JPS61219381A - Human-human hybridoma - Google Patents

Abstract

PURPOSE:A human-human hybridoma for producing anti-tetanus antibody, having improved multiplication properties free from problem antigenecity, obtained by subjecting a cell having specific multiplication properties and a cell having specified antibody-forming properties to cell fusion. CONSTITUTION:A human-human hybridoma obtained by subjecting a human derived established cell having sensitivity to HAT and resistance to obtain a a B cell (cell-line) having a human derived anti-tetanus antibody-forming properties transformed with an anti-lymphocyte virus (e.g. Epstein-Barr virus, etc.) to cell fusion. Since this hybridoma is derived from human, it has no problem with regard to antigenecity of antibody produced by the hybridoma to human and can provide antibody-forming cell having more improved antibody- forming ability especially multiplication properties than a hybridoma obtained by simple cell fusion of a human-derived established B cell and a human-derived anti-tetanus antibody-forming B cell, or one obtained by transforming the human- derived anti-tetanus antibody-forming B cell with the anti-lymphocyte virus.

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、新規なヒト−ヒトハイプリドーマに関する。[Detailed description of the invention] 〔Technical field〕 The present invention relates to novel human-human hybridomas.

更に詳しくは、本発明は抗破傷風抗体産生能を有するヒ
ト−ヒトハイプリドーマに関する。More specifically, the present invention relates to a human-human hybridoma capable of producing anti-tetanus antibodies.

本発明に係るヒト−ヒトハイプリドーマは、破傷風菌に
対するモノクローナル抗体の生産に利用でき、しかも、
その細胞系がヒト由来のものであることから、当該ハイ
ブリドーマによって産生される抗体は、抗原性に関する
問題がない点においプーム価μ十さｆｒ力り昆志！、ナ
ー＾す仝■ＨアあＡ−〔従来技術〕 破傷風抗体は破傷風菌による感染を受けた人に投与する
ことにより、破傷風の発症を防止する効果のあることが
判っている。また、破傷風発症の防止と共に破傷風抗体
の投与により感染を未然に防ぐことも次第に明らかにな
っており、医学的に貢献度の高いものとして期待されて
いる。The human-human hybridoma according to the present invention can be used for producing monoclonal antibodies against Clostridium tetani, and furthermore,
Since the cell line is of human origin, the antibodies produced by the hybridoma have no problems with antigenicity and have an odor value of 10%. [Prior art] Tetanus antibodies have been found to be effective in preventing the onset of tetanus when administered to people infected with Clostridium tetani. In addition, it has become increasingly clear that administration of tetanus antibodies can prevent the onset of tetanus and infection, and is expected to make a significant medical contribution.

ところで、一般に抗体にはポリクローナル抗体とモノク
ローナル抗体の二種類があるが、最近は増殖性を有する
癌化リンパ様細胞系を用いてモノクローナル抗体を製造
する技術が注目を集めている。このモノクローナル抗体
は、−個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体
であるが、その生産方法としては、現在、細胞融合法と
形質転換法がある。どちらも増殖性と抗体産生能を同時
に兼ね備えた細胞を調製するもので、前者は免疫された
供給者のＢ細胞を骨髄腫細胞とｉｎ　ｖｉｔｒ。By the way, there are generally two types of antibodies: polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and recently, a technique for producing monoclonal antibodies using a cancerous lymphoid cell line with proliferative properties has been attracting attention. This monoclonal antibody is a single antibody that reacts only with - antigenic determinants, and currently there are two methods for its production: cell fusion and transformation. Both methods prepare cells that have proliferative and antibody-producing abilities at the same time, and the former involves in vitro combining B cells from an immunized donor with myeloma cells.

で融合させる方法であり、後者は免疫した供給者のＢ細
胞をＥｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒウィルス等の向リンパ性
ウィルスに感染させて増殖可能な形に変換させる方法で
ある。The latter method involves infecting the immunized donor's B cells with a lymphotropic virus such as Epstein Barr virus and converting them into a form capable of proliferating.

これらの製造方法は未だ未熟であり、その抗体産生量の
改善、毒素である抗原を使用することに対する安全対策
、夾雑抗原の精製の困難性の克服などの未解決の問題点
も多く、実用化には多くの困難がある。即ち、細胞融合
法を用いた場合は、融合効率の低さと、全リンパ球の中
に存在する抗破傷風抗体産生細胞の割合の低さにより、
満足のいく抗体産生ハイブリドーマは得られていない。These production methods are still in their infancy, and there are many unresolved issues such as improving the amount of antibody produced, taking safety measures against the use of antigens that are toxins, and overcoming the difficulty of purifying contaminant antigens. has many difficulties. That is, when using the cell fusion method, due to the low fusion efficiency and the low proportion of anti-tetanus antibody producing cells among all lymphocytes,
Satisfactory antibody-producing hybridomas have not been obtained.

また、形質転換法を用いる場合、非常に高い確率で株化
細胞は得られるが、クローニング効率が数％と非常に低
いのが弱点である。Furthermore, when using the transformation method, established cell lines can be obtained with a very high probability, but the drawback is that the cloning efficiency is extremely low at a few percent.

また、生産される抗体の抗原性についての問題は、ヒト
と免疫反応を起こさない動物の細胞系を用いることによ
って解決されるが、一般的にはヒト由来の細胞系を用い
ることにより安全性が保たれることが判っている。しか
し、この場合も抗体産生能および増殖性について必ずし
も満足な結果が得られるまでには至っていない。In addition, the issue of antigenicity of the produced antibodies can be solved by using animal cell lines that do not cause immune reactions with humans, but in general, using human-derived cell lines is safer. It is known that it will be preserved. However, even in this case, satisfactory results regarding antibody productivity and proliferation have not yet been obtained.

本発明者らは、完全でかつ大量生産可能な抗破傷風抗体
産生細胞系の確立の一環として、抗原性の問題のないヒ
ト−ヒトハイブリドーマについて鋭意研究を重ねた結果
、上述したような抗体生産に係わる諸問題を克服する手
段として、新規な親細胞であるＨＡＴ　（ヒボキサンチ
ン・アミノプテリン・チミジン）感受性ウアバイン耐性
を有するヒト由来株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）と
Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒウィルス等の向リンパ性ウィ
ルスによって形質転換させたヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞とを細胞融合させることにより、増殖性が高く
、しかも抗原性の問題もないヒト−ヒトハイブリドーマ
が得られることを見いだし、本発明を完成した。As part of our efforts to establish a complete anti-tetanus antibody-producing cell line that can be mass-produced, the present inventors have conducted intensive research on human-human hybridomas that do not have antigenicity problems, and have found that the above-mentioned antibody production is possible. As a means to overcome these problems, we have developed a new parent cell line, a human-derived B cell line (cell 1ine) that is sensitive to HAT (hyboxanthin, aminopterin, and thymidine) and resistant to ouabain, and a lymphotropic virus such as Epstein Barr virus. The present invention was completed based on the discovery that a human-human hybridoma with high proliferative properties and no antigenicity problems could be obtained by cell fusion with transformed human-derived anti-tetanus antibody-producing B cells.

（発明の開示〕 本発明は、増殖性に優れ、抗原性の問題もない抗破傷風
抗体産生のためのヒト−ヒトハイブリドーマを提供する
ことを目的とするものであり、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウ
アバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）　と
、向リンパ性ウィルスによって形質転換されたヒト由来
抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを融合させて得られたヒト
−ヒトハイブリドーマに関する。(Disclosure of the Invention) The purpose of the present invention is to provide a human-human hybridoma for producing an anti-tetanus antibody that has excellent proliferative properties and is free from antigenic problems, and is a human-derived HAT-sensitive ouabain-resistant strain. The present invention relates to a human-human hybridoma obtained by fusing a human-derived B cell (cell 1ine) with a human-derived anti-tetanus antibody-producing B cell transformed by a lymphotropic virus.

本発明における細胞融合は、増殖性を持った細胞と抗体
産生性を持った細胞とによって行われる。Cell fusion in the present invention is performed using proliferative cells and antibody-producing cells.

本発明において、抗体産生性細胞として向リンパ性ウィ
ルスによって形質転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞を用いる。In the present invention, human-derived anti-tetanus antibody-producing B cells transformed by a lymphotropic virus are used as antibody-producing cells.

当該Ｂ細胞は自体既知の手段によって調製され、その調
製法としては、たとえば次の如き方法が例示される。The B cells are prepared by means known per se, and examples of the preparation method include the following methods.

当該Ｂ細胞を得るための破傷風抗原は、破傷風菌が生成
する分子量１５万、等電点５．１の蛍白毒素であり、菌
体外毒素であり、通常、市販の無毒化トキソイド、破傷
風菌を培養後、培養液を精製したもの等が用いられる。The tetanus antigen used to obtain the B cells is fluorescent white toxin with a molecular weight of 150,000 and an isoelectric point of 5.1 produced by Clostridium tetani, which is an extracellular toxin and is usually commercially available detoxified toxoid or Clostridium tetani. After culturing, a purified culture solution is used.

こうして得られる破傷風抗原の抗原性を高めておくため
に、蛋白変性剤の存在下、加熱処理を施すことも可能で
ある。抗原はさらに免疫用に高度に精製しておくことが
望ましい。In order to increase the antigenicity of the tetanus antigen thus obtained, it is also possible to heat it in the presence of a protein denaturing agent. It is desirable that the antigen be further purified to a high degree for immunization.

上記破傷風抗原によるＢ細胞の抗体産生の刺激は、ｉｎ
　ｖｉｖｏあるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる。１ｎ
ｖｉｖｏの場合は、公知の方法を用いればよく、例えば
破傷風抗原をヒトの皮肉に２〜３回接種し、最終免疫の
数日後、採血を行い、得られた血液からＢ細胞を回収、
精製することにより、所望のヒト由来抗破傷風抗体産生
性Ｂ細胞が得られる。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの場合は
、Ｂ細胞を先にヒト生体外に取り出し、そのまま、ある
いは培養した後、破傷風抗原で刺激することによって行
われる。破傷風抗原による生体外での刺激は、例えば精
製抗原の適量とＢ細胞とを３０〜４０℃で１０〜５０時
間接触させることによって行われ、一般的には培地中で
行われる。Ｂ細胞の分離は、好適にはファイコール・コ
ンレイの比重遠心法によって行われる。Stimulation of antibody production by B cells by the tetanus antigen is in
It can be done in vivo or in vitro. 1n
In the case of vivo, known methods may be used, such as inoculating a human with tetanus antigen two to three times, collecting blood several days after the final immunization, and collecting B cells from the obtained blood.
By purification, desired human-derived anti-tetanus antibody-producing B cells can be obtained. In the case of in vitro testing, B cells are first taken out of the human body and stimulated with tetanus antigen either directly or after culturing. In vitro stimulation with tetanus antigen is performed, for example, by contacting an appropriate amount of purified antigen with B cells at 30 to 40°C for 10 to 50 hours, and is generally performed in a culture medium. Isolation of B cells is preferably carried out by Ficoll-Conray specific gravity centrifugation.

かくして得られたＢ細胞は、向リンパ性ウィルスによっ
て増殖型に形質転換される。The B cells thus obtained are transformed into a proliferative form by a lymphotropic virus.

形質転換には、向リンパ性ウィルス、たとえばＥｐｓｔ
ｅｉｎ　Ｂａｒｒウィルスが用いられる。当８亥ウィル
スは、正常細胞を増殖型の細胞に形質転換させるウィル
スとして知られる（　Ｎａｔｕｒｅ　２６９．４２０−
４２２（１９７７））　、　Ｂ　９５−８山来Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ　Ｂａｒｒウイルス〔マイコプラズマフリー　８
９５−８培地からの（培養）上清としてうる〕を用い、
あらかじめ細胞転換可能量のウィルスを調製する。かく
して調製されたウィルスをＢ細胞の培養系培地に適量滴
下し、好ましくは３７℃において５〜２０日間接触させ
る。Ｂ細胞の培養は、例えば３７℃、５％牛脂児血清中
で行う。また、この培養は培地にグルタミンを添加した
培養培地中で行ってもよい。For transformation, lymphotropic viruses such as Epst
Ein Barr virus is used. This virus is known as a virus that transforms normal cells into proliferative cells (Nature 269.420-
422 (1977)), B 95-8 Yamaki Epst
ein Barr virus [mycoplasma free 8
95-8 medium, which can be obtained as a (culture) supernatant],
Prepare in advance an amount of virus that can transform cells. An appropriate amount of the thus prepared virus is dropped into a culture medium of B cells, and the virus is preferably kept in contact with the culture medium at 37° C. for 5 to 20 days. B cells are cultured, for example, at 37° C. in 5% tallow serum. Moreover, this culture may be performed in a culture medium to which glutamine is added.

こうして形質転換により得られた増殖型Ｂ細胞を継代培
養し、この細胞から破傷風抗原に対する抗体を産生ずる
細胞を選別、濃縮する。The proliferating B cells thus obtained by transformation are subcultured, and cells that produce antibodies against tetanus antigen are selected and concentrated from these cells.

抗破傷風抗体を産生ずる細胞は、例えばＰＨＡ法、ＥＲ
Ａ法、ＰＨＡ法等により追跡される。Cells that produce anti-tetanus antibodies can be prepared using, for example, the PHA method, ER
Tracked by method A, PHA method, etc.

本発明に関して、増殖性をもつ細胞として、ヒト由来Ｈ
ＡＴ惑受性ウアバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉ
ｎｅ　）が用いられる。当該ヒト由来ＨＡＴ感受性ウア
バイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）は、公
知の方法により調製され得る。例えば、ヒト由来ＨＡＴ
感受性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）を培養する
際に、培地中のウアバイン濃度を長時間にわたり上昇さ
せていくことにより、自然発生的なウアバイン耐性細胞
が得られる。この操作により、細胞が本来有していた性
質（ＨＡＴ感受性、融合効率、増殖性など）に影響を及
ぼさずにウアバイン耐性というマーカー機能を持たせる
ことができ、選択が容易になる。Regarding the present invention, human-derived H.
AT-susceptible ouabain-resistant B cell line (cell 1i
ne) is used. The human-derived HAT-sensitive ouabain-resistant B cell line (cell 1ine) can be prepared by a known method. For example, human-derived HAT
When culturing a sensitive B cell line (cell 1ine), naturally occurring ouabain-resistant cells can be obtained by increasing the ouabain concentration in the medium over a long period of time. By this operation, the marker function of ouabain resistance can be imparted to the cells without affecting their inherent properties (HAT sensitivity, fusion efficiency, proliferative ability, etc.), and selection becomes easy.

こうして得られた形質転換により増殖性を有するヒト由
来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とヒト由来ＨＡＴ惑受性ウ
アバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌｌｉｎｅ　）とを用
いて細胞融合を行う。細胞融合は自体既知の手段にて行
われるが、その−例は増殖性を持った細胞と抗体を産生
じている前記Ｂ細胞とをポリエチレングリコールの存在
下で反応せしめる。混合比は増殖性細胞１個に対して、
Ｂ細胞１〜１０個が適当である。Cell fusion is performed using the thus obtained transformed human-derived anti-tetanus antibody-producing B cells that have proliferative properties and the human-derived HAT-susceptible ouabain-resistant B cell line (cellline). Cell fusion is carried out by means known per se, an example of which is to react proliferative cells with the antibody-producing B cells in the presence of polyethylene glycol. The mixing ratio is for one proliferative cell,
1-10 B cells is suitable.

こうして得られた融合細胞は、ＨＡＴ＋ウアバイン添加
培地により選択されるが、それは以下のような根拠に基
づく。ＨＡＴ感受性とは、培地中にＨＡＴが存在すると
綱１？−：が成育あるいは増殖できない性質をさし、ウ
アバイン耐性とは高濃度のウアバイン存在下でも細胞が
増殖可能となることである。又、ウアバイン耐性細胞と
正常細胞とを融合させたものはウアバイン耐性となるこ
とが知られている。従って、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウア
バイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）とヒト
由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞（このＢ細胞はＨＡＴ感
受性、ウアバイン耐性ともにない）を融合させた場合、
培地中にＨＡＴ＋ウアバインが存在していれば、融合し
なかった株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）はＨＡＴ感
受性のために、また融合しなかったＢ細胞もウアバイン
耐性ではないために増殖できない。しかし、融合できた
細胞はウアバイン耐性のために増殖可能となる。こうし
て融合細胞のみを選別することができる。The thus obtained fused cells are selected using a medium supplemented with HAT and ouabain, based on the following rationale. HAT sensitivity means that if HAT is present in the medium, class 1? -: refers to the property of not being able to grow or proliferate, and ouabain resistance means that cells can proliferate even in the presence of high concentrations of ouabain. Furthermore, it is known that a fusion of ouabain-resistant cells and normal cells becomes ouabain-resistant. Therefore, when a human-derived HAT-sensitive ouabain-resistant B cell line (cell 1ine) is fused with a human-derived anti-tetanus antibody-producing B cell (this B cell is neither HAT-sensitive nor ouabain-resistant),
If HAT+ouabain is present in the medium, the unfused B cell line (cell 1ine) cannot proliferate because it is sensitive to HAT, and the unfused B cells are also not ouabain resistant. However, the fused cells are able to proliferate due to ouabain resistance. In this way, only fused cells can be selected.

さらに、目的とする抗破傷風抗体を産生じている細胞を
公知の方法によりスクリーニングおよびクローニングし
て、抗破傷風抗体産生ヒト−ヒトハイブリドーマを得る
。Furthermore, cells producing the desired anti-tetanus antibody are screened and cloned by known methods to obtain anti-tetanus antibody-producing human-human hybridomas.

こうして得られたハイブリドーマはヒト由来であるため
、ハイブリドーマが産生じた抗体のヒトに対する抗原性
についても問題はなく、また単にヒト由来株化Ｂ細胞（
ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）とヒト由来抗破傷風抗体産生性
Ｂ細胞を細胞融合させたもの、あるいは、ヒト由来抗破
傷風抗体産生性Ｂ細胞をＥｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒウィ
ルスで形質転換させただけのものに比べて、抗体産生能
および特に増殖性に優れた抗体産生細胞を得ることがで
きる。Since the hybridomas obtained in this way are of human origin, there is no problem with the antigenicity of the antibodies produced by the hybridomas to humans.
cell 1ine) and human-derived anti-tetanus antibody-producing B cells, or human-derived anti-tetanus antibody-producing B cells simply transformed with Epstein Barr virus. In addition, antibody-producing cells with particularly excellent proliferative properties can be obtained.

このハイブリドーマを成育培地で増殖させることにより
、モノクローナル抗体を連続的に産生せしめて、次いで
培地から抗体を回収することができる。By growing this hybridoma in a growth medium, monoclonal antibodies can be continuously produced and then recovered from the medium.

以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこ
れらに限定されない。EXAMPLES The present invention will be explained below with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例１ 健康な大人の志願者各々にテタヌストキソイド（０，５
ｍ１）のブースター（補助注射）免疫法を行った。この
注射から約４日月を初日として一定の時間間隔で採血し
た。この末梢血液からファイコール・コンレイ比重遠心
法によりリンパ球を単離した後、Ｅ−ロゼツト形成によ
りＴ細胞を除いてＢ細胞のみを得た。このＢ細胞はＲＰ
ＭＩ　１６４０＋１５％ウシ胎児血清＋２ｍＭグルタミ
ンの培地で培養しておく　（ｆ！胞濃度Ｉ　Ｘ　１０６
個／ｍｌ）　、　一方、Ｂ９５−８細胞（マーモセント
リンパ球株化細胞）をＲＰＭＩ　１６４０＋　２０％ウ
シ胎児血清培養液で培養し、数日後、培養上清を分取し
たものをＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒウィルス液として用い
た（濃度１０５転換用量／１）。上述したＢ細胞培養培
地１１にＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒウィルス液０．２１を
加え、怒染させて、培養液（ＲＰ旧１６４０＋２０％ウ
シ胎児血清）中、５％ＣＯ２下で３週間静置培養し、細
胞の増殖を行った。増殖した細胞から抗体産生細胞を回
収するために、限界希釈培養法を用い、ＥＬ　ｒ　ＳＡ
法でチェックしながら抗破傷風抗体産生性の継代培養細
胞を得た。Example 1 Healthy adult volunteers were each given tetanus toxoid (0,5
m1) booster (supplementary injection) immunization was performed. Blood was collected at regular time intervals starting approximately 4 days after this injection. Lymphocytes were isolated from this peripheral blood by Ficoll-Conley density centrifugation, and then T cells were removed by E-rosette formation to obtain only B cells. This B cell is RP
Culture in a medium containing MI 1640 + 15% fetal bovine serum + 2mM glutamine (f!cell concentration I x 106
On the other hand, B95-8 cells (marmocent lymphocyte cell line) were cultured in RPMI 1640+ 20% fetal bovine serum culture medium, and after a few days, the culture supernatant was collected and used as an Epstein Barr virus solution. (concentration 105 conversion doses/1). Epstein Barr virus solution 0.21 was added to the above-mentioned B cell culture medium 11, and the mixture was dyed and cultured for 3 weeks in a culture medium (RP old 1640 + 20% fetal bovine serum) under 5% CO2 to increase cell proliferation. I did it. In order to collect antibody-producing cells from the proliferated cells, limiting dilution culture method was used, and EL r SA
We obtained subcultured cells producing anti-tetanus antibodies while checking the results using a method.

一方、ヒト由来ＨＡＴ惑受性ウアバイン耐性株化Ｂ細胞
（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）は以下の方法により調製した
。On the other hand, a human-derived HAT-susceptible ouabain-resistant B cell line (cell 1ine) was prepared by the following method.

対数増殖期のヒト由来ＨＡＴ感受性株化Ｂ細胞（ｃｅｌ
ｌ　１ｉｎｅ　）を細胞数８個／＋ｍｌとなるように培
地（ＲＰＭｒ　１６４０＋　１０％ウシ胎児血清）で希
釈し、９５ｈａｌｌマイクロプレートを用いて１００ｐ
Ｊ／ｗｅｌｌで分注し、ｗｅｌ＋当たりの細胞数を０．
８個とした。A human-derived HAT-sensitive B cell line (cell
l 1ine) was diluted with medium (RPMr 1640 + 10% fetal bovine serum) to 8 cells/+ml, and plated at 100p using a 95-hall microplate.
Dispense in J/well, and set the number of cells per well+ to 0.
There were 8 pieces.

これを３７℃、５％ＣＯ２で約２週間培養した。This was cultured at 37°C and 5% CO2 for about 2 weeks.

その後、３０〜４０％のクローニング効率で細胞の増殖
がみられ、そのうちもっとも増殖性の良い細胞を約ｔｏ
ｅ個／１の細胞密度に調整した培養液に１０−７Ｍのウ
アバインを加えた培地で培養した。同様の培地交換を２
〜３度繰り返し、最後は１０″６Ｍのウアバインを加え
て培養した。その後、ウアバインを除いて培養を行い、
ごく少数の生存した細胞を増殖させた。約１ｏ日後、増
殖してきた細胞を遠心洗浄し、ｌＯ″ｆ１Ｍのウアバイ
ンを含む培地に１０５個／ｍｌとなるように細胞を浮遊
させ、９６ｈａｌｌマイクロプレートに１００μ／ｈａ
ｌｌとなるように分注した。これを−週間に２回の培地
交換で約１ケ月培養し、１０″ＩＩＩＭのウアバイン存
在下でも増殖する細胞を得た。After that, cell proliferation was observed with a cloning efficiency of 30-40%, and the most proliferative cells were approximately
The cells were cultured in a medium prepared by adding 10 −7 M ouabain to a culture solution adjusted to a cell density of e cells/1. 2 similar medium exchanges
Repeated ~3 times, and finally cultured by adding 10"6M of ouabain. After that, cultured without ouabain,
Only a few surviving cells were allowed to proliferate. After about 10 days, the proliferated cells were washed by centrifugation, suspended in a medium containing 1M ouabain at 105 cells/ml, and placed in a 96-hall microplate at 100μ/ha.
It was dispensed into 1 liter. This was cultured for about one month with medium exchange twice a week to obtain cells that proliferated even in the presence of 10'' IIIM of ouabain.

このＨＡＴ感受性ウアつイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ
　１ｉｎｅ　）　　１，５　ｘ　ｌ　９８個と上述の継
代培養細胞３Ｘ１０”個と混和し、５０％ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ１５００．ＢＤＨ製）０．３＋ｓｌ
を加え、３７℃で２分間、細胞融合を行わせた。細胞を
遠心洗浄した後、ＲＰＭＩ　１６４０４１０％ウシ胎児
血清培養液で細胞数をｌＸｌ０”個／ｍｌに調整し、９
６％４ａｌｌマイクロプレートに１００　ｐｊｉ／ｗｅ
ｌｌで分注した。ＨＡＴ＋ウアバイン選択培地〔ヒポキ
サンチア１３．６１Ｂ／１．７−、／７’テ！Ｊ７０．
１８ｍｇ／１１チミジン３．８８　ｍｇ／　ｌ、ウアバ
イ７０．５Ｘ１０″ＢＭ（全て最終濃度）〕は、ＰＥＧ
処理後、２４時間後に加えて２週間培養した。This HAT-sensitive, urein-resistant B cell line (cell
1ine) 1,5 x l 98 cells and 3 x 10'' subcultured cells described above, mixed with 50% polyethylene glycol (PEG1500. manufactured by BDH) 0.3 + sl
was added, and cell fusion was performed at 37°C for 2 minutes. After washing the cells by centrifugation, the number of cells was adjusted to 1×10” cells/ml with RPMI 16404 10% fetal bovine serum culture medium, and
100 pji/we in 6% 4all microplate
It was dispensed in 1 liter. HAT + Ouabain selective medium [Hypoxanthia 13.61B/1.7-, /7'te! J70.
18mg/11 Thymidine 3.88mg/l, Uabai 70.5X10″BM (all final concentrations)
After 24 hours of treatment, the cells were cultured for 2 weeks.

その結果、４３ｈｅ１１中２０ｗｅｌｌに細胞の増殖が
見られたので、これらの培養上清中の抗破傷風抗体活性
をＥＬｒＳＡ法で測定し、抗体産生の有無ヲ調べた（ス
クリーニング）。抗体産生の高かった１２−ｅｌｌにつ
いて細胞培養液をＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ウシ胎児
血清培養液で希釈して８個／ｍｌに調整し、９６ｈａｌ
ｌマイクロプレートに１００ｄ／ｗｅｌｌで分注し、ｗ
ｅｌｌ当たりの細胞数を０．８個とした（限界希釈培養
法）、３７℃、５％ｃｏ２下で培養し、クローニングを
行った。抗体産生をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によりチェックし
て選別し、株化ヒト−ヒトハイブリドーマを得た。〔尚
、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法ではパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
　ｇＡ＋　Ｉ　ｇＧ＋　Ｉ　ｇＭヤギ抗体（Ｋ　Ｐ　Ｌ
社製）を用いた。〕こうして得られた株化ヒト−ヒトハ
イブリドーマは、増殖性および抗体産生能について両親
細胞の性質をよく受は継いでおり、従来の方法による細
胞融合体、形質転換体に比べて優れていることが判明し
た。As a result, cell proliferation was observed in 20 wells of 43he11, so the anti-tetanus antibody activity in these culture supernatants was measured by the ELrSA method to examine the presence or absence of antibody production (screening). For 12-ell with high antibody production, the cell culture medium was diluted with RPMI 1640 + 10% fetal bovine serum culture medium to adjust to 8 cells/ml, and 96hal
Dispense into a microplate at 100d/well, w
Cloning was performed by culturing at 37°C under 5% CO2, with the number of cells per cell being 0.8 (limiting dilution culture method). Antibody production was checked and selected by ELISA method, and human-human hybridoma lines were obtained. [In addition, in the EL I SA method, peroxidase-labeled anti-human I
gA+ IgG+ I gM goat antibody (K P L
(manufactured by Seiko Co., Ltd.) was used. ] The human-human hybridoma line obtained in this way inherits the properties of both parent cells in terms of proliferation and antibody production ability, and is superior to cell fusions and transformants produced by conventional methods. There was found.

実験例１ 実施例１により得られた２系列のハイプリドーマ（ＩＯ
Ｃ，ｌ０Ｃ）において、その染色体数を調べた（第１表
）。なお、表中の値はその染色体をもつ細胞数を示す。Experimental Example 1 Two series of hybridomas (IO
C, 10C), the number of chromosomes was investigated (Table 1). Note that the values in the table indicate the number of cells having that chromosome.

第１表に示したようにハイプリドーマはその親細胞であ
るＢ細胞、株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）（染色
体数共に４６）より数本から３０本多い染色体を有して
いることが判った。即ち、染色体に変異が起こっている
ことが確認されたわけで、当該細胞が親細胞とは異なる
ハイブリドーマであることが染色体数からも示唆された
。As shown in Table 1, hybridomas are found to have several to 30 more chromosomes than their parent cells, B cells and B cell lines (cell number 1ine) (both have 46 chromosomes). . That is, it was confirmed that a mutation had occurred in the chromosome, and the number of chromosomes also suggested that the cell was a hybridoma different from the parent cell.

実験例２ 実施例１により得られた株化ヒト−ヒトハイブリドーマ
の性質を調べ、その結果を第２表に示した。［ハイブリ
ドーマ生成率」は、親細胞ｌＸｌ０”個当たり出現する
ハイブリドーマの数で示した。Experimental Example 2 The properties of the human-human hybridoma line obtained in Example 1 were investigated, and the results are shown in Table 2. "Hybridoma production rate" was expressed as the number of hybridomas appearing per 1X10'' of parent cells.

「クローニング効率」は、増殖性を示す指標として用い
たが、出現ハイブリドーマ中、増殖可能なハイブリドー
マの確率を示した。また、対照として親細胞であるヒト
株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）およびヒト抗破傷
風抗体産生性Ｂ細胞、株化Ｂ細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ
　）とＢ細胞の細胞融合体、Ｂ細胞のＥｐｓｔｅｉｎ　
Ｂａｒｒウィルスによる形質転換体を用いた。"Cloning efficiency" was used as an indicator of proliferation, and indicated the probability of hybridomas capable of proliferation among emerging hybridomas. In addition, as controls, human B cell line (cell 1ine), human anti-tetanus antibody-producing B cell line, and B cell line (cell 1ine), which are parent cells, were used as controls.
) and B cell fusion, B cell Epstein
A transformant caused by Barr virus was used.

第２表に示したように本発明の株化ヒト−ヒトハイブリ
ドーマは、発現率も良く、また増殖性も備わった極めて
効率の良い抗破傷風抗体産生細胞となりうろことが判明
した。また、本発明ハイブリドーマは、ヒト由来である
ため抗原性に関する問題もないものである。As shown in Table 2, the established human-human hybridoma line of the present invention was found to be highly efficient anti-tetanus antibody producing cells with good expression rate and proliferative ability. Furthermore, since the hybridoma of the present invention is derived from humans, there is no problem with antigenicity.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] ヒト由来ＨＡＴ感受性ウアバイン耐性株化Ｂ細胞（ｃｅ
ｌｌ　ｌｉｎｅ）と、向リンパ性ウィルスによって形質
転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを融合
させてなることを特徴とするヒト−ヒトハイブリドーマ
。Human-derived HAT-sensitive ouabain-resistant B cell line (ce
ll line) and a human-derived anti-tetanus antibody-producing B cell transformed by a lymphotropic virus.