JPS61242596A - Determination of body fluid component of living body - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To improve the determination accuracy of the components in body fluid, by decomposing the body fluid proteins interfering the determination of the body fluid components with a protease. CONSTITUTION:In the determination of a component in body fluid, e.g. the colorimetry of ammonia by indophenol method, determination method using triphenylmethane leuco dye as a color-developer, etc., the determination accuracy is improved by decomposing the proteins in the body fluid with a protease. The protease is dissolved in a buffer solution to a concentration of e.g. 10-10,000 U/l and the solution is added to the objective specimen.

Description

【発明の詳細な説明】 「発明の利用分野」 本発明は、共存するタンパク質の影響を回避した、血清
、血漿等の生体体液成分の測定法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention relates to a method for measuring biological fluid components such as serum and plasma that avoids the influence of coexisting proteins.

「発明の背景」 体液、特に血清（又は血漿）中には通常６〜８％のタン
パク質が含有されており、これが血清成分の測定値にし
ばしば正又は負の誤差を生ずる原因になることはよく知
られている。"Background of the Invention" Body fluids, especially serum (or plasma), usually contain 6-8% protein, which often causes positive or negative errors in measurements of serum components. Are known.

例えば、血清中のアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）活
性の測定に於て、アデノシンを基質とし血清中ＡＤＡの
作用により生成したアンモニアをニトロプルジッドナト
リウム、フェノール及びアルクリ性次亜塩素酸ナトリウ
ムを用いるインドフェノール法により測定する場合は、
血清中のタンパク質も同時に緑色に呈色し正誤差を生ず
る。For example, in measuring adenosine deaminase (ADA) activity in serum, ammonia produced by the action of ADA in serum using adenosine as a substrate is measured using the indophenol method using sodium nitropruside, phenol, and alkaline sodium hypochlorite. When measuring by
Proteins in the serum also turn green at the same time, causing a correct error.

その為、各検体毎に検体盲検をとることによりこれに対
処している。又、血清中の鉄を測定する場合、タンパク
質と結合している鉄を鉄イオンに解離させる為、除タン
パクするか、あるいは高濃度の界面活性剤を使用して鉄
イオンを解離させてから発色、測定する等の方法が行わ
れている。又、トリフェニルメタン系ロイコ色素を過酸
化水素生成系の酸化呈色試薬として用いる場合はタンパ
ク質成分に起因する負誤差を生ず□る為、界面活性剤を
用いることによって誤差を低減させている。このように
生体体液成分の測定に際して、タンパク質の妨害作用を
回避する為、検体盲検をとる、除タンパクする、あるい
は界面活性剤を使用する等の方法が従来行われていた。Therefore, this problem was addressed by conducting a sample-blind test for each sample. In addition, when measuring iron in serum, in order to dissociate iron bound to proteins into iron ions, it is necessary to remove protein or use a high concentration of surfactant to dissociate iron ions before coloring. , measurement, and other methods are being used. Additionally, when triphenylmethane-based leuco dyes are used as oxidative coloring reagents for hydrogen peroxide production, negative errors occur due to protein components, so errors are reduced by using surfactants. . In order to avoid the interfering effects of proteins when measuring biological fluid components, methods such as blinding the sample, removing protein, or using a surfactant have been conventionally used.

しかしながら検体盲検をとることは、自動分析法、用手
法を問わず使用試薬量及び稼動時間が検体盲検を必要と
しない場合に比べ２倍、又はそれ以上になり、多忙な臨
床検査室では大きな負担となる。又、除タンパク法は、
操作が繁雑であるという欠点を有し、界面活性剤を使用
する場合も、その濃度によっては濁りを生じたり、試液
の粘度が高くなる為それにより生ずる実用上のトラブル
が起り易いという欠点を有する。従って、これら従来行
われていたタンパク質の妨害作用回避方法は、いずれも
夫々欠点を有し、これらの点を改良した、共存するタン
パク質に起因する誤差の全くない生体体液成分の測定法
の出現が望まれていた。However, specimen blinding, regardless of the automated analysis method or method, doubles or more the amount of reagents used and the operating time compared to when specimen blinding is not required, and in busy clinical laboratories. It becomes a big burden. In addition, the protein removal method is
It has the disadvantage of being complicated to operate, and even when a surfactant is used, depending on its concentration, it can cause turbidity and increase the viscosity of the test solution, which can easily cause practical problems. . Therefore, all of these conventional methods for avoiding the interfering effects of proteins have their own drawbacks, and it is hoped that a method for measuring biological fluid components will be developed that improves these points and is free from errors caused by coexisting proteins. It was wanted.

「発明の目的」 本発明は、従来行われていた、生体体液成分の測定に於
けるタンパク質の妨害作用回避方法の欠点を改善した新
規で且つ極めて効果的なタンパク質の妨害作用回避方法
と、該方法を用いる生体体液成分の測定法を提供するこ
とを目的とする。``Object of the Invention'' The present invention provides a novel and extremely effective method for avoiding the interference effect of proteins that improves the drawbacks of conventional methods for avoiding the interference effect of proteins in the measurement of biological body fluid components, and An object of the present invention is to provide a method for measuring biological fluid components using a method.

「発明の構成」 本発明は、被検試料中に共存するタンパク質により影響
を受けて測定値に正又は負の誤差を生じる生体体液成分
の測定に於て、該タンパク質をプロテアーゼを用いて分
解することによりその影響を回避し、該測定を行うこと
を特徴とする、生体体液成分の測定法である。"Structure of the Invention" The present invention decomposes proteins using protease when measuring biological fluid components that are affected by proteins coexisting in a test sample and cause positive or negative errors in measurement values. This is a method for measuring biological fluid components, which is characterized in that the measurement is performed while avoiding the influence of the above.

本発明で用いられるプロテアーゼが、ペプチド結合の加
水分解を触媒する酵素であることは公知であるが、生体
体液成分の測定に於て、プロテアーゼを用いることによ
り、目的成分及び測定系には何ら影響を与えることなく
試料中に共存するタンパク質を測定上妨害を及ぼさない
状態にまで分解し、これによる妨害作用を排除し得るか
否かについてはこれまでに全く知見がなく、本発明者ら
が鋭意研究の結果初めて見出したものである。Although it is known that the protease used in the present invention is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of peptide bonds, the use of protease in measuring biological fluid components does not affect the target components or the measurement system in any way. Until now, there has been no knowledge of whether or not it is possible to decompose proteins coexisting in a sample to a state that does not interfere with measurement without giving any interference, and to eliminate the interfering effects caused by this. This was discovered for the first time as a result of research.

本発明の方法に用いられるプロテアーゼは菌由来のもの
、細菌由来のもの、植物由来のもの、動物由来のものな
どいずれのものでも使用できる□。The protease used in the method of the present invention can be any of those derived from fungi, bacteria, plants, animals, etc. □.

これらのものを例示すると、菌由来のものとしては、例
えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、　Ｔｒｉ
ｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍ、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ　５ａｉｔｏｉ、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　５ｏ
ｊａｅ等があり、又細菌由来のものとしては例えばＢａ
ｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ。Examples of these are those derived from bacteria, such as Aspergillus oryzae, Tri.
tirachiumalbum, Aspergill
us 5aitoi, Aspergillus 5o
jae, etc., and examples of bacterial origin include Ba.
cillus amyloliquefaciens,
Bacillus 5ubtilis.

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｏｌｙｍｙｘａ、　　Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　　Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏ−ｔｅｏｌｙｔｉｃｕ
ｓ　　ｒａｋｋａ、　５ｔｒｅｐｔ’ｏｍｙｃｅｓ　　
ｇｒｉｓｅｕｓ。Bacillus polymyxa, Bacillus
llus Thermopro-teolyticu
s rakka, 5trept'omyces
griseus.

５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ等があ
り、植物内゛来のものとしては例えばパパイン、Ｆｉｃ
ｉｎ等があり、動物由来のものとしては、例えばペプシ
ン、トリプシン等が挙げられるが、いずれもこれらに限
定されるものではない。又、プロテアーゼはその種類に
よってタンパク質構造における作用点が異なる為、２種
類以上のプロテアーゼを同時に用いることも有効である
。5 taphylococcus aureus, etc., and those that are found in plants include papain, Fic, etc.
Examples of animal-derived substances include pepsin and trypsin, but they are not limited to these. Furthermore, since the point of action on the protein structure differs depending on the type of protease, it is also effective to use two or more types of protease at the same time.

本発明の測定法の代表的具体例としては、例えばインド
フェノール法によるアンモニアの比色定量法を用いてこ
れを行うＡＤＡ活性やグアナーゼ活性等の測定法やトリ
フェニルメタン系ロイコ色素、例えば一般式［Ｉ］ 〔式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４は水素又は低級アルキル
基を表わし、夫々同じであっても互いに異っていても良
く、Ｘｉ、　ｘ２は水素、　−３０３Ｍ１　、−０００
Ｍ２　。Typical specific examples of the measurement method of the present invention include a method for measuring ADA activity and guanase activity using a colorimetric method of ammonia using the indophenol method, and a method for measuring ADA activity and guanase activity, and triphenylmethane-based leuco dyes, such as the general formula [I] [In the formula, R1, R2, R3, and R4 represent hydrogen or a lower alkyl group, and may be the same or different, Xi and x2 are hydrogen, -303M1, -000
M2.

−０（ＣＨ２）、ＳＯ３Ｍ３．　−０（ＣＩ２）、Ｃ０
０Ｍ４．　’Ｘ４ｉ−−Ｎ（Ｒ５（但しＭｌ、　Ｍ２．
　Ｍ３．　Ｍ４は水素、アルカリ金属イオン又はＮＨ４
＋を示し、Ｒ５，Ｒ６は水素又は低級アルキル基を示し
、ｍ、ｎは夫々２〜４の整数を示す。）を表わし、夫々
間じでおっても互いに異っていてもよい〕で表わされる
トリフェニルメタン系ロイコ色素を過酸化水素生成系に
於ける被酸化性呈色試薬（発色剤）として用いる測定法
、及びタンパク質と結合している目的金属をタンパク質
との結合から解き金属イオンを遊離させて行う金属イオ
ンの定量法等が挙げられるがこれらに限定されるもので
ないことはいうまでもない。-0(CH2), SO3M3. -0 (CI2), C0
0M4. 'X4i--N(R5 (However, Ml, M2.
M3. M4 is hydrogen, alkali metal ion or NH4
+, R5 and R6 represent hydrogen or a lower alkyl group, and m and n each represent an integer of 2 to 4. ), which may be the same or different from each other] Measurement using triphenylmethane-based leuco dyes as oxidizable coloring reagents (color formers) in hydrogen peroxide production systems Examples include, but are not limited to, methods for quantifying metal ions in which the target metal bound to the protein is released from its binding to the protein and the metal ions are released.

本発明の方法を実施するには、例えば、体液試料の一定
量例えば５〜５００＃Ｌ４Ｑ、をとり、これにプロテア
ーゼを適当な濃度、例えば１０〜１０，０ＯＯＵ／ＩＬ
に溶解した緩衝液を加えて一定時間、例えば５〜２０分
間、室温〜５０℃で反応させた後目的成分の測定を実施
するか、又は目的成分が酵素であるような場合などは、
基質緩衝液にプロテアーゼを予め加えておき測定を行っ
てもよい。To carry out the method of the present invention, for example, a certain amount of a body fluid sample is taken, e.g., 5-500 #L4Q, and protease is added to it at an appropriate concentration, e.g., 10-10,0 OOU/IL.
After adding a buffer solution dissolved in the solution and reacting at room temperature to 50°C for a certain period of time, for example, 5 to 20 minutes, the target component is measured, or in cases where the target component is an enzyme, etc.
The measurement may be performed by adding protease to the substrate buffer in advance.

プロテアーゼの至適酵素反応は、プロテアーゼの種類に
より、又緩衝液のｐＨ，濃度２種類によっても異ること
があるので、測定法の反応条件に合わせて、プロテアー
ゼの種類、緩衝液のＰＨ。The optimal enzymatic reaction of protease may differ depending on the type of protease, as well as the pH and concentration of the buffer solution.

濃度１種類を適宜選択すればよい。One type of concentration may be selected as appropriate.

以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例により
何ら限定されるものではない。Examples are given below, but the present invention is not limited to these Examples in any way.

「実施例」 実施例　１．インドフェノール法によるアンモニアの比
色定量法 〔試薬〕 （１）発色試液■ ０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中にイミダゾー
ル０．３％、　　Ｓｉｇｍａ社製のＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ１，０００
　Ｕ／ｌを含む溶液を調製した。"Example" Example 1. Colorimetric determination of ammonia by indophenol method [Reagents] (1) Color reagent ■ 0.3% imidazole in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0), Streptomy manufactured by Sigma
Protease derived from ces griseus 1,000
A solution containing U/l was prepared.

（２）発色試液ＩＩ Ｏ，Ｉ　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，ｏ）中にサリチル
酸ナトリウム８％を含む溶液を調製した。(2) Color reagent II A solution containing 8% sodium salicylate in O, IM phosphate buffer (pH 7, O) was prepared.

（３）発色試液■ 水酸化ナトリウム２％、及び次亜塩素酸ナトリウム０．
１２％を含む溶液を調製した。(3) Coloring test solution■ Sodium hydroxide 2% and sodium hypochlorite 0.
A solution containing 12% was prepared.

〔試料〕〔sample〕

（１）標準液 アンモニア窒素として４００曹ｇ／Ｉを含む溶液を調製
した。(1) Standard solution A solution containing 400 g/I of ammonia nitrogen was prepared.

（２）５％人アルブミン水溶液（アンモニア窒素として
？Ｏｍｇ／ｌ含有） （３）コントロール血清ＩＩワコー（和光紬薬玉業■製
）（アンモニア窒素として２０ｍｇ／Ｉ含有）〔操作法
〕 試料２０ル文をとり、発色試液Ｉ　　０．５ｍｌを加え
３７℃で１０分間加温した。その後、発色試液ＩＩ　　
Ｏ，５ｍｌを加えて混和し、ついで発色試液Ｉ［Ｉ２ｍ
１を加え３７℃で５分間加温後試薬ブランクを対照とし
て６５０ｎｍの吸光度を測定した。(2) 5% human albumin aqueous solution (contains ?0mg/l as ammonia nitrogen) (3) Control serum II Wako (manufactured by Wako Tsumugi Yakugyo) (contains 20mg/l as ammonia nitrogen) [Procedure] Sample 20 grams 0.5 ml of Color Reagent I was added to the solution, and the mixture was heated at 37° C. for 10 minutes. After that, color reagent II
Add 5 ml of O, mix, and then add color reagent I [I2m
1 was added and heated at 37° C. for 5 minutes, and the absorbance at 650 nm was measured using the reagent blank as a control.

比較例　ｌ　インドフェノール法によるアンモニアの比
色定量法 〔試薬〕 実施例１の発色試液のうち、発色試液Ｉはプロテアーゼ
を含有せずその他は実施例１と同様に調製し、発色試液
■及び■は実施例１と同一とした。Comparative Example l Colorimetric determination of ammonia by indophenol method [Reagents] Among the coloring reagents of Example 1, coloring reagent I did not contain protease and was otherwise prepared in the same manner as in Example 1. Coloring retardants ■ and ■ was the same as in Example 1.

〔試料〕〔sample〕

実施例１と同じ。 Same as Example 1.

〔操作法〕[How to operate]

実施例１と同じ。 Same as Example 1.

実施例１と比較例１の結果を表１に示した。The results of Example 1 and Comparative Example 1 are shown in Table 1.

表　　１ 表１の結果から明らかなように比較例１ではアンモニア
以外のタンパク成分も発色し高値を示しているのに対し
、実施例１では５％人アルブミン水溶液、コントロール
血清■ワコーとも、含有されているアンモニア窒素のみ
が発色している。即ち、本発明に係る実施例１ではタン
パクの影響が完全に除去されていることが解る。Table 1 As is clear from the results in Table 1, in Comparative Example 1, protein components other than ammonia developed color and showed high values, whereas in Example 1, neither the 5% human albumin aqueous solution nor the control serum ■Wako contained any protein components. Only the ammonia nitrogen that is present is colored. That is, it can be seen that in Example 1 according to the present invention, the influence of protein was completely eliminated.

実施例　２　インドフェノール法によるアンモニアの比
色定量法 〔試薬〕 （１）前処理液 ０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中にＳ　ｉｇｍ
ａ社製のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由
来のプロテアーゼ１．０００１１１を含む溶液を調製し
た。Example 2 Colorimetric determination of ammonia by indophenol method [Reagents] (1) Pretreatment solution Sigm in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0)
A solution containing Streptomyces griseus-derived protease 1.000111 manufactured by Company A was prepared.

（２）発色試液■ ０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中にサリチル酸
ナトリウム８％、ニトロプルジットナトリウム０．４％
を含む溶液を調製した。(2) Color reagent ■ 8% sodium salicylate, 0.4% sodium nitroprusit in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0)
A solution containing was prepared.

（３）発色試液ＩＩ 水酸化ナトリウム０．７％、次亜塩素酸ナトリウム０．
０５％を含む水溶液を調製した。(3) Color reagent II Sodium hydroxide 0.7%, Sodium hypochlorite 0.
An aqueous solution containing 0.05% was prepared.

〔試料〕〔sample〕

（１）標準液 アンモニア窒素として５０ｍｇ／ｌを含む溶液を調製し
た。(1) Standard solution A solution containing 50 mg/l of ammonia nitrogen was prepared.

（２）５％人アルブミン水溶液（アンモニア窒素として
？Ｏｍｇ／Ｉ含有） （３）コントロール血清ＩＩワコー（アンモニア窒素と
して２０ｍｇ／　ｌ含有） 〔操作法〕 試料２０ｐＬｕをとり前処理液１１を加え３７℃で１０
分間加温した。その後、発色試液Ｉ　　１ｍｌを加えて
混和し、ついで発色試験液１１２ｍｌを加えて３７℃で
ｌＯ分間加温後試薬ブランクを対照として［１９０ｎｍ
の吸光度を測定した。(2) 5% human albumin aqueous solution (contains ?0mg/I as ammonia nitrogen) (3) Control serum II Wako (contains 20mg/l as ammonia nitrogen) [Procedure] Take 20 pLu of sample, add pretreatment solution 11, and heat at 37°C. So 10
Warmed for minutes. After that, 1 ml of color development test solution I was added and mixed, then 112 mL of color development test solution was added and heated at 37°C for 10 minutes.
The absorbance was measured.

比較例　２　インドフェノール法によるアンモニアの比
色定量法 〔試薬〕 （１）発色試液Ｉ ０９１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中にサリチル酸
ナトリウム４％、ニトロプルジッドナトリウム０．２％
を含む溶液を調製した。Comparative Example 2 Colorimetric determination of ammonia by indophenol method [Reagents] (1) Color reagent I Sodium salicylate 4%, sodium nitropruside 0.2% in 091M phosphate buffer (pH 7.0)
A solution containing was prepared.

（２）発色試液■ 実施例２と同じ。(2) Color reagent ■ Same as Example 2.

〔試料〕〔sample〕

実施例２と同じ。 Same as Example 2.

〔操作法〕[How to operate]

試料２０ル文をとり発色試液Ｉ　　２＋ａｌを加え、次
に発色試液Ｈ２ｍｌを加えて３７℃で１０分間加加温後
薬ブランクを対照としてＥｔ９０ｎｍの吸光度を測定し
た。A 20-liter sample was taken, color reagent I 2+al was added thereto, then 2 ml of color reagent H was added, and after heating at 37° C. for 10 minutes, the absorbance at 90 nm of Et was measured using a drug blank as a control.

゛　実施例２と比較例２の結果を表２に示した。Table 2 shows the results of Example 2 and Comparative Example 2.

表２の結果から明らかなように、比較例２ではアンモニ
ア以外のタンパク成分も発色し高値を示しているのに対
し、実施例２では５％人アルブミン水溶液、コントロー
ル血清ＩＩワコーとも、含有されているアンモニア窒素
のみが発色している。As is clear from the results in Table 2, in Comparative Example 2, protein components other than ammonia also developed color and showed high values, whereas in Example 2, both the 5% human albumin aqueous solution and the control serum II Wako were contained. Only the ammonia nitrogen present is colored.

即ち、本発明に係る実施例２でも、タンパク質の影響が
完全に除去ｙれていることが解る。That is, it can be seen that the influence of proteins was completely removed in Example 2 according to the present invention as well.

実施例　３　血清中のアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ
　）活性測定法 〔試薬〕 （１）基質緩衝液 ０．１　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）中にアデノ
シン１．２３ｍｍ＋ｏｌ／Ｉ、Ｓｉｇｍａ社製のＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ
１．０００　Ｕ／文を含む溶液を調製した。Example 3 Adenosine deaminase (ADA) in serum
) Activity measurement method [Reagents] (1) Adenosine 1.23 mm + ol/I in substrate buffer 0.1 M phosphate buffer (pH 7,5), Str manufactured by Sigma
A solution containing 1.000 U/liter of protease from Eptomyces griseus was prepared.

（２）発色試液Ｉ サリチル酸ナトリウム８％、ニトロプルジットナトリウ
ム０．４％を含む溶液を調製した。(2) Color reagent solution I A solution containing 8% sodium salicylate and 0.4% sodium nitroprusitate was prepared.

（３）発色試液ＩＩ 水酸化ナトリウム０．７％、次亜塩素酸ナトリウム０．
０５％を含む水溶液を調製した。(3) Color reagent II Sodium hydroxide 0.7%, Sodium hypochlorite 0.
An aqueous solution containing 0.05% was prepared.

〔試料〕〔sample〕

血清 〔操作法〕 血清５０ル文をとり基質緩衝液１ｍｌを加え３７°Ｃで
３０分間加温したのち、発色試液Ｉを１ｍｌ、発色試験
液ＩＩを２ｍｌ加え、更に３７℃でｌＯ分間加温後試薬
ブランクを対照として８９０ｎｍの吸光度を測定した（
ＥＳ）。Serum [Procedure] Take 50 liters of serum, add 1 ml of substrate buffer, and warm at 37°C for 30 minutes, then add 1 ml of Color Test Solution I and 2 ml of Color Test Solution II, and further heat at 37°C for 10 minutes. The absorbance at 890 nm was measured using the post-reagent blank as a control (
ES).

別に同一血清５０ｊＬｌをとり、０．１Ｍリン酸塩緩衝
液（ｐＨ７，５）中にＳｉｇｍａ社製のＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ１．００
０　Ｕ／ｌを含む溶液１ｍｌを加え３７°Ｃで３０分間
加温後、発色試液Ｉを１ｍｌ、発色試液ＩＩを２ｍｌ加
え、更に３７℃で１０分間加加温後薬ブランクを対照と
して６９０ｎ＋＊の吸光度を測定した（ＥＳＢ）。Separately, 50 l of the same serum was taken, and Strepto (Sigma) was added to 0.1 M phosphate buffer (pH 7,5).
myces griseus derived protease 1.00
Add 1 ml of a solution containing 0 U/l, heat at 37°C for 30 minutes, add 1 ml of Color Reagent I and 2 ml of Color Reagent II, and further warm at 37°C for 10 minutes. The absorbance of the sample was measured (ESB).

比較例　３　血清中のＡＤＡ活性測定法〔試薬〕 （１）基質緩衝液 ０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ、Ｈ７，５）中にアゾンジ
ノ１．２３ｍｍｏｌ／Ｉを含む溶液を調製した。Comparative Example 3 Method for Measuring ADA Activity in Serum [Reagents] (1) Substrate Buffer A solution containing 1.23 mmol/I of azondino in 0.1 M phosphate buffer (p, H7,5) was prepared.

（２）発色試液Ｉ 実施例３と同じ。(2) Color reagent I Same as Example 3.

（３）発色試液ＩＩ 実施例３と同じ。(3) Color reagent II Same as Example 3.

〔試料〕〔sample〕

血清（実施例３と同じ。） 〔操作シ去〕 血清５０ＪＬ文をとり、基質緩衝液１１を加え３７℃で
３０分間加温したのち、発色試液Ｉを１ｍｌ、発色試液
ＩＩを２ｍｌ加え、更に３７℃で１０分間加加温後薬ブ
ランクを対照として８１］Ｏｎｍの吸光度を測定した（
Ｅ　Ｓ）。Serum (same as in Example 3) [Procedure] Take 50 JL of serum, add substrate buffer 11, and warm at 37°C for 30 minutes, then add 1 ml of Color Reagent I and 2 ml of Color Reagent II, and then add After heating at 37°C for 10 minutes, the absorbance at 81] Onm was measured using the drug blank as a control (
ES).

別に、基質緩衝液１１をとり３７°Ｃで３０分間加温し
たのち、発色試液Ｉを１１、同一血清を５０ｐ、ｌ、発
色試液■を２ｍｌ加え、更に３７℃で１０分間加加温後
薬ブランクを対照として８９０ｒ＋＋ｗの吸光度を測定
した（ＥＳＢ）。Separately, take substrate buffer 11 and warm it at 37°C for 30 minutes, then add 11 coloring reagent I, 50p, 1 of the same serum, and 2ml of coloring reagent ■, and after further heating at 37°C for 10 minutes, Absorbance at 890r++w was measured using a blank as a control (ESB).

実施例３と比較例３の結果を表３に示した。Table 3 shows the results of Example 3 and Comparative Example 3.

表　　３ 表３より明らかな如〈実施例３の検体ブランク（Ｅ　Ｓ
Ｂ）は０．００５であり測定誤差の範囲内であるが、比
較例３のＥＳＢはタンパク質が発色しているため０．１
８３と高値を示す。しかし検体の吸光度（Ｅ　Ｓ）から
検体ブランクの吸光度（ＥＳＢ）を差引いた値は実施例
３のそれと有意差はない。Table 3 As is clear from Table 3, the sample blank of Example 3 (E S
B) is 0.005, which is within the measurement error range, but the ESB of Comparative Example 3 is 0.1 because the protein is colored.
It shows a high value of 83. However, the value obtained by subtracting the absorbance of the sample blank (ESB) from the absorbance of the sample (ES) is not significantly different from that of Example 3.

実施例　４　トリフェニルメタン系ロイコ色素による過
酸化水素の比色定量法 〔試薬〕 （１）発色試液 ０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）にビス（４−
Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノフェニル）　−３，４−ジソジ
ウムスルホブロポキシフェニルメタン（以下ＢＳｄｉｐ
ｒｏ　ＰＭと略称する。）　０．０５ｍｍｏｌ／ｌ　　
ペルオキシダーゼ３，０００　Ｕｉを含む溶液を調製し
た。Example 4 Colorimetric determination of hydrogen peroxide using triphenylmethane-based leuco dye [Reagents] (1) Color reagent: Bis(4-
BSdip
It is abbreviated as ro PM. ) 0.05 mmol/l
A solution containing 3,000 Ui of peroxidase was prepared.

（２）前処理液 ０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中にＳｉｇｍａ
社製のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来
のプロテアーゼ５．０００　Ｕｉを含む溶液を調製した
。(2) Sigma in pretreatment solution 0.1M phosphate buffer (pH 7,0)
A solution containing 5.000 Ui of Streptomyces griseus-derived protease manufactured by Streptomyces griseus was prepared.

（３）標準液 ０．８８ｍｍｏｌ／ｌの過酸化水素水溶液を調製した。(3) Standard solution A 0.88 mmol/l hydrogen peroxide aqueous solution was prepared.

〔操作法〕[How to operate]

７％アルブミン溶液５０７Ｌｕをとり前処理液０．２１
を加え３７°Ｃで１０分間加温後発色試液３１を加えｔ
＝。ついで標準液２０１１．ｌを加えて室温で１０分間
放置後、試薬ブランクを対照として８２０ｎｍの吸光度
を測定した（Ｅ　Ｓｌ）。Take 7% albumin solution 507Lu and pre-treatment solution 0.21
Add and heat at 37°C for 10 minutes, then add color reagent 31.
=. Next, standard solution 2011. 1 was added and left at room temperature for 10 minutes, and the absorbance at 820 nm was measured using a reagent blank as a control (E Sl).

別に、７％アルブミン溶液５０ル文をとり０．１Ｍリン
酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）　０．２ｍｌを加え３７℃
で１０分間加温後発色試液３１を加えた。ついで標準液
２０店文を加えて室温で１０分間放置後、試薬ブランク
を対照として８２０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ　Ｓ２
）・ 更に別に、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，ｏ）０．
２ｍｌをとり蒸留水５０ｐＬＪＬ、発色試大３１、つい
で標準液２０＃Ｌ文を加えて室温で１０分間放置後、試
薬ブランクを対照としてｆ（２０ｎｍの吸光度を測定し
た（Ｅ　Ｓ３）。Separately, take 50 ml of 7% albumin solution, add 0.2 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and mix at 37°C.
After heating for 10 minutes, color reagent solution 31 was added. Next, 20 standard solutions were added and left at room temperature for 10 minutes, and the absorbance at 820 nm was measured using the reagent blank as a control (E S2
)・Furthermore, 0.1M phosphate buffer (pH 7, o) 0.
2 ml was taken, and 50 pLJL of distilled water, color reagent 31, and 20#L standard solution were added, and after being left at room temperature for 10 minutes, the absorbance at f(20nm) was measured using the reagent blank as a control (ES3).

表４より明らかな如＜ＥＳ２はプロテアーゼによる前処
理をしていないためアルブミンの影響をうけ、７％アル
ブミン溶液を添加しないＥＳ３の吸光度に比べて低値を
示しているが、本発明に係るプロテアーゼによる前処理
を行ったＥＳＩではＥＳ３と有意差のない測定値が得ら
れた。As is clear from Table 4, ES2 is affected by albumin because it is not pretreated with protease, and shows a lower absorbance than ES3 without 7% albumin solution. ESI pre-processed with ES3 yielded measured values with no significant difference from ES3.

実施例　５　血清鉄測定法 〔試薬〕 （１）前処理液 ０．０５Ｍリン酸塩緩衝液中にトリプシン（和光紬薬工
業■製）　５，０００　Ｕｎ、アスコルビン酸ナトリウ
ム０．２％、及びバソフェナンドロリンスルホン酸ナト
リウム０．００１％を含有する溶液を調製した。Example 5 Serum iron measurement method [Reagents] (1) Pretreatment solution 0.05M phosphate buffer containing 5,000 Un of trypsin (manufactured by Wako Tsumugi Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.2% sodium ascorbate, and A solution containing 0.001% sodium phenandroline sulfonate was prepared.

（２）発色試液 ２−二トロン−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピ
ルアミノ）フェノール塩酸塩（Ｎｉｔｒｏｓ。(2) Color reagent solution 2-nitrone-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)phenol hydrochloride (Nitros).

−ＰＳＡＰ）の０．０８％水溶液を調製した。A 0.08% aqueous solution of -PSAP) was prepared.

〔試料〕〔sample〕

血清 〔操作法〕 血清２００ＩＬｌをとり、前処理液２．０１を加え、３
７°Ｃで１０分間加温後発色試液０．０５ｍ１を加えて
試薬ブランクを対照として波長７５０ｎｍの吸光度を測
定した　（ＥＳ）。Serum [Procedure] Take 200IL of serum, add 2.01ml of pretreatment solution,
After heating at 7°C for 10 minutes, 0.05 ml of coloring reagent was added, and the absorbance at a wavelength of 750 nm was measured using a reagent blank as a control (ES).

別に、鉄２００１１．ｇ／旧を含む標準液２００に文を
とり、同一操作により吸光度を測定した（ＥＳｔｄ）。Separately, iron 20011. A sample was added to a standard solution containing 200 g/old, and the absorbance was measured by the same procedure (EStd).

次式より血清中の鉄濃度を算出した。The iron concentration in serum was calculated using the following formula.

比較例　４　血清鉄測定法 実施例５と同じ血清５００ＩＬｉをとり、ＩＮ塩酸１．
０１を加え８０〜８５°Ｃで約２分間加熱した後、２０
％トリクロル酢酸溶液１１を加えて撹拌後遠心分離した
。その上清２．０ｍｌをとり０．１％アスコルビン酸溶
液１ｍｌを加え、ついで０．０４％バソフェナンドロリ
ンスルホン酸ナトリウム溶液１１を加え試薬ブランクを
対照として波長５３３ｎｍの吸光度を測定した（　Ｅ　
Ｓ）。Comparative Example 4 Serum iron measurement method 500 ILi of the same serum as in Example 5 was taken, and IN hydrochloric acid 1.
Add 01 and heat at 80-85°C for about 2 minutes, then add 20
After adding 11% trichloroacetic acid solution and stirring, the mixture was centrifuged. 2.0 ml of the supernatant was taken, 1 ml of 0.1% ascorbic acid solution was added, and then 0.04% sodium bathophenandroline sulfonate solution 11 was added, and the absorbance at a wavelength of 533 nm was measured using the reagent blank as a control (E
S).

鉄２００ルｇ／ｄ　ｌを含む標準液４０ＯＩＬ文をとり
、ＩＮ塩酸０．８ｍｌ、２０％トリクロル酢酸０．８ｍ
ｌ。Take 40 OIL of standard solution containing 200g/dl of iron, add 0.8ml of IN hydrochloric acid, 0.8ml of 20% trichloroacetic acid.
l.

０．１％アスコルビン酸溶液１ｆｆｌｌを加え、ついで
０．０４％バソフェナンドロリンスルホン酸ナトリウム
溶液１ｍｌを加え試薬ブランクを対照として波長５３３
ｎｍの吸光度を測定した（　Ｅ　５ｔｄ）。Add 1 ffll of 0.1% ascorbic acid solution, then add 1 ml of 0.04% sodium bathophenandroline sulfonate solution, and use the reagent blank as a reference at wavelength 533.
The absorbance at nm was measured (E5td).

次式により血清中の鉄濃度を算出した。The iron concentration in serum was calculated using the following formula.

実施例５と比較例４の結果を表５に示した。The results of Example 5 and Comparative Example 4 are shown in Table 5.

表　　５ 実施例５と比較例４は、相関係数γ＝　０．９９７４゜
回帰式Ｙ　＝　１．０２７　Ｘ　−５，３となり有意差
は認められなかった。Table 5 Between Example 5 and Comparative Example 4, correlation coefficient γ = 0.9974° regression equation Y = 1.027 X -5,3, and no significant difference was observed.

実施例　６　血清中のグアナーゼ活性測定法〔試薬〕 （１）基質緩衝液 ０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ７，２）中にグアニン
０．１ｍｍｏｌ／ｌ、及びＳｉｇｍａ社製のＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ１，
０００　Ｕ／ｕを含む溶液を調製した。Example 6 Method for measuring guanase activity in serum [Reagents] (1) Substrate buffer 0.1 mmol/l of guanine in 0.05 M phosphate buffer (PH 7,2) and Strep manufactured by Sigma
protease 1 from Tomyces griseus,
A solution containing 000 U/u was prepared.

（２）発色試液■ サリチル酸ナトリウム８％、ニトロプルシ・ントナトリ
ウム０．４％を含む溶液を調製した。(2) Color reagent solution ■ A solution containing 8% sodium salicylate and 0.4% sodium nitropruscinto was prepared.

（３）発色試液ＩＴ 水酸化ナトリウムＯ，７％、次亜塩素酸ナトリウム０．
０５％を含む水溶液を調製した。(3) Color reagent IT sodium hydroxide O, 7%, sodium hypochlorite 0.
An aqueous solution containing 0.05% was prepared.

〔試料〕〔sample〕

血清 〔操作法〕 血清５０弘文をとり基質緩衝液１１を加え３７℃で３０
分間加温した。ついで発色試液Ｉを１１、発色試液ＩＩ
を２ｍｌ加え更に３７℃でｌＯ分間加温後試薬ブランク
を対照として６９０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ９）。Serum [Procedure] Take 50 pieces of Hirofumi serum, add 11 pieces of substrate buffer, and heat at 37°C for 30 minutes.
Warmed for minutes. Next, add color reagent I to 11 and color reagent II.
After adding 2 ml of the solution and further heating at 37° C. for 10 minutes, the absorbance at 690 nm was measured using the reagent blank as a control (E9).

同一血清５０ル文をとり、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（
ｐＨ７，２）中に９ｉｇｍａ社製のＳｔｒｅｐｔｏＩｌ
ｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ由来のプロテアーゼ１，０００
　Ｕ／文を含む溶液１ｍｌを加え３７℃で３０分間加温
した、その後発色試液Ｉを１ｍｌ、発色試液ＩＩを２ｍ
ｌ加え更に３７°Ｃで１０分間加加温後薬ブランクを対
照としてＢ９０ｎｍの吸光度を測定した（ＥＳＢ）。Take 50 μl of the same serum and add it to 0.05M phosphate buffer (
StreptoIl manufactured by 9igma in pH 7.2)
yces griseus derived protease 1,000
Add 1 ml of the solution containing U/text and warm at 37°C for 30 minutes, then add 1 ml of Color Reagent I and 2 ml of Color Reagent II.
After further heating at 37°C for 10 minutes, absorbance at B90 nm was measured using a drug blank as a control (ESB).

比較例　５　血清中のグアナーゼ活性測定法〔試薬〕 （１）基質緩衝液 ０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＨ７，２）中にグアニン
０．１ｍｍｏｌ／Ｉを含む溶液を調製した。Comparative Example 5 Method for Measuring Guanase Activity in Serum [Reagents] (1) Substrate Buffer A solution containing 0.1 mmol/I of guanine in 0.05 M phosphate buffer (PH 7,2) was prepared.

（２）発色試液Ｉ 実施例６と同じ。(2) Color reagent I Same as Example 6.

（３）発色試液ＩＩ 実施例６と同じ。(3) Color reagent II Same as Example 6.

〔試料〕〔sample〕

血清（実施例６と同じ。） 〔操作法〕 血清５０ＩＬ文をとり基質緩衝液１ｍｌを加え３７℃で
３０分間加温した。その後発色試液Ｉを１１、発色試液
ＩＩを２１加え、更に３７℃でｌＯ分間加温後試薬ブラ
ンクを対照として８１１０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ
Ｓ）。Serum (same as in Example 6) [Procedure] 50 IL of serum was taken, 1 ml of substrate buffer was added, and the mixture was heated at 37° C. for 30 minutes. Thereafter, 11 parts of Color Reagent I and 2 parts of Color Reagent II were added, and after further heating at 37°C for 10 minutes, the absorbance at 8110 nm was measured using the reagent blank as a control (E
S).

別に基質緩衝液１１をとり３７℃で３０分間加温した後
、発色試液工を１ｍｌ、同一血清を５０ｐ−１、発色試
液ＩＩを２ｍｌ加え更に３７℃で１０分間加加温後薬ブ
ランクを対照として８９０ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ
　ＳＢ）・ 実施例６と比較例５の結果を表６に示した。Separately, take substrate buffer 11 and warm it at 37℃ for 30 minutes, then add 1ml of color reagent, 50p-1 of the same serum, and 2ml of color reagent II, and after further heating at 37℃ for 10 minutes, use a drug blank as a control. The absorbance at 890 nm was measured as (E
SB) The results of Example 6 and Comparative Example 5 are shown in Table 6.

表　　６ 表６より明らかな如〈実施例６の検体ブランク（Ｅ　Ｓ
Ｂ）は０．００３であり測定誤差の範囲内であるが、比
較例５のＥＳＢはタンパクが発色しているため０．１９
Ｂと高値を示した。しかし、検体の吸光度（Ｅ　Ｓ）か
ら検体ブランクの吸光度（ＥＳＢ）を差引いた値は、実
施例６と比較例５に有意差はない。Table 6 As is clear from Table 6, the sample blank of Example 6 (E S
B) is 0.003, which is within the measurement error range, but the ESB of Comparative Example 5 is 0.19 because the protein is colored.
It showed a high value of B. However, there is no significant difference between Example 6 and Comparative Example 5 in the value obtained by subtracting the absorbance of the sample blank (ESB) from the absorbance of the sample (ES).

「発明の効果」 以上述べた如く、本発明は、共存するタンパク質の影響
をプロテアーゼを用いることにより回避した生体体液成
分の測定法を提供するものであり、従来行われていたタ
ンパク質の妨害作用回避方法の欠点である測定時間がか
かる、操作が繁雑である、測定上の妨・害を生じる等の
点を改善した点に顕著な効果を奏する発明であって斯業
に貢献するところ大なる発明である。"Effects of the Invention" As described above, the present invention provides a method for measuring biological fluid components that avoids the influence of coexisting proteins by using protease, and avoids the interference effect of proteins that has been conventionally performed. An invention that has a remarkable effect on improving the shortcomings of the method, such as the long measurement time, complicated operations, and interference with measurement, and is a great invention because it contributes to this industry. It is.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）被検試料中に共存するタンパク質により影響を受
けて測定値に正又は負の誤差を生じる生体体液成分の測
定に於て、該タンパク質をプロテアーゼを用いて分解す
ることによりその影響を回避し、該測定を行うことを特
徴とする、生体体液成分の測定法。(1) When measuring biological body fluid components that are affected by proteins coexisting in the test sample and cause positive or negative errors in measurement values, avoid such effects by decomposing the proteins using protease. A method for measuring biological fluid components, characterized in that the measurement is performed. （２）生体体液成分の測定が、インドフェノール法によ
るアンモニアの比色定量法を用いてこれを行う特許請求
の範囲第１項に記載の測定法。(2) The measuring method according to claim 1, wherein the measurement of biological body fluid components is performed using a colorimetric determination method of ammonia based on the indophenol method. （３）生体体液成分の測定が、トリフェニルメタン系ロ
イコ色素を発色剤として用いてこれを行う特許請求の範
囲第１項に記載の測定法。(3) The measurement method according to claim 1, wherein the measurement of biological fluid components is performed using a triphenylmethane-based leuco dye as a coloring agent. （４）生体体液成分の測定が、タンパク質と結合してい
る目的金属をタンパク質との結合から解き金属イオンを
遊離させることにより行う金属イオンの定量である特許
請求の範囲第１項に記載の測定法。(4) The measurement according to claim 1, wherein the measurement of biological fluid components is a metal ion quantification performed by dissolving the target metal bound to the protein from its binding to the protein and liberating the metal ion. Law.