JPS6131090A - 新規なポリペプチドの発現方法 - Google Patents
新規なポリペプチドの発現方法Info
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- JPS6131090A JPS6131090A JP9240685A JP9240685A JPS6131090A JP S6131090 A JPS6131090 A JP S6131090A JP 9240685 A JP9240685 A JP 9240685A JP 9240685 A JP9240685 A JP 9240685A JP S6131090 A JPS6131090 A JP S6131090A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は微生物からのポリペプチドの発現に関する。１
Ｉ７１ｉ乳類の細胞および他の真核細胞と共通して１．
？クチリアは異常ポリ被ゾチドまたはもはや必要のない
ポリペプチドを選択的に分解する夕／・ξり質の加水分
解系をもっている。自然のなりゆきで、異常性は突然変
異あるいは生合成の誤り罠よって生じる。これに対し、
正常なポリペプチドは特定の生体機能を遂行するために
細胞中で特定の時にのみ必要とされるが、一方それ以外
の時にはそのぼりペプチドの存在は細胞にとって有害と
なり、従って一旦、？ ＩＪ Ｏゾチドがその機能を遂
行するとポリペブチＰは選択的に破壊される。これらの
操作は調節因子と構造因子を相互に作用させる複合ネッ
トワークを意味する。実際に、最もよく研究された細菌
系である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
ではこの選択的分解系で個々にまたは協同して作用する
８個の異ったエン１プロテアーゼがこれまで発表されて
いる。
Ｉ７１ｉ乳類の細胞および他の真核細胞と共通して１．
？クチリアは異常ポリ被ゾチドまたはもはや必要のない
ポリペプチドを選択的に分解する夕／・ξり質の加水分
解系をもっている。自然のなりゆきで、異常性は突然変
異あるいは生合成の誤り罠よって生じる。これに対し、
正常なポリペプチドは特定の生体機能を遂行するために
細胞中で特定の時にのみ必要とされるが、一方それ以外
の時にはそのぼりペプチドの存在は細胞にとって有害と
なり、従って一旦、？ ＩＪ Ｏゾチドがその機能を遂
行するとポリペブチＰは選択的に破壊される。これらの
操作は調節因子と構造因子を相互に作用させる複合ネッ
トワークを意味する。実際に、最もよく研究された細菌
系である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
ではこの選択的分解系で個々にまたは協同して作用する
８個の異ったエン１プロテアーゼがこれまで発表されて
いる。
異種遺伝子を微生物に導入すると不注意にこのタン・ξ
り質加水分解系を活性化し、希望する遺伝子生成物の遺
伝子工学の手法による大規模生産を阻害することが多か
った。この問題は真核波ゾチドを指令（ｃｏｄｉｎｇ
）する遺伝子を細菌中に導入する場合に特に甚だしい。
り質加水分解系を活性化し、希望する遺伝子生成物の遺
伝子工学の手法による大規模生産を阻害することが多か
った。この問題は真核波ゾチドを指令（ｃｏｄｉｎｇ
）する遺伝子を細菌中に導入する場合に特に甚だしい。
この問題を回避する方策は所望の遺伝子生成物を指令す
るヌクレオチー配列を、その生成物が本質的に安定して
いることが知られている構造遺伝子または担体タフ ７
ｅり質遺伝子（ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎ
ｅ）の少くとも一部と融合することであった。
るヌクレオチー配列を、その生成物が本質的に安定して
いることが知られている構造遺伝子または担体タフ ７
ｅり質遺伝子（ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎ
ｅ）の少くとも一部と融合することであった。
もし担体タン・ξり質が十分に大きくて全ハイブリッド
ポリペプチドが生（ｎａｔｉｖｅ）で本質的に安定であ
ると認めることができるならば、所望の遺伝子生成物を
担体タン・ξり質と直列に配置すると安定なハイブリッ
ドポリペプチドを生物から発現させる。真核、ｔ？ Ｉ
ＪベゾチＰの直接発現が既存技術では難しいことと発現
をうるために担体タン・ξり質を用いる必要のあること
はよく認識されており、多くの科学雑文や公開出願特許
や特許、例えば米国特許第４．．３４２，８３２号に記
載されている。ンマトスクチンの製造にこの技術を用い
ることを記述した代表的な特許は米国特許第４，３６６
，２４６号である。
ポリペプチドが生（ｎａｔｉｖｅ）で本質的に安定であ
ると認めることができるならば、所望の遺伝子生成物を
担体タン・ξり質と直列に配置すると安定なハイブリッ
ドポリペプチドを生物から発現させる。真核、ｔ？ Ｉ
ＪベゾチＰの直接発現が既存技術では難しいことと発現
をうるために担体タン・ξり質を用いる必要のあること
はよく認識されており、多くの科学雑文や公開出願特許
や特許、例えば米国特許第４．．３４２，８３２号に記
載されている。ンマトスクチンの製造にこの技術を用い
ることを記述した代表的な特許は米国特許第４，３６６
，２４６号である。
しかしこの方法の不利な点は、所望の生成物がハイブリ
ツＰポリベゾチドのごく一部を占めるだけで、従って理
論収量を著しく低下させ、生の（ｎａｔｉｖｅ ）担体
タン／ｌり質を分離して所望のボＩＪ 、、１ゾチド生
成物を精製する追加処理を必要とすることである。しか
し収量を向上させるために生の担体部分（ｍｏｉｅｔｙ
）を７・イブリッド生成物の小部分にまで減少させる努
力をしても発現した・・イブリッドポリペプチドは不安
定になる。
ツＰポリベゾチドのごく一部を占めるだけで、従って理
論収量を著しく低下させ、生の（ｎａｔｉｖｅ ）担体
タン／ｌり質を分離して所望のボＩＪ 、、１ゾチド生
成物を精製する追加処理を必要とすることである。しか
し収量を向上させるために生の担体部分（ｍｏｉｅｔｙ
）を７・イブリッド生成物の小部分にまで減少させる努
力をしても発現した・・イブリッドポリペプチドは不安
定になる。
本明細書中に用いられている記号、略号およびいくつか
の用語は次の意味を有する。
の用語は次の意味を有する。
ＤＮＡ −デオキンリデ核酸Ａ
−アデニン Ｔ −チミン Ｇ −グアニン Ｃ−シトシン ）９人 −２−アミノ−２−ヒドロキシ−
エチル−１，３−ゾロノぐ／ノ オール ＥＤＴＡ −エチレンノアミン四錯酸
ＡＴＰ 〜アデノシン三り／酸ＴＴＩ
） −チミジン三リン酸ＧＴＩ’
−グアノシン三リン酸Ｔ４
−大腸菌に特定な・ζクテリオファージ ヌクレオチド −ヌクレオンＰリン酸コドン
−特定のアミノ酸を規定する３個のヌクレ
オチド配列 オリゴヌクレオチド −多数のヌクレオチｒよりなる
ポリマー シラスミ１ −自己複製する染色体外遺伝素子本
発明によれば驚くことにこの既存技術のもつ問題が十分
に解決され、微生物の自然の選択的タン・ξり質分解の
機構が妨げられて所望の真核ボＩＪ ６ゾチドの高収量
平屋が達成されることがわかった。このことは複数のポ
リペプチド遺伝子を容易に切断可能なアミン配列にょシ
直列に結合しその結果できたＤＮＡ構成物（ｃｏｎｓ
ｔ ｒｕｃ ｔ ）をクローニングの運び手に組込み、
微生物をこのクローニング運び手で形質転換することに
より達成される。
−アデニン Ｔ −チミン Ｇ −グアニン Ｃ−シトシン ）９人 −２−アミノ−２−ヒドロキシ−
エチル−１，３−ゾロノぐ／ノ オール ＥＤＴＡ −エチレンノアミン四錯酸
ＡＴＰ 〜アデノシン三り／酸ＴＴＩ
） −チミジン三リン酸ＧＴＩ’
−グアノシン三リン酸Ｔ４
−大腸菌に特定な・ζクテリオファージ ヌクレオチド −ヌクレオンＰリン酸コドン
−特定のアミノ酸を規定する３個のヌクレ
オチド配列 オリゴヌクレオチド −多数のヌクレオチｒよりなる
ポリマー シラスミ１ −自己複製する染色体外遺伝素子本
発明によれば驚くことにこの既存技術のもつ問題が十分
に解決され、微生物の自然の選択的タン・ξり質分解の
機構が妨げられて所望の真核ボＩＪ ６ゾチドの高収量
平屋が達成されることがわかった。このことは複数のポ
リペプチド遺伝子を容易に切断可能なアミン配列にょシ
直列に結合しその結果できたＤＮＡ構成物（ｃｏｎｓ
ｔ ｒｕｃ ｔ ）をクローニングの運び手に組込み、
微生物をこのクローニング運び手で形質転換することに
より達成される。
従って、本発明によれば容易に切断可能なアミノ酸配列
を指令するオリゴヌクレオチドによって分離され、断片
の両端間に停止および開始のコドンを有しない既知のア
ミノ酸配列の所望の生成物の繰返し単位よシなるポリペ
プチドを指令するオリゴヌクレオチド配列を有する新規
なＤＮＡ断片が得られる。
を指令するオリゴヌクレオチドによって分離され、断片
の両端間に停止および開始のコドンを有しない既知のア
ミノ酸配列の所望の生成物の繰返し単位よシなるポリペ
プチドを指令するオリゴヌクレオチド配列を有する新規
なＤＮＡ断片が得られる。
既知のアミノ酸配列の所望の生成物を指令する繰返し単
位よシなる、容易に切断可能なアミノ酸単位を指令する
オリゴヌクレオチドによつ又分離されたＤＮＡ断片をつ
くることによって。
位よシなる、容易に切断可能なアミノ酸単位を指令する
オリゴヌクレオチドによつ又分離されたＤＮＡ断片をつ
くることによって。
微生物中で生成物を安定して発現することのできる複製
可能なクローニング運び手を得ることができる。微生物
が生長する間に生成物が一旦発現すると、生成物は細胞
培養基から単離され、繰返し単位を切断箇所で切断して
所望生成物の複数の独立単位をつくることにより所望の
ポリペプチド生成物が単離された生成物から得られる。
可能なクローニング運び手を得ることができる。微生物
が生長する間に生成物が一旦発現すると、生成物は細胞
培養基から単離され、繰返し単位を切断箇所で切断して
所望生成物の複数の独立単位をつくることにより所望の
ポリペプチド生成物が単離された生成物から得られる。
所望のポリペプチド生成物の複数のコピーが微生物から
発現するので生成物の収量は上記の既存技術の発現方法
に比べて可成り向上する。
発現するので生成物の収量は上記の既存技術の発現方法
に比べて可成り向上する。
本発明は微生物中のポＩＪ ’プチドの安定性の向上に
一般に適用可能であり、ヒトおよび動物起源のポリペブ
チＰ、例えばヒトプロイン／ユリ／、ヒト生長ホルモン
、ンマトスタチンおよびヒトインターフェロンなどのホ
ルモンポリペブチｒおよびワクチンに使用するウィルス
タンパク質よりなる広範囲なポリペプチド”生成物をつ
くるのに用いられる。
一般に適用可能であり、ヒトおよび動物起源のポリペブ
チＰ、例えばヒトプロイン／ユリ／、ヒト生長ホルモン
、ンマトスタチンおよびヒトインターフェロンなどのホ
ルモンポリペブチｒおよびワクチンに使用するウィルス
タンパク質よりなる広範囲なポリペプチド”生成物をつ
くるのに用いられる。
本発明にとって必要欠くべからざることは、その生成物
が容易に切断される結合単位（ｊｏｉｎｉｎｇ ｕｎｉ
ｔｓ ）によって分離されその各々が既知のアミノ酸配
列の所望の生成物を指令する少くとも２個の単位を有す
るＤＮＡ断片の生成である。安定性を達成するのに必要
な繰返し単位の数は所望生成物によシ、−力結合単位の
性質と切断に用いる切断剤もまた所望生成物によってか
わる。
が容易に切断される結合単位（ｊｏｉｎｉｎｇ ｕｎｉ
ｔｓ ）によって分離されその各々が既知のアミノ酸配
列の所望の生成物を指令する少くとも２個の単位を有す
るＤＮＡ断片の生成である。安定性を達成するのに必要
な繰返し単位の数は所望生成物によシ、−力結合単位の
性質と切断に用いる切断剤もまた所望生成物によってか
わる。
発現生成物に関連して本明細書で使用される”安定性“
という用語はその抽出を行うのに十分な期間の半減期を
もつ物質をいう。本発明では約２００分以上の半減期を
もつ生成物をつくることが好ましい。
という用語はその抽出を行うのに十分な期間の半減期を
もつ物質をいう。本発明では約２００分以上の半減期を
もつ生成物をつくることが好ましい。
本発明の独特な実施態様はヒトプロインシュリンすなわ
ちＡ鎖およびＢ鎖に加えてＣ鎖を有するインシュリンの
先駆物質の発現に関する。
ちＡ鎖およびＢ鎖に加えてＣ鎖を有するインシュリンの
先駆物質の発現に関する。
しかしその原理は上記のように如何なるポリペプチドに
も広く適用できる。
も広く適用できる。
本発明を用いてその好ましい実施態様に従ってヒトプロ
インシュリンの製造を行う際に、最終生成物中で個々の
プロインシュリンイプチドを互に容易に分離させる容易
に切断可能な単位を指令するオリゴヌクレオチド配列に
よって分離されたヒトプロインシュリンを指令する複数
の配列を保有するＤＮＡ断片が生じる。停止と開始のシ
グナルを指令する配列は断片の両端の間にはない。その
ＤＮＡ断片は微生物中で断片を発現させることができる
複製可能なクローニングの運び手の中に挿入される。
インシュリンの製造を行う際に、最終生成物中で個々の
プロインシュリンイプチドを互に容易に分離させる容易
に切断可能な単位を指令するオリゴヌクレオチド配列に
よって分離されたヒトプロインシュリンを指令する複数
の配列を保有するＤＮＡ断片が生じる。停止と開始のシ
グナルを指令する配列は断片の両端の間にはない。その
ＤＮＡ断片は微生物中で断片を発現させることができる
複製可能なクローニングの運び手の中に挿入される。
複合プロインシュリン遺伝子をつくるこれをクローニン
グの運び手に融合および不融合の両装置（ａ ｆｕｓｅ
ｄ ａｎｄ ａｎ ｕｎｆｕｓｅｄ ｃｏｎｆｉｇｕｌ
ａｔｉｏｎ）で挿入する好ましい方法を第１図に示す。
グの運び手に融合および不融合の両装置（ａ ｆｕｓｅ
ｄ ａｎｄ ａｎ ｕｎｆｕｓｅｄ ｃｏｎｆｉｇｕｌ
ａｔｉｏｎ）で挿入する好ましい方法を第１図に示す。
融合配置では、ヒトインシュリンを指令する配列はｌａ
ｃ （ラクトース）プロモータを有しβ−ガラクトシダ
ーゼのＮ−末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）の始めの８０
個のアミノ酸をコーｒ化（ｅｎｃｏｄｅ）する断片の３
′側に結合している。不融合配置ではプロインシュリン
を指令する配列はＴａＣゾロモータを保有する断片ヒ直
接結合し細菌の７ヤイ／−ダルガルノ配列がこれＫつソ
いている。発現したポリペゾチＰの収量は微生物の細胞
当りのグラム数で表わして融合配置の場合の方が不融合
配置と比較してはるかに大きいことがわかっている。
ｃ （ラクトース）プロモータを有しβ−ガラクトシダ
ーゼのＮ−末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）の始めの８０
個のアミノ酸をコーｒ化（ｅｎｃｏｄｅ）する断片の３
′側に結合している。不融合配置ではプロインシュリン
を指令する配列はＴａＣゾロモータを保有する断片ヒ直
接結合し細菌の７ヤイ／−ダルガルノ配列がこれＫつソ
いている。発現したポリペゾチＰの収量は微生物の細胞
当りのグラム数で表わして融合配置の場合の方が不融合
配置と比較してはるかに大きいことがわかっている。
両者の配置において、単遺伝子ヒトぼりインシュリンは
微生物から生成物として単離するには余りに不安定であ
るが、第１図の方法で遺伝子構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔ ）にさらにヒトプロインシュリンを指令する配列が
加えられるとその結果できる複合領域ポリ４ゾチド（ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅｄｏｍａｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
）はますます安定になり、不融合配置では３個の直列結
合プロインシュリン領域（ｔｈｒｅｅ ｔａｎｄｐｒｎ
ｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎｄｏｍａｉ
ｎｓ ）で、融合配置では２個の直列結合プロインシュ
リン領域で正常な安定に近づく。直列結合（ｔａｎｄｅ
ｍｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ） したプロインシュリンを指
令する配列の数が増えつソけるとそれ以上の数ではポリ
マーの収量が減する指令配列の最大数に達する。例えば
プロインシュリンの不融合配置中で直列結合（ｔａｎｄ
ｅｍｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ）単位の数を６以上に増すと
細胞によってつくられるＩリマー生成物の量が減少する
。不融合配置では４または５個のプロインシュリン指令
配列をまた融合配置では３ないし４個のプロインシュリ
ン指令配列を用いることが好ましい。
微生物から生成物として単離するには余りに不安定であ
るが、第１図の方法で遺伝子構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔ ）にさらにヒトプロインシュリンを指令する配列が
加えられるとその結果できる複合領域ポリ４ゾチド（ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅｄｏｍａｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
）はますます安定になり、不融合配置では３個の直列結
合プロインシュリン領域（ｔｈｒｅｅ ｔａｎｄｐｒｎ
ｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎｄｏｍａｉ
ｎｓ ）で、融合配置では２個の直列結合プロインシュ
リン領域で正常な安定に近づく。直列結合（ｔａｎｄｅ
ｍｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ） したプロインシュリンを指
令する配列の数が増えつソけるとそれ以上の数ではポリ
マーの収量が減する指令配列の最大数に達する。例えば
プロインシュリンの不融合配置中で直列結合（ｔａｎｄ
ｅｍｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ）単位の数を６以上に増すと
細胞によってつくられるＩリマー生成物の量が減少する
。不融合配置では４または５個のプロインシュリン指令
配列をまた融合配置では３ないし４個のプロインシュリ
ン指令配列を用いることが好ましい。
第１図に示された実施態様中で結合単位（ｌｉｎｋｉｎ
ｇ ｕｎｉｔ）または領域結合（ｄｏｍａｉｎ ｊｕｎ
ｃｔｉｏｎ）のためのオリゴヌクレオチド配列は次の様
に表わされる。
ｇ ｕｎｉｔ）または領域結合（ｄｏｍａｉｎ ｊｕｎ
ｃｔｉｏｎ）のためのオリゴヌクレオチド配列は次の様
に表わされる。
Ｐｉｇ −Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｍｅｔ−
ＰｉｇＡＧＧ ＣＧＣＡＡＴ ＴＯＴ ＡＴＧＰｉｇ・
・・プロインシュリン遺伝子 Ａｒｇ・・・アルギニン、 ＡＳｎ・・・アスノξラ
ギンＳｅｒ・・・セリン Ｍｅｔ・・・メチオニ
ンＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ！は先に説明した略号。
ＰｉｇＡＧＧ ＣＧＣＡＡＴ ＴＯＴ ＡＴＧＰｉｇ・
・・プロインシュリン遺伝子 Ａｒｇ・・・アルギニン、 ＡＳｎ・・・アスノξラ
ギンＳｅｒ・・・セリン Ｍｅｔ・・・メチオニ
ンＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ！は先に説明した略号。
アミノ酸領域結合（ｄｏｍａｉｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ
）は臭化ンアン（Ｃｙａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ）
と反応させて単プロインシュリンペプチドに容易に切断
できる。
）は臭化ンアン（Ｃｙａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ）
と反応させて単プロインシュリンペプチドに容易に切断
できる。
この領域結合（ｄｏｍａｉｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ）と
その切断方法は種々の結合単位（ｌｉｎｋｉｎｇ ｕｎ
ｉｔ）と採用可能な切断の仕方の一例にすぎない。
その切断方法は種々の結合単位（ｌｉｎｋｉｎｇ ｕｎ
ｉｔ）と採用可能な切断の仕方の一例にすぎない。
メチオニン群（ｇｒｏｕｐ ）をもたないポリペプチド
に対しては、もしメチオニン群ド／がペプチｒ指令結合
（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｄｉｎｇ ｊｕｎｃｔｉｏｎ
）を構成するならば、直接化の物質（ｎａｔｉｖｅｍａ
ｔｅｒｉａｌ）を製造するために臭化シアン切断（ｃｙ
ａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ）
を用いてもよい。
に対しては、もしメチオニン群ド／がペプチｒ指令結合
（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｄｉｎｇ ｊｕｎｃｔｉｏｎ
）を構成するならば、直接化の物質（ｎａｔｉｖｅｍａ
ｔｅｒｉａｌ）を製造するために臭化シアン切断（ｃｙ
ａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ）
を用いてもよい。
一方メチオニン群（ｇｒｏｕｐ ）をもつポリペプチド
に対しては、容易に切断可能な箇所を与えるだめの所望
のホリペゾチＰ切片（ｓｅｇｍｅｎｔ ）間に位置する
特定アミノ酸配列の設計は遺伝子工学の手法によって行
われる。たとえばアスノξルチルーゾロリン結合（ｂｏ
ｎｄ ）をもたないポリペブチＰは複合物指令配列構成
物（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔ）の各単位間にこのような結合（ｂｏｎ
ｄ ）をもつように処理され（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）
従って単離された複合領域（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｍａｉｎ
）ポリペプチドからの生の物質の回収はＪａｕｒｅｇｕ
ｉ−ＡｄｅｌｌおよびＭａｒｔｉ 、 Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏＣｈｅｍ、 ６９ 、４６８（１９７５）に記載され
ているように酸による切断によって達成することができ
る。
に対しては、容易に切断可能な箇所を与えるだめの所望
のホリペゾチＰ切片（ｓｅｇｍｅｎｔ ）間に位置する
特定アミノ酸配列の設計は遺伝子工学の手法によって行
われる。たとえばアスノξルチルーゾロリン結合（ｂｏ
ｎｄ ）をもたないポリペブチＰは複合物指令配列構成
物（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔ）の各単位間にこのような結合（ｂｏｎ
ｄ ）をもつように処理され（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）
従って単離された複合領域（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｍａｉｎ
）ポリペプチドからの生の物質の回収はＪａｕｒｅｇｕ
ｉ−ＡｄｅｌｌおよびＭａｒｔｉ 、 Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏＣｈｅｍ、 ６９ 、４６８（１９７５）に記載され
ているように酸による切断によって達成することができ
る。
一般に、アミノ酸残基−配列（ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ）に特有な酵素的方法または化学反応は所望
のポリベゾチｒ遺伝子間の結合群（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇ
ｒｏｕｐ）の切断を行うために用いられる。
ｕｅｎｃｅ）に特有な酵素的方法または化学反応は所望
のポリベゾチｒ遺伝子間の結合群（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇ
ｒｏｕｐ）の切断を行うために用いられる。
真のヒトプロインシュリン分子はメチオニ／残基（ｒｅ
ｓｉｄｕｅ ）を保有せず従って臭化シアン処理は複合
領域プロインシュリン分子を切断してＣ一端末（Ｃ−ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ）真プロインシュリン単位とともにいく
つかのプロインシュリン相似片（ａｎａｌｏｇ ｍｏｉ
ｅｔｉｅｓ ）にわける。このことはメチオニンコＰン
をゾロイン７ユリンを指令スる配列単位の各々の５′一
端に計画的に配置したことから生じたものである。
ｓｉｄｕｅ ）を保有せず従って臭化シアン処理は複合
領域プロインシュリン分子を切断してＣ一端末（Ｃ−ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ）真プロインシュリン単位とともにいく
つかのプロインシュリン相似片（ａｎａｌｏｇ ｍｏｉ
ｅｔｉｅｓ ）にわける。このことはメチオニンコＰン
をゾロイン７ユリンを指令スる配列単位の各々の５′一
端に計画的に配置したことから生じたものである。
このようにしてつくられた個々のゾロイン／ニリン単位
はトリプシンとカルゼキシベプチダーゼＢで消化（ｄｉ
ｇｅｓｔｉｏｎ ） してあるいは他の適当な方法でさ
らに真ヒトインシュリンに加工される。
はトリプシンとカルゼキシベプチダーゼＢで消化（ｄｉ
ｇｅｓｔｉｏｎ ） してあるいは他の適当な方法でさ
らに真ヒトインシュリンに加工される。
プロインシュリンの複数コピーを指令するオリゴヌクレ
オチド配列を有する組換え体プラスミドの生成は、既存
技術によるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するノ・イ
ブリツＰ分子の発現と比較すると、プロインシュリンお
よびプロ・インシュリン相似体（ａｎａｌｏａｓ ）の
収量に可成りの増加をもたらす。
オチド配列を有する組換え体プラスミドの生成は、既存
技術によるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するノ・イ
ブリツＰ分子の発現と比較すると、プロインシュリンお
よびプロ・インシュリン相似体（ａｎａｌｏａｓ ）の
収量に可成りの増加をもたらす。
第１図に見られるように、新規なシラスミＰｐＴａｃ
／ ２ＰＩおよびｐｌａｃ ２３９／２ＰＩおよび他の
複数ＰＩ単位プラスミド特に発現プラスミドルμ狂／
５ＰＩおよび第８図に示すようにさらに加工されて好ま
しい発現シラスミＰ ｐｌａｃ−３ＰＩ をつくるｐ
ｌａｃ ２３９ ／ ３ＰＩを形成する好ましい配列は
、ＥｃｏＲＩとＢａＩＴ）ｌ Ｉの制限箇所の間にヒト
プロインシュリンを指令するオリゴヌクレオチド配列を
有するプラスミドｐＡＴ ／ ＰＩＲから始まる。既知
のプラスミドｐＢＯＡ４から同じく新規なプラスミドで
あるプラスミドｐＡＴ ／ ＰＩＲの誘導を第４図に示
す。第６図に示すように、ｐＴａｃおよびｐｌａｃ２３
９の断片はそれぞれプラスミドｐＴａｃ／ＰＩおよびｐ
ｌａｃ ２３９ ／ ＰＩから誘導され、後二者は他の
新規プラスミドｐｌａｃ ５０４ ／ ＰＩから誘導さ
れる。
／ ２ＰＩおよびｐｌａｃ ２３９／２ＰＩおよび他の
複数ＰＩ単位プラスミド特に発現プラスミドルμ狂／
５ＰＩおよび第８図に示すようにさらに加工されて好ま
しい発現シラスミＰ ｐｌａｃ−３ＰＩ をつくるｐ
ｌａｃ ２３９ ／ ３ＰＩを形成する好ましい配列は
、ＥｃｏＲＩとＢａＩＴ）ｌ Ｉの制限箇所の間にヒト
プロインシュリンを指令するオリゴヌクレオチド配列を
有するプラスミドｐＡＴ ／ ＰＩＲから始まる。既知
のプラスミドｐＢＯＡ４から同じく新規なプラスミドで
あるプラスミドｐＡＴ ／ ＰＩＲの誘導を第４図に示
す。第６図に示すように、ｐＴａｃおよびｐｌａｃ２３
９の断片はそれぞれプラスミドｐＴａｃ／ＰＩおよびｐ
ｌａｃ ２３９ ／ ＰＩから誘導され、後二者は他の
新規プラスミドｐｌａｃ ５０４ ／ ＰＩから誘導さ
れる。
プラスミドｐｌａｒ： ５０４ ／ ＰＩの既知のプラ
スミドからの誘導も壕だ第６図に示されている。
スミドからの誘導も壕だ第６図に示されている。
ｐＴａｃおよびｐｌａｃベクトルをプラスミドｐＴａＣ
／ｐＩおよびｐｌａｃ ／ ＰＩ すなわ、ちプロイ
ンシュリンの遺伝子の単コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐ
ｙ ）を有するプラスミドからうろことは重要ではない
。
／ｐＩおよびｐｌａｃ ／ ＰＩ すなわ、ちプロイ
ンシュリンの遺伝子の単コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐ
ｙ ）を有するプラスミドからうろことは重要ではない
。
これら４クトルは夫々ＴａＣおよびｌａｃゾロモータを
有し且つＥｃｏＲＩおよびＢａｒｒｆ（Ｉ箇所で切断さ
れて複数プロインシュリン遺伝子断片（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｐｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ
）と連結するだめのベクトルをつくることのできる他の
適当なプラスミドから誘導できる。同様に、プロインシ
ュリン遺伝子の単コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐ”／
）を有するプラスミドｐｌａｃ ５０４ ／ ＰＩを中
間体としてつくることは必須ではなく他の適当な中間体
プラスミドを用いてもよい。本明細書に示した独特の単
コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ）プロインシュリン
遺伝子シラスミＰは本発明者らによって本発明に至った
実験中にプロインシュリンを安定して発現する構成物（
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）をつくる試みの際につくられた
。先に述べたように、このことは単コピー遺伝子（ｓｉ
ｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｇｅｎｅ）では可能であるとはみ
なされていなかった。
有し且つＥｃｏＲＩおよびＢａｒｒｆ（Ｉ箇所で切断さ
れて複数プロインシュリン遺伝子断片（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｐｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ
）と連結するだめのベクトルをつくることのできる他の
適当なプラスミドから誘導できる。同様に、プロインシ
ュリン遺伝子の単コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐ”／
）を有するプラスミドｐｌａｃ ５０４ ／ ＰＩを中
間体としてつくることは必須ではなく他の適当な中間体
プラスミドを用いてもよい。本明細書に示した独特の単
コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ）プロインシュリン
遺伝子シラスミＰは本発明者らによって本発明に至った
実験中にプロインシュリンを安定して発現する構成物（
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）をつくる試みの際につくられた
。先に述べたように、このことは単コピー遺伝子（ｓｉ
ｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｇｅｎｅ）では可能であるとはみ
なされていなかった。
図面に示しまた先に開示した種々のプラスミドの生成実
験の詳細については下記の実施例で論する。
験の詳細については下記の実施例で論する。
新規プラスミドｐｌａｃ ２３９−３ＰＩ 、 ｐＴａ
ｃ１５ＰＩ。
ｃ１５ＰＩ。
ｐＡ’ｌｌ” ／ ＰＩＲおよびｐｌａＣ５０４／ Ｐ
Ｉの詳細な誘導と主な制限箇所地図は夫々第２．３．５
および７図に示す。プラスミドｐｌａｃ ２３９−３Ｐ
Ｉ およびｐＴａｃ ／ ５ＰＩ の各々によって
転換した大腸菌ＪＭ１０３は１９８４年７月６日に米国
メリーランＣｏｌ １ｅｃｔ １ｏｎ）に寄託され次の
受託番号が与えられている。
Ｉの詳細な誘導と主な制限箇所地図は夫々第２．３．５
および７図に示す。プラスミドｐｌａｃ ２３９−３Ｐ
Ｉ およびｐＴａｃ ／ ５ＰＩ の各々によって
転換した大腸菌ＪＭ１０３は１９８４年７月６日に米国
メリーランＣｏｌ １ｅｃｔ １ｏｎ）に寄託され次の
受託番号が与えられている。
生物大腸菌／プラスミドｐｌａＣ２３９−３ＰＩ−ＡＴ
ＣＣ３９７６０ 生物大腸菌／プラスミドｐＴａｃ ／ ５ＰＩ−ＡＴＣ
Ｃ３９７５９ 本発ＢＡｔ更に実施例によって説明する。
ＣＣ３９７６０ 生物大腸菌／プラスミドｐＴａｃ ／ ５ＰＩ−ＡＴＣ
Ｃ３９７５９ 本発ＢＡｔ更に実施例によって説明する。
実施例 １
本実施例にはヒトプロインシュリン遺伝子の複数単位を
保有する新規プラスミドの生成が述べられている。
保有する新規プラスミドの生成が述べられている。
（ａ） ｐＡＴ ／ ＰＩＲの調製
シラスミＩ’ ｐＡＴ ／ ＰＩＲを第４図に示した手
順に従って調製しこのプラスミドの制限地図を第５図に
示す。原料シラスミｐ ｐＢｃＡ４はそのＥｃｏＲＩオ
、１： （Ｊ Ｂａｍ１（Ｉ制限箇所の間にヒトゾロイ
ン７ユリンを指令するヌクレオチド配列を有している。
順に従って調製しこのプラスミドの制限地図を第５図に
示す。原料シラスミｐ ｐＢｃＡ４はそのＥｃｏＲＩオ
、１： （Ｊ Ｂａｍ１（Ｉ制限箇所の間にヒトゾロイ
ン７ユリンを指令するヌクレオチド配列を有している。
しかももしこのプラスミドのＥｃｏＲＩ −ＢａｍＩ（
Ｉ断片を直接用いると誤った読取り枠（ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ ）を生ずるので従って下記のように変換し
なければならない。プラスミドｐＢＣＡ４はＮａｒａｎ
ｇらのＧｅｎｅ、 １．７ 、２７９ （１９８２）に
記載されており、米国ニューヨーク州イサ力のコーネル
大学の同報文の著者の一人であるＲ、Ｗｕ 教授から入
手した。
Ｉ断片を直接用いると誤った読取り枠（ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ ）を生ずるので従って下記のように変換し
なければならない。プラスミドｐＢＣＡ４はＮａｒａｎ
ｇらのＧｅｎｅ、 １．７ 、２７９ （１９８２）に
記載されており、米国ニューヨーク州イサ力のコーネル
大学の同報文の著者の一人であるＲ、Ｗｕ 教授から入
手した。
プラスミドｐＢｃＡ４をＦｏｋ ＩとＢａｍ１−１１
で切断しこのＦｏｋｌ−Ｂａｍ［−ｆｌ 断片を単
離した。２個の合成ヌクレオチドをつくりＦｏｋＩ −
ＢａｍＨＩ断片と連結してＰＩ配列の５′一端をＦｏｋ
ＩからＥｃｏＲＩに延長した。この変性したＥｃｏＲ
Ｉ端を有するＰＩ配列をＰＩＲと称する。合成ヌクレオ
チド配列は化学的に合成したものであシ次の配列よりな
っていた。
で切断しこのＦｏｋｌ−Ｂａｍ［−ｆｌ 断片を単
離した。２個の合成ヌクレオチドをつくりＦｏｋＩ −
ＢａｍＨＩ断片と連結してＰＩ配列の５′一端をＦｏｋ
ＩからＥｃｏＲＩに延長した。この変性したＥｃｏＲ
Ｉ端を有するＰＩ配列をＰＩＲと称する。合成ヌクレオ
チド配列は化学的に合成したものであシ次の配列よりな
っていた。
５’ ＡＡ、ＴＴＣＴＡＴＧＴＴＴＧＴＯＡＡＴ
３’３’ ＧＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡ
ＧＴＯＧ ５’原料プラスミドｐＡＴ １５３はよ
く知られたプラスミドｐＢＲ３２２からいわゆる６毒素
”（ｐｏｉｓｏｎ）配列を除いた高次複製変性体（ｈｉ
ｇｈ ｃｏｐｙ ｖａｒｉａｎｔ）でありＴｗｉｇｇら
により Ｎａｔｕｒｅ、 ２８３ 、２１６（１９８０
）に記述されている。プラスミドｐＡＴ １５３は米国
ウイスコン／ン州マノソンのウイスコンシンーマノソン
大学、遺伝学科０．Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ 教授より入手し
た。プラスミドｐＡＴ １５３をＥｃｏＲＩとＢａｍＩ
−（Ｉで切断しベクトルを単離した。単離したベクトル
をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＩ刊（ＰＩＲ）断片と連結し新規
プラスミドｐＡＴ ／ Ｐｌ、Ｒをつくった。
３’３’ ＧＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡ
ＧＴＯＧ ５’原料プラスミドｐＡＴ １５３はよ
く知られたプラスミドｐＢＲ３２２からいわゆる６毒素
”（ｐｏｉｓｏｎ）配列を除いた高次複製変性体（ｈｉ
ｇｈ ｃｏｐｙ ｖａｒｉａｎｔ）でありＴｗｉｇｇら
により Ｎａｔｕｒｅ、 ２８３ 、２１６（１９８０
）に記述されている。プラスミドｐＡＴ １５３は米国
ウイスコン／ン州マノソンのウイスコンシンーマノソン
大学、遺伝学科０．Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ 教授より入手し
た。プラスミドｐＡＴ １５３をＥｃｏＲＩとＢａｍＩ
−（Ｉで切断しベクトルを単離した。単離したベクトル
をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＩ刊（ＰＩＲ）断片と連結し新規
プラスミドｐＡＴ ／ Ｐｌ、Ｒをつくった。
（ｂ） プロインシュリン遺伝子の複数コピー（Ｍｕ
ｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ ）の調製プロインシュリ
ン遺伝子の複数コピー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｏｐｉｅｓ
）をつくるのに必要な操作の手順を第１図に示す。合成
オリゴヌクレオチＰ （Ａ）および（Ｂ）は次の配列を
うるように化学的に調製した。
ｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ ）の調製プロインシュリ
ン遺伝子の複数コピー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｏｐｉｅｓ
）をつくるのに必要な操作の手順を第１図に示す。合成
オリゴヌクレオチＰ （Ａ）および（Ｂ）は次の配列を
うるように化学的に調製した。
（Ａ） ５’ ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡ
ＡＣＴＡＣＴＧＣｕＣＡＧｃＣＧＣ３／（Ｈ） ３’
ＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＣＧＴＴ
ＧＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡ ５’２００ ｐモルのオリ
ザヌクレオチド（Ｂ）とその５′一端を３２ｐ−ＡＴＰ
でライルした２００ｐモルのオリゴヌクレオチＹ （Ａ
）を３０μｌの６６ｍＭトリス−＋１ＣＩ （ｐＨ７６
） 、 ６６ｍＭ ＭｇＣ１□および１０ｍＭジチオト
レイット中で混合し８０’Ｃで１５分間加熱して両オリ
ゴヌクレオチＰをア＝ −／ｌ／ （ａｎｎｅａｌ）し
指令配列（ｃｏｄｉｎｇ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ） （０
３一端に近イ５ｆａＮ工切断箇所で始り最後のプロイン
ンユリンコ１ン（ＡＡＧりで終り、次に示す付加配列が
っソくヒトゾロイン７ユリンを指令する配列の装置をつ
くった。
ＡＣＴＡＣＴＧＣｕＣＡＧｃＣＧＣ３／（Ｈ） ３’
ＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＣＧＴＴ
ＧＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡ ５’２００ ｐモルのオリ
ザヌクレオチド（Ｂ）とその５′一端を３２ｐ−ＡＴＰ
でライルした２００ｐモルのオリゴヌクレオチＹ （Ａ
）を３０μｌの６６ｍＭトリス−＋１ＣＩ （ｐＨ７６
） 、 ６６ｍＭ ＭｇＣ１□および１０ｍＭジチオト
レイット中で混合し８０’Ｃで１５分間加熱して両オリ
ゴヌクレオチＰをア＝ −／ｌ／ （ａｎｎｅａｌ）し
指令配列（ｃｏｄｉｎｇ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ） （０
３一端に近イ５ｆａＮ工切断箇所で始り最後のプロイン
ンユリンコ１ン（ＡＡＧりで終り、次に示す付加配列が
っソくヒトゾロイン７ユリンを指令する配列の装置をつ
くった。
５’ ＡＧＧ ＣＧＣ３’
３’ ＴＯＣＧＣＧ ＴＴＡＡ ５’合成オ
リゴヌクレオチドのこれらの付加配列は２個のアルギニ
ン残基（ｒｅｓｉｄｕｅ ）をコーＰ化しく ｅｎｃｏ
ｄも）、Ｂｃｏ几■付着端に連結する付着端を与える。
リゴヌクレオチドのこれらの付加配列は２個のアルギニ
ン残基（ｒｅｓｉｄｕｅ ）をコーＰ化しく ｅｎｃｏ
ｄも）、Ｂｃｏ几■付着端に連結する付着端を与える。
この連結はＣＧ塩基対（ｂａｓｅｐａｉｒ）（第１図の
ワク内）があるためにＥｃｏＲＩ箇所を破壊する。
ワク内）があるためにＥｃｏＲＩ箇所を破壊する。
上記（ａ）に述べたように調製したｐＡＴ ／ ＰＩＲ
１０μｇを４０μｌの消化緩衝液中でＥＣ０ＲＩおよび
ＢａｍＩ−Ｉ Ｉ各４０単位を用いて３７℃で１時間消
化した（ ｄｉｇｅｓｔｅｄ）。この消化したＤＮＡを
ｐＨ３０の２００ｍＭトリス−ＨＣｌ中でウシ腸アルカ
リホスファターゼ（ｃａｌｆ １ｎｔｅｓｔｉｎｅ ａ
ｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ） ４単位を
用いて３７℃で３０分間消化して脱リン酸した。プロイ
ンンユリン遺伝子断片（ＦＩＲ）をフェノール抽出によ
！ｌ１１％アガローズゲルから単離した。この単離した
断片をさらに６単位の５ｆａＮＩを用いて消化緩衝液４
（Ｊｔｔｅ中で３７℃で３時間消化しＰＩＲのＥＣ０Ｒ
Ｉ −８ｆａＮＩ断片を単離した。
１０μｇを４０μｌの消化緩衝液中でＥＣ０ＲＩおよび
ＢａｍＩ−Ｉ Ｉ各４０単位を用いて３７℃で１時間消
化した（ ｄｉｇｅｓｔｅｄ）。この消化したＤＮＡを
ｐＨ３０の２００ｍＭトリス−ＨＣｌ中でウシ腸アルカ
リホスファターゼ（ｃａｌｆ １ｎｔｅｓｔｉｎｅ ａ
ｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ） ４単位を
用いて３７℃で３０分間消化して脱リン酸した。プロイ
ンンユリン遺伝子断片（ＦＩＲ）をフェノール抽出によ
！ｌ１１％アガローズゲルから単離した。この単離した
断片をさらに６単位の５ｆａＮＩを用いて消化緩衝液４
（Ｊｔｔｅ中で３７℃で３時間消化しＰＩＲのＥＣ０Ｒ
Ｉ −８ｆａＮＩ断片を単離した。
アニールしたオリゴヌクレオチド（３）およびＦＢ）１
００ｐモルと単離したＰＩＲＥｃｏＲＩ −５ｆａＮＩ
断片約４ｐモルを、２０単位のＴ ４ＤＮＡリガーゼを
用いて３０ ｔｔｌの６６ｍＭ）す、Ｘ −Ｈｃｌ（Ｄ
ｌｌ ７６）、１ｉ、 （ｉ ｍＭ ＭＱＣｌ ２．１
．０ｍＭヂチオトレイットおよびｌ ｍＭ ＡＴＰ中で
１５℃で１４時間連結した。上記のように５ｆａＮＩ切
断の前にプロインンユリン遺伝子断片を脱リン酸化し、
オリゴヌクレオチド（３）のみをリン酸化した結果、反
応は一方向のみに進みプロインシュリン遺伝子断片ＰＩ
Ｒはアニールしたオリゴヌクレオチドと連結した。連結
反応生成物を１５％アガローズゲル上で電気泳動し、そ
の結果生じたプロインシュリン遺伝子相似構成物（ａｎ
ａｌｏｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ） （ＰＩ相似体（２ｎ
ａｌｏｇ） ）をゲルから単離した。
００ｐモルと単離したＰＩＲＥｃｏＲＩ −５ｆａＮＩ
断片約４ｐモルを、２０単位のＴ ４ＤＮＡリガーゼを
用いて３０ ｔｔｌの６６ｍＭ）す、Ｘ −Ｈｃｌ（Ｄ
ｌｌ ７６）、１ｉ、 （ｉ ｍＭ ＭＱＣｌ ２．１
．０ｍＭヂチオトレイットおよびｌ ｍＭ ＡＴＰ中で
１５℃で１４時間連結した。上記のように５ｆａＮＩ切
断の前にプロインンユリン遺伝子断片を脱リン酸化し、
オリゴヌクレオチド（３）のみをリン酸化した結果、反
応は一方向のみに進みプロインシュリン遺伝子断片ＰＩ
Ｒはアニールしたオリゴヌクレオチドと連結した。連結
反応生成物を１５％アガローズゲル上で電気泳動し、そ
の結果生じたプロインシュリン遺伝子相似構成物（ａｎ
ａｌｏｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ） （ＰＩ相似体（２ｎ
ａｌｏｇ） ）をゲルから単離した。
単離したプロインシュリン遺伝子相似体（ａｎａｌｏｇ
）配列（約３ｐモル）をＡＴＰとＴ４ ポリヌクレオチ
ドキナーゼでリン酸化した。上記（ａｌのように調製し
たプラスミドｐＡＴ ／ ＦＩＲ１，０μ９をＥｃｏＲ
ＩとＢａｍＨＩ各４０単位を用いて３７℃で１時間消化
した。約３ｐモルのＰＩＲゾロインシュリン遺伝子配列
をアガロースゲルから単離した。単離したプロインシュ
リン遺伝子配列およびリン酸化したプロインシュリン遺
伝子相似体（ａｎａｌｏｇ）配列を２０単位のＴ、リガ
ーゼと４０単位のＥｃｏＲＩとＩ３ａｍＨＩを含有する
連結反応（１ｉｃｒａｔｉｏｎ）緩衝液３０１１１中で
３７℃で３時間連結した。
）配列（約３ｐモル）をＡＴＰとＴ４ ポリヌクレオチ
ドキナーゼでリン酸化した。上記（ａｌのように調製し
たプラスミドｐＡＴ ／ ＦＩＲ１，０μ９をＥｃｏＲ
ＩとＢａｍＨＩ各４０単位を用いて３７℃で１時間消化
した。約３ｐモルのＰＩＲゾロインシュリン遺伝子配列
をアガロースゲルから単離した。単離したプロインシュ
リン遺伝子配列およびリン酸化したプロインシュリン遺
伝子相似体（ａｎａｌｏｇ）配列を２０単位のＴ、リガ
ーゼと４０単位のＥｃｏＲＩとＩ３ａｍＨＩを含有する
連結反応（１ｉｃｒａｔｉｏｎ）緩衝液３０１１１中で
３７℃で３時間連結した。
連結反応混合物を１％アガローズゲル上で泳動させオー
トラジオグラフィー後２量体（ｄｉｍｅｒ）すなわち２
個−ゾロインシュリン指令配列および３量体（ｔｒｉｍ
ｅｒ）すなわち３個−プロインシュリン指令配列をフェ
ノール抽出によりゲルから単離した。四量体、三量体お
よび六量体すなわち夫々４，５および６個−プロインシ
ュリン指令配列は上記の一般的方法に従って、単離した
断片を更にプロインシュリン遺伝子相似体（ａｎａｌｏ
ｇ）と連結することによって得た。
トラジオグラフィー後２量体（ｄｉｍｅｒ）すなわち２
個−ゾロインシュリン指令配列および３量体（ｔｒｉｍ
ｅｒ）すなわち３個−プロインシュリン指令配列をフェ
ノール抽出によりゲルから単離した。四量体、三量体お
よび六量体すなわち夫々４，５および６個−プロインシ
ュリン指令配列は上記の一般的方法に従って、単離した
断片を更にプロインシュリン遺伝子相似体（ａｎａｌｏ
ｇ）と連結することによって得た。
（Ｃ１複数ＰＩ単位（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＰＩ Ｕｎｉ
ｔｓ ）を保有するｐ’ｒａｃおよびｐｌａｃ ２３９
組換え体の調製２個−プロインシュリン指令配列から６
個−ゾロインシュリン指令配列までを含有する種々ノＰ
１断片構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）を上記（ｂ）に
記したように連結反応（１ｉｃｒａｔｉｏｎ）によって
イクトルｐＬ匹およびｐｌａｃ ２３９に挿入した。ｐ
虱およびｐｌａｃ２３９ベクトルはそれぞれ下記の（ｄ
）および（ｅ）に記した方法に従って調製したｐＴａｃ
／ＰＩおよびｐｌａｃ ２３９ ／ ＰＩをＢｃｏＲＩ
とＢａｍＨＩで消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ） してつ
くった。プロインシュリン三量体を１）１２ｃ２３９ベ
クトル中に、またプロインシュリン遺伝子三量体をｐＴ
ａｃ−’：ツクトル中挿入すると融合および不融合の（
ｆｕｓｅｄ ａｎｄｕｎｆｕｓｅｄ ）複数（ｍｕｌｔ
ｉＤｌｅ）ブロイ７’／−Ｌリン遺伝子プラスミＰ ｐ
ｌａｃ２３９ ／ ３ＰＩおよびｐＴａｃ１５ＰＩがそ
れぞれ得られた。後者の新規なプラスミドの誘導（ｄｅ
ｒｉｖａｔｉｏｎ）と制限箇所！地図を第３図に示す。
ｔｓ ）を保有するｐ’ｒａｃおよびｐｌａｃ ２３９
組換え体の調製２個−プロインシュリン指令配列から６
個−ゾロインシュリン指令配列までを含有する種々ノＰ
１断片構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）を上記（ｂ）に
記したように連結反応（１ｉｃｒａｔｉｏｎ）によって
イクトルｐＬ匹およびｐｌａｃ ２３９に挿入した。ｐ
虱およびｐｌａｃ２３９ベクトルはそれぞれ下記の（ｄ
）および（ｅ）に記した方法に従って調製したｐＴａｃ
／ＰＩおよびｐｌａｃ ２３９ ／ ＰＩをＢｃｏＲＩ
とＢａｍＨＩで消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ） してつ
くった。プロインシュリン三量体を１）１２ｃ２３９ベ
クトル中に、またプロインシュリン遺伝子三量体をｐＴ
ａｃ−’：ツクトル中挿入すると融合および不融合の（
ｆｕｓｅｄ ａｎｄｕｎｆｕｓｅｄ ）複数（ｍｕｌｔ
ｉＤｌｅ）ブロイ７’／−Ｌリン遺伝子プラスミＰ ｐ
ｌａｃ２３９ ／ ３ＰＩおよびｐＴａｃ１５ＰＩがそ
れぞれ得られた。後者の新規なプラスミドの誘導（ｄｅ
ｒｉｖａｔｉｏｎ）と制限箇所！地図を第３図に示す。
同様に、ｐｌａＣ２３９／ ４ＰＩ 、 ｐｌａｃ２３
９ ／ ５ＰＩ 。
９ ／ ５ＰＩ 。
ｐ瑛／３ＰＩ 、 ｐＴａｃ／４ＰＩ 、およびｐＴａ
ｃ ／ ６ＰＩなどの他の複数プロインシュリン遺伝子
プラスミドは種々の多量体プロイン７ユリン遺伝子とｐ
ｌａｃ２３９およびｐＴａｃベクトルから調製した。
ｃ ／ ６ＰＩなどの他の複数プロインシュリン遺伝子
プラスミドは種々の多量体プロイン７ユリン遺伝子とｐ
ｌａｃ２３９およびｐＴａｃベクトルから調製した。
１ないし６コビーのプロインシュリン指令配列を有する
この種々の構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）を制限地図
法およびＤＮＡ配列分析によって確認した。
この種々の構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）を制限地図
法およびＤＮＡ配列分析によって確認した。
（ｄ） ｐｌａｃ ２３９−ＰＩの調製プラスミドｐ
ｌａｃ ２３９−ＰＩの誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）
を第６図に示す。このプラスミドは詳細には第８図に示
すようにシラスミｌ’ ｐｌａｃ ５０４／ｌ’ｌから
調製した。プラスミドｐｌａｃ ５０４ＡＩの生成は更
に詳細に下記（ｆ）に示す。プラスミドｐｌａｃ ５０
４／ＰＩｉｊｌａｃプロモーター、遺伝子のカルゼキシ
端（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ）近くのＦ！ｃ
ｏＲＩ箇所で完結するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｚ
−遺伝子）をもっている。Ｚ−遺伝子はその翻訳がプロ
インシュリンを直接指令しつｙけるように読取り枠に残
るために、このＥｃｏＲＩ箇所でシラスミＹ ｐＢＣＡ
４のヒトプロインシュリン遺伝子挿入物と融合している
。
ｌａｃ ２３９−ＰＩの誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）
を第６図に示す。このプラスミドは詳細には第８図に示
すようにシラスミｌ’ ｐｌａｃ ５０４／ｌ’ｌから
調製した。プラスミドｐｌａｃ ５０４ＡＩの生成は更
に詳細に下記（ｆ）に示す。プラスミドｐｌａｃ ５０
４／ＰＩｉｊｌａｃプロモーター、遺伝子のカルゼキシ
端（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ）近くのＦ！ｃ
ｏＲＩ箇所で完結するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｚ
−遺伝子）をもっている。Ｚ−遺伝子はその翻訳がプロ
インシュリンを直接指令しつｙけるように読取り枠に残
るために、このＥｃｏＲＩ箇所でシラスミＹ ｐＢＣＡ
４のヒトプロインシュリン遺伝子挿入物と融合している
。
次に第８図を参照して説明する。プラスミドｏ１ａｃ
５０４／Ｔ’ＩをＭｓｔＩＩで消化しく ｄｉｃｙｅｓ
ｔ ）生じた付着端をｄＴＴＰおよびｄＧＴＰで満した
。５′−丁端を次にマングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎ
ｇｂｅａｎ ｎｕｏｌｅａｓｅ）で消化して除去し、こ
の断片をＥＣ０ＩＩ、Ｉで切断してＺ遺伝子のＭｓｔＩ
Ｉ ／ Ｅｃ、ｏＲＩ ｉ）Ｊ片（ｓｅｇｍｅｎｔ
）を除き、ＥｃｏＲＩの付着端をｄＡＴＰとｄ Ｔ Ｔ
１）で満し、プラスミドをプラント末端で連結して新
しいＥｃｏＲＩ箇所をつくった。この結果できたシラス
ミＰをｐｌａｃ ２３９／Ｔ’Ｉと称する。
５０４／Ｔ’ＩをＭｓｔＩＩで消化しく ｄｉｃｙｅｓ
ｔ ）生じた付着端をｄＴＴＰおよびｄＧＴＰで満した
。５′−丁端を次にマングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎ
ｇｂｅａｎ ｎｕｏｌｅａｓｅ）で消化して除去し、こ
の断片をＥＣ０ＩＩ、Ｉで切断してＺ遺伝子のＭｓｔＩ
Ｉ ／ Ｅｃ、ｏＲＩ ｉ）Ｊ片（ｓｅｇｍｅｎｔ
）を除き、ＥｃｏＲＩの付着端をｄＡＴＰとｄ Ｔ Ｔ
１）で満し、プラスミドをプラント末端で連結して新
しいＥｃｏＲＩ箇所をつくった。この結果できたシラス
ミＰをｐｌａｃ ２３９／Ｔ’Ｉと称する。
このプラスミドをＥｃｏＲＩを用いて新しい箇所で切断
し、断片のＥｃｏＲＩ尾部（ｔａｉｌ ）をマングビー
ンヌクレアーゼで消化し、出きた断片ｔ−ｊランド末端
で連結して正しいＰＩ 読取υ枠が回復したシラス ）
’ ｐｌａｃ ２３９−門をつくった。他の融合（ｆｕ
ｓｅｄ ）シラスミＰ例えばｐｌａｃ ２３９／３ＰＩ
で正しいＰＩ 読取り枠を回復するためには、Ｆ：ｃｏ
ｌｔＩ尾部を上記と同様な方法で除去して相当する発現
シラスミＰ ｐｌａｃ ２３９−３ＰＩ をつくらな
ければならない。ｐｌａｃ−３ＰＩ の誘導と主な制
限箇所地図は第２図の如くである。
し、断片のＥｃｏＲＩ尾部（ｔａｉｌ ）をマングビー
ンヌクレアーゼで消化し、出きた断片ｔ−ｊランド末端
で連結して正しいＰＩ 読取υ枠が回復したシラス ）
’ ｐｌａｃ ２３９−門をつくった。他の融合（ｆｕ
ｓｅｄ ）シラスミＰ例えばｐｌａｃ ２３９／３ＰＩ
で正しいＰＩ 読取り枠を回復するためには、Ｆ：ｃｏ
ｌｔＩ尾部を上記と同様な方法で除去して相当する発現
シラスミＰ ｐｌａｃ ２３９−３ＰＩ をつくらな
ければならない。ｐｌａｃ−３ＰＩ の誘導と主な制
限箇所地図は第２図の如くである。
（ｅｌ ｐＴａｃ ／ ＰＩの調製
シラスミ）’ ｐＴａｃ／１１）Ｉの調製を第６図に示
すがこのシラスミＰはｐｌａｃ ５０４／ＰＩとシラス
ミ１ｐＤＩＬ ５４０からつくられた。プラスミドｐＤ
Ｒ５４０についてはＧｅｎｅ、Ｖｏｌ、２ｏ、２３ｘ（
１９８２）にＲｕ５ｓｅｌらの記載があるが次の特徴を
もっている：プロモータ上流のＨｉｎｄｍ箇所、 ｔｒ
ｐ上流の〜３５領域（ｒｅｇｉｏｎ） 、 −１０オ被
レータ−、シャインーダルガルノ、シャインーダルガル
ノから開始点までのｌａｃのスペーサー領域（ｓｐａｃ
ｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）および開始点に位置するＢａｍ
ＨＩ箇所。米国ウィスコンシン州ミルウオーキーのＰ−
Ｌノ々イオケミカル（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）から購入したシラスミ）’ ｐＤＲ５４，０をＢａ
ｍＨＩとＨｉｎｄｍで切断し、付着端ヲマングビーンヌ
クレアーゼで除去し、次に先づプラスミドｐｌａｃ／１
’ＩをＨｉｎｃｌｍとＥｃｏＲＩで消化し次に末端をＤ
ＮＡポリメラーゼＩで満すことにより、単離した亜プロ
モーターをプラント末端で連結してシラスミＰ ｐｌａ
ｃ ５０４／ＰＩのＰＩ遺伝子を有する単離したＨｉｎ
ｄｍ −ＥｃｏＲＩ断片中に挿入した。このようにして
プラスミドｐＤＲ５４０の亜プロモーターはｐｌａｃ５
０４／ＰＩ の野性型のｌａｃプロモーター（ラクト
ースプロモータ）およびＺ−遺伝子部分とおきかわり、
これによってハイブリツＰプロモーターの配列、間隔お
よび特質を保持しているが、ＥｃｏＲＩ配列を適当にも
っている。
すがこのシラスミＰはｐｌａｃ ５０４／ＰＩとシラス
ミ１ｐＤＩＬ ５４０からつくられた。プラスミドｐＤ
Ｒ５４０についてはＧｅｎｅ、Ｖｏｌ、２ｏ、２３ｘ（
１９８２）にＲｕ５ｓｅｌらの記載があるが次の特徴を
もっている：プロモータ上流のＨｉｎｄｍ箇所、 ｔｒ
ｐ上流の〜３５領域（ｒｅｇｉｏｎ） 、 −１０オ被
レータ−、シャインーダルガルノ、シャインーダルガル
ノから開始点までのｌａｃのスペーサー領域（ｓｐａｃ
ｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）および開始点に位置するＢａｍ
ＨＩ箇所。米国ウィスコンシン州ミルウオーキーのＰ−
Ｌノ々イオケミカル（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）から購入したシラスミ）’ ｐＤＲ５４，０をＢａ
ｍＨＩとＨｉｎｄｍで切断し、付着端ヲマングビーンヌ
クレアーゼで除去し、次に先づプラスミドｐｌａｃ／１
’ＩをＨｉｎｃｌｍとＥｃｏＲＩで消化し次に末端をＤ
ＮＡポリメラーゼＩで満すことにより、単離した亜プロ
モーターをプラント末端で連結してシラスミＰ ｐｌａ
ｃ ５０４／ＰＩのＰＩ遺伝子を有する単離したＨｉｎ
ｄｍ −ＥｃｏＲＩ断片中に挿入した。このようにして
プラスミドｐＤＲ５４０の亜プロモーターはｐｌａｃ５
０４／ＰＩ の野性型のｌａｃプロモーター（ラクト
ースプロモータ）およびＺ−遺伝子部分とおきかわり、
これによってハイブリツＰプロモーターの配列、間隔お
よび特質を保持しているが、ＥｃｏＲＩ配列を適当にも
っている。
げ） ｐｌａｃ ５０４／ＰＩの調製プラスミドｐｌ
ａｃ ５０４／１’Ｉを第６図に示す工程の手順に従っ
て調製した。このプラスミドの誘導と主な制限箇所を第
７図に示す。
ａｃ ５０４／１’Ｉを第６図に示す工程の手順に従っ
て調製した。このプラスミドの誘導と主な制限箇所を第
７図に示す。
プラスミドｐｌａｃ ５０４／ＰＩをつくる最初の工程
は既知のシラスミ）’ ｐＭｃ１３９６とＭ１３ｍｐ
７からプラスミドｐｌａｃ １．９の生成であった。プ
ラスミドｐＭＣ１３９６はＣａｓ；＋ｄａｂａｎらによ
ってＪ 、ＢａＣｔ 、 、Ｖｏ１１４３．９７１（１
９８０）に記載されており一方ゾシスミＰ Ｍ１３ｍｐ
７はＭｅｓｓｉｎｇらによりＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ａｅｓｅａｒｃｈ、 ＶＯｌ、 ９，３０９ （１９
ｓ １）に述べられている。プラスミドＭ １．３ｍｐ
７は米国モンタナ州ゲイザースノ々−グ（Ｃ）ａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ）のＢＩ’ＬＬ社から購入し、プラス
ミドｐＭ０１３９６は米国マサチュセツツ州ケンブリッ
ジのＭ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ氏より頂いた。
は既知のシラスミ）’ ｐＭｃ１３９６とＭ１３ｍｐ
７からプラスミドｐｌａｃ １．９の生成であった。プ
ラスミドｐＭＣ１３９６はＣａｓ；＋ｄａｂａｎらによ
ってＪ 、ＢａＣｔ 、 、Ｖｏ１１４３．９７１（１
９８０）に記載されており一方ゾシスミＰ Ｍ１３ｍｐ
７はＭｅｓｓｉｎｇらによりＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ａｅｓｅａｒｃｈ、 ＶＯｌ、 ９，３０９ （１９
ｓ １）に述べられている。プラスミドＭ １．３ｍｐ
７は米国モンタナ州ゲイザースノ々−グ（Ｃ）ａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ）のＢＩ’ＬＬ社から購入し、プラス
ミドｐＭ０１３９６は米国マサチュセツツ州ケンブリッ
ジのＭ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ氏より頂いた。
シラスミｒｐＭｃ１３９６はＳｍａｌで消化し、Ｂａｌ
：（１で処理し、 Ｈｉｎｄｍリンカ−と連結してゾラ
スミドｐｌａｃ９をつくった。プラスミドｐＭ１３ｍｐ
７はＡｖａ Ｈで消化してＦｌｉｎｄｍ ＋Ｊンカーに
連結しプラスミドｐｌａｃｌをつくった。プラスミドｐ
ｌａｃ９とｐｌａｃ＋の両者をＨｉ ｎｄｍで消化し連
結してｐｌａｃ １．１）プラスミドをつくった。
：（１で処理し、 Ｈｉｎｄｍリンカ−と連結してゾラ
スミドｐｌａｃ９をつくった。プラスミドｐＭ１３ｍｐ
７はＡｖａ Ｈで消化してＦｌｉｎｄｍ ＋Ｊンカーに
連結しプラスミドｐｌａｃｌをつくった。プラスミドｐ
ｌａｃ９とｐｌａｃ＋の両者をＨｉ ｎｄｍで消化し連
結してｐｌａｃ １．１）プラスミドをつくった。
ヒトプロインシュリンを指令する配列を有するプラスミ
ドｐＢＣＡ４をＥｃｏＲＩとＳａｌ Ｉで消化しＥｃｏ
ｌＬｌ −８ａ ｌ Ｉ断片を単離した。プラスミドｐ
ｌａｃ１９をＥｃｏＲＩとＳａｌ Ｉで消化し生じたベ
クトルをシラスミｌ’ ｐＢＣＡ４のＥＣＯ几Ｉ −Ｓ
ａｌ Ｉ断片と連結してプラスミドｐｌａｃ １９／１
）Ｉ をつくった。
ドｐＢＣＡ４をＥｃｏＲＩとＳａｌ Ｉで消化しＥｃｏ
ｌＬｌ −８ａ ｌ Ｉ断片を単離した。プラスミドｐ
ｌａｃ１９をＥｃｏＲＩとＳａｌ Ｉで消化し生じたベ
クトルをシラスミｌ’ ｐＢＣＡ４のＥＣＯ几Ｉ −Ｓ
ａｌ Ｉ断片と連結してプラスミドｐｌａｃ １９／１
）Ｉ をつくった。
プラスミドｐＢＧ）’１２０はｌａｃプロモーター （
ラクトースゾロモーター）を有しておすＰｏ１ｉｓｋｙ
らによりＰｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、Ｖｏ
ｌ 、 ７３ 、３９００（１９７６）に記述されてい
る。このプラスミドは米国ニューヨーク州イサ力のコー
ネル大才のＲ８Ｗｕ 博士から入手したものであるが
、これをＥｃｏＲＩとｌｌ１ｎｄ■で消化しｌａｃプロ
モーター（２クト−スゾロモーター）をもつ１ｉｉｎｄ
ｍ −ＥＣＯ几Ｉ断片を分離した。ｐｌａｃ １９／
ＰＩシラス＜ ）４をＥｃｏＲｌと出ｎｄｍで消化後、
得られた４クトルをプラスミドｐＢＧＰ１２０のＨｉｎ
ｄ ｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片と連結しシラスミ）’ ｐ
ｌａｃ５０４／ＰＩを得た。
ラクトースゾロモーター）を有しておすＰｏ１ｉｓｋｙ
らによりＰｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、Ｖｏ
ｌ 、 ７３ 、３９００（１９７６）に記述されてい
る。このプラスミドは米国ニューヨーク州イサ力のコー
ネル大才のＲ８Ｗｕ 博士から入手したものであるが
、これをＥｃｏＲＩとｌｌ１ｎｄ■で消化しｌａｃプロ
モーター（２クト−スゾロモーター）をもつ１ｉｉｎｄ
ｍ −ＥＣＯ几Ｉ断片を分離した。ｐｌａｃ １９／
ＰＩシラス＜ ）４をＥｃｏＲｌと出ｎｄｍで消化後、
得られた４クトルをプラスミドｐＢＧＰ１２０のＨｉｎ
ｄ ｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片と連結しシラスミ）’ ｐ
ｌａｃ５０４／ＰＩを得た。
実施例 ２
本実施例では複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ）ゾロインシュ
リン遺伝子をもつ新規なシラスミ）＋１で転換した微生
物の調製とポリプロインシュリンポリペプチドの発現に
ついて説明する。
リン遺伝子をもつ新規なシラスミ）＋１で転換した微生
物の調製とポリプロインシュリンポリペプチドの発現に
ついて説明する。
（ａ） 細胞の形質転換と生長
新規なプラスミドｐｌａｃ２３９−ｎＰＩ （ｎは２な
いし５）とｐＴ３ｙｆ′ｎＰ工（ｍは３ないし６）を用
いてＪＭＩ０３として知られる大腸菌の株を形質転換し
た。この菌株はＭｅｓｓｉｎｇらによりＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、９．３０９ （１９第１）に記
述されているが遺伝子型（ｌａｃ ｐｒ、ｏ ） 、
ｔｈｉ、 ５ｔｒＡ、５ｕＤＥ。
いし５）とｐＴ３ｙｆ′ｎＰ工（ｍは３ないし６）を用
いてＪＭＩ０３として知られる大腸菌の株を形質転換し
た。この菌株はＭｅｓｓｉｎｇらによりＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、、９．３０９ （１９第１）に記
述されているが遺伝子型（ｌａｃ ｐｒ、ｏ ） 、
ｔｈｉ、 ５ｔｒＡ、５ｕＤＥ。
ｅｎｄＡ、 ５ｂｃＢ、 ｈｓｄＲ，Ｆ ｔｒａＤｌ、
ｐｒｏＡ、Ｂ、 １ａｃｌｑ。
ｐｒｏＡ、Ｂ、 １ａｃｌｑ。
ＺＭ１５に特徴がある。この大腸菌株を使用するのけた
ｙ便宜上のためだけで他の大腸菌株および他の微生物も
勿論用いることができる。
ｙ便宜上のためだけで他の大腸菌株および他の微生物も
勿論用いることができる。
形質転換した菌株はアンピシリン５ Ｑ ｔｉ ９ ／
＃／を含有するＹＴ培地で培養した。ＹＴ培地は１１
当りトリジトン８ｇ、酵母抽出物５．９、ＮａＣ１５ｇ
およびＩ Ｎ Ｎａ０Ｈ（ｐＨＩ Ｏないし７２に）１
ｍｌを含有している。プラスミドからビリプロインシュ
リン、ｔ？ ＩＪ 被プチドの発現を誘発するために、
細胞密度が５６０ ｎｍの波長で測定して光学密度０．
１に達したときに最終濃度がｌ ｍＭになるようにイン
ゾロビル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトゾｒ（ＩＰＴＧ）を加
えた。
＃／を含有するＹＴ培地で培養した。ＹＴ培地は１１
当りトリジトン８ｇ、酵母抽出物５．９、ＮａＣ１５ｇ
およびＩ Ｎ Ｎａ０Ｈ（ｐＨＩ Ｏないし７２に）１
ｍｌを含有している。プラスミドからビリプロインシュ
リン、ｔ？ ＩＪ 被プチドの発現を誘発するために、
細胞密度が５６０ ｎｍの波長で測定して光学密度０．
１に達したときに最終濃度がｌ ｍＭになるようにイン
ゾロビル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトゾｒ（ＩＰＴＧ）を加
えた。
（ｂｌ 発現したポリペプチドの回収ＩＰＴＯによる
誘導後、細胞培養を約８ないしＪ２時間続けた。細胞を
遠心分離によシと９出し、リン酸緩衝溶液で洗滌しＬａ
ｅｒｒｍｌｉによってＮａｔｕｒｅ、 ２２７ 、６８
０ （１９７０）に記されているように５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ （硫酸ナトリウムドデシル−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動）によって直接分析するかあるいは更に精製
した。このような再精製は、３ ｍｌの培地から得だ洗
滌した細胞を１．、０１のＴ緩衝液（すなわち、スクロ
ース２５％、 Ｎｏｎ１ｄｅｔ−Ｐ２Ｏ１％、デオキシ
コール〔トリウムα５％およびＢＤＴＡ＆ｒｒＭを含有
するｐＨ７９の５０ｍＭトリスＩ−ｆｃｌ ）中に懸濁
し、０℃で波長１２μｍで２度の６０秒ノζ−ストを行
って細胞を音波処理にかけることによって行った。この
音波処理した物質を４℃で工被ンドルフミクロ遠心機（
Ｂｐｏｐｎｄｏｒｆ ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
）で１０分間遠心分離した。遠心分離したベレットを
試料緩衝液にとかし５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
誘導後、細胞培養を約８ないしＪ２時間続けた。細胞を
遠心分離によシと９出し、リン酸緩衝溶液で洗滌しＬａ
ｅｒｒｍｌｉによってＮａｔｕｒｅ、 ２２７ 、６８
０ （１９７０）に記されているように５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ （硫酸ナトリウムドデシル−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動）によって直接分析するかあるいは更に精製
した。このような再精製は、３ ｍｌの培地から得だ洗
滌した細胞を１．、０１のＴ緩衝液（すなわち、スクロ
ース２５％、 Ｎｏｎ１ｄｅｔ−Ｐ２Ｏ１％、デオキシ
コール〔トリウムα５％およびＢＤＴＡ＆ｒｒＭを含有
するｐＨ７９の５０ｍＭトリスＩ−ｆｃｌ ）中に懸濁
し、０℃で波長１２μｍで２度の６０秒ノζ−ストを行
って細胞を音波処理にかけることによって行った。この
音波処理した物質を４℃で工被ンドルフミクロ遠心機（
Ｂｐｏｐｎｄｏｒｆ ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
）で１０分間遠心分離した。遠心分離したベレットを
試料緩衝液にとかし５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
（Ｃ） 複数ＰＩ遺伝子構成物（Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔ
ｓ）からの発現の分析 不融合配置で複数的に発現した（ ｍｕｌｔｉｐｌｙ−
ｅｘｐｒ６ｓｓｅｄ ）プロインシュリンポリ被ゾチＰ
の電気泳動分析を第９図に示す。上記のように部分的に
精製したタン・ξり質を１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分析した。１列から５列まではシラスミ ト° ｐコ
−？２竿 ／ＰＩ、ｐコニ塁７ｃ２ＰＩ 、 ｐＴ
ａコ；／３ＰＩ 、Ｔ）’！二塁３＝／什工およびｐ
座１５ＰＩを宿したＪＭｌ、０３細胞の原培養基５００
ｆｆ／に相当する生成物を表わし、一方Ｍ列はタン・ク
ク質分子量標＠ （ｍａｒｋｅｒ）を有している。
ｓ）からの発現の分析 不融合配置で複数的に発現した（ ｍｕｌｔｉｐｌｙ−
ｅｘｐｒ６ｓｓｅｄ ）プロインシュリンポリ被ゾチＰ
の電気泳動分析を第９図に示す。上記のように部分的に
精製したタン・ξり質を１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分析した。１列から５列まではシラスミ ト° ｐコ
−？２竿 ／ＰＩ、ｐコニ塁７ｃ２ＰＩ 、 ｐＴ
ａコ；／３ＰＩ 、Ｔ）’！二塁３＝／什工およびｐ
座１５ＰＩを宿したＪＭｌ、０３細胞の原培養基５００
ｆｆ／に相当する生成物を表わし、一方Ｍ列はタン・ク
ク質分子量標＠ （ｍａｒｋｅｒ）を有している。
融合配置中で複数的に発現した（ ｍｕｌｔｉｐｌｙ−
ｅｘｏｒｅｓｓｅｄ ）プロインシュリンボリベゾチド
の電気泳動分析を第１０図に示す。Ａ、Ｂおよび０列は
プラスミドｐｌａｃ２３９−ＰＩ 、 ｐｌａｃ ２３
９−２ＰＩおよびｐｌａｃ２３９−３ＰＩを宿したＪＭ
１０３Ｍ胞の原培養基１５０μｌに相当する全細胞タン
・ξり質を表わし一方り、ＥおよびＦ列はＡ、Ｂおよび
０列と同じ生成物であるが上記のように生成物が部分的
に精製されている点が異っている。Ｍ列はタンノξり質
分子量標識（ｍａｒｋｅｒ）を有している。
ｅｘｏｒｅｓｓｅｄ ）プロインシュリンボリベゾチド
の電気泳動分析を第１０図に示す。Ａ、Ｂおよび０列は
プラスミドｐｌａｃ２３９−ＰＩ 、 ｐｌａｃ ２３
９−２ＰＩおよびｐｌａｃ２３９−３ＰＩを宿したＪＭ
１０３Ｍ胞の原培養基１５０μｌに相当する全細胞タン
・ξり質を表わし一方り、ＥおよびＦ列はＡ、Ｂおよび
０列と同じ生成物であるが上記のように生成物が部分的
に精製されている点が異っている。Ｍ列はタンノξり質
分子量標識（ｍａｒｋｅｒ）を有している。
微生物の細胞当り１″−得られる生成物の量は定食的に
は測定しなかったが、定性的には既存技術でハイブリッ
ドポリベゾチト°を発現する場合に通常得られることが
わかっている量と比較すると、複数遺伝子断片（ｍｕｌ
ｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の方がはる
かに多いと観察された。
は測定しなかったが、定性的には既存技術でハイブリッ
ドポリベゾチト°を発現する場合に通常得られることが
わかっている量と比較すると、複数遺伝子断片（ｍｕｌ
ｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の方がはる
かに多いと観察された。
実施例 ３
本実施例はボリベゾチｒフラクンヨンノ分離精製とこの
フラクションからのインシュリンの生成を説明する。
フラクションからのインシュリンの生成を説明する。
（ａ） ゾロインシュリンの回収
約７ｇの細胞を１ｏｔ＋ｌ／Ｅｌの割合でＴ緩衝液中に
懸濁し波長１８μｍで２度９０秒・ぐ−ストを用いて０
℃で音波処理した。１２，０００ｇで１０分間遠心分離
後、ベレットをｐＨ８４で２５ｍＭトリス１−１ｃ１．
２ＭＮａＣ１，４Ｍ尿素の液中に細胞ｇ当り５ ｍｌの
割合で懸濁させ、再び音波処理をして１２，０００ｇで
再び遠心分離した。ポリゾロイン７ユリンを溶解するた
めに、Ｋし・ットをＯＤ Ｆ Ｔ緩衝液（７Ｍ塩化グア
ニジウム（塩酸グアニジ７ ）、１００ｍＭギ酸ナトリ
ウム、 ｐＨ３，０）中に細胞ｇ当り５ ｖＩｌを用い
て再び懸濁させゆっくり１時間攪拌した。ＧＤＦＴ緩衝
液中に含まれるポリゾロインシュリンを６倍容量の水冷
水中に稀釈して沈澱させ、５，０００９で低速遠心分離
を行って回収した。得られたベレットは５ＤＳ−ＩＡＣ
）Ｂで測定してほとんど純粋カプロインンユリンポリ被
ゾチドポリマーを含有していた（第１１図、Ｂ列参照）
。
懸濁し波長１８μｍで２度９０秒・ぐ−ストを用いて０
℃で音波処理した。１２，０００ｇで１０分間遠心分離
後、ベレットをｐＨ８４で２５ｍＭトリス１−１ｃ１．
２ＭＮａＣ１，４Ｍ尿素の液中に細胞ｇ当り５ ｍｌの
割合で懸濁させ、再び音波処理をして１２，０００ｇで
再び遠心分離した。ポリゾロイン７ユリンを溶解するた
めに、Ｋし・ットをＯＤ Ｆ Ｔ緩衝液（７Ｍ塩化グア
ニジウム（塩酸グアニジ７ ）、１００ｍＭギ酸ナトリ
ウム、 ｐＨ３，０）中に細胞ｇ当り５ ｖＩｌを用い
て再び懸濁させゆっくり１時間攪拌した。ＧＤＦＴ緩衝
液中に含まれるポリゾロインシュリンを６倍容量の水冷
水中に稀釈して沈澱させ、５，０００９で低速遠心分離
を行って回収した。得られたベレットは５ＤＳ−ＩＡＣ
）Ｂで測定してほとんど純粋カプロインンユリンポリ被
ゾチドポリマーを含有していた（第１１図、Ｂ列参照）
。
精製したゾロイン／ニリンポリマーを７０％ギ酸中に細
胞相当物２Ｉ当り１０ｍ／を用いて溶解し、室温で３５
時間タン・？り質ダ当り５０■の臭化７アンを用いて消
化し、生成物を５ＤＳ−Ｐ Ａ Ｇ Ｅで分析した。第
１１図のＡ列は５個−直列プロイン／ニリンポリ被プチ
ドの切断生成物を示す。Ｍ列はタンパク質分子量標識（
ｍａｒｋｅｒ）を有している。ＡおよびＢ列の５ＤＳ−
ＰＡＧＥゲルのウェスターンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ）はこのヒトゾロイン／ニリンの大きさの物
質がブタの抗−プロインンユリン血清と反応することを
示している。
胞相当物２Ｉ当り１０ｍ／を用いて溶解し、室温で３５
時間タン・？り質ダ当り５０■の臭化７アンを用いて消
化し、生成物を５ＤＳ−Ｐ Ａ Ｇ Ｅで分析した。第
１１図のＡ列は５個−直列プロイン／ニリンポリ被プチ
ドの切断生成物を示す。Ｍ列はタンパク質分子量標識（
ｍａｒｋｅｒ）を有している。ＡおよびＢ列の５ＤＳ−
ＰＡＧＥゲルのウェスターンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ）はこのヒトゾロイン／ニリンの大きさの物
質がブタの抗−プロインンユリン血清と反応することを
示している。
（ｂ） インシュリンの製造
回収した臭化ンアン消化生成物（Ｃｙａｎｏｇｅｎｂｒ
ｏｍｉｄｅ ｄｉｇｅｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔ）をｘＯｗ
／＋＋＋／の割合で６Ｍ塩塩酸グアノノンよび０．２
Ｍエタノールアミンを含有するＧＥ緩衝液ｒｐＨ９）に
溶しＮａ、、ＳＯ３とＮａ２Ｓ４０４を夫々０．４ Ｍ
とα８Ｍの濃度になるまで加え室温で２時間反応を起さ
せて亜硫酸分解した。亜硫酸分解した生成物を１．０ｍ
Ｍ關酸アンモニウム（ｐＩ（４５）に対して透析して沈
澱させた。この沈澱物を２５％ホルムアミドと５０ｍＭ
トリス−ＨＣＩ （ｐＨａ＋、）を含有するＴＦ緩衝液
中に４ ｍｙ ／ ｖｒｌの割合で溶解し、溶液をＩ）
ＥＡＥセルロースコラム上にコラム２．５ Ｘ １０／
ｇ当す２００ダの割合で負荷させた。ＮａＣｌの濃度を
０から５００ｍＭに直線的に変化させて生成物を塩化ナ
トリウムで微分的に溶離した。
ｏｍｉｄｅ ｄｉｇｅｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔ）をｘＯｗ
／＋＋＋／の割合で６Ｍ塩塩酸グアノノンよび０．２
Ｍエタノールアミンを含有するＧＥ緩衝液ｒｐＨ９）に
溶しＮａ、、ＳＯ３とＮａ２Ｓ４０４を夫々０．４ Ｍ
とα８Ｍの濃度になるまで加え室温で２時間反応を起さ
せて亜硫酸分解した。亜硫酸分解した生成物を１．０ｍ
Ｍ關酸アンモニウム（ｐＩ（４５）に対して透析して沈
澱させた。この沈澱物を２５％ホルムアミドと５０ｍＭ
トリス−ＨＣＩ （ｐＨａ＋、）を含有するＴＦ緩衝液
中に４ ｍｙ ／ ｖｒｌの割合で溶解し、溶液をＩ）
ＥＡＥセルロースコラム上にコラム２．５ Ｘ １０／
ｇ当す２００ダの割合で負荷させた。ＮａＣｌの濃度を
０から５００ｍＭに直線的に変化させて生成物を塩化ナ
トリウムで微分的に溶離した。
亜硫酸分解した生合成ヒトプロインシュリン（＋１１１
１）Ｉ−８ＳＯ３）は塩傾斜溶離プロフィル（ｓ：Ａｌ
ｔｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｒ＋ ｐｒｏｆｉｌ
ｅ）のＨＰ Ｌ Ｃ−分析によって容易に固定できた。
１）Ｉ−８ＳＯ３）は塩傾斜溶離プロフィル（ｓ：Ａｌ
ｔｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｒ＋ ｐｒｏｆｉｌ
ｅ）のＨＰ Ｌ Ｃ−分析によって容易に固定できた。
旧（Ｐ ｌ−８ＳＯ３をあつめてｐ ｉｆ ４．５で透
析してホルムアミＰを除き生成物を沈澱させた。純粋な
りＨＰＩ−８ＳＯ３沈澱物を０、 ！’ｉ ＴＲ９／
ＩＡｌの割合でグリノン５０ｍＭとＥＤＴＡ＆ｍＭを含
有するＲ Ｈ緩衝液（ＤＩ−１１−０，５）に溶解しｌ
−２℃に冷却した。エタンチオールを８００μｍｉで加
え、２４時間反応させて分子のりフォールディング（ｒ
ｅｆｏｌｄｉｎｇ ）を行わせた。１−ＩＣＩでｐＩ−
（を７に調節して反応を停止させ１反応生成物を分析し
た。リフオールドした生合成ヒトゾロイン／ニリン（Ｂ
ＨＰＩ）は反応生成物の七ツマー成分を構成していた。
析してホルムアミＰを除き生成物を沈澱させた。純粋な
りＨＰＩ−８ＳＯ３沈澱物を０、 ！’ｉ ＴＲ９／
ＩＡｌの割合でグリノン５０ｍＭとＥＤＴＡ＆ｍＭを含
有するＲ Ｈ緩衝液（ＤＩ−１１−０，５）に溶解しｌ
−２℃に冷却した。エタンチオールを８００μｍｉで加
え、２４時間反応させて分子のりフォールディング（ｒ
ｅｆｏｌｄｉｎｇ ）を行わせた。１−ＩＣＩでｐＩ−
（を７に調節して反応を停止させ１反応生成物を分析し
た。リフオールドした生合成ヒトゾロイン／ニリン（Ｂ
ＨＰＩ）は反応生成物の七ツマー成分を構成していた。
ＢＨＰＩを１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７６）と
１０ｍＭ ０２Ｃ１２を含有するＴｏ緩衝液に２ ＃
／ ａｔの割合でとかし、１０μ９ ／ ｙｇｌのトリ
プシンと４０μ９ ／ ｍｌのカルポキンベゾチダーゼ
Ｂを加え、混合物を３０分室温で反応させた。罷酸を１
％まで加えて反応を停止させ、生合成ヒトインシュリン
（旧１１）を沈澱させて回収した。回収収貴は使用した
旧ＩＰＩＯ量を基準にして理論値の９８％であった。
１０ｍＭ ０２Ｃ１２を含有するＴｏ緩衝液に２ ＃
／ ａｔの割合でとかし、１０μ９ ／ ｙｇｌのトリ
プシンと４０μ９ ／ ｍｌのカルポキンベゾチダーゼ
Ｂを加え、混合物を３０分室温で反応させた。罷酸を１
％まで加えて反応を停止させ、生合成ヒトインシュリン
（旧１１）を沈澱させて回収した。回収収貴は使用した
旧ＩＰＩＯ量を基準にして理論値の９８％であった。
ＢＨＩ ｆ′ｉＬＩ Ｐ Ｌ Ｃ分析、アミノ酸組成、
アミノ酸配列および生物学的活性から判断して正真正銘
のものであると考えられる。従って、直列に結合した単
位（ｔａｎｄｅｍｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ｕｎｉｔｓ ）
の形でのヒトプロインツユリンは形質転換した細胞から
安定して発現し、ヒトインツユリンはこの発現生成物か
ら容易につくることができる。
アミノ酸配列および生物学的活性から判断して正真正銘
のものであると考えられる。従って、直列に結合した単
位（ｔａｎｄｅｍｌｙ−１ｉｎｋｅｄ ｕｎｉｔｓ ）
の形でのヒトプロインツユリンは形質転換した細胞から
安定して発現し、ヒトインツユリンはこの発現生成物か
ら容易につくることができる。
本明細書の総括として、本発明は各々所望のポリ０ゾチ
ド生成物を指令し、容易に切断可能なアミノ酸群（ｇｒ
ｎｕｐｉｒｏｚｓ ）を指令するオリゴヌクレオチドに
よって直列に結合した複数のオリゴヌクレオチド配列を
有するＤＮＡ断片をつくり、この断片を組換え体プラス
ミドに組込み、このプラスミドで微生物を形質転換する
ことよりなる、生物からポリベゾチドを発現させる新規
な方法を提供する。本発明の範囲内で変型は可能である
。
ド生成物を指令し、容易に切断可能なアミノ酸群（ｇｒ
ｎｕｐｉｒｏｚｓ ）を指令するオリゴヌクレオチドに
よって直列に結合した複数のオリゴヌクレオチド配列を
有するＤＮＡ断片をつくり、この断片を組換え体プラス
ミドに組込み、このプラスミドで微生物を形質転換する
ことよりなる、生物からポリベゾチドを発現させる新規
な方法を提供する。本発明の範囲内で変型は可能である
。
第１図は本発明に従って、組換え体プラスミド°の生成
を図示するものである。 第２図はプラスミドｐｌａＣ２３９−３ＰＩの誘導（ｄ
ｅｒｉｖａｔｉｏｎ）および制限箇所地図である。 第３図はプラスミドｐヒ５ＰＩの誘導および制限箇所地
図である。 第４図はプラスミドｐＡＴ／ＩＦ Ｉ Ｒをつくる工程
の手順を示す。 第５図はシラスミ）’ ｐＡＴ／ＦＩＲの誘導と制限箇
所地図である。 第【１図はプラスミドｐｌａｃ５０４／ＰＩをつくる工
程ノ″Ｊｌ−順トコノソラスミドからｐ ｌ ａ Ｃ２
３９／Ｐ Ｉとｐ’ｒａｃ／Ｉ″Ｉの生成を示す。 第７図はプラスミドｐ ｌ ａＣ５０４／Ｐ Ｉの誘導
と制限箇１５１地図である。 第８図はシラスミ）′ｐｌａｃ５ｏ４Ａ■からｐｌａｃ
２３９−１゛１の生成を示す。 第４１ 、 Ｉ Ｏおよび１１図は本発明に基いてつく
られた種々生成物について行った電気泳動実験の写真で
ある。
を図示するものである。 第２図はプラスミドｐｌａＣ２３９−３ＰＩの誘導（ｄ
ｅｒｉｖａｔｉｏｎ）および制限箇所地図である。 第３図はプラスミドｐヒ５ＰＩの誘導および制限箇所地
図である。 第４図はプラスミドｐＡＴ／ＩＦ Ｉ Ｒをつくる工程
の手順を示す。 第５図はシラスミ）’ ｐＡＴ／ＦＩＲの誘導と制限箇
所地図である。 第【１図はプラスミドｐｌａｃ５０４／ＰＩをつくる工
程ノ″Ｊｌ−順トコノソラスミドからｐ ｌ ａ Ｃ２
３９／Ｐ Ｉとｐ’ｒａｃ／Ｉ″Ｉの生成を示す。 第７図はプラスミドｐ ｌ ａＣ５０４／Ｐ Ｉの誘導
と制限箇１５１地図である。 第８図はシラスミ）′ｐｌａｃ５ｏ４Ａ■からｐｌａｃ
２３９−１゛１の生成を示す。 第４１ 、 Ｉ Ｏおよび１１図は本発明に基いてつく
られた種々生成物について行った電気泳動実験の写真で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、容易に切断可能なアミノ酸配列を指令するオリゴヌ
クレオチドによつて直列に結合し既知のアミノ酸配列の
所望の生成物の繰返し単位よりなるポリペプチドを指令
するオリゴヌクレオチド配列を有し、ＤＮＡ断片の両端
の間に停止および開始のシグナルのコドンを有しないＤ
ＮＡ断片。 ２、微生物中で該断片を発現する能力のある複製可能な
クローニング運び手の中にある特許請求の範囲第１項記
載の断片。 ３、所望の生成物がヒトプロインシュリンであることを
特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記載の断
片。 ４、各々がヒトプロインシュリンを指令し容易に切断可
能なアミノ酸配列を指令するオリゴヌクレオチドで直列
に結合している２ないし６個の繰返し単位を特徴とする
特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記
載の断片。 ５、ＤＮＡ断片が容易に切断可能なアミノ酸配列を指令
するオリゴヌクレオチドで直列に結合した既知のアミノ
酸配列の所望の生成物を指令する繰返し単位よりなるこ
とを特徴とする、プラスミドベクトルとそれに連結した
発現可能なＤＮＡ断片よりなる組換え体プラスミド。 ６、所望の生成物がヒトプロインシュリンで、ＤＮＡ断
片がβ−ガラクトシダーゼの始めの約８０個のアミノ酸
をコード化するラクトースオペロン断片の３′側に接続
し、断片がヒトプロインシュリンを指令する２ないし５
個の直列に結合したオリゴヌクレオチド配列を有するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のプラスミド
。 ７、所望の生成物がヒトプロインシュリンで、ＤＮＡ断
片がＴａｃプロモーターとそれにつゞく細菌のシャイン
−ダルガルノ配列を有するクローニングベクトルの断片
に直接結合し、断片がヒトプロインシュリンを指令する
３ないし６個の直列に結合したオリゴヌクレオチド配列
を有することを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
プラスミド。 ８、該ＤＮＡ断片の発現のために特許請求の範囲第５項
ないし第７項のいずれか１項に記載のプラスミドによつ
て形質転換される微生物。 ９、（ａ）ベクトルを所定の制限箇所で切断し、（ｂ）
容易に切断可能なアミノ酸配列を指令するオリゴヌクレ
オチドの配列によつて分離されたポリペプチドの遺伝子
の複数のコピーを有する切断したベクトルへの挿入物を
つくり、（ｃ）この挿入物を切断したベクトルに連結し
て挿入物を保有する組換え体プラスミドをつくり、 （ｄ）組換え体プラスミドで微生物を形質転換し、 （ｅ）該微生物を培地中で培養して前記のポリペプチド
を指令する配列の複数のコピーを有するＤＮＡ断片を発
現させ、 （ｆ）微生物からポリペプチドの複数の結合したコピー
よりなるポリマーを構成する部分を分離し、 （ｇ）分離した複数コピーポリペプチドを単一のポリペ
プチドに切断する ことを特徴とする微生物によつてポリペプチドを製造す
る方法。 １０、ポリペプチドがヒトプロインシュリンであること
を特徴とする特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、ヒトプロインシュリンをヒトインシュリンに変換
することを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の方
法。 １２、工程（ｆ）には培地から分離した微生物の細胞の
音波処理が含まれることを特徴とする特許請求の範囲第
９項ないし第１１項のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA453270 | 1984-05-01 | ||
| CA000453270A CA1213537A (en) | 1984-05-01 | 1984-05-01 | Polypeptide expression method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6131090A true JPS6131090A (ja) | 1986-02-13 |
Family
ID=4127766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9240685A Pending JPS6131090A (ja) | 1984-05-01 | 1985-05-01 | 新規なポリペプチドの発現方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0163406B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6131090A (ja) |
| CA (1) | CA1213537A (ja) |
| DE (1) | DE3581231D1 (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2862870B2 (ja) * | 1986-09-12 | 1999-03-03 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ペプチド |
| US5695952A (en) * | 1986-09-12 | 1997-12-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing Leu13 !motilin |
| US5420113A (en) * | 1986-09-12 | 1995-05-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same |
| US5420242A (en) * | 1986-10-22 | 1995-05-30 | Kaare M. Gautvik | Production of human parathyroid hormone from microorganisms |
| EP1114865B1 (en) | 1986-10-22 | 2004-01-21 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Production of human parathyroid hormone |
| US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
| US5705478A (en) * | 1989-02-21 | 1998-01-06 | Washington University | Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists |
| US5218093A (en) * | 1989-03-01 | 1993-06-08 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | EGF variants and pharmaceutical use thereof |
| FR2650598B1 (fr) * | 1989-08-03 | 1994-06-03 | Rhone Poulenc Sante | Derives de l'albumine a fonction therapeutique |
| US5595887A (en) * | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
| US5202239A (en) * | 1990-08-07 | 1993-04-13 | Scios Nova Inc. | Expression of recombinant polypeptides with improved purification |
| JPH07108232B2 (ja) * | 1990-10-09 | 1995-11-22 | エム・ディ・リサーチ株式会社 | ペプチド又は蛋白質の製造方法 |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| BR9506313A (pt) * | 1994-08-12 | 1997-08-05 | Univ Washington | Formas de cadeia simples do quarteto de hormônio de glicoproteína |
| AU4415796A (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-26 | Bionebraska, Inc. | Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| SE9702401D0 (sv) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | Astra Ab | Pharmaceutical use |
| GB9716790D0 (en) | 1997-08-07 | 1997-10-15 | Creative Peptides Sweden Ab | Recombinant DNA molecules comprising multimeric copies of a gene sequence and expression thereof |
| US6103501A (en) * | 1997-11-17 | 2000-08-15 | Washington University | Single chain glycoprotein hormones comprising two β and one α subunits and recombinant production thereof |
| US6635256B1 (en) | 1998-10-19 | 2003-10-21 | Washington University | Glycoprotein hormone compositions comprising two β subunits and methods of use thereof |
| WO2000017336A1 (en) * | 1998-09-19 | 2000-03-30 | Sang Jun Lee | Dna cassette encoding a multimer of a biologically active peptide and a cleavable linker attached thereto and process for preparing the biologically active peptide |
| US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1276756A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-06-09 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
| US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| ES2545090T3 (es) | 2001-12-21 | 2015-09-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina y GCSF |
Citations (3)
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| JPS56140897A (en) * | 1980-03-14 | 1981-11-04 | Cetus Corp | Production of aspurtem |
| JPS579795A (en) * | 1980-01-30 | 1982-01-19 | Searle & Co | Recombinant dna technics |
Family Cites Families (4)
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| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| CA1202581A (en) * | 1980-03-27 | 1986-04-01 | Saran A. Narang | Adaptor molecules for dna and their application to synthesis of gene-derived products |
| EP0154576A1 (en) * | 1984-02-06 | 1985-09-11 | INTERFERON SCIENCES, INC a Delaware Corporation | Hybrid nucleic acid sequences having tandemly arranged genes |
-
1984
- 1984-05-01 CA CA000453270A patent/CA1213537A/en not_active Expired
-
1985
- 1985-04-18 DE DE8585302744T patent/DE3581231D1/de not_active Revoked
- 1985-04-18 EP EP85302744A patent/EP0163406B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-01 JP JP9240685A patent/JPS6131090A/ja active Pending
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JPS54163600A (en) * | 1977-11-08 | 1979-12-26 | Genentech Inc | Microbiological polypeptide expression method and means |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1213537A (en) | 1986-11-04 |
| EP0163406B1 (en) | 1991-01-09 |
| DE3581231D1 (de) | 1991-02-14 |
| EP0163406A1 (en) | 1985-12-04 |
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