conditions described above are used.

かくして、得られる微生物菌体はそのまま反応に使用で
きるし、さらに該菌体を極々処理して（尋られる処理物
を反応に用いても良い。The microbial cells thus obtained can be used as they are for the reaction, or they can be further treated (and the treated product can be used for the reaction).

微生物菌体としては、菌体そのもの又は菌体を含む培養
液が用いられる。As the microbial cells, the microbial cells themselves or a culture solution containing the microbial cells are used.

菌体処理物としては、菌体の機械的摩砕処理物。The bacterial cell treatment product is a mechanically ground bacterial cell product.

超音波処理物、凍結乾燥処理物、溶媒処理物、酵素処理
物、乾燥処理物、界面活性剤処理物、菌体の蛋白質分画
、菌体及び菌体処理物の固定化物等が用いられる。Ultrasonicated products, freeze-dried products, solvent-treated products, enzyme-treated products, dry-treated products, surfactant-treated products, protein fractions of bacterial cells, immobilized products of bacterial cells and treated bacterial cells, etc. are used.

反応は水性液中、前記で得られる菌体もしくはその処理
物を■２−ケトイソカプロン酸　■フマール酸及び■ア
ンモニウムイオン又は尿素に作用することによって行わ
れる。The reaction is carried out in an aqueous solution by reacting the above-obtained bacterial cells or their treated products with 1) 2-ketoisocaproic acid, 2) fumaric acid, and 2) ammonium ions or urea.

反応に使用する２−ケトイソカプロン酸、フマール酸及
びアンモニウムイオンとしては前記と同じものが用いら
れる。The same 2-ketoisocaproic acid, fumaric acid, and ammonium ion used in the reaction as described above are used.

作用条件としては、温度１０〜７０℃、好ましくは２０
〜５０℃、ｐＨ５〜ｌＯ１好ましくは６〜９で行なう。The operating conditions include a temperature of 10 to 70°C, preferably 20°C.
The reaction is carried out at a temperature of ~50°C and a pH of 5 to 1O1, preferably 6 to 9.

かくして、水性液中にＬ−ロイシンが生成する。Thus, L-leucine is produced in the aqueous liquid.

培養液又は水性液中からＬ−ロイシンを回収する方法と
しては、常法、例えば、イオン交換樹脂法。As a method for recovering L-leucine from a culture solution or an aqueous solution, a conventional method such as an ion exchange resin method can be used.

沈澱法、溶媒抽出法等が用いられる。Precipitation methods, solvent extraction methods, etc. are used.

以下に実施例を示す。Examples are shown below.

実施例１ グルコース０．５ｇ／Ｊ、酵母エキス０．３ｇ／Ｊ。Example 1 Glucose 0.5g/J, yeast extract 0.3g/J.

肉エキスＩｇ／Ｊ、ペプトンＩｇ／Ｊ、Ｎａ（１！（］
、３ｇ／ｃｌｐＨ７，０）の組成の培地１ＯＩＴ１１を
含む試験管に第１表に示す微生物をに−ゼ宛接種し、２
１Ｏｒｐｍの振盪条件下、２８℃の温度条件下で１８時
間振盪培養する。Meat extract Ig/J, peptone Ig/J, Na (1! ()
Microorganisms shown in Table 1 were inoculated into a test tube containing 1OIT11 of a medium with a composition of 3g/clpH7.0),
The culture is carried out under shaking conditions of 1 rpm and a temperature of 28° C. for 18 hours.

培養終了液を試験管ごと遠心分離してＳ菌し、さらに１
０ｍＩづつの０゜８５％食塩溶液で２回遠沈洗浄後、各
試験管へ下記の組成の反応液１．５ｍｌづつを添加し、
４０℃の温度条件下で２４時間静置して反応させたとこ
ろ、各々の微生物が第１表に示す濃度のＬ−ロイシンを
生成した。Centrifuge the cultured solution together with the test tube to collect S bacteria, and then add 1
After washing by centrifugation twice with 0 mI of 0°85% saline solution, 1.5 ml of the reaction solution with the following composition was added to each test tube.
When the microorganisms were allowed to react for 24 hours at a temperature of 40° C., each microorganism produced L-leucine at the concentrations shown in Table 1.

反応液の組成は次のとおり：２−ケトイソカプロン酸・
ナトリウム２００ｍＭ、ピリドキサールリン酸２００μ
Ｍ、）リスバッファー１００ｍＭ（ｐ　Ｈ８，９）　、
７７−ル酸アンモニウム４００ｍＭ０反応液から２−ケ
トイソカプロン酸・ナトリウム。The composition of the reaction solution is as follows: 2-ketoisocaproic acid.
Sodium 200mM, pyridoxal phosphate 200μ
M,) Lys buffer 100mM (pH 8,9),
Sodium 2-ketoisocaproic acid from 400mM 0 reaction solution of ammonium 77-acetate.

７７−ル１ｌ１２アンモニウムあるいはアンモニウムイ
オンのいずれか１つを除いた時のＬ−ロインンの蓄積は
０ト■／ｍ１以下であった。When either 77-l112 ammonium or ammonium ion was removed, the accumulation of L-loin was less than 0 tons/ml.

第１表 実施例２ 使用菌として、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ＡＴＣＣ６８７１を用い、反応液の組成を下記のとおり
に変えた他は実施例１と同様に実施した結果、反応液中
に３．１　ｍｇ　／ｍｌのし一ロイ／ンが生成した。反
応液から尿素を除いた時のＬ−（３イ／ンの生成量は０
．１■／ｍ１以下であった。Table 1 Example 2 As a result of carrying out the same procedure as in Example 1 except that Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 was used as the bacteria used and the composition of the reaction solution was changed as shown below, 3. mg/ml was produced. When urea is removed from the reaction solution, the amount of L-(3 ion/n produced is 0.
．． It was less than 1■/m1.

反応液の組成　２−ケトイソカプロン酸・ナトリウム２
００ｍＪ　ピリドキサールリン酸２００μＭ。Composition of reaction solution Sodium 2-ketoisocaproic acid 2
00mJ pyridoxal phosphate 200μM.

フマール酸ナトリウム４００ｍＭ、尿素４００ｍＭ。Sodium fumarate 400mM, urea 400mM.

トリスバッフｙ　　２００ｍＭ（ｐＨ８，４）発明の効
果 本発明方法により著量のＬ−ロインンを製造することが
できる。Tris buffer y 200mM (pH 8,4) Effects of the invention A significant amount of L-loin can be produced by the method of the invention.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] エシェリヒア属、シトロバクター属、アエロモナス属、
アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバ
クター属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、コリネ
バクテリウム属、エルビニア属、エンテロバクター属、
フラボバクテリウム属、クルイベラ属、ミクロコッカス
属、パラコッカス属、シュードモナス属、サルモネラ属
又はセラチア属に属し、（１）フマール酸及び（２）ア
ンモニウムイオン又は尿素の存在下、２−ケトイソカプ
ロン酸をＬ−ロイシンに変換する能力を有する微生物を
、Ａ、（イ）２−ケトイソカプロン酸（ロ）フマール酸
及び（ハ）アンモニウムイオン又は尿素の存在下に培地
に培養することにより、又はＢ、培地に培養して得られ
る菌体又はその処理物及び前記（イ）、（ロ）及び（ハ
）を含有する水性液中で反応させ、培養液又は水性液中
にＬ−ロイシンを生成させ、これを採取することを特徴
とするＬ−ロイシンの製造法。Escherichia, Citrobacter, Aeromonas,
Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Brevibacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Enterobacter,
It belongs to the genus Flavobacterium, Kluybella, Micrococcus, Paracoccus, Pseudomonas, Salmonella or Serratia, and in the presence of (1) fumaric acid and (2) ammonium ion or urea, 2-ketoisocaproic acid is L- A. By culturing a microorganism capable of converting into leucine in a medium in the presence of (a) 2-ketoisocaproic acid (b) fumaric acid and (c) ammonium ion or urea, or B. culturing in a medium. and the bacterial cells obtained by the above-mentioned methods (a), (b), and (c) in an aqueous solution containing them to produce L-leucine in the culture solution or aqueous solution, which is then collected. A method for producing L-leucine, characterized by the following.