JPS6125491A - N-carbamoyl-d-naphthylglycine and its preparation - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce the titled compound which is a precursor of D-naphthylyglycine useful as a synthetic intermediate, by biochemically hydrolyzing 5-naphthylhydantoin utilizing the intracellular enzyme of a specific microorganism. CONSTITUTION:A microbial strain capable of hydrolyzing the hydantoin ring of 5-naphthylhydantoin (the compound of formula I ) to produce N-carbamoyl-D- naphthylglycine (the compound of formula II) (e.g. Aerobacter cloacae) is used in the present process. The cultured product, cells or treated cells of the above microorganism are added to an aqueous dispersion of 5-naphthyl-hydantoin, and subjected to the enzymatic reaction at about 7-10pH and about 20-70 deg.C under stirring to obtain the objective N-carbamoyl-D-naphthyglycine. The 5-naphthylhydantoin used as a raw material may be D-, L- or DL-isomer.

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、半合成β−ラクタム抗生物質などの医薬の合
成中間体として有用なり一ナフチルグリシンの前駆物質
となる新規化合物Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリ
ジンに関する。さらに詳しくは本発明は、（１）一般式
（１） ％式％ 〔式中、α炭素はＲ配置を示す〕 で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシン
。Detailed Description of the Invention (Field of Industrial Application) The present invention is directed to a novel compound N-carbamoyl-D which is useful as a synthetic intermediate for pharmaceuticals such as semi-synthetic β-lactam antibiotics and is a precursor of naphthylglycine. - Concerning naphthylglydine. More specifically, the present invention relates to (1) N-carbamoyl-D-naphthylglycine represented by the general formula (1) %Formula% [In the formula, the α carbon shows the R configuration].

ＮＨＯＯＮＨ２ で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナフＮＨＯ
ＯＮＨ２ れるＮ−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフチル）クリシン
が該当する。及び、（２）一般式で表わされる５−ナフ
チルヒダントインを、微生物の菌体内酵素を利用して生
化学的に加水分解することによりＮ−カルバモイル−Ｄ
−ナフチルグリジンを製造する方法に関する。N-carbamoyl-D-(1-naphNHO
A case in point is N-carbamoyl-D-(2-naphthyl)chrysine, which is represented by ONH2. and (2) N-carbamoyl-D by biochemically hydrolyzing 5-naphthylhydantoin represented by the general formula using intracellular enzymes of microorganisms.
- A method for producing naphthylglycine.

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、先に６−フェニルヒダントインまたは５
−（置換フェニル）ヒダントイン類に微生物酵素を作用
させてＮ−カルバモイル−Ｄ−フェニルグリシンまたは
その置換誘導体を製造する方法を特願昭５１−１１５７
５号、特願昭５１−１４５７４８号および特願昭５２−
４８７１７号として出願し、天然アミノ酸類またはそれ
らの置換誘導体に対応する５−置換ヒダントイン類から
同様にしてＮ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸類を製
造する方法を特願昭５１−１５７７１８号として出願し
た。また５−チェニルヒダントインに、１１物酵素を作
用させてＮ−カルバモイル−Ｄ−チェニルグリシンを製
造する方法を特願昭５８−８００６２号として出願した
。本発明は前記技術の発展の一つとして５−ナフチルヒ
ダントインへの適用を確認したものである。(Problems to be Solved by the Invention) The present inventors have previously discovered 6-phenylhydantoin or 5-phenylhydantoin.
- Patent application No. 1157/1989 for a method for producing N-carbamoyl-D-phenylglycine or its substituted derivatives by reacting microbial enzymes with (substituted phenyl)hydantoins.
No. 5, Japanese Patent Application No. 145748/1983 and Japanese Patent Application No. 1987-
No. 48717, and a similar method for producing N-carbamoyl-D-α-amino acids from 5-substituted hydantoins corresponding to natural amino acids or their substituted derivatives was filed as Japanese Patent Application No. 157718-1983. did. In addition, he filed a patent application No. 80062/1983 for a method for producing N-carbamoyl-D-chenylglycine by reacting 5-chenylhydantoin with an 11-enzyme. The present invention confirms its application to 5-naphthylhydantoin as one of the developments of the above technology.

本発明の目的化合物Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグ
リシンは、医薬などの合成中間体とじて有用なり一ナフ
チルグリシン合成の前駆物質であり、文献未記載の新規
な化合物である。The target compound of the present invention, N-carbamoyl-D-naphthylglycine, is useful as a synthetic intermediate for pharmaceuticals and the like, and is a precursor for the synthesis of naphthylglycine, and is a novel compound that has not been described in any literature.

（問題点を解決するための手段及び作用効果）本発明の
要点は次式で表わされる。(Means and effects for solving the problems) The gist of the present invention is expressed by the following formula.

（ＤＬ、ＤまたはＬ体）　　　　　　　　（Ｄ体〕上記
のように、本発明は５−ナフチルヒダントインに、ヒダ
ントイン環を立体特異的に加水分解してＮ−カルバモイ
ル−Ｄ−ナフチルグリシンを生成させる能力を有する微
生物の培養物、菌体または菌体処理物をｐＨ７〜１０の
水性媒体中で作用させることを特徴とする新規化合物Ｎ
−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシン及びその製造法
に関するものである。(DL, D or L form) (D form) As described above, the present invention provides 5-naphthylhydantoin with the ability to stereospecifically hydrolyze the hydantoin ring to produce N-carbamoyl-D-naphthylglycine. A novel compound N characterized in that a culture, bacterial cells, or treated bacterial cells of a microorganism having the following properties are allowed to act in an aqueous medium with a pH of 7 to 10.
-Carbamoyl-D-naphthylglycine and its production method.

この場合、基質の５−ナフチルヒダントインが５−（１
−ナフチル）ヒダントイン、５−（２−ナフチル）ヒダ
ントインのいずれの場合にでも本発明を適用することが
でき、それぞれＮ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナフチル
）グリシン、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフチル）
クリシンを生成する。In this case, the substrate 5-naphthylhydantoin is 5-(1
The present invention can be applied to both N-carbamoyl-D-(1-naphthyl)hydantoin and 5-(2-naphthyl)hydantoin, and N-carbamoyl-D-(1-naphthyl)glycine and N-carbamoyl-D-(2-naphthyl)hydantoin, respectively. −naphthyl)
Produces chrysin.

本発明の方法を利用することにより、安価な微生物酵素
源を用いてＤＬ−５−ナフチルヒダントインノ全員をほ
ぼ定量的にＤ体のＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリ
シンに変換させることも可能である。Ｎ−カルバモイル
−Ｄ−ナフチルグリ２、 シンは、例えば亜硝酸との反応によって高収率でＤ−ナ
フチルグリシンに変換されるので、本発明はＤ−ナフチ
ルグリシンの工業的製法として極めて有利な手段を提供
するものである。以下に本発明の詳細な説明する。By utilizing the method of the present invention, it is also possible to almost quantitatively convert all DL-5-naphthylhydantoin into D-form N-carbamoyl-D-naphthylglycine using an inexpensive microbial enzyme source. . Since N-carbamoyl-D-naphthylglycine 2,sine can be converted into D-naphthylglycine in high yield by reaction with nitrous acid, the present invention provides an extremely advantageous means for industrially producing D-naphthylglycine. This is what we provide. The present invention will be explained in detail below.

本発明で原料として用いられる５−ナフチルヒダントイ
ンは、通常は、化学合成で得られるＤＬ体を使用するの
が適当である。ＤＬ−５−ナフチルヒダントインは、公
知のヒダントイン合成法倒名Ｂｕｏｈｅｒｅｒ−Ｂｅｒ
ｇ法）を利用して、例えば１、または２−ナフトアルデ
ヒドに青酸ソーダと重炭酸アンモニウムを反応させるこ
とによってそれぞれ、５−（１−ナフチル）ヒダントイ
ンまたは５−（２−ナフチル゛）ヒダントインを合成す
ることができる。As for 5-naphthylhydantoin used as a raw material in the present invention, it is usually appropriate to use the DL form obtained by chemical synthesis. DL-5-naphthylhydantoin can be synthesized using a known hydantoin synthesis method (Buoherer-Ber).
For example, 5-(1-naphthyl)hydantoin or 5-(2-naphthyl)hydantoin is synthesized by reacting 1- or 2-naphthaldehyde with sodium cyanide and ammonium bicarbonate, respectively, using method g). can do.

本発明で使用される微生物は、５−ナフチルヒダントイ
ンのヒダントイン環を立体特異的に加水分解してＮ−カ
ルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシンを生成させる能力を
有するもので、自然界に存在する野生株、公的な微生物
保存機関に保存されている菌株、あるいはそれらから人
工的に変異誘導した微生物などから、前記能力の有無を
調べることによって選択されるものである。The microorganism used in the present invention has the ability to stereospecifically hydrolyze the hydantoin ring of 5-naphthylhydantoin to produce N-carbamoyl-D-naphthylglycine. The microorganisms are selected by examining the presence or absence of the above-mentioned ability from microorganisms preserved in microorganism preservation institutions, or from microorganisms artificially mutated therefrom.

この能力の検定方法としては、例えば次のような方法が
用いられる。先づ微生物の培養物２ｗｌを遠心分離して
菌体を集め、それを２ｚｔの０．９％食塩水で洗浄後再
び遠心分離して菌体を集菌する。For example, the following method is used to test this ability. First, 2 wl of microbial culture is centrifuged to collect bacterial cells, which are washed with 2zt of 0.9% saline and then centrifuged again to collect bacterial cells.

この分離した菌体（湿重量４０〜２００１ｑ）を濃度０
．５％のＤＬ−５−（２−ナフチル）ヒダントイン懸濁
液２ｘｔに加えてｐＨ７〜１０、温度８０〜４０℃に保
って１０〜４０ｖｊ間反応させる。反応後、適宜希釈し
ｐ−ジメチルシミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液を加
えて発色させ、その液を遠心分離して菌体等の不溶物を
除き、次いで上澄液の吸光度を４８０ｎｍで測定して反
応液中のＮ−カルバモイル−（２−ナフチル）グリシン
生成量を求める。This isolated bacterial body (wet weight 40-2001q) was reduced to a concentration of 0.
．． Add to 2xt 5% DL-5-(2-naphthyl)hydantoin suspension, maintain pH 7-10, temperature 80-40°C, and react for 10-40vj. After the reaction, dilute it appropriately and add a concentrated hydrochloric acid solution of p-dimethylciminobenzaldehyde to develop a color, centrifuge the solution to remove insoluble matter such as bacterial cells, and then measure the absorbance of the supernatant at 480 nm. The amount of N-carbamoyl-(2-naphthyl)glycine produced in the reaction solution is determined.

このようにして比較的高い変換率を示した菌株について
は、実験規模を大キくシて再度５−（２−ナフチル）ヒ
ダントインの加水分解反応を行ない、生成したＮ−カル
バモイル−（２−ナフチル）グリシンを単離して、それ
がＤ体であると認められた菌株を本発明に使用する微生
物として採用する。このようにして得られた微生物は５
−（１−ナフチル）ヒダントインに対しても同様に作用
しＮ−カルバモイル−（１−ナフチル）グリシンを生成
する。For the strains that showed a relatively high conversion rate in this way, we conducted the hydrolysis reaction of 5-(2-naphthyl)hydantoin again on a larger scale, and the resulting N-carbamoyl-(2-naphthyl) ) A bacterial strain in which glycine is isolated and is found to be in the D form is employed as a microorganism for use in the present invention. The microorganisms obtained in this way were 5
It acts similarly on -(1-naphthyl)hydantoin to produce N-carbamoyl-(1-naphthyl)glycine.

本発明で使用する微生物は、＃ＩＩ菌、放線菌、かび、
酵母および不完全菌の中から上記の検定に合格するもの
が選ばれるが、本発明者らの研究によれば分類学的にみ
ても極めて広範囲の種馬の中に見出すことができる。そ
れら菌株の具体的な例示は、既に特開昭５１−１１５７
５号、特願昭５１−１４５７４８号、特願昭５１−１５
７７１８号、特願昭５２−４８７１７号および特願昭５
８−８００６２号の明細書中に記載されているが、５−
ナフチルヒダントインに対して特に高活性を示す微生物
で細菌に属するものとしては、アエロバクタ−属、アグ
ロバクテリウム精、バチルス属、プレビバクテリウム属
、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュ
ードモナス属など；放線菌に属するものとしては、アク
チノミセス属、ミコバクテリウム属、ノカルディア属、
ストレプトミセス属などの中に見出されている。The microorganisms used in the present invention include #II bacteria, actinomycetes, molds,
Those that pass the above test are selected from among yeast and Deuteromycota, but according to the research of the present inventors, they can be found in an extremely wide range of stallions from a taxonomic perspective. Specific examples of these strains have already been published in JP-A-51-1157.
No. 5, Patent Application No. 145748/1984, Patent Application No. 1973/1984
No. 7718, Japanese Patent Application No. 52-48717 and Japanese Patent Application No. 1977
Although it is described in the specification of No. 8-80062, 5-
Microorganisms that exhibit particularly high activity against naphthylhydantoin and belong to bacteria include Aerobacter genus, Agrobacterium genus, Bacillus genus, Previbacterium genus, Corynebacterium genus, Microbacterium genus, Pseudomonas genus, etc.; Actinomycetes include the genus Actinomyces, the genus Mycobacterium, the genus Nocardia,
It is found in the genus Streptomyces.

本発明の方法は、微生物の菌体またはその処理物の形態
で菌体内酵素の作用を利用するものであるが、この酵素
は天然栄養源を含有する通常の培地で微生物を培養する
ことによって菌体内Ｃζ生成蓄積させることができる。The method of the present invention utilizes the action of intracellular enzymes in the form of microbial cells or their processed products, and this enzyme is produced by culturing microorganisms in a normal medium containing natural nutrients. It is possible to generate and accumulate Cζ in the body.

培養は通常液体培地で行なわれるが、固体表面培養によ
っても行なうことができる。培地には通常、資化し得る
炭素源、窒素源および各微生物の生育に必要な無機塩な
らびに栄養素とを含有させるが、更に各種のピリミジン
系核酸塩基類またはそれらの誘導体、或いは各種のヒダ
ントイン類を０．０５〜０．８％添加して所望の酵素を
適応的に増強させることが望ましい。Cultivation is usually carried out in a liquid medium, but it can also be carried out by solid surface culture. The culture medium usually contains assimilable carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and nutrients necessary for the growth of each microorganism, but it also contains various pyrimidine nucleobases or derivatives thereof, or various hydantoins. It is desirable to add 0.05 to 0.8% to adaptively enhance the desired enzyme.

酵素誘導効果の高いピリミジン系核酸塩基類としては、
ウラシル、シトシンおよびチミンがあり、それらの誘導
体としてはジヒドロウラシル、ジヒドロチミンなどがあ
る。またヒダントイン類の中ではヒダントイン、ＤＬ−
５−メチルヒダントインなどが比較的好ましい。しかし
多くの微生物に共通して、実用的に最も好ましい酵素−
，導基質はウラシルである。培養条件は、使用する微生
物の至適生育条件に応じて温度２０〜６５℃、ｐＨ４〜
１１の範囲が用いられる。培養中には通気攪拌を行なっ
て微生物の生育を促進させることもできる。Pyrimidine-based nucleobases with high enzyme-inducing effects include:
There are uracil, cytosine and thymine, and their derivatives include dihydrouracil and dihydrothymine. Also, among the hydantoins, hydantoin, DL-
5-methylhydantoin and the like are relatively preferred. However, common to many microorganisms, the most practically preferred enzyme is
, the guiding substrate is uracil. The culture conditions are temperature 20-65℃, pH 4-4 depending on the optimal growth conditions of the microorganism used.
A range of 11 is used. During cultivation, aeration and stirring may be performed to promote the growth of microorganisms.

５−ナフチルヒダントインの加水分解反応には、前記の
ようにして培養した微生物を培養物、菌体または菌体処
理物の形態で使用する。通常微生物の培養液をそのまま
反応に使用することができるが、培養液中の成分が障害
になる場合や酵素量を多く用いたい場合には、培養液か
ら分離した菌体を使用すればよい。菌体は生菌体のまま
で使用目的を達するが、貯蔵あるいは取扱いの便宜から
凍結乾燥菌体として用いることもできる。また菌体その
ものでなく、菌体破砕物や菌体抽出物のような菌体処理
物の状態で使用することも可能である。For the hydrolysis reaction of 5-naphthylhydantoin, the microorganisms cultured as described above are used in the form of a culture, bacterial cells, or treated bacterial cells. Normally, the culture solution of microorganisms can be used as is for the reaction, but if components in the culture solution are a hindrance or if a large amount of enzyme is desired to be used, microbial cells isolated from the culture solution may be used. Although the purpose of use of the bacterial cells is achieved as they are, they can also be used as freeze-dried cells for convenience in storage and handling. In addition, it is also possible to use the microbial cells in the form of processed microbial products such as crushed microbial cells and microbial cell extracts, instead of the microbial cells themselves.

更に上記の菌体または菌体処理物を公知の方法で固定化
したものも使用することができる。Furthermore, it is also possible to use the above-mentioned bacterial cells or treated bacterial cells immobilized by a known method.

５−ナフチルヒダントインに微生物の培養物、菌体また
は菌体処理物を作用させるには、通常水性媒体中で両者
を混合する方法が用いられる。６−ナフチルヒダントイ
ンの反応液中での濃度については特に制限はないが、１
〜８０％細度の高濃度では基質は完全には溶解しない。In order to cause a microbial culture, bacterial cells, or treated bacterial cells to act on 5-naphthylhydantoin, a method of mixing the two in an aqueous medium is usually used. There is no particular restriction on the concentration of 6-naphthylhydantoin in the reaction solution, but 1
At high concentrations of ~80% fineness, the substrate is not completely dissolved.

しかし反応の進行に伴って６−ナフチルヒダントインが
逐次溶解していくので何ら支障にはならない。However, as the reaction progresses, 6-naphthylhydantoin gradually dissolves, so this does not pose any problem.

本発明において用いられる微生物酵素の真の基質はＤ体
であり、Ｄ体の６−ナフチルヒダントインのみが選択的
に加水分解されて、カルバモイル体に変換される。一般
に、５−置換ヒダントインは、容易にラセミ化しやすい
性質を有することが知られているが、本酵素反応条件の
ような穏和な条件においても、基質である６−ナフチル
ヒダントインは、実際、酵素反応中宮にラセミ化状態に
あり、酵素反応の進行に伴ってＤ体が消費されても、加
水分解されないＬ体の迅速なラセミ化により反応系には
常にＤ体が補給される。このようにラーＩＦＥ化反応が
酵素反応と併行して進むということから、Ｌ体も間接的
な基質とみなすことができる。従って原料の６−ナフチ
ルヒダントインは、ＤＬ体、Ｄ体、Ｌ体のいずれであっ
ても、実際的な効果には殆んど差がないことになる。一
方、生成物であるＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリ
シンは全くラセミ化されることはない。これらの結果と
して、酵素反応の基質として、Ｄ’Ｌ体、Ｄ体またはＬ
体のいずれを用いても生成物としては、常にＤ体のＮ−
カルバモイル−ナフチルグリシンを、対掌体基質を残す
ことなく、はぼ定量的な収率で得ることも可能である。The true substrate of the microbial enzyme used in the present invention is the D-form, and only the D-form 6-naphthylhydantoin is selectively hydrolyzed and converted to the carbamoyl form. Generally, 5-substituted hydantoin is known to have the property of being easily racemized, but even under mild conditions such as the present enzyme reaction conditions, the substrate 6-naphthylhydantoin actually Even if the D isomer is in a racemized state in the middle court and is consumed as the enzymatic reaction progresses, the D isomer is constantly replenished into the reaction system due to the rapid racemization of the L isomer that is not hydrolyzed. Since the L-IFE reaction proceeds in parallel with the enzymatic reaction, the L-form can also be regarded as an indirect substrate. Therefore, there is almost no difference in practical effects whether the raw material 6-naphthylhydantoin is in the DL, D, or L form. On the other hand, the product N-carbamoyl-D-naphthylglycine is not racemized at all. As a result, D'L form, D form or L form can be used as substrates for enzymatic reactions.
No matter which type of body is used, the product is always D-type N-
It is also possible to obtain carbamoyl-naphthylglycine in almost quantitative yield without leaving any enantiomeric substrate.

水性媒体中で５−ナフチルヒダントインの立体特異的加
水分解反応を行なう際に、実用上好ましいｐＨの範囲は
７〜１０であり、特に好ましいのは８〜９である。活性
の高い微生物を使用して、このような条件で反応を行な
えば非常に高収率で目的物を得る仁とができる。。ｐＨ
７未満では反応速度は極めて小さく、ｐＨ１０を超える
と好ましくない副反応を生じるので、いずれも実用性に
は乏しい。ｐＨ７〜ｌＯが好ましい理由としては、本発
明で利用される微生物酵素の至適ｐＨが８〜９付近にあ
ること、ｐＨが増すにつれて基質の溶解度が増すこと、
ならびにヒダントイン環のラセミ化反応がアルカリ性に
おいて効果的に促進されることなどによって結果的に５
−ナフチルヒダントインからＮ−カルバモイル−Ｄ−ナ
フチルグリシンへの変換速度が増大することにある。反
応の進行に伴って媒体のｐＨが低下するので、反応中、
継続的に中和剤を添加して至適ｐＨに保持することが望
ましい。中和剤としては、アンモニア、苛性ソーダ、苛
性カリ、炭酸ソーダなどが適当である。その他、目的に
応じて水性媒体に有機溶媒や界面活性剤を添加して反応
を行なわせることもできる。反応温度は、使用する微生
物の酵素に適した温度が採用されるが、通常２０〜７０
℃の範囲内にある。When carrying out the stereospecific hydrolysis reaction of 5-naphthylhydantoin in an aqueous medium, a practically preferred pH range is 7-10, particularly preferably 8-9. If a highly active microorganism is used and the reaction is carried out under such conditions, the desired product can be obtained in a very high yield. . pH
If the pH is less than 7, the reaction rate is extremely low, and if the pH exceeds 10, undesirable side reactions occur, so both are poor in practical use. The reason why pH 7 to 1O is preferable is that the optimum pH of the microbial enzyme used in the present invention is around 8 to 9, and that the solubility of the substrate increases as the pH increases.
In addition, the racemization reaction of the hydantoin ring is effectively promoted in alkaline conditions, resulting in 5
- The conversion rate of naphthylhydantoin to N-carbamoyl-D-naphthylglycine is increased. During the reaction, the pH of the medium decreases as the reaction progresses.
It is desirable to continuously add a neutralizing agent to maintain the optimum pH. Suitable neutralizing agents include ammonia, caustic soda, caustic potash, and soda carbonate. In addition, depending on the purpose, an organic solvent or a surfactant may be added to the aqueous medium to carry out the reaction. The reaction temperature is a temperature suitable for the enzyme of the microorganism used, but it is usually 20-70°C.
within the range of ℃.

加水分解によって生成したＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフ
チルグリシンは、沈殿法あるいは陰イオン交換樹脂を利
用するなど、通常の方法により単離することができるが
、単離をしないでそのまま鉱酸酸性下、亜硝酸と反応さ
せることにより容易にＤ−ナフチルグリシンに変換され
る。N-carbamoyl-D-naphthylglycine produced by hydrolysis can be isolated by conventional methods such as precipitation or using an anion exchange resin, but it can be isolated without isolation under mineral acid. It is easily converted to D-naphthylglycine by reacting with nitrous acid.

Ｄ−ナフチルグリシンは半合成β−ラクタム抗生物質等
、医薬の製造中間体として重要な化合物であるが、本発
明による新規な方法により得られる新規な化合物Ｎ−カ
ルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシンを用いることにより
、その製造を工業的に有利に°行なうことができるので
ある。D-naphthylglycine is an important compound as an intermediate in the production of pharmaceuticals such as semi-synthetic β-lactam antibiotics, but the novel compound N-carbamoyl-D-naphthylglycine obtained by the novel method of the present invention can be used. This makes it possible to manufacture it industrially advantageously.

（実施例） 以下実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの例のみに限定されるものではない。(Examples) The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

実施例１ 下記組成からなる栄養液体培地を調製し、綿栓をした大
型試験管に１０゛胃ｌずつ分注して１２０℃で１６分間
蒸気殺菌を行なった。Example 1 A nutrient liquid medium having the following composition was prepared and dispensed into large test tubes with cotton plugs in 10 ml portions and steam sterilized at 120° C. for 16 minutes.

培地組成： 肉エキス　　　　　０．６％（重量％）酵母エキス　　
　　０．６％ ポリペプトン　　　１．０％ Ｎａ１ｌ　　　　　　　Ｏ，１５％ ウラシル　　　　　０．１％ ｐ　Ｈ，７，，０ ・予め、ブイヨン寒天スラントで８０°Ｃ１２４時間培
養した表−１に示す微生物を上記栄養液体培地に一白金
耳接種して８８°Ｃで２４時間振とう下に培養を行なっ
た。これらの培養液の４ｍｌを用い、遠心分離して得た
生菌体を更に同量の０．９％食塩水で洗浄したのち、再
び遠心分離して集菌し、下記の反応液成分として使用し
た。Medium composition: Meat extract 0.6% (wt%) Yeast extract
0.6% Polypeptone 1.0% Na1l O, 15% Uracil 0.1% pH, 7,0 ・The microorganisms shown in Table 1, which had been previously cultured in a bouillon agar slant at 80°C for 124 hours, were placed in the above nutrient liquid medium. One platinum loopful was inoculated into the cells and cultured at 88°C for 24 hours with shaking. Using 4 ml of these culture solutions, centrifuge the viable cells, wash them with the same amount of 0.9% saline, centrifuge again to collect the bacteria, and use as the reaction solution component below. did.

反応液組成： （１）　　Ｄ　Ｌ　−５−（２−ナフチル）ヒダントイ
ンを０．０５Ｍ　　ＮａＨＯＯａ−Ｎａ２００ｇ緩衝液
に加え、ｐＨ８，７に調製した濃度８．８５ｍＭ　（０
，２％（Ｗ／Ｖ））の基質懸濁液・・・・・・・・・４
．０　ｍｌ。Reaction solution composition: (1) D L -5-(2-naphthyl)hydantoin was added to 200 g of 0.05 M NaHOOa-Na buffer solution, and the concentration was adjusted to pH 8.7.
, 2% (W/V)) substrate suspension...4
．． 0 ml.

（２）前記、４０耐培養液より遠心分離、洗浄した生菌
体。(2) Live bacterial cells centrifuged and washed from the 40-resistant culture solution.

上記（１）と（２）を混合し、よく菌体を懸濁した反応
液を夫々共栓付小型試験管に入れ、緩く振とうしなから
８７°Ｃで４８時間反応させた。尚、対照と５倍に希釈
した後、希釈液４．　Ｏｐａｌに対し２０％トリクロル
酢酸２．Ｏｚｌ、　１０％ｐ−ジメチルアミノベンズア
ルデヒドの１２Ｎ塩酸溶液１．０　ｍｌを加えて混合し
た。この黄色に発色した液を遠心分離して不溶物を除き
４８０ｎｍの吸光度を測定してＮ−カルバモイル−（２
−ナフチル）グリシンを比色定量した。その結果、反応
液中に生成したＮ−カルバモイル−（２−ナフチル）グ
リシンの量とＤＬ−５−（２−ナフチル）ヒダントイン
からの変換率は、各微生物について夫々表−１に示す通
表−１ ＊培養、反応共に６０℃にて実施 実施例２ 下記の組成からなる液体栄養培地を調製し、綿栓付大型
試験管に１Ｏｙｇｌずつ分注して１２０°Ｃで２０分間
蒸気殺菌を行なった。The above (1) and (2) were mixed, and the reaction solution in which the bacterial cells were well suspended was placed in a small test tube with a stopper and allowed to react at 87°C for 48 hours while shaking gently. In addition, after diluting 5 times with the control, diluted solution 4. 20% trichloroacetic acid for Opal2. Ozl and 1.0 ml of a 12N hydrochloric acid solution of 10% p-dimethylaminobenzaldehyde were added and mixed. This yellow colored liquid was centrifuged to remove insoluble materials, and the absorbance at 480 nm was measured.
-naphthyl)glycine was determined colorimetrically. As a result, the amount of N-carbamoyl-(2-naphthyl)glycine produced in the reaction solution and the conversion rate from DL-5-(2-naphthyl)hydantoin were determined for each microorganism as shown in Table 1. 1 * Both culture and reaction were carried out at 60°C Example 2 A liquid nutrient medium having the following composition was prepared, and 1 Oygl was dispensed into large test tubes with cotton stoppers and steam sterilized at 120°C for 20 minutes. .

培地組成ニ ゲルコース　　　　　　　２．０％（重量％）ソイビー
ン・ミール　　　１．０％ 酵母エキス　　　　　　　０．２５％ （ＮＨ４）２８０４　　　　　　０．１０％Ｃａ０ＯＢ
　　　　　　　　　　ｏ、　５％に２ＨＰＯ４０，４％ ヒダントイン ｐＨ７，０ 予め、ベネット寒天スラントで２８℃、７２時間培養し
た表−２に示す微生物を上記栄養液体培地ｌζ接種して
２８℃で４４時間振とう下に培養を行なった。この培養
液４０ｍ１から菌体を遠心分離し、以下実施例Ｉと同様
の処理を行なって洗浄生菌体を得た。そして、この生菌
体を用いて実施例１と同様の反応液組成で、８７℃で４
８時時間中かな振とり下に反応を行なった。反応後も実
施例１と同様に分析を行ない、反応液中に生成したＮ−
カルバモイル−（２−ナフチル）グリシン承を定量した
。その結果と、ＤＬ−５−（２−ナフチル）ヒダントイ
ンからの変換率は、各微生物について夫々表−２に示す
通りであった。Medium composition Nigelcose 2.0% (wt%) Soy bean meal 1.0% Yeast extract 0.25% (NH4) 2804 0.10% CaOB
o, 5% 2HPO40.4% hydantoin pH 7.0 The microorganisms shown in Table 2, which had been previously cultured on a Bennett agar slant at 28°C for 72 hours, were inoculated into the above nutrient liquid medium lζ and incubated at 28°C for 44 hours with shaking. Culture was performed. The bacterial cells were centrifuged from 40 ml of this culture solution, and the same treatment as in Example I was performed to obtain washed viable bacterial cells. Then, using this viable cell, a reaction solution composition similar to that of Example 1 was used, and the reaction solution was incubated at 87°C.
The reaction was carried out under shaking for 8 o'clock. After the reaction, analysis was performed in the same manner as in Example 1, and the N- generated in the reaction solution was analyzed.
Carbamoyl-(2-naphthyl)glycine was quantified. The results and the conversion rate from DL-5-(2-naphthyl)hydantoin were as shown in Table 2 for each microorganism.

表−２ 実施例８ 下記組成からなる栄養液体培地を調製し２０００ｍ１容
肩付振とうフラスコに２５０ｇ＋／ずつ分注し、１２０
°Ｃで２０分間蒸気殺菌を行なった。Table 2 Example 8 A nutrient liquid medium having the following composition was prepared and dispensed into 2000 ml shoulder shaker flasks at 250 g/min.
Steam sterilization was performed at °C for 20 minutes.

培地組成： 肉エキス　　　　　０．６％（重量％）ボッペプトン　
　　１．０％ 酵母エキス　　　　０．５％ Ｎａ（Ｍ　　　　　　　Ｏ，８％ ウラシル　　　　　００１％ ＭｎＯ１２・４　Ｈ２Ｏ２０ｐｐｍ ｐＨ７，０ これに同一組成寒天培地で８８°Ｃにて２４時間培養し
た表−８に示す微生物を上記栄養液体培地に接種して８
８℃にて２４時間振とう下に培養を行なった。この培養
液から菌体を遠心分離し、以下実施例１と同様に処理を
行なって洗浄生菌体を得た。この生菌体をＤＬ−５−（
２−ナフチル）ヒダントイン１ｆ／ｄｌを含む０．０５
　Ｍ　　ＮａＨＯＯｌ−Ｎａ２００Ｂ緩衝液（ｐＨ８，
７）　５０ｘｌに全量添加し、８８℃に２０時時間中か
な振とう下に保持、反応させた。反応後、反応液を遠心
分離し、そのＪＪを得て、生成したＮ−カルバモイル−
（２−ナフチル）グリシン量を高速液体クロマトグラフ
ィーにより分離定量した（カラム；日本分光Ｆｉｎｅｐ
ａｋ　８ＩＬ　０１Ｂ、　４．６　Ｘ　２５０ｇ１１．
８６　ｍＭＫＨ２ＰＯ４を含む０．０２Ｍ−Ｈ８ＰＯ４
（ｐＨ２，５）：ＭｅＯＨ＝’ｌ：８、検出２１０　ｆ
ｇＷＩ　）。Medium composition: Meat extract 0.6% (wt%) boppeptone
1.0% yeast extract 0.5% Na (MO, 8% uracil 001% MnO 12.4 H2O 20 ppm pH 7,0) To this were added the microorganisms shown in Table 8 that were cultured on an agar medium with the same composition at 88°C for 24 hours. Inoculate the above nutrient liquid medium and
Culture was performed at 8°C for 24 hours with shaking. The bacterial cells were centrifuged from this culture solution and treated in the same manner as in Example 1 to obtain washed viable bacterial cells. This viable bacterial cell was DL-5-(
0.05 containing 1f/dl of 2-naphthyl)hydantoin
M NaHOOl-Na200B buffer (pH 8,
7) The entire amount was added to 50xl and kept at 88°C for 20 hours with constant shaking for reaction. After the reaction, the reaction solution was centrifuged to obtain the JJ, and the generated N-carbamoyl-
The amount of (2-naphthyl)glycine was separated and quantified by high performance liquid chromatography (column: JASCO Finep
ak 8IL 01B, 4.6 X 250g11.
0.02M-H8PO4 containing 86 mM KH2PO4
(pH2,5):MeOH='l:8, detection 210 f
gWI).

更に、この上清のｐＨを濃塩酸で１．６〜２に調製する
とＮ−カルバモイル２（２−ナフチル）グリシンが沈殿
して析出した。仁の沈殿を炉底し、更にエタノールで再
結晶して得られたＮ−カルバモイル−（２−ナフチル）
グリシンの比旋光度を測定した。以上の結果を各使用微
生物ごとに表−８に示す。比旋光度の測定結果からＮ−
カルバモイル−（２−ナフチル）グリシンはすべてＤ体
であることが確認された。Furthermore, when the pH of this supernatant was adjusted to 1.6 to 2 with concentrated hydrochloric acid, N-carbamoyl 2(2-naphthyl)glycine was precipitated. N-carbamoyl-(2-naphthyl) obtained by boiling the precipitate of keratin and recrystallizing it from ethanol.
The specific rotation of glycine was measured. The above results are shown in Table 8 for each microorganism used. From the measurement results of specific optical rotation, N-
It was confirmed that all carbamoyl-(2-naphthyl)glycines were in the D form.

表−８ ＊＊培養、反応共に６０°Ｃにて実施 実施例４ 実施例８と同様の組成からなる栄養液体培地を調製し、
５００ｇ１容肩付振とうフラスコに１００ｍ１ずつ分注
し１２０°Ｃにて２０分間蒸気殺菌を行なった。これに
綿栓をした大型試験管にて、同一組成培地１０ゴで８８
℃で２４時間培養したバシルス・スピーシーズ（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　）　Ｋ　Ｎ　Ｋ１０８　
（ＦＩＩＲＭ　Ｐ−６０５６）を２．０　ｍ振温し、８
８°Ｃで２４時間振とう培養を行なった。この培養液１
００耐を２００胃／容四ツロ丸底フラスコに入れ、窒素
通気下、攪拌しながらＤＬ−５−（２−ナフチル）ヒダ
ントイン１．Ｏｆを加え、８７℃で２０時間反応させた
。反応中１．　ＯＮ　−ＮａＯＨ溶液を用いて反応系の
ｐＨを８．７に継続的に調節した。反応後、液のｐＨを
７．０に調整して遠心分離を行ない、未反応基質や菌体
等の不溶物を除去した。こうして得られた上澄液の一部
をとり実施例８と同様に高速液体クロマトグラフィーで
分析した結果、生成Ｎ−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフ
チル）グリシン量は０．９５ｆであり、変換率は８８．
０モル％であった。Table 8 **Culture and reaction both carried out at 60°C Example 4 A nutrient liquid medium having the same composition as in Example 8 was prepared.
The mixture was dispensed in 100 ml portions into 500 g 1-capacity shoulder shake flasks and steam sterilized at 120°C for 20 minutes. In a large test tube with a cotton stopper, 10 g of the same composition medium was added to 88 g.
Bacillus sp.
illus 5pecies) KN K108
(FIIRM P-6056) was shaken for 2.0 m, and
Shaking culture was performed at 8°C for 24 hours. This culture solution 1
00 resistance was placed in a 200 stomach/capacity four-bottle round bottom flask, and DL-5-(2-naphthyl)hydantoin 1. Of was added, and the mixture was reacted at 87°C for 20 hours. During the reaction 1. The pH of the reaction system was continuously adjusted to 8.7 using ON-NaOH solution. After the reaction, the pH of the solution was adjusted to 7.0 and centrifugation was performed to remove insoluble matter such as unreacted substrates and bacterial cells. A portion of the supernatant thus obtained was analyzed by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 8. As a result, the amount of N-carbamoyl-D-(2-naphthyl)glycine produced was 0.95f, and the conversion rate was is 88.
It was 0 mol%.

更に上澄液のｐＨを濃塩酸で１．６〜２に調整するとＮ
−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフチル）グリシンが沈殿
をして析出した。この沈殿を炉底し、更にエタノールで
再結晶して無色針状結晶ｏ、６９ｆを得た。以上のよう
にして得たＮ−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフチル）グ
リシンの比旋光度、融点、ＩＲｌＮＭＲの結果を以下−
こ示す。Furthermore, when the pH of the supernatant liquid was adjusted to 1.6 to 2 with concentrated hydrochloric acid, N
-Carbamoyl-D-(2-naphthyl)glycine was precipitated. This precipitate was drained to the bottom of the furnace and further recrystallized from ethanol to obtain colorless needle crystals o, 69f. The specific rotation, melting point, and IRlNMR results of N-carbamoyl-D-(2-naphthyl)glycine obtained as above are shown below.
This is shown.

（”）：　＝−１４６，２（０＝、１　、０．１Ｎ　Ｎ
ＨＮＨ４０Ｈ）　　　２０５〜２０７℃　（ｄｅａｏｍ
ｐ、　）ＩＲ（ｔＮ−’）ｉ　８４６０，８８００．１
９０５，１６８５゜１６８５．１５６０．１Ｂ１０，１
２８０．１１８０゜１００７．８０９，７５５．４７８
　　（ＫＢｒ）ＮＭＲＤｙａｓＯ−ｄ６　（６９９ｍ）
　；　５．２０　（ＩＨ，ａ、　ＯＨ）。(''): =-146,2(0=,1,0.1N N
HNH40H) 205-207℃ (deaom
p, )IR(tN-')i 8460,8800.1
905,1685°1685.1560.1B10,1
280.1180°1007.809,755.478
(KBr)NMRDyasO-d6 (699m)
; 5.20 (IH, a, OH).

５．６６（２Ｈ，８，ＮＨ２）、６．８８（ＩＨ，ａ。5.66 (2H, 8, NH2), 6.88 (IH, a.

ＮＨ）、７．４〜７．９（７Ｈ，ｍ、ナフタレン環）実
施例５ 実施例４と同様に培養したバシルス・スピーシーズＩＮ
Ｋ−１０８（ＦＢＲＭ　　Ｐ−６０５６）　　の培養液
１００ｇ／を２００ｗ１容四ツ目丸底フラスコに入れ窒
素通気下、攪拌しなからＤＬ−５−（１−ナフチル）ヒ
ダントインｉ、ｏｆＩを加え、３７°Ｃ２０時間反応さ
せた。反応中１．　ＯＮ−ＮａＯＨ溶液を用いて反応系
のｐＨを８．７に継続的に調節した。NH), 7.4 to 7.9 (7H, m, naphthalene ring) Example 5 Bacillus sp. IN cultured in the same manner as in Example 4
K-108 (FBRM P-6056) culture solution (100g) was placed in a 200w 1 volume four-eye round bottom flask, stirred under nitrogen aeration, and then DL-5-(1-naphthyl)hydantoin I, ofI was added. The reaction was carried out at °C for 20 hours. During the reaction 1. The pH of the reaction system was continuously adjusted to 8.7 using ON-NaOH solution.

反応後、液のｐＨを７．０に調整して遠心分離を行ない
、未反応基質や菌体等の不溶物を除去した。After the reaction, the pH of the solution was adjusted to 7.0 and centrifugation was performed to remove insoluble matter such as unreacted substrates and bacterial cells.

こうして得られた上澄液の一部をとり実施例８゜４と同
様に高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、生成
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−（１−ｔ）チル）グリシン量は
０．８’ｌｆであり、変換率は８０．６モル％であった
。A portion of the supernatant thus obtained was analyzed by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 8.4. As a result, the amount of N-carbamoyl-D-(1-t)thyl)glycine produced was 0.8' lf, and the conversion rate was 80.6 mol%.

更をこ上澄液のｐＨを濃塩酸で１．５〜２に調製すると
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナフチル）グリシンが沈
殿をして析出した。この沈殿を胛取し、更にエタノール
で再結して白色粉末結晶０．６１Ｆを得た。When the pH of the supernatant was further adjusted to 1.5-2 with concentrated hydrochloric acid, N-carbamoyl-D-(1-naphthyl)glycine was precipitated. This precipitate was collected and further recrystallized with ethanol to obtain white powder crystals of 0.61F.

以上のようにして得たＮ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナ
フチル）グリシンの比旋光度、融点、エル、ＮＭＲの結
果を以下に示す。− 〔α〕甘せ−１６１．７　　（０＝１．０．１Ｎ　ＮＨ
ＮＨ４０Ｈ）　　２１４〜２１７℃　ｌｅｃｏｍｐ、　
）ＩＲ（α−’）［４６０，８８００，１９２０，１６
８０゜１６Ｂ０，１５６０．１４０８．１８１０．１２
７９゜１１８０．１１５０．１００８．８００．７７５
（ＫＢｒ）ＮＭＲＤｘｓｏ４ｇ（δＰｐＭ）　＋　５．
６７（２Ｈ，ｓ、　ＮＨｇ）。The results of specific rotation, melting point, L, and NMR of N-carbamoyl-D-(1-naphthyl)glycine obtained as above are shown below. - [α] Amase -161.7 (0=1.0.1N NH
NH40H) 214-217℃ lecomp,
)IR(α-')[460,8800,1920,16
80°16B0,1560.1408.1810.12
79°1180.1150.1008.800.775
(KBr)NMRDxso4g(δPpM) +5.
67 (2H, s, NHg).

５．９８（ＩＨ，ｃｌ、　ＯＨ）、　６．８８（ＩＨ，
ｄ、ＮＨ）。5.98 (IH, cl, OH), 6.88 (IH,
d, NH).

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフチルグリシン
。(1) Formula (I) ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼N-carbamoyl-D-naphthylglycine represented by (I). （２）式（ I ）の化合物が、式▲数式、化学式、表等
があります▼で表 わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−（１−ナフチル）グリ
シンである特許請求の範囲第１項記載の化合物。(2) The compound according to claim 1, wherein the compound of formula (I) is N-carbamoyl-D-(1-naphthyl)glycine represented by the formula ▲, which includes mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. （３）式（ I ）の化合物が、式▲数式、化学式、表等
があります▼で 表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−（２−ナフチル）グ
リシンである特許請求の範囲第１項記載の化合物。(3) The compound according to claim 1, wherein the compound of formula (I) is N-carbamoyl-D-(2-naphthyl)glycine represented by the formula ▲ where there are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼. （４）５−ナフチルヒダントインに、ヒダントイン環を
立体特異的に加水分解してＮ−カルバモイル−Ｄ−ナフ
チルグリシンを生成させる能力を有する微生物の培養物
、菌体または菌体処理物をｐＨ７〜１０の水性媒体中で
作用させることを特徴とするＮ−カルバモイル−Ｄ−ナ
フチルグリシンの製造法。(4) To 5-naphthylhydantoin, add a culture, bacterial cells, or bacterial cell-treated product of a microorganism that has the ability to stereospecifically hydrolyze the hydantoin ring to produce N-carbamoyl-D-naphthylglycine at a pH of 7 to 10. 1. A method for producing N-carbamoyl-D-naphthylglycine, which is carried out in an aqueous medium. （５）アエロバクター属、アグロバクテリウム属、バチ
ルス属、プレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属
、ミクロバクテリウム属、シユードモナス属、アクチノ
ミセス属、ミコバクテリウム属、ノカルデイア属または
ストレプトミセス属に属する微生物を使用する特許請求
の範囲第４項記載の製造法。(5) Belongs to the genus Aerobacter, Agrobacterium, Bacillus, Previbacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Actinomyces, Mycobacterium, Nocardia, or Streptomyces The manufacturing method according to claim 4, which uses microorganisms. （６）微生物の菌体として、生菌体または乾燥菌体を使
用する特許請求の範囲第４項または第５項記載の製造法
。(6) The production method according to claim 4 or 5, wherein live or dried microbial cells are used as the microorganism cells. （７）微生物の菌体処理物として、菌体破砕物または菌
体抽出物を使用する特許請求の範囲第４項または第５項
記載の製造法。(7) The production method according to claim 4 or 5, wherein a microbial cell crush product or a microbial cell extract is used as the microbial cell-treated product. （８）微生物の菌体または菌体処理物として、菌体また
は、菌体処理物の固定化物を用いる特許請求の範囲第４
項、第５項、第６項または第７項記載の製造法。(8) Claim 4 uses an immobilized product of microbial cells or a processed product of microorganisms as the microorganism cells or processed product of microorganisms.
The manufacturing method according to item 5, item 6, or item 7. （９）培地にピリミジン系核酸塩基類または、それらの
誘導体を添加して培養し、ヒダントイン環を立体特異的
に加水分解する能力を増強させた微生物を使用する特許
請求の範囲第４項、第５項、第６項、第７項または第８
項記載の製造法。(9) Claims 4 and 4 which use a microorganism that has been cultured with the addition of pyrimidine nucleic acid bases or their derivatives to a medium to enhance the ability to stereospecifically hydrolyze hydantoin rings. Section 5, Section 6, Section 7 or Section 8
Manufacturing method described in section. （１０）５−ナフチルヒダントインがＤＬ体である特許
請求の範囲第４項記載の製造法。(10) The production method according to claim 4, wherein 5-naphthylhydantoin is a DL form.