JPS61247372A - Device for microscopic perfusion culture - Google Patents

Abstract

PURPOSE:The culture tank in the culture plate on the microscope is perfused sterilely with the culture mixture which is heated at a constant temperature to keep the tank itself at a constant temperature and enable the tank to be held in the same view. CONSTITUTION:In arm 12, the tube for introducing the culture mixture is wound with heater coil 2 and connected to the thermistor 3. The inlet nozzle 5 is connected to the tank 3 so that the top end comes into the culture tank 16. Simultaneously, exhausting nozzle 6 is connected from the culture tank 6 to the pipe 10. The thermistor probe 26 in the thermistor tank 3 is connected through the thermistor tank cap 4 to the thermistor 22 provided with a constant- current unit 23. Further, the inlet tube 1 and the exhaust tube 10 are connected to the reservoir bottle for perfusion solution 25 and either the inlet tube 1 or the exhausting tube is equipped with a peristaltic pump 21. As a result, the culture tank itself is always kept at a constant temperature.

Description

【発明の詳細な説明】 イ、科学研究上の利用分野 本発明は本来顕微鏡とは全く別の装置である恒温培養器
で行なわれていた培養の全過程を常に顕微鏡上で行なえ
るよう考えられた装置で、細胞および組織の培養過程に
関する詳細な研究を行なうことができる。[Detailed description of the invention] B. Field of use in scientific research The present invention was designed to allow the entire process of culturing, which was originally carried out in a constant temperature incubator, which is a completely separate device from a microscope, to be carried out on a microscope. Detailed studies on cell and tissue culture processes can be carried out using this equipment.

口１発明が解決しようとする問題点 前述の如く、現在まで培養細胞あるいは組織の観察はす
べて、恒温培養器で培養されたものを毎回顕微鏡上に移
し、目的とする部分を視野上に探しあてて行なわれてい
た。しかし、この方法ではいくつかの問題点がある。1. Problems that the invention aims to solve As mentioned above, until now, all observations of cultured cells or tissues have been carried out by culturing them in a constant temperature incubator, transferring them onto a microscope each time, and locating the target area in the field of view. It was being done. However, this method has several problems.

まず第一に毎回人の手によって培養プレートを恒温培養
器より取り出して観察するため、頻回に観察をした場合
、培養プレートが恒温培養器より出ている時間が長くな
り、事実上培養が目的とする温度で行なえなくなる。First of all, the culture plate is manually removed from the thermostatic incubator each time for observation, so if the culture plate is observed frequently, the time that the culture plate is out of the thermostatic incubator increases, and in fact, the purpose of culturing is It becomes impossible to perform the test at a certain temperature.

次にある程度長時間間隔で観察分行なった場合でも、顕
微鏡の性質上、同一の目的とする細胞、組織を毎回同じ
視野にもってくることは非常に難しい。とりわけ、細胞
の分化過程を観察する場合、試料の形態が急速に変化し
ていくため、事実上同−細胞の変化を追跡することが不
可能である。Next, even if observations are made at relatively long intervals, due to the nature of microscopes, it is extremely difficult to bring the same cells or tissues of interest into the same field of view each time. In particular, when observing the differentiation process of cells, the morphology of the sample changes rapidly, making it virtually impossible to track changes in the same cell.

さらに従来の培養は培養液を潅流させずに行なうため、
培養液を８日に１度交換という大変手間のかかる現状で
ある。Furthermore, because conventional culture is performed without perfusing the culture medium,
The current situation is that the culture solution must be replaced once every eight days, which is very time-consuming.

ハ、問題点を解決するための手段と効果本発明は、この
８つの問題点、すなわち、■　顕微鏡観察時間が長い程
培養プレートが低温に長くさらされている点。C. Means and effects for solving the problems The present invention solves these eight problems, namely: (1) The longer the microscope observation time, the longer the culture plate is exposed to low temperature.

■　同一部位を毎回同じ視野において観察することが事
実上困難である点。■ It is practically difficult to observe the same part from the same field of view every time.

■　培養液の交換が頻繁で手間が非常にかかる点。■ Frequent exchange of culture solution is very time consuming.

０８点を解決するため、顕微鏡上に置かれた培養プレー
トの培養槽自身を恒温加熱した培養液で無菌的に潅流す
るという、全く新しいとステムに置きかえた。このこと
Ｋより、 ■　培養槽自身は常に恒温状態が維持され、■　顕微鏡
上で培養するため常に同一視野の確保が可能で、 ■　培養液は常に潅流されているため手間をかけて交換
することが不要とな）、 上記３点の問題点は、すべて解決されることとなった。In order to resolve point 08, we replaced the culture plate with a completely new system in which the culture tank itself placed on the microscope is aseptically perfused with culture solution heated at a constant temperature. From this, ■ the culture tank itself is always maintained at a constant temperature, ■ the same field of view can always be secured because the culture is carried out on a microscope, and ■ the culture solution is constantly perfused, so there is no need to take time to replace it. The above three problems were all resolved.

尚、最近、顕微鏡の試料台を箱の中に収納し、内部の窒
気の加熱により、同様に顕微鏡を恒温培養器としようと
するものが発明されたが、この方法は箱内の温度が不安
定であり、培養液を交換しなければならない他、狭い箱
内での操作が難しく、とりわけ無菌操作ではかなシの注
意を要するという欠点がある。しかし、本発明はこれら
いずれの欠点をも克服しており、大きな意義をもつと考
えられる。Recently, a method has been invented in which the sample stage of the microscope is housed in a box and the microscope is heated with nitrogen gas inside to similarly turn the microscope into a constant temperature incubator. It is unstable, the culture medium must be replaced, it is difficult to operate in a narrow box, and it requires special care especially when operating aseptically. However, the present invention overcomes all these drawbacks and is considered to have great significance.

二、装置の構成 本発明は以下の構成要素に分割される。2. Device configuration The invention is divided into the following components.

（１）培養槽恒温潅流アーム 本装置のもつとも中′心となる部分であるアームはその
頭部が培養槽に接し、尾部が顕微鏡の試料台上に固定さ
れ第１図の如く主に次の８つの部分構成要素よりなる。(1) Culture tank constant temperature perfusion arm The arm, which is the central part of this device, has its head in contact with the culture tank and its tail fixed on the sample stage of the microscope. It consists of eight subcomponents.

すなわち、 ｉ、　　＊流液を注入する注入管、 ２、潅流液を加熱するため、注入管に巻きつけたニクロ
ム線加熱コイル、 ８、サーミスター（温度検出器）の検知部（プローペ）
を収納し、加熱された潅流液の温度を検知してヒーター
の大切を制御するためのサーミスター槽、 ４、　サーミスター槽を密栓し、気体を通し、液体を流
さない１ｌＩｉ％フィルターにより、加熱で発生した気
泡を除去するサーミスター槽キャップ、 ５、潅流液を直接培養槽に注入するための注入ノズル、 ６．４流液の排出口となる排液ノズル、７、　培養槽と
頭部を密着させ気密にするための密着パツキン、 ８、頭部を気密すると同時に採光および培養槽内操作口
となる頭部採光密栓キャップ、以上の８部分である。That is, i. *The injection tube for injecting the fluid, 2. The nichrome wire heating coil wrapped around the injection tube to heat the irrigation fluid, 8. The detection part (prope) of the thermistor (temperature detector).
4. The thermistor tank is tightly plugged, and a 1lIi% filter that allows gas to pass through but does not allow liquid to flow through the thermistor tank. 5. An injection nozzle for directly injecting the perfusion liquid into the culture tank; 6.4 A drain nozzle that serves as a discharge port for the flowing liquid; 7. The culture tank and the head The above 8 parts are: a close-fitting gasket to make the head airtight, 8. a head light-lighting seal cap that serves as a light-tight and operation port for the culture tank at the same time as making the head air-tight.

本アーム自身は固定器により顕微鏡の試料台に固定し、
下方への圧迫により、頭部を培養プレートの培養槽上面
に密着させる。This arm itself is fixed to the sample stage of the microscope using a fixator.
Press downward to bring the head into close contact with the top of the culture tank of the culture plate.

（２）サーミスターおよびその検知部 温度検出装置は温度設定によりヒーターコイルのＷ、源
の入切を行なう。検知部（プローぺ〕は水溶液中に入れ
るためテフロン又はガラスで被膜されたものを用いる。(2) The thermistor and its detection part The temperature detection device turns on and off the heater coil's W and power source depending on the temperature setting. The detection part (probe) is coated with Teflon or glass so that it can be placed in an aqueous solution.

図面では省略しているが必要な場合には培養槽恒温潅流
アームの頭部を加工し、プローぺをもう１つ使えるサー
ミスターにより、培養槽の温度をモニターする。Although not shown in the drawing, if necessary, the head of the constant-temperature perfusion arm of the culture tank can be modified to monitor the temperature of the culture tank with a thermistor that can be used as an additional probe.

しかし培養槽に入れるサーミスター金ヒーターコイルの
入切用に使用することは培養槽温度の揺れを大きくする
ため行なわない。However, it should not be used to turn on and off the thermistor gold heater coil placed in the culture tank, as this would increase fluctuations in the temperature of the culture tank.

（３）ヒーターコイル電源 定電流装置を使用する。０．８から０．５Ａ程度の出力
で使用可能である。(3) Use a constant current device for the heater coil power supply. It can be used with an output of about 0.8 to 0.5A.

（４）’Ｉｌｌ！Ｉポンプ（ペリスタルテイツクボンプ
）注入側のチューブに装着し、潅流液を注入する。チュ
ーブは、肉厚シリコンチューブを用い、１分間に０．１
から１．０　ｘｔ程度の注入速度が要求される。排液側
のチューブに装着しても使用できる。(4)'Ill! Attach the I pump (peristaltic pump) to the tube on the injection side and inject the perfusion fluid. The tube is a thick-walled silicone tube, and the rate is 0.1 per minute.
An injection rate of about 1.0 xt is required. It can also be used by attaching it to the tube on the drainage side.

（５）Ｑ流液貯留ピン この中に潅流液を無菌的に貯留する。潅流させた液は再
使用可能なので、このピンに循環させる。実験の必要上
潅流液の組成を変更する場合は潅流液貯留ピンを並列に
接続し流れを切シかえるだけでよい。したがって従来の
ように培養プレートの培養槽の吸引、注入をくりかえす
手間は必要としない。尚、貯留している潅流液は、常に
外部より無菌的な５チ二酸化炭素９５チ酸素ガスで洗浄
しておく。(5) Q Fluid storage pin Store the perfusion fluid in this aseptically. The perfused fluid is reusable and is circulated through this pin. If you wish to change the composition of the perfusate for experimental purposes, simply connect the perfusate reservoir pins in parallel and switch the flow. Therefore, it is not necessary to repeatedly suction and inject the culture plate into the culture tank as in the conventional method. The stored perfusion fluid is always cleaned from the outside with sterile 5% carbon dioxide and 95% oxygen gas.

ホ、装置の原理 本装置は基本的には顕微鏡上に置かれた培養プレートの
培養槽に無菌的潅流液をポンプで潅流循環し、ヒーター
とサーミスターで恒温加熱するという単純なものである
。しかし次の２点に重要な工夫点がある。E. Principle of the device This device is basically a simple device that uses a pump to perfuse and circulate a sterile perfusion solution into a culture tank of a culture plate placed on a microscope, and heats it at a constant temperature using a heater and a thermistor. However, there are two important points to consider.

（１）温度を一定に保つための工夫 培養プレートの培養槽と、サーミスターおよびヒーター
コイルの位置関係を工夫することにより培養槽の温度の
揺れを上下０．５°Ｃ以内に抑えた。すなわち、ヒータ
ーコイルの大切の制御に用いるサーミスタープローベを
培養槽の中に入れず、サーミスター槽として培養槽とは
別に離してヒーターコイルの直後に置いた。このサーミ
スター槽内のサーミスタープローベによりヒーターコイ
ルの入切を行なったところ、サーミスター槽内の温度は
上下１．０℃から１．５°Ｃの変化を示した。しかし、
サーミスター槽と潅流液の間に１ｃＩｒＬｌｌｆＩ後の
距離を置いたところ培養槽内の温度変化は０．５℃以内
と減少した。培養槽内に直接サーミスターを置き、ヒー
ターの入切を行なうと培養槽内は上下１°Ｃ以上の温度
変化を示した。(1) Invention to keep the temperature constant By devising the positional relationship between the culture tank of the culture plate, the thermistor, and the heater coil, fluctuations in the temperature of the culture tank were suppressed to within 0.5°C vertically. That is, the thermistor probe used to control the heater coil was not placed inside the culture tank, but was placed as a thermistor tank separately from the culture tank and immediately after the heater coil. When the heater coil was turned on and off using a thermistor probe in the thermistor tank, the temperature inside the thermistor tank showed a change of 1.0°C to 1.5°C above and below. but,
When a distance of 1cIrLllfI was placed between the thermistor tank and the perfusate, the temperature change within the culture tank was reduced to within 0.5°C. When a thermistor was placed directly in the culture tank and the heater was turned on and off, the temperature inside the culture tank showed a temperature change of more than 1°C vertically.

以上よシサーミスター檜を設置してこれを培養槽と少し
離し、ヒーターコイルの直後で温度制御をするという発
明により初めて、極めて安定な恒温潅流が可能となった
。As described above, extremely stable constant-temperature perfusion became possible for the first time with the invention of installing a scissor mister cypress, placing it a little apart from the culture tank, and controlling the temperature immediately after the heater coil.

（２）培養槽からの排液 ０．２から０．５　ｍｌ程度の小さい培養槽より定常的
に培養液を排液させるため、培養槽をアーム頭部で密閉
し、排液側は排液ノズルよシ押し出す方式とした。培養
槽内の培養液面は排液ノズルの高さによって調整し、注
入ノズルより注入された潅流液により潅流檀より同等量
の培養液が排液され、液面は常に排液ノズル下端に維持
された。この方式は、排液にポンプや吸引を必要とせず
液面の調整も簡単で極めて有用である。(2) Drainage liquid from the culture tank In order to regularly drain the culture solution from a small culture tank of about 0.2 to 0.5 ml, the culture tank is sealed with the arm head, and the drain side is drained. The method is to push it out through the nozzle. The culture solution level in the culture tank is adjusted by the height of the drain nozzle, and the same amount of culture solution is drained from the perfusion solution by the perfusion solution injected from the injection nozzle, and the liquid level is always maintained at the lower end of the drain nozzle. It was done. This method is extremely useful as it does not require a pump or suction to drain the liquid, and the liquid level can be easily adjusted.

尚、排液チューブに情動ポンプを装着した場合にも注入
側に引く力をかける他は、全く同様にして培養液の交換
が可能である。Incidentally, even when an emotional pump is attached to the drainage tube, the culture solution can be replaced in exactly the same way, except that a pulling force is applied to the injection side.

へ、装置の使用方法 以下の手順で使用する。How to use the device Use the following steps.

（１）サーミスター槽にサーミスタープローベを装着し
、接続チューブを注入管および排液管に接続する。(1) Attach the thermistor probe to the thermistor tank and connect the connecting tube to the injection pipe and drain pipe.

（２）　　（１）でセットした培養槽恒温潅流アーム全
体をエチレンオキサイドガスで滅菌する。この際同時に
潅流液貯留ピン側も滅菌する。(2) Sterilize the entire constant temperature perfusion arm of the culture tank set in (1) with ethylene oxide gas. At this time, the irrigation fluid storage pin side is also sterilized at the same time.

（３）観察したい培養プレートを顕微鏡上にのせ、培養
液と培養細胞あるいは組織を入れる。従来の恒温培養器
で培養されていたプレートを月いてももちろんよい。こ
の場合は、特に初期の培養が難しいものの継続観察の手
段として使用すれば効率よく実験できる。(3) Place the culture plate you wish to observe on the microscope and add the culture solution and cultured cells or tissues. Of course, plates that have been cultured in a conventional thermostatic incubator may also be used for a month. In this case, although initial cultivation is particularly difficult, experiments can be carried out efficiently if used as a means of continuous observation.

（４）滅菌したアームの接続チューブを同じく＃：酌済
みの貯留ピンに接続後、アームの頭部を培養プレート内
の観察したい培養槽にのせ、密着パツキンで両者間が気
密となるように顕微鏡の固定台上に固定する。(4) After connecting the sterilized arm connection tube to the same #: cupped storage pin, place the head of the arm on the culture tank you wish to observe in the culture plate, and place it under the microscope so that there is an airtight seal between the two. Fix it on a fixed stand.

（５）　　サーミスタープローベ舎ヒーターコイル端子
をそれぞれサーミスターおよび定電流［源につなぐ。(5) Connect the thermistor probe housing heater coil terminals to the thermistor and constant current source respectively.

（６）　　注入側又は排液側接続チューブに情動ポンプ
を装着する。(6) Attach the emotion pump to the inlet or drain side connection tube.

（７）　　ヒーター・サーミスターの電源を入れ、同時
に＃４動ポンプを始動する。(7) Turn on the power to the heater and thermistor, and start the #4 pump at the same time.

（８）　　顕微鏡視野内に観察したい部位をもってくる
。(8) Bring the part you want to observe within the field of view of the microscope.

以上で稼動する。尚、潅流液貯留ピンの液面は培養槽の
液面とほぼ同じ高さに合わせるのがよい。It operates with the above. In addition, it is preferable that the liquid level of the perfusion liquid storage pin be adjusted to approximately the same height as the liquid level of the culture tank.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は本装置の中心部である培養槽恒温潅流アームの
上面図。 第２図は培養槽恒温潅流アームの正面図。 第８図は培養槽恒温潅流アームを頭部側より見た側面図
。 第４図は培養槽恒温潅流アークの頭部の斜視図。 第５図は本発明の装置を顕微鏡上に設置した状態を示す
正面図。 （１）・・・注入管、　　　　　（２）・・・加熱コイ
ル、（３）・・・サーミスター槽、 （４）・・・サーミスター槽キャップ、（５）・・・注
入ノズル、（６）・・・排液ノズル、（７）・・・密着
パツキン、 （８）頭部採光密栓キャップ、 （９）・・・透明採光板、　　αＱ・・・排液管、（６
）・・・アーム固定穴、 Ｑ２・・・培養槽恒温潅流アーム、 （２）・・・対物レンズ、　　ａΦ・・・接眼レンズ、
（至）・・・倒立顕微鏡、　　αＱ・・・培養槽、α力
・・・培養プレート、　（至）・・・顕微鏡光源、σす
・・・排液側接続チューブ、 に）・・・注入側接続チューブ、 （財）・・・情動ポンプ、　　（イ）・・・サーミスタ
ー、（ホ）・・・定電流装置、　　（財）・・・無菌フ
ィルター、（７）・・・潅流液貯留ピン、 （ホ）・・・サーミスターブローベ、 （Ａｌ・・・頭部、　　　　　　（Ｂ）・・・尾部。 特許出願人　　　　板　東　義　間 第１図 ′４３０ ′＄暢FIG. 1 is a top view of the constant temperature perfusion arm of the culture tank, which is the central part of this device. Figure 2 is a front view of the constant temperature perfusion arm of the culture tank. Figure 8 is a side view of the constant temperature perfusion arm of the culture tank, viewed from the head side. Figure 4 is a perspective view of the head of the constant temperature perfusion arc in the culture tank. FIG. 5 is a front view showing the apparatus of the present invention installed on a microscope. (1)...Injection pipe, (2)...Heating coil, (3)...Thermistor tank, (4)...Thermistor tank cap, (5)...Injection nozzle, (6 )...Drain nozzle, (7)...Tight packing, (8) Head lighting sealing cap, (9)...Transparent lighting plate, αQ...Drain pipe, (6
)...Arm fixing hole, Q2...Culture tank constant temperature perfusion arm, (2)...Objective lens, aΦ...Eyepiece lens,
(To)...Inverted microscope, αQ...Culture tank, α force...Culture plate, (To)...Microscope light source, σ...Drain side connection tube, To)...Injection Side connection tube, (Foundation)...Emotional pump, (A)...Thermistor, (E)...Constant current device, (Foundation)...Sterile filter, (7)...Irrigation fluid storage Pin, (E)...Thermistor bulb, (Al...Head, (B)...Tail. Patent applicant: Board Higashi Yoshima Fig. 1'430'$Nobu

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （Ａ）注入管にヒーターコイルを巻きつけ、サーミスタ
ー槽に接続する。サーミスター槽に注入ノズルを接続し
、その先端が培養槽内に入る。排液ノズルは培養槽より
出て排液管に接続する培養槽恒温潅流アーム。 （Ｂ）サーミスター槽キャップを通して、定電流装置を
設けたサーミスターより接続線で接続され、サーミスタ
ー槽に入れられるサーミスタープローベ。 （Ｃ）注入管および排液管を潅流液貯留ピンにそれぞれ
接続し、注入側または排液側接続チューブの中間に蠕動
ポンプを取り付けている。 以上のように構成された顕微鏡上潅流培養装置。[Claims] (A) A heater coil is wound around the injection pipe and connected to the thermistor tank. Connect the injection nozzle to the thermistor tank and insert its tip into the culture tank. The drain nozzle is a constant temperature perfusion arm of the culture tank that exits from the culture tank and connects to the drain pipe. (B) A thermistor probe that is connected to a thermistor equipped with a constant current device with a connecting wire through the thermistor tank cap and placed in the thermistor tank. (C) The inlet tube and the drain tube are each connected to the perfusate storage pin, and a peristaltic pump is installed in the middle of the inlet or drain side connecting tube. Microscopic perfusion culture device configured as described above.