JPS61199787A - Cloning of human granulocyte-macrophage colony promotion factor gene - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、コロニー促進因子（ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕ
ｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　、以下”　Ｃ８Ｆ”）に
関するものであって、ニジ詳細には、マウスＧＭ　−Ｃ
８Ｆ相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ”　　）クローン
から得られるヌクレオチドグローブを使用してヒト顆粒
球−マクロファージコロニー促進因子（ｇｒａｎｕｌｏ
ｃｙｔθ　−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　　ｃｏ’ｌｏｎｙ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ　、以下”　ＧＭ
　−Ｃ８Ｆ”）のメツセンジャーリボ核酸（”ｍＲＮＡ
”　　）　１１：：含むｍＲＮＡ　Ｚ＋”も合成される
ｃＤＮＡ　　ライブラリーをスクリーニングすることに
よるヒトＧＭ　−Ｃ８Ｆ遺伝子のクローニングに関する
ものであって、また、ＧｌＪ　−０８Ｆ遺伝子の塩基配
列決定に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Technical Field) The present invention relates to colony-promoting factors (colonystimu
(lating factor, hereinafter referred to as "C8F"), and in detail, mouse GM-C
Nucleotide globes obtained from 8F complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) clones were used to generate human granulocyte-macrophage colony-promoting factor (granulocyte)
cytθ-macrophage co'lony
stimulating factor, hereinafter referred to as “GM”
-C8F”) metsenger ribonucleic acid (“mRNA”)
The present invention relates to the cloning of the human GM-C8F gene by screening a cDNA library in which mRNA Z+ is also synthesized, and also relates to the determination of the base sequence of the GlJ-08F gene.

（発明の背景） ０８Ｆは、骨髄中に認められる前駆細胞（ｐｒｏｇｓｎ
ｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｇ　）が、成熟した血液細胞のそれ
ぞれ特殊なタイプに分化するように誘導するリン７オカ
イン（１ｙｍｐｈｏｋｉｎａｓ　）の−団を意味するも
のである。前駆細胞由来の成熟血液細胞の個々のタイプ
は、存在するａｓｐのタイプに依存する。例えば、エリ
トロポエチン（ｅｒ７ｔ、ｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　）は
、前駆細胞を赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ　）に
成熟させるとされており、トロンボボエチン（ｔｈｒｏ
ｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ　）は、前駆細胞を血小板に誘導
すると考えられている。同様に、顆粒球−マクロファー
ジコロニー形成は、ＧＭ　−Ｃ８Ｆの存在に依存する。(Background of the Invention) 08F is a progenitor cell (progsn) found in the bone marrow.
It refers to a group of lymphokines (Lymphokinas) that induces cells (Itor cellg) to differentiate into specialized types of mature blood cells. The particular type of mature blood cells derived from progenitor cells depends on the type of asp present. For example, erythropoietin (er7t, hropoietin) is said to mature progenitor cells into red blood cells (erythrocytes);
mbopoietin) is thought to induce progenitor cells into platelets. Similarly, granulocyte-macrophage colony formation is dependent on the presence of GM-C8F.

本発明は、と）ＧＭ−Ｃ８Ｆのクローニングに関するも
のである。The present invention relates to the cloning of GM-C8F.

ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを含む、０８１Ｆは、生体内で、わず
か微量で生成される。Ｃ８Ｆ’様因子は、生体器官から
抽出されており（シエリダン（Ｓｈｅｒｌｄａｎ　）お
よびスタンレー（５ｔａｎ１ｅｙ）著、７８Ｊ、＋：：
ｅｌｌ。081F, including human GM-C8F, is produced in very small amounts in vivo. C8F'-like factors have been extracted from living organs (Sherldan and Stanley, 78J, +:
ell.

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４５１−４５９　（１９７１年）参
照）、血清および尿中に検出されている（ロビンソン（
Ｒｏｂｉｎｅｏｎ　）他者、　６９　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　
Ｐｈｙｓｉｏｌ　。Physiol, 451-459 (1971)) and has been detected in serum and urine (Robinson (1971)).
Robineon) Others, 69 J, Ce1l
Physiol.

８３−９２（１９６７年）；スタンレー（５ｔａｎｌｅ
ｙ　）他者、　７９　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ１１ｎ、　Ｍｅｄ
　、　６５７−６６８（１９７２年）参照）。マクロフ
ァージあるいは単球と思われるヒト末梢血液細胞′Ｄ）
らの低力価（ｔｉｔθｒ）Ｃ８Ｆ様因子の単離も研究者
らにより報告されている（ムーブ（Ｍｏｏｒｅ　）およ
びウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　）著、８０　Ｊ　
、　Ｃｅ１．Ｐｈｙｓｉｏ１１９５−２０６（１９７２
年）；ゴールド（Ｇｏｗｎｓ　）およびクライン（ｖ、
１１ｎｅ　）著、５に（Ｊｉｎ、工ｎｖｅｓｔ、　２９
８１−．２９８３　（１９７２年）；ムーブ（Ｍｏｏｒ
ｅ　）ら著、　５０　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　０ａｎｓｅｒ
工ｎｓｔ、５９１−６０１　（１９７３年）参照）。83-92 (1967); Stanley (5 tanle
y) Others, 79 J, Lab, C11n, Med
, 657-668 (1972)). Human peripheral blood cells, likely macrophages or monocytes (D)
The isolation of a low titer (titθr) C8F-like factor has also been reported by researchers (Moore and Williams, 80 J
, Ce1. Physio1195-206 (1972
); Gold (Gowns) and Klein (v.
11ne), 5 (Jin, Engineering Best, 29
81-. 2983 (1972);Moor
e) et al., 50 J, Natl, 0anser
(1973)).

上記研究者らによって同定された因子は、Ｃ９Ｆだと報
告されてはいるが、これまで、その生化学的性質お工び
生物学的性質を十分研究するに足るだけのヒトＣ８Ｆは
、ＧＭ−Ｃ８Ｆを含めて得られていない。均質なとｌ−
ＧＭ−Ｃ８Ｆの十分−ｉ’を人手できることは、研究お
よびある棟の白血病や貧血のような、増殖性血液病に対
してなしうる治療に於いて有益であろう、また、従来工
り純粋で多葉のヒトＧＭ−Ｃ８Ｆが得られるようになる
と、ヒトＧＭ−０８Ｐが六ンの地学治療後の骨髄移殖の
成功のために有効だと証明できるであろう。The factor identified by the above researchers has been reported to be C9F, but until now human C8F has not been sufficiently studied to fully study its biochemical and biological properties. It has not been obtained including C8F. Homogeneous and l-
The ability to make GM-C8F by hand would be beneficial in research and possible treatments for proliferative blood diseases, such as leukemia and anemia, and would also be useful in conventionally produced pure and Once multilobal human GM-C8F becomes available, human GM-08P may prove effective for successful bone marrow transplantation after Rokunin's geological treatment.

均質なヒトＧＭ−Ｏ８Ｆ　を比較的多量に供給する可能
な方法の一つは１、組み換えＤＮＡ技術を利用すること
である。そのタンパク質をコードする遺伝子が一旦単離
され、同定されれば組み換えＤＮＡ技術によって、求め
るタンパク’Ｊ［ｔｌ業的に生産するための方法は開発
されている。このようなタンパク質生産の為の組み換え
ＤＮＡ技術についての議論は、サイエンス誌（５ｃｉｅ
ｎｃｅ）のＶＯ１１９６（１９７７年４月）に於ける論
説およびその基になる各種論文に述べられている。しか
しながら上記文献中で述べられている組み換えＤＮＡ技
術を利用するには、まずヒ）ＧＭ−Ｃ１９Ｆ　をコード
するＩＷ伝子を単離しなければならない。One possible way to provide relatively large amounts of homogeneous human GM-O8F is to use recombinant DNA technology. Once the gene encoding the protein has been isolated and identified, methods have been developed to commercially produce the desired protein by recombinant DNA technology. A discussion of such recombinant DNA techniques for protein production can be found in Science magazine (5cie
nce) in VO1196 (April 1977) and various papers on which it is based. However, in order to utilize the recombinant DNA technology described in the above-mentioned literature, the IW gene encoding GM-C19F must first be isolated.

（発明の概要） 本発明にＬれば、ヒトａｙ−ａｓｐ　’２コードする遺
伝子を、ニックトランスレーションされた（　ｎ１ｃｋ
−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　）　ｃＤＮＡプローブを用い
てｃＤＮＡライブラリーから単＊−Ｖる。グローブは、
マウスＧＭ−０８Ｆのヌクレオチド配列の一部分に相当
てる合成オリゴマクレオチドプローブの使用に工り、マ
ウスＧＭ−０８Ｆｌ　ｃＤＮＡライブラリーから単離さ
れる。全ヒトＲＮＡは、ＧＭ−０８Ｆを比較的高い水準
で生産すると考えられている細胞系あるいは他の材料η
為ら抽出される。ポリアデニル化されたｍＲＮＡ　＋−
この全ＲＮＡ抽出物力為ら単離される。ｃＤＮＡ　ライ
ブラリーは、ポリアデニル化されたｍＲＮＡを逆転写酵
素で逆転写することに工って調製される。このＤＮＡは
、ＤＮＡポリメラーゼＩで二本鎖にされ、適当なりロー
ニックベクターに挿入される。得られた組み換えクロー
ニングベクターは、適当な宿主を形質転換するのに用い
られる。(Summary of the Invention) According to the present invention, the gene encoding human ay-asp'2 is nick-translated (n1ck
-translated) cDNA probes are used to extract single*-V from a cDNA library. The glove is
We engineered the use of a synthetic oligonucleotide probe that corresponds to a portion of the nucleotide sequence of mouse GM-08F and was isolated from the mouse GM-08Fl cDNA library. Total human RNA may be derived from cell lines or other materials that are believed to produce GM-08F at relatively high levels.
It is extracted from Tamera. Polyadenylated mRNA +-
This total RNA extract is isolated from the sample. A cDNA library is prepared by reverse transcribing polyadenylated mRNA using reverse transcriptase. This DNA is made double stranded with DNA polymerase I and inserted into an appropriate rhonic vector. The resulting recombinant cloning vector is used to transform a suitable host.

形質転換された宿主は同定され、グループ化され、プー
ル（ｐｏｏｌθ）される。これらのプールから調製され
たプラスミドＤＮＡは、放射性標識されたマウスｃＤＮ
Ａ　プローブとハイブリッド形成を行なう。グローブに
対して正のシグナルを示す１０−ンのプールは同定され
、さらに、推定されたプールは再分され、ハイブリッド
形成スクリーニングが繰り返される。最終的には、ヒト
ＧＭ−Ｏ８Ｆ遺伝子に相当する単一の形質転換体が同定
される。プラスミドＤＮＡは上記形質転換体から調製さ
れ、ＤＮＡ塩基配列決定法によって同定されろ。さらに
、対応するアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から決定
される。ヒトＧＭ−Ｏ８Ｆ遺伝子のコード領域は、成熟
したＧＭ−Ｃ８Ｆを発現するように酵母（ｙｅａｓｔ　
）宿主系に於いてクローニングされる。その後、発現さ
れたタンパク質生成物がＧＭ−ＣＢＩＰであることを確
認するために、生物学的検定を行なう。Transformed hosts are identified, grouped, and pooled. Plasmid DNA prepared from these pools was combined with radiolabeled mouse cDNA.
A Perform hybridization with the probe. Pools of 10-tones showing a positive signal for the globe are identified, and the putative pools are subdivided and the hybridization screen is repeated. Eventually, a single transformant corresponding to the human GM-O8F gene is identified. Plasmid DNA is prepared from the transformants described above and identified by DNA sequencing. Additionally, the corresponding amino acid sequence is determined from the nucleotide sequence. The coding region of the human GM-O8F gene is expressed in yeast (yeast) to express mature GM-C8F.
) is cloned in the host system. A biological assay is then performed to confirm that the expressed protein product is GM-CBIP.

（発明の構成） ヒ）　ＧＭ−Ｃ，Ｂ１！Ｐをコードする遺伝子を得るた
めのＣＤＮＡ　　ライブラリーは、あらかじめ池のリン
７オカイｙ　（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　）を比較的高
い水準で生産する細胞を、それらがヒ）　ＧＭ−Ｃ！Ｓ
ＩＦも生産するであろうという仮定のもとで、使用して
作成するのが望ましい。これらの細胞源は、ヒトＩＪン
バ＆Ｔ細胞系のような、″悪性細胞系を含んでいてもよ
い。本発明者らは、ｃＤＮＡ　ライブラリーをＨＵＴ−
１０２やジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ　）のような、数
種のヒトリンパ腫Ｔ細胞系から調製した。(Structure of the invention) H) GM-C, B1! The CDNA library for obtaining the gene encoding P. lymphokines was prepared in advance from cells that produce relatively high levels of Lymphokines. S
It is preferable to create it using the assumption that the IF will also be produced. These cell sources may include "malignant cell lines," such as the human IJ and T cell lines.
102 and Jurkat were prepared from several human lymphoma T cell lines.

これらの特定の細胞系は、多様な供給先から入手でき、
広く研究者達に使用されている。例えば、レオナルト（
Ｌｅｏｎａｒｄ　）他藩、８０　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。These specific cell lines are available from a variety of sources and
Widely used by researchers. For example, Leonard (
Leonard) Other Domains, 80 Proc, Natl
.

２６７（１９８２年１１月）参照。See 267 (November 1982).

活性化されたヒト末梢血液単核細胞も、ＧＭ−ｃｓｙ分
子の細胞源となる可能性を持つ。本発明に於ける使用の
際は、末梢血液単核細胞は、フィコール−ハイバーク（
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　）遠心分離法のような
、標準的な技術によって、全血液から分離しりる。付着
細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ　Ｃｅ１ｌｓ　）は、プラスチ
ック付着にエリ除去し、残存白血球？Ｔ細胞マイトジエ
ｙ　（ｍｉｔｏｇｅｎ　）とともに、血清を含んだ培地
中で、インビトロ培養によって増殖させる。Activated human peripheral blood mononuclear cells are also a potential cellular source of GM-csy molecules. For use in the present invention, peripheral blood mononuclear cells are
Ficoll-Hypaque) is separated from whole blood by standard techniques such as centrifugation. Adherent cells are removed from the plastic and remaining white blood cells are removed. T cell mitogens are expanded by in vitro culture in serum-containing medium.

本発明者らは、前出のものを含む多数のヒト細胞系お工
び、末梢血液Ｔ細胞をヒｌ−ＧＭ−Ｏ８Ｆ　’ｉコード
する遺伝子の細胞源として研究してきた。The inventors have used a number of human cell lines, including those mentioned above, and have investigated peripheral blood T cells as the cellular source of the gene encoding the human l-GM-O8F'i.

後に述べるように、本発明者らは、ＨＵＴ−１０２細胞
系およびマイトジェンで活性化された、非付着性白血球
から調製されたＣＤＮＡ　　ライプラＩＪ　−かも、該
遺伝子を単離するのに成功した。As described below, we successfully isolated the gene using the HUT-102 cell line and mitogen-activated, nonadherent leukocytes.

ヒトのＧＭ−Ｃ８Ｆを産生する能力を持つ細胞力為らの
全ＲＮＡは、次に示される標準的な方法に工りて抽出さ
れろ；チャーウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　）細工びマニ
アナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）他者、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒり州コールドＯスプリング・バーバー、コールド・
スプリング・ハーバ−研究所、１９８２年）。Total RNA from cells capable of producing human GM-C8F is extracted using standard methods as described by Chirgwin and Maniatis et al. ,Mo1ecul
Cold O Spring Barber, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1982).

しく知られている二うに、細胞刀）らＲＮＡ　全抽出す
る際には、抽出の初期段階に於いて、リボヌクレアーゼ
（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　”ＲＮａｓｅ”　）活性
を液小限にしておくことが１１Ｌ要である。上記のこと
を行なうための一つの手法は、ＲＮａｓｅ　を含む、細
胞のタンパク質ｉ、ＲＮＡのＲＮａｓｅによる加水分解
の割合を越える程度に、変性させることである。チャー
ウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　）らの方法（前出）お工び
マニアナイスらの方法（前出、１９７）では、グアニジ
ニウムチオシアネートｇ ｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　）を
２−メルカプトエタノールのような還元剤（タンパク質
のジスルフィド結合を切断するため）とともに使用する
ことによって行なわれる。ＲＮＡは、タンパク質から、
フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱、塩化
セシウムによる沈降などの標準的な方法によって争離さ
れろ。As is well known, when extracting total RNA from cytoplasmic cells, it is necessary to keep ribonuclease (RNase) activity at a minimum level of 11 L in the initial stage of extraction. One approach to doing this is to denature cellular proteins, including RNase, to an extent that exceeds the rate of hydrolysis by RNase. In the method of Chirgwin et al. (supra) and Maninais et al. (supra, 197), guanidinium thiocyanate) is combined with a reducing agent such as 2-mercaptoethanol (protein disulfide). (to sever bonds). RNA comes from protein.
Disassociate by standard methods such as phenol/chloroform extraction, ethanol precipitation, cesium chloride precipitation.

次に、ポリアデニル化されたｍＲＮＡが、抽出されたタ
ンパク質ρ・ら分離される。この分離過程を行なうため
の数種の方法が考案されてきたが、望ましい方法の一つ
は、エドモンズ（ｚｄｍｏｎａｓ　）他（１９７１年）
：アビブ（Ａｖｉｖ　）おＬびレーダ１４０８（１９７
２年）；マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）他者、前
出１９７に述べられている、オリゴ（ｄＴ）−セルロー
スでの、ポリアデニル化されたｍＲｌＪ　Ａのクロマト
グラフィーである。The polyadenylated mRNA is then separated from the extracted protein ρ. Although several methods have been devised to perform this separation process, one preferred method is the one described by Edmonds et al. (1971).
: Aviv and Radar 1408 (197
2); Chromatography of polyadenylated mRlJ A on oligo(dT)-cellulose as described in Maniatis et al., supra 197.

オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム全光てン用バッファ
ー（Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　）　ｆ用いて調製
し、ｍＲＮＡ　ｆカラムに注ぐ。その説、ポリアデニル
化されていないｍＲＮＡを除去するために、まずバッフ
ァー溶液で洗浄し、次に、ポリアデニル化されたｍＲＮ
Ａを緩衝化された、イオン強度の低い溶離液で、カラム
から溶離させる。ポリアデニル化されたｍＲＮＡの純度
は、ゲル電気泳動で、確かめられる。Prepare the oligo(dT)-cellulose column using loading buffer f and pour into the mRNA f column. The theory is that to remove non-polyadenylated mRNA, first wash with a buffer solution, then remove polyadenylated mRNA.
A is eluted from the column with a buffered, low ionic strength eluent. The purity of polyadenylated mRNA is verified by gel electrophoresis.

上記のように調製された全ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃ
ＤＮＡ　ライブラリーは、逆転写酵素を使用する、既知
の方法に１って作成される。本発明に関連して使用され
うる上記方法の一つは、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ　）らに工って、詳述されている（前出、２３０）。Double-stranded c corresponding to total mRNA prepared as above
DNA libraries are created using known methods using reverse transcriptase. One of the above methods that may be used in connection with the present invention is Mania Nice.
(ibid., 230).

略述すると、ポリアデニル化されたｍＲＮＡは、ｃＤＮ
Ａの一査目の鎖のプライ＝　　（ｐｒｉｍｅｒ）として
、ｍＲＮＡ　のポリアデニル化された末端にハイブリッ
ド形成させたオリゴ−ｄＴを便用して、逆転写される。Briefly, polyadenylated mRNA is cDNA
The first strand of A is reverse transcribed using oligo-dT hybridized to the polyadenylated end of the mRNA as a primer.

以上の操作で、第２のｃＤＮＡ鎖のための、内在性プラ
イマーとして働く９ヘアピン”ループが第１のｃＤＮＡ
鎖の３′末端に形成される。次に、第２のｃＤＮＡ鎖を
酵素ＤＮＡポリメラーゼエで合成し、二本鎖ｃＤＮＡ分
子を作るために、Ｓ１ヌクレアーゼでヘアピンループを
切断する。二本鎖ｃＤＮＡは、短い二本鎖を除去するた
めに何らかの便利な方法で分画し、それにＬつてｃＤＮ
Ａの小断片の不要なりローニッグを避ける。With the above operations, the 9-hairpin loop, which serves as an endogenous primer for the second cDNA strand, is connected to the first cDNA strand.
Formed at the 3' end of the chain. A second cDNA strand is then synthesized with the enzyme DNA polymerase, and the hairpin loop is cleaved with S1 nuclease to create a double-stranded cDNA molecule. The double-stranded cDNA is fractionated by any convenient method to remove short duplexes, and then the cDNA
Avoid unnecessary Ronig of small fragments of A.

本発明に従って、ｍＲＮＡかも二本鎖ＣＤＮＡ１調製す
る際に、別の標準的方法で行うことも可能なことを理解
しておくべきである。そのような別の方法の一つは、ラ
ンド（Ｌａｎｄ　）他者、９　Ｎｕｃ’ｌ。It should be understood that other standard methods can be used to prepare mRNA or double-stranded CDNA 1 in accordance with the present invention. One such alternative is Land et al., 9 Nuc'l.

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　２２５１　（１９８１年）に述
べられている。ランドらの方法では、ヘアピンループは
、第２のｃＤＮＡ鎖のプライマーとして使用されない。Ac1ds Res, 2251 (1981). In the method of Land et al., the hairpin loop is not used as a primer for the second cDNA strand.

その２＞わり、第１のｃＤＮＡ鎖の３′末端にターミナ
ルヌクレオチジルトランスフエラーゼ（”　ＴｄＴ″）
の丈用に工り、ｄｃＭＰ残基でテーリングする。その結
果ボＩＪ　＋　Ｑ残基の３′テイルが生成する。次に、
３′テイルへのオリゴ−ｄＧのハイブリッド形成によっ
て、第２のｃＤＮＡ鎖の合成を開始させる。マニアナイ
スらの方法では、Ｓ１ヌクレアーゼでヘアピンループを
切断するが、その際に生じる可能性のめる第２のｃＤＮ
Ａ鎖の５′テイル部分の欠失を、この方法では避けうる
と、言われている。2> Instead, terminal nucleotidyl transferase ("TdT") is present at the 3' end of the first cDNA strand.
length and tailed with dcMP residue. As a result, the 3' tail of the IJ + Q residue is generated. next,
Hybridization of oligo-dG to the 3' tail initiates synthesis of the second cDNA strand. In the method of Manniais et al., the hairpin loop is cut with S1 nuclease, but a second cDNA is
It is said that deletion of the 5' tail portion of the A chain can be avoided with this method.

次に、ベクターの複製に適合する原核生物宿主細胞ある
いは、真核生物宿主細胞を形質転換する際に使用される
クローニングベクターに、二本鎖ｃＤＮＡ　を挿入する
。その後、形質転換体を同定し、プラスミドＤＮＡをそ
の形質転換体から調整する。The double-stranded cDNA is then inserted into a cloning vector used to transform prokaryotic host cells or eukaryotic host cells compatible with the replication of the vector. Transformants are then identified and plasmid DNA prepared from the transformants.

本発明の実施のために、多種のクロー二／グベクターの
使用が可能である。望ましいのはグラスミドであるが、
ベクターは、バクテリオファージあるいはコスミド（ｃ
ｏｓｍｉｄ）でもよい。クローニングが、哺乳類細胞で
行なわれるならば、ウィルスもベクターとして使用でき
る。A wide variety of cloning vectors can be used to practice the invention. Grasmid is preferable, but
Vectors can be bacteriophages or cosmids (c
osmid) may also be used. Viruses can also be used as vectors, provided the cloning is performed in mammalian cells.

プラスミド金便用する際には、プラスミドは天然に得ら
れるものでも、人工的に合成されたもの′　　でも可能
である。選択されるプラスミドは、宿主が大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉじに、　ｃｏｌｉ”））
、酵母（ｙｅａｓｔ　）であっても、あるいは他の単細
胞微生物であっても、その使用される形質転換宿主に適
合するものでなければならない。グラスミドは、使用さ
れる宿主細胞に応じて、適当な複製の起点を持たなけれ
ばならない。また、プラスミドは、形質転換をした宿主
細胞が容易に同定でき、形質転換していない宿主細胞と
容易に分離できるような表現型の（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉ
ｃ　）特性を持つべきである。上記のような表現型特性
には、抗生物質のような、成長阻害物質に対する抵抗性
を与える遺伝子も含まれる。テトラサイタリン （ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　）、ストレプトマイシン
（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　）、サルファ剤（５ｕｌ
ｆａ　ｄｒｕｇｓ　）。When using plasmids, plasmids can be either naturally obtained or artificially synthesized. The selected plasmid has a host of Escherichia coli (Es
cherichia coli
It must be compatible with the transformed host used, whether it is yeast, yeast, or other unicellular microorganism. Grasmids must have a suitable origin of replication depending on the host cell used. Plasmids also have a phenotypic form that allows transformed host cells to be easily identified and separated from untransformed host cells.
c) It should have the characteristic. Phenotypic traits such as those described above also include genes that confer resistance to growth inhibitory substances, such as antibiotics. Tetracycline, streptomycin, sulfa drugs (5ul)
fa drugs).

ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　）　、お工びアン
ピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　＞などの多種の抗生
′ｓ１′Ｉ質に抵抗性の遺伝子をコードするプラスミド
は、市販のものが入手できる。Plasmids encoding genes resistant to various antibiotics such as penicillin and ampicillin are commercially available.

大腸菌（Ｋ、ｃｏｌｉ　）を宿主細胞として使用するな
うば、本発明に関して使用しうる多種のクローニンググ
ラスミドが市販されており、入手可能である。本発明を
行なう際に望ましいプラスミドは、ｐＢＲ３２２である
。サトクリフエ（８ｕｔｃｌｉｆｆｅ　）Ｂｌｏｌ、７
７（１９７９年）に述べられているように、該プラスミ
ドの塩基配列は完全に決定されている。該プラスミドの
重要な特長は、アンピシリン抵抗遺伝子部分のＰｓｔＩ
切断部位を含む、１１ケ所の既知の独特な制限酵素切断
部位を持つことである。この特長は、ホモポリマーテー
リング法（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ　ｔａｉｌｉｎｇ　
ｍｅｔｈｏｄ　）によるクローニングの際に特に有用で
ある。Since Escherichia coli (K. coli) is used as a host cell, a wide variety of cloning grasmids are commercially available that can be used in connection with the present invention. A preferred plasmid in practicing the invention is pBR322. Sutcliffe (8utcliffe) Blol, 7
7 (1979), the nucleotide sequence of the plasmid has been completely determined. The important feature of this plasmid is that the ampicillin resistance gene part PstI
It has 11 known unique restriction enzyme cleavage sites, including cleavage sites. This feature is based on the homopolymer tailing method.
This method is particularly useful for cloning using this method.

プラスミドのかわりにバクテリオファージを使用する際
にも、上記のグラスミド選択の際と実質的に同様の特性
が、該７アージに必要である。上記特性には、表現型マ
ーカーおよび外米遺伝子の付着のだめの連結可能な末端
の存在も含む。When using bacteriophages instead of plasmids, substantially similar characteristics are required in the 7age as in the Grasmid selection described above. The above characteristics also include the presence of phenotypic markers and ligatable ends of the attachment strands of foreign rice genes.

本発明においては、プラント末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ
）を持つ、二本鎖ｃＤＮＡを、ホモポリマーのテーリン
グによって、プラスミドベクターに挿入するのが望まし
い。遺伝子工学の分野ではよく知られている工うに、上
記方法では、二本鎖ｃＤＮＡお工びプラスミドＤＮＡに
、相補的ホモポリマー鎖を付加する。次に、ベクターお
よび二本鎖ｃＤＮＡは、相補的ホモポリマーとなってい
るテイル間の水素結合に二って結合し、大腸菌（Ｋ、　
ｃｏｌｉ　）のような宿主細胞を形質転換しうる、開環
状ハイブリッド分子（ｏｐｅｎ　、　ｃｉｒｃｕｌａｒ
　ｈｙｂｒｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　）を形成する。In the present invention, the blunt end
) is preferably inserted into a plasmid vector by homopolymer tailing. In the above method, a complementary homopolymer strand is added to double-stranded cDNA and plasmid DNA, a technique well known in the field of genetic engineering. Next, the vector and double-stranded cDNA are bound together by hydrogen bonds between the tails of a complementary homopolymer, and
open, circular hybrid molecules capable of transforming host cells such as coli
hybrl molecules).

ホモポリマーによるテーリング（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅ
ｒｉｃｔａｉｌｉｎｇ　）を行なう方法の一つにおいて
は、約５０乃至１５０のｄＡ　ヌクレオチド残基を直鎖
状にしたプラスミドＤＮＡの３′末端に付加する。同数
のｄＴヌクレオチド残基金二本鎖ｃＤＮＡの３′末熾に
付加し、次に、ｃＤＮＡとグラスミドを結合させる。Homopolymer tailing
In one method of performing rictailing, approximately 50 to 150 dA nucleotide residues are added to the 3' end of linearized plasmid DNA. An equal number of dT nucleotide residues are added to the 3' end of the double-stranded cDNA, and then the cDNA and Grasmid are ligated.

上記のものとは異なる、望ましい方法においては、適当
な制限酵素で切断されたクローニングベクターの３′末
端に、ｄＧデテール付加する。例えば、ｐＢｌ　３２２
　　グラスミドを使用する際には、プラスミドをアンピ
シリン抵抗遺伝子部位で切断するのに、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉを使用する。相補的な（１０テールを二本鎖ｃＤＮＡ
の３′末端に付加し、次に、適当なアニーリングバッフ
ァー（ａｎｎｅ９）（ａ）ｉｎｇｂｕｆｆｏｒ）のもと
で、ｃＤＮＡ断片のプラスミドへの挿入を行なう。In a preferred method different from that described above, dG detail is added to the 3' end of a cloning vector that has been cleaved with an appropriate restriction enzyme. For example, pBl 322
When using Grasmid, the restriction enzyme Pst is used to cut the plasmid at the ampicillin resistance gene site.
Use I. Complementary (double-stranded cDNA with 10 tails)
Then, the cDNA fragment is inserted into the plasmid under an appropriate annealing buffer (anne9) (a) ingbuffer).

二本鎖ＱＤＮＡのプラスミドクローニングベクターへの
挿入は、他の多種の標準的方法によっても行なわれるこ
とは、理解されるべきである。上記の別の方法の一つで
は、ＤＮＡ　リガーゼ（ＤＮＡｌｌｇａａｅ　）の使用
による、合成ヌクレオチドリンカ−（１ｉｎｋｅｒｓ　
）の二本鎖ＣＤＮＡ末端への付加を行なう。リンカ−は
、制限酵素で切断され、同じ制限酵素で切断されたプラ
スミドへの挿入のための付着端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｔ
ｅｒｍｉｎｉ　）　ｆ生成する。It should be understood that insertion of double-stranded QDNA into a plasmid cloning vector can also be accomplished by a variety of other standard methods. In one of the above methods, synthetic nucleotide linkers (1inkers) are produced by the use of DNA ligase (DNA ligase).
) to the ends of the double-stranded CDNA. The linker is cut with a restriction enzyme and leaves a cohesive end for insertion into a plasmid cut with the same restriction enzyme.
ermini) generate f.

（シェラ−（５ｃｈａ１１ａｒ　）他者、１９６５ｃｉ
ｅｎｃｅ１７７−１８０（１９７７年）漬マニアティス
（Ｍａｎｉａｔｉｅ　）他者、前出２１９）上記方法で
得られた組み換えＤＮＡプラスミドは、宿主細胞を形質
転換するのに使用される。宿生細胞は、いかなる適当な
原核細胞おＬび真核細胞でも可能であるが、大腸菌（１
ｃｏｌｉ　）および酵母（ｙｅａｓｔ　）菌株のＬうな
、明確に研究されている細菌が望ましい。上記宿主は、
容易に形質転換され、培養の際に、急速な増殖をなしう
る。サルモネラ（Ｓ９）（ａ）ｍｏｎｅｌａ　）ひ工び
肺炎双球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｕｓ　）のような、別
種の細菌も、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の代用として使用
しうる。菌類（ｆｕｎｇｉ　）や藻類（９）（ａ）ｇａ
ｅ　）の工うな、他の単細胞微生物も、使用可能である
。選択される宿主が何であっても、組み換えグラスミド
を切断する二つな制限酵素は含まれてはならない。(Sierra (5cha11ar) Others, 1965ci
The recombinant DNA plasmid obtained by the above method is used to transform host cells. The host cell can be any suitable prokaryotic or eukaryotic cell, but may include Escherichia coli (1
Well-studied bacteria, such as L. coli and yeast strains, are preferred. The above host is
It is easily transformed and can rapidly grow in culture. Other species of bacteria can also be used as substitutes for E. coli, such as Salmonella (S9) (a) monella and Pneumococcus. Fungi (fungi) and algae (9) (a) ga
Other unicellular microorganisms can also be used. Whatever host is chosen, it must not contain two restriction enzymes that will cut the recombinant grasmid.

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）を宿主として使用する場合
に望ましい菌株は、ＭＭ２９４お工びＲＲＩでおる。When using Escherichia coli (E. coli) as a host, the preferred strain is MM294 and RRI.

プラスミドベクターにＬるＭＭ　２９４宿主の形質転換
の方法は、工く知られている（マニアナイス（Ｍａｎｉ
ａｔｉａ　）他者、前出（２５５１；お工びハ５５７（
１９８３年）蚕照）、プラスミドペタターにＬるＲＲＩ
宿主の形質転用の方法もよく知られている（ポリバー（
Ｂｏｌｌｖａｒ　）他者、２Ｇｅｎｅ９５（１９７７年
）２工びピーコック（Ｐｅａｃｏｃｋ）他者、６５５　
Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、Ａｃｔａ　、
　２４３（１９８１年）参照）、適当な宿主として便用
しうる大腸菌（Ｗ、、　ｃｏｌｉ　）の別の菌株には、
ＤＨＩ（Ａｔｃｃ＆　３３Ｂ４９　）お工びＣ６００も
ｔまれる。これらの菌株およびＭＭ２９４菌株お工びＲ
ＲＩ菌株は広く市販されており入手可能である。Methods for the transformation of MM294 hosts with plasmid vectors are well known (Mani
atia) Others, supra (2551; Okobiha 557 (
1983) RRI in plasmid petata
Methods for host transformation are also well known (polyvar (
Bollvar) Others, 2Gene95 (1977) 2-engine Peacock Others, 655
Biochem, Biophys, Acta,
243 (1981)), other strains of Escherichia coli (W. coli) that may serve as suitable hosts include
DHI (Atcc & 33B49) C600 is also included. These strains and MM294 strain Okobi R
RI strains are widely available commercially.

マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉａ　）らの方法（前出）
おＬびハナハン（Ｈａｎａｈａｎ　）の方法（前出）を
含む形質転換法に於いて、細胞によるプラスミドの取り
こみ（ｕｐｔ９）（ａ）ｃθ）が制限されているために
、実際には宿主細胞の一部のみが形質転換される。The method of Maniatia et al. (supra)
In transformation methods, including the method of L. and Hanahan (supra), the uptake of the plasmid by the cells (upt9) (a) cθ) is limited, so that in practice only one part of the host cell Only part of the body is transformed.

形質転換された宿主細胞は、適当な成長培地（ｇｒｏｗ
ｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ　）　２Ｌび抗生物質の工うな表現
型同定物質（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　１ｄｅｎｔｉｆｉ
ｅｒ　）　ｆ含有する寒天プレート上で細胞培養を行な
うことで同定される。適当な抵抗性遺伝子（丁なわち、
抗生物質に対して）を持つ細胞のみが残存する。大腸菌
（］１ｉ、ｃｏｌｉ）菌株ＭＭ２９４を形質転換するの
に、組み換えｐＢＨ３２２グラスミドを使用する場合に
は、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃ７ｃ１１ｎｅ　）
を表現型同定物質として使用して、形質転換された細胞
を同定することができる。The transformed host cells are grown in a suitable growth medium (grow
th medium) Phenotypic 1 dentifi for 2L and antibiotics
er) is identified by culturing cells on agar plates containing f. Appropriate resistance genes (i.e.,
Only those cells that are resistant to antibiotics will remain. When using recombinant pBH322 grasmid to transform Escherichia coli (]1i, coli strain MM294, tetracycline (tetrac7c11ne)
can be used as a phenotypic identifier to identify transformed cells.

の調製 グラスＧＭ−Ｃ８Ｆ　′をコードする遺伝子のヌクレオ
チド配列の大部分に対応する数百の塩基対（ｂａｓｅｐ
ａｉｒ　、　”　ｂｐ”）からなる放射性標識されたＤ
ＮＡ　Ｗｒ片を、上記操作で調製されたヒ）　ｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするためのグローブ（ｐ
ｒｏｂｅ　）として使用する。このプローブは、７９２
０Ｍ−０８７種のヌクレオチド配列部分に対応する、放
射性標識された合成オリゴヌクレオチドプローブを用い
てマウスｃＤＮＡ　　ライブラリーから単離されろ。The preparation of several hundred base pairs (basep
air, “bp”)
The NAWr fragment was prepared using the above procedure.
Grove for screening libraries (p
Robe). This probe is 792
A radiolabeled synthetic oligonucleotide probe corresponding to a portion of the 0M-087 nucleotide sequence was isolated from a mouse cDNA library using a radiolabeled synthetic oligonucleotide probe.

本発明のスクリーニング法で、使用されるｃＤＮＡプロ
ーブを単離するには、まず、上記の方法でマウスｍＲＮ
Ａ１＞１−）マウスｃＤＮＡ　ライブラリーを調製する
。ｍＲＮＡは、ＧＭ−０８Ｆ’類の物質を産生すると知
られている、マウス細胞系から抽出する。上記細胞系に
は、Ｔ−リンパ＠細胞系ＬＢＲＭ　−３３、あるいは、
Ｂ−１０ＢＲマクスからの放射線誘導されに肺臓リンパ
ｈａ胞系（ｒａｄｉａｔｉｏｎ　−ｉｎｄｕｃｅｄ１１
１１ｐｌｅｎｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉ
ｎｅｓ　）のクローンのような、多種のＴ細胞系および
マクロファージ細胞系を含む。上記細胞系およびそのク
ローンは、多様な民間企業および私的機関から入手可能
であって、および他国の研究者に広く使用されている。To isolate the cDNA probe used in the screening method of the present invention, first, mouse mRNA is isolated using the method described above.
A1>1-) Prepare a mouse cDNA library. The mRNA is extracted from a mouse cell line known to produce substances of the GM-08F' class. The above cell lines include the T-lymph@cell line LBRM-33, or
radiation-induced11
11plenic lymphoma cell 1i
nes), including a wide variety of T cell and macrophage cell lines. The cell lines and their clones are available from a variety of private companies and institutions, and are widely used by researchers in other countries.

マウス細胞からの全ＲＮＡは、上記の標準的方法例えば
グアニジニウムチオシアネートの２−メルカグトエタノ
ールとの併用によって、抽出されろ。Total RNA from mouse cells is extracted by standard methods described above, such as guanidinium thiocyanate in combination with 2-mercagutoethanol.

次に、ポリアデニル化されたｍＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ
）−セルロース上でのクロマトグラフィーによって、抽
出されたタンパク質から分離する。Next, the polyadenylated mRNA was transformed into an oligo(dT
) - separated from the extracted proteins by chromatography on cellulose.

マウスｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡ　ライブラリ
ーは、上記のように、逆転写酵素を使用し、ｍＲＮＡを
鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ　）としてｃＤＮＡの初めの一
本鎖を形成することで、調製される。次に、酵素ＤＮＡ
ポリメラーゼエを使用して、第一の一本鎖′を鋳聾とし
て第二のｃＤＮＡｆｉ（ｉ−合成する。A double-stranded cDNA library corresponding to mouse mRNA is prepared by using reverse transcriptase to form the first single strand of cDNA using mRNA as a template, as described above. Next, enzyme DNA
A polymerase is used to synthesize a second cDNA fi(i) using the first single strand as a template.

二本鎖ｃＤＮＡは、ベクターの複製に適合する宿主細胞
を形質転換するのに使用されるクローニングベクターに
挿入される。ベクターは、グラスミドｐＢＲ３２２の工
うに、数個の独特な制限酵素切断部位を持つプラスミド
から成るものが望ましい。The double-stranded cDNA is inserted into a cloning vector that is used to transform host cells compatible with vector replication. The vector preferably consists of a plasmid containing several unique restriction enzyme cleavage sites, such as Grasmid pBR322.

ｍＲＮＡから調整されたｃＤＮＡは、上記ホモポリマー
によるテーリング（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａ
ｉｌｉｎｇ　）によって、プラスミドに挿入する。組み
換えプラスミドは、大腸菌（Ｗ、　ｃｏｌｉ　）菌株の
工うな、適当な宿主細胞全形質転換するのに使用される
。もちろん、他の適当な宿主細胞も使用されうる。組み
換えプラスミドによって形質転換された宿主細胞は、抗
生物質のような、適当な標準的表現型同定物質（ｐｈｅ
ｎｏｔｙｐｉｃ　１ｄｅｎｔｉｆｉｅｒ　）で、同定さ
れる。cDNA prepared from mRNA is tailed with the homopolymer described above.
iling) into the plasmid. The recombinant plasmid is used to whole-transform a suitable host cell, such as a strain of Escherichia coli (W. coli). Of course, other suitable host cells may also be used. Host cells transformed with recombinant plasmids are treated with appropriate standard phenotypic agents, such as antibiotics (phe
notypic 1 dentifier).

マウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため
のプローブとして使用するために、放射性標識されたオ
リゴヌクレオチド　を合成する。マウスＧＭ−Ｃ８Ｆを
コードする遺伝子の、情報を持たない一本鎖（ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ　）の一部に由来するプロー
ブは、以下の配列を持つ：５′−ＴＧＡＴＧＧＯ（！Ｔ
（！ＴＡＣＡＴＧＯＴＴＣｃ！ＡＡＧＧＣＣＧＧＧＴＡ
ｊｌＡＡＴＴＡＴ−３’。上記グローブは、第１図に示
された、情報を持つ一本鎖（５ｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ
　）の５′末端部分を補足し、比較的容易に合成できる
程度に短く、−万、７９７０Ｍ−０８Ｆ遺伝子のための
プローブとして有用な、十分な情報を含んでいる程度に
長いという利点を持っている。しかしながら、この合成
プローブの配列は、本発明の範囲および意図から逸脱す
ることなく、７９７０Ｍ−０８Ｆ遺伝子の別の部分に対
応するものであってもよいことは、理解されるべきであ
る。Radiolabeled oligonucleotides are synthesized for use as probes to screen mouse cDNA libraries. A single chain of the gene encoding mouse GM-C8F (anti
The probe derived from part of the sense 5 trand) has the following sequence: 5'-TGATGGO (!T
(!TACATGOTTCc!AAGGCCGGGTA
jlAATTAT-3'. The above-mentioned glove is a single strand (5ense 5trand) with information shown in FIG.
) and has the advantage of being short enough to be relatively easily synthesized and long enough to contain enough information to be useful as a probe for the 7970M-08F gene. There is. However, it should be understood that the sequence of this synthetic probe may correspond to other portions of the 7970M-08F gene without departing from the scope and intent of the invention.

合成オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステＡ
／　（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ　）お工びトリエ
ステＡ／　（ｔｒｉｅｓｔｅｒ　）法のような既知の方
法によって、容易に化学的に合成しうる。トリエステル
合成法の詳細は、例えば、スート（５ｏｏｄ　）他者、
４　Ｎｕｃｌ。Synthetic oligonucleotide probes include phosphodiester A
/ (phosphodiester) can be easily synthesized chemically by known methods such as the Trieste A/ (triester) method. Details of the triester synthesis method can be found, for example, by Soot et al.
4 Nucl.

Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　２５５７　　（１９７７年）およ
び、ヒロセ他者、２８Ｔｅｔ、１ｓｔｔ、２４４９　　
（１９７８年）に述べられている。合成後、オリゴヌク
レオチドプローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ）お
よび”ｐ−Ａ’ｒｐでラベルされる。ラベルする際の標
準的方法は、マニアティ、Ｘ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）
他者、前出１２２に述べられている。オリゴヌクレオチ
ドプローブはＯＨ５’末端で合成できるという利点を持
ち、それに工ってホスファターゼ法を特に要求すること
を避けうる。Ac1d Res, 2557 (1977) and Hirose Others, 28Tet, 1stt, 2449
(1978). After synthesis, the oligonucleotide probe is synthesized by T4 polynucleotide kinase (
The standard method for labeling is Maniatis, X.
Others, supra, 122. Oligonucleotide probes have the advantage of being able to be synthesized with an OH 5' end, thereby avoiding the specific requirements for phosphatase methods.

マウスｃＤＮＡライブラリーは、後述（ｒｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニング」お工び実施例３お工び実施
例４）のように、放射性標識された前記合成プローブで
スクリーニングされる。次に、プラスミドＤＮＡ　’ｌ
スクリーニング法で同定されたもののうち、陽性の特定
コロニー７０）も調装する。The mouse cDNA library is screened with the radiolabeled synthetic probe as described below (Screening of an rcDNA Library, Example 3 and Example 4). Next, plasmid DNA'l
Among those identified by the screening method, specific positive colonies 70) are also prepared.

マウスプラスミドＤＮＡは、侵出「スクリーニングされ
たｃＤＮＡの塩基配列決定」で述べるように、チェイン
−ターミネーションｍ　（ｃｈａｉｎ　−ｔｏｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　）で塩基配列決定を行なう
。第１図に示された、配列決定の結果Ｌ＃）、単離され
たプラスミドＤＮＡは、実質的に７９７０Ｍ−０８Ｆ遺
伝子の全コード領域および遺伝子の５′末端に付加した
配列および付加コドン、ＣＣム（ヌクレオチド２０１−
２３０　）、に含んでいることが明らかとなり、それら
によってマウスｃＤＮＡライブラリーから単離したマウ
スグラスミドＤＮＡがマウスＧＭ−ＣＢＦ　１にコード
していることが確証された。マウスＧＭ−Ｃ８Ｆ　と単
離されたプラスミドＤＮＡとのさらに別の相異点は第１
図に示されている；これらの相異点は全て、コードされ
たアミノ酸の変化の原因とはならない。Mouse plasmid DNA is transfected with chain-termination m (chain-tormin) as described in "Sequencing of screened cDNA".
ation method) to determine the base sequence. Sequencing results (L#) shown in FIG. (nucleotide 201-
230), and it was confirmed that the mouse grasmid DNA isolated from the mouse cDNA library encodes mouse GM-CBF1. Another difference between mouse GM-C8F and the isolated plasmid DNA is the first
As shown in the figure; all of these differences do not result in changes in the encoded amino acids.

まず、単離されたマウスプラスミドＤＩＪＡの全長を、
上記の工うにａｉｌｉｌ製されたヒ）　ＣＤＩＡ　ライ
ブラリーのスクリーニングのためのグローブとして便用
した。比較的大きなプローブ（３００乃至５００　ｂｐ
程度）は、多くの場合、ＧＭ−Ｃ１３１Ｐをコードして
いないｃＤＮＡ　Ｗｒ）！ｒＬりも、実際にヒトＧＭ−
Ｃ８Ｆ　をコードしているｃＤＮＡがハイブリッド形成
を行なう可能性を増大させる。しかしながら、上記でウ
スプラスミドＤＮＡ全体をグローブとして挿入したもの
を使用した結果は良くなかった；ヒトｃＤＮＡ　　ライ
ブラリーのｃＤＮＡ　ｌ＃ｒ片とのハイブリッド形成は
起こらな力為った。First, the full length of the isolated mouse plasmid DIJA was
It was conveniently used as a glove for screening the CDIA library produced by the above-mentioned Ailil. Relatively large probes (300 to 500 bp
degree) is often a cDNA that does not encode GM-C131P (Wr)! rL Rimo is actually human GM-
Increases the likelihood that cDNA encoding C8F will undergo hybridization. However, the results using the above insert of the entire US plasmid DNA as a glove were not good; hybridization with the cDNA l#r piece of the human cDNA library did not occur.

引き続いてマウスプローブの大きさを縮小し、ヒトｃＤ
ＮＡ　ライブラリーの再スクリーニングを行なった。縮
小したグローブは、ＷＪ１図の下線で示された、ヌクレ
オチド番号４５乃至４００からなるフラグメントであっ
て、マウスプラスミドＤＮＡ　フラグメントの３′末端
非コード領域のごく一部を含み、５′末端非コード領域
は全く含まない。以下に詳述するように、上記プローブ
の使用により、ｃＤＮＡ　　ライブラリーからのヒトＧ
Ｍ−ｃｓｙ遺伝子の単離が成功した。マウスプラスミド
ＤＮＡ　７ラグメントのヌクレオチド配列の他の部分に
対応するグローブも、本発明の意図および範囲から逸脱
することなく便用されうろことは、理解されるべきであ
る。Subsequently, the size of the mouse probe was reduced and human cD
A rescreening of the NA library was performed. The reduced globe is a fragment consisting of nucleotide numbers 45 to 400, shown as underlined in the WJ1 diagram, which includes a small portion of the 3' non-coding region of the mouse plasmid DNA fragment and the 5' non-coding region. is not included at all. As detailed below, the use of the probes described above allows for the extraction of human G from cDNA libraries.
The M-csy gene was successfully isolated. It should be understood that gloves corresponding to other portions of the nucleotide sequence of the mouse plasmid DNA 7 fragment may also be conveniently employed without departing from the spirit and scope of the invention.

１ウスｃＤＮＡプローブは、ヒトｃ　ＤＮＡ　　ライブ
ラリープールのハイブリッド形成に使用する前に、放射
性標識を施丁。グローブが比較的大きいため、標識のた
めに、多種の方法が使用されうる；しかＬ７ｋから、”
ニックトランスレーション（ｎ１ｃｋｔｒａｎｓｘａｔ
ｉｏｎ　）”にＬつてプローブを標識するのが望ましい
。リグビー（Ｒｌｇｂｙ）他藩、１１３１、　Ｍｏ１ｅ
ｃ、Ｂｉｏ、　２３７　（１９７７）およびマニアテイ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｇ）他藩、前出１０８で述べられて
いるように、この既知の方法では、非常に制限されたＤ
Ｎアーゼエ（ＤＩ　ａｓｅＩ　）処理によって、ニック
（ｎｉｃｋｓ　）がＤＮＡ中の広く離れた位置に誘導さ
れ、それによってそれぞれのニックに遊離の３’　−Ｏ
Ｈ基を生じる。ＤＮＡポリメラーゼエ（ＤＮＡ　ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　）は、３’−ＯＨ末潟に適当な放
射性標識されたデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｅｏ
ｘｙｎｕｃｌ、ｅｏｔｉｄｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅａ　。1. The murine cDNA probe was radiolabeled prior to use in hybridization of the human cDNA library pool. Due to the relatively large size of the globe, a variety of methods can be used for marking; however, from L7k onwards,
nick translation (n1cktransxat
It is preferable to label the probe with "L ion )". Rigby et al., 1131, Mole.
This known method has a very limited D
DIaseI treatment induces nicks to widely separated locations in the DNA, thereby attaching free 3'-O to each nick.
yields an H group. DNA polymerase (DNA pol)
ymerase I) is an appropriately radiolabeled deoxynucleotide triphosphate (deo
xynucl, eotide triphosphat
ea.

”Ｐ−ｄＮＴＰｓ　）　ｔ”取りこませ、それに併行し
てニックの５′側からヌクレオチドを除去し、ＤＮＡに
沿ったニックの逐次的移動をひき起丁ために使用サレる
（′″ニツクトランスレーシヨン　ｎ１ｃｋｔｒａｎｓ
　１ａｔｉｏｎ　）”）。"P-dNTPs)" are incorporated and concomitantly remove nucleotides from the 5' side of the nick, resulting in sequential movement of the nick along the DNA and used for binding. sion n1cktrans
1ation)”).

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング本発明のスクリ
ーニング法では、形質転換体はまずそれぞれ約１００，
０００　　の形質転換体から成る比較的大きな集団にプ
ール化される。複製されたプラスミドはア／ｌ／　カリ
溶菌（９）（ａ）ｋ９）（ａ）ｉｎｅ　１ｙｓｉｓ）の
ような数種の既知の方法のいずれかを用いて形質転換体
から抽出する。プラスミドＤＭＡは、抽出されたプラス
ミドをＰａｔ工で切断することによって調製されろ。得
られたＤＮＡ　断片は、アガロースゲル上の電気泳動に
１って分画され、サザン（１９７５年）に示された、サ
ザンプロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ
　）によって直ちに分析される。ブザ／プロット法に於
いて、ニトロセルロースフィルター上に吸着したＤＮＡ
　７ラグメントは、標識されたｃＤＮＡ　７０−ブとハ
イブリッド形成を行なう。プローブとハイブリッド形成
した、特定のＤＮＡフラグメントはオートラジオグラフ
ィー（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ　）に工って同
定される。Screening of cDNA libraries In the screening method of the present invention, transformants are first isolated from approximately 100,
000 transformants are pooled into a relatively large population of 1,000 transformants. The replicated plasmids are extracted from the transformants using any of several known methods, such as a/l/potash lysis (9) (a) k9) (a) ine lysis). Plasmid DMA is prepared by cutting the extracted plasmid with a Pat machine. The obtained DNA fragments were fractionated by electrophoresis on an agarose gel, and the Southern blotting method described in Southern (1975) was used.
) will be analyzed immediately. In the buzzer/plot method, DNA adsorbed onto a nitrocellulose filter
7 fragment hybridizes with labeled cDNA 70-bu. The specific DNA fragments that hybridized to the probe are identified using autoradiography.

オートラジオグラフィーで、強度のハイブリッド形成帯
を示したクローン金持つ候補プールは、約５ｏｏｏの形
質転換体の集団に再分し、上記のような放射性標識され
たマウスｃＤＮＡプローブの使用によるハイブリッド形
成スクリーニングを繰り返丁。クローンを含む候補プー
ルの再分割および形質転換体のスクリーニングの、上記
過程は、要求するプールの大きさが得られるまで繰り返
される。次に、放射性標識された１０−プとハイブリッ
ド形成を行なう唯一の形質転換体を既知のコロニーハイ
ブリッド形成法（ｃｏｌｏｎｙｈｙｂｒｉｄｉｇｉｎｇ
　ｔｅｃｈｈｉｑｕｅ、グルンシュタイン（Ｇｒｕｎａ
ｔｅｉｎ　）およびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｅ　）　。The candidate pool with clones that showed strong hybridization bands on autoradiography was subdivided into a population of approximately 500 transformants and subjected to hybridization screening by the use of radiolabeled mouse cDNA probes as described above. Repeat Ding. The above process of subdividing candidate pools containing clones and screening for transformants is repeated until the desired pool size is obtained. Next, the only transformant that hybridizes with the radiolabeled 10-pump is isolated using a known colony hybridizing method.
techhique, Grunstein
tein) and Hognese.

（１９７５年））によって同定する。上記方法により、
本発明者らは一つの上記陽性コロニーを発見した。ｐＨ
０２３と命名されたグラスミドＤＮＡが、上記コロニー
η為ら調製された。(1975)). By the above method,
The present inventors discovered one of the above positive colonies. pH
Grasmid DNA designated 023 was prepared from the colony η.

上記の工うに調製されたプラスミドＤＮＡは、標準的な
、チェインターミネーション法（ｃｈａｉｎ　−ｔｅｒ
ｍｉｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　）で塩基配列決定
を行なう９゜上記塩基配列決定法は、サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ　）他によって（７０Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　１３ｃｉ、　（Ｕ８Ａ　）５４６３　（１
９７７年））考案された。米国特許第４．３２２，４９
９月明細書参照。チェインターミネーション塩基配列決
定法は、以下の文献に記載されている；Ｍ１３のクロー
ニング及び配列決定（Ｍ　１３　Ｃ１ｏｎｉｎＨａｎｄ
　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　）　（アマージャム龜・飄ン
ドプツク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈａｄｂｏｏｋ　）。The plasmid DNA prepared in the above manner can be processed using the standard chain termination method.
The base sequencing method described above is based on the Sanger method.
(70Proc, Natl,
Acad, 13ci, (U8A)5463 (1
977)) was devised. U.S. Patent No. 4.322,49
See September statement. Chain termination sequencing methods are described in the following literature: M13 Cloning and Sequencing (M13 C1oninHand
(Amersham Hadbook).

ブレンハイム・クレセント（Ｂｌｅｎｈｅ　ｉｍ　、Ｃ
ｒｅｓｓｎｔ　）　。Blenheim Crescent (Blenhe im, C
(resnt).

ロンドン、１９８３年、以下　“アマ−ジャム−ハンド
ブック”と略称する）；フラング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）
著、２組み変えＤＮＡ技術集４８（１９７９年）；フラ
ング−（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　）他者、２８．Ｇｅｎｅ
　１０１（１９８３年）；セレツテイ（Ｏｅｒｒｅｔｔ
ｉ　）他者、１１　Ｎｕｃｌ　、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
　。London, 1983, hereinafter abbreviated as “Amma Jam Handbook”);
Author, 2 Recombinant DNA Techniques Collection 48 (1979); Frang (Norrander) Others, 28. Gene
101 (1983); Seretsutei (Oerrett)
i) Others, 11 Nucl, Ac1ds Res
.

２５９９（１９８３年）；ビギン（Ｂｉｇｇｉｎ）他者
、８０　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ
、　（ＵＳＡ　）３９６３（１９８３年）、Ｍ１３ｍ状
７アージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　Ｐｈａｇｅ　）は
、問題となるＤＮＡ塩基配列をクローンするためのベク
ターとして使用される。上記７アージベクターは、チェ
インターミネーション法に工って容易に塩基配列決定さ
れうる、単鎖ＤＮＡの鋳型を供給する。チェインターミ
ネーション法は、遊離３′水酸基を育てる短いプライマ
ー（Ｐｒｉｍａｒ　）鎖で単鎖鋳型分子をあらかじめプ
ライミングし、次に、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフ
ラグメン）　（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ））の
便用に工り４種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸、
丁なわちｄＡＴＰ、　ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰ、お工びｄＴ
ＴＰ　（まとめて′″ｄＮＴＰｓ″と称する）を用いた
チェイ／−二りステンション反応（ｃｈａｉｎｅｘｔｅ
ｎｓｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）で、ｄＮＴＰＯ一種を
放射性標識したものを便用して、鋳型ＤＮＡ鎖の複Ｒｋ
行なうものである。この合成反応において、３′−水酸
基末端を欠いた、ヌクレオチドに特異的なチェイン・タ
ーミネータ−（ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　）　
％例えば、２’　、　３’−ジデオキシヌクレオチド３
リン酸（＠ｄａＮＴＰ”）を使用して、一連の、異なる
鎖長の延長が行なわれる。上記ターミネータ−は、通常
の５′末・端を有し、そのため伸長するＤＮＡ鎖に組み
入れろことができるが、３′末端水酸基を欠く。ターミ
ネータ−がＤＮＡ鎖に取り込まれると、それ以後はデオ
キシヌクレオチド３リン酸は付加できず、従ってＤＮＡ
鎖の伸長は停止する。それぞれ、４槽のヌクレオチドｄ
ＮＴＰ　、すなわち（ＬＡＴＰ　、　ｄｃ！ＴＰ　、　
ｄＧＴＰお工びｄＴＴＰのうち一種のｄｄＮＴＰ　を有
する、４種の合成反応ヲ蝕立に実施する。ポリアクリル
アミドゲル上で、大きさによる分画を行なった後に、合
成されたＤＮＡ鎖のオートラジオグラフィーを行なえる
ように、正常なｄＮＴＰのうち一種は放射性標識を施す
。オートラジオグラフィーにＬるＤＮＡ　フラグメント
のパターンを、クローン化されたＤＮＡの塩基配列と照
合できるように、４ｓの反応による伸長ＤＮＡ鎖は、隣
接して分離された帯状ゲル上に、配置される。2599 (1983); Biggin et al., 80 Proc, Natl, Acad, 8ci.
(USA) 3963 (1983), M13m filamentous Phage is used as a vector to clone the DNA base sequence of interest. The above-mentioned 7age vector provides a single-stranded DNA template that can be easily sequenced using the chain termination method. The chain termination method involves pre-priming a single-stranded template molecule with a short primer strand that grows free 3' hydroxyl groups, and then injecting four types of DNA polymerase (Klenow fragment) into the chain termination method. deoxyribonucleotide triphosphate,
Namely dATP, dcTP, dGTP, and dT
Chainextension reactions using TPs (collectively referred to as ``dNTPs'')
reaction), using a radioactively labeled dNTPO, the double Rk of the template DNA strand is
It is something to do. In this synthesis reaction, a nucleotide-specific chain terminator lacking a 3'-hydroxyl terminal is used.
% e.g. 2', 3'-dideoxynucleotide 3
Phosphoric acid (@daNTP") is used to perform a series of different length extensions. The terminator has a conventional 5' end and therefore cannot be incorporated into the growing DNA strand. However, it lacks the 3'-terminal hydroxyl group.Once the terminator is incorporated into the DNA chain, deoxynucleotide triphosphates cannot be added from then on, so the DNA
Chain elongation stops. Each of the four cisternae of nucleotide d
NTP, i.e. (LATP, dc!TP,
Four types of synthesis reactions involving one type of ddNTP among dGTP and dTTP were carried out. One of the normal dNTPs is radiolabeled to allow autoradiography of the synthesized DNA strands after size fractionation on a polyacrylamide gel. The elongated DNA strands resulting from the 4s reaction are placed on adjacent separated gel strips so that the pattern of DNA fragments detected by autoradiography can be matched with the base sequence of the cloned DNA.

第２図は、上記のようにｖＩ４製された１）ＨＧ　２３
プラスミドＤＮＡ　に含有されるヒ）ＧＭ−Ｏ８Ｆ遺伝
子のヌクレオチド配列會示したものである。アラニン（
Ａｌａ）残基慝１（ヌクレオチド＆　１４　）からグル
タミン酸（Ｇｌｕ）残基慝１２７　（ヌクレオチドＩＩ
Ｇ、３９４）に至る、遺伝子のコード領域の、対応する
アミノ酸配列も第２図に示されている。Figure 2 shows 1) HG 23 manufactured by vI4 as described above.
The nucleotide sequence of the GM-O8F gene contained in the plasmid DNA is shown. Alanine (
Ala) residue 1 (nucleotide &14) to glutamic acid (Glu) residue 127 (nucleotide II
The corresponding amino acid sequence of the coding region of the gene leading to G, 394) is also shown in FIG.

配列決定の調製に於いて、挿入ＤＮＡを含むプラスミド
ＤＮＡは、単鎖鋳型ＤＮＡ　”ｉ形成させるために、Ｍ
１３ファージベクター中にサブクローニング（５ｕｂｃ
ｌｏｎｅ）を行なう。情報金持つ単鎖および情報を持た
ない単鎖（ｔｈθθｅｎｓｅ　ａｎｄａｎｔｉａｅｎｓ
ｅ　５ｔｒａｎａｓ　）の配列決定には一般的な汎用プ
ライマーを使用する。−回のみのチェインターミネーシ
ョン法による７ラグメ／ト全体の配列決定から得られた
塩基配列の結果に依存だけでなく、さらに別の合成した
グライマーを便用して、サブクローニングされたＤＮＡ
　フラグメントの鎖長の中間点からチェインターミネー
ション法を開始する。前記合成的に、１ＪｉＩ製される
プライマーの塩基配列は、一般的なプライマーを用いて
得られた塩基配列の情報全根拠とした。上記過程におい
ては、サブクローニングされたＤＮＡ　７ラグメントの
二本の鎖の塩基配列は、重複した状態で決定され、その
ため、塩基配列を十分に確実に決定する際に役立つ。In preparation for sequencing, the plasmid DNA containing the insert DNA is fused with M to form a single-stranded template DNA.
13 subcloning into phage vector (5ubc
one). Single chain with information and single chain without information (thθθense andantiaens
Common general purpose primers are used for sequencing of e 5tranas ). - Relying on the sequence results obtained from the sequencing of the entire 7-lag mate by a single chain termination method, as well as making use of additional synthesized glymer, the subcloned DNA
Start the chain termination method at the midpoint of the chain length of the fragment. The nucleotide sequence of the synthetically produced 1JiI primer was based on all the information on the nucleotide sequence obtained using a general primer. In the above process, the base sequences of the two strands of the subcloned DNA 7 fragments are determined in an overlapping manner, which is useful in determining the base sequences with sufficient certainty.

上に概要を示したチェインターミネーション法を使用す
る他に、本発明の意図および範囲を逸脱せずに、クロー
ニングされたヒト挿入ＤＮＡの配列決定に他の既知の方
法を実施しうろことは、理べられている。！クサム（Ｍ
ａｄａｍ　）およびギルバート（Ｇ１１ｂｅｒｔ　）の
化学的分解法（ｃｈｅｍｉｃ９）（ａ）ｄ＠ｇｒａｄａ
ｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　）　を使用しうる。In addition to using the chain termination method outlined above, it is understood that other known methods may be practiced for sequencing cloned human insert DNA without departing from the spirit and scope of the present invention. It's being ignored. ! Kusam (M
adam) and Gilbert (G11bert) chemical decomposition method (chemical9) (a) d@grada
tion method) can be used.

ｃＤＮＡクローンからの、機能的ＧＭ−Ｃ！ＳＦの形質
発現 ｐＨ０２３に含有される、ｃＤＮＡのＧＭ−Ｏ８ＩＰ遺
伝子コード領域が、機能を釆たてＧＭ−０８Ｆをコード
しているか否か全決定するために、上記遺伝子を宿主細
胞中で形質発現させ、寒天中の骨髄コロニーの成長を促
進する能力上検定した。第２図に示された、実質的にＧ
Ｍ−０８Ｆ遺伝子の全コード領域であるｃＤＮＡフラグ
メント、丁なわち８ｆａ　Ｎ工から　Ｎｅｏ工　までの
フラグメントを、成熟形態のＧＭ−０８７を酵母宿主細
胞で合成、および分泌させる形質発現ベクター（第３図
）に挿入する。この形質発現ベクターはｐＹαｆＧＭ−
２と呼ばれ、複製の起点およびアンピシリン抵抗遺伝子
（Ａｐｒ　）　ｆ含む、プラスミドｐＢＲ３２２由来の
塩基配列（第３図太線）を含有する。また、上記形質発
現ベクターは、選択性マーカー（５ｒｌｅｃｔａｂｌｅ
　ｍａｒｋｅｒ　）としてのトリプトファン−１遺伝子
（Ｔｒｐ−１）および２μ酵母り製起点を含む、酵母由
来の塩基配列（第３図細餓）も含首する。さらに、上記
彫質発親ベクターは、効果的なブ　モモターとして、酵
母プレープローα接合因子（ｙｅａｓｔ　ｐｒｅ−ｐｒ
ｏ−αｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ　、　’″α因子″）
お工び、酵母細胞中でＧＭ−Ｏ８Ｆの合成と分泌を行な
わせるリーダー配列（１ｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ　）　ｆ含有し、上記リーダー配列の＠後に第２図に
示され７４ＧＭ−ＯＥＩＦのコード領域の塩基配列を有
する。α−因子遺伝子の構造は、クルヤン（ｋｕｒｊａ
ｎ　）お工びヘルスコヴイツツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ
　　）ｆｆｉ、３０　Ｃｅ１ｌ　９３３−９４３（１９
８２年１０月）に詳述されている。Functional GM-C from cDNA clone! Expression of SF In order to fully determine whether the cDNA GM-O8IP gene coding region contained in pH023 fully functions and encodes GM-08F, the above gene was expressed in host cells. and assayed for its ability to promote the growth of bone marrow colonies in agar. As shown in FIG.
A cDNA fragment representing the entire coding region of the M-08F gene, that is, a fragment from 8faN to Neo, was used as a gene expression vector (Fig. 3) to synthesize and secrete the mature form of GM-087 in a yeast host cell. ). This expression vector is pYαfGM-
2, which contains the base sequence derived from plasmid pBR322 (bold line in Figure 3), including the origin of replication and the ampicillin resistance gene (Apr) f. Further, the above-mentioned expression vector contains a selectable marker (5rlectable
It also contains the tryptophan-1 gene (Trp-1) as a marker) and a yeast-derived base sequence (Fig. 3), including the 2μ yeast origin. In addition, the above-mentioned vegetative vector can be used as an effective vector for yeast pre-pr α mating factor (yeast pre-pr α mating factor).
o-α mating factor, '"α factor")
The leader sequence (1 leader 5 sequence) that allows GM-O8F to be synthesized and secreted in yeast cells.
s) Contains f, and has the base sequence of the coding region of 74GM-OEIF shown in FIG. 2 after @ of the leader sequence. The structure of the α-factor gene is based on the Kurja
n) Herskowitz
)ffi, 30 Ce1l 933-943 (19
(October 1982).

ｐＹαｆＧＭ−２形質発現プラスミドは、酵母、サツカ
ロミセス・セレビシェ（８，ｃｅｒｅｖｉｅ１ａθ）の
適当な菌株中に形質転換を行なう。望ましい菌株は、酵
母菌株番号７９　、Ｘ２１８１−ＩＢ、ＤＢＹ　７４６
、ＹＮＮ２８２．２０Ｂ−１２を含む、上記各菌株は、
α−因子プロモーターとの適合性およびＴｒｐ十形質転
換体の選択の点において、全てα、Ｔｒｐｌである。上
記菌種は全て広く人手可能であって、例えば菌株７９は
、カリフォルニア大学酵母遺伝子貯臓センター生物物理
お工び医学物理部門（ｔｈｅＹｅａｓｔ　Ｇ６１ｎ８ｔ
ｉＣ５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　、　ｎｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔｏｆ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃ
９）（ａ）　Ｐｈｙｓｉｃｓ）　（カリフォルニア州パ
ータレ−９４７０２）Ｆも入手できる。培養上清は、ヒ
ト骨髄細胞から顆粒球およびマクロファージ混合型コロ
ニーの形成を行なわせる能力についての生物学的活性の
検定を行なう。対照として、ＧＭ−０８７塩基配列を欠
く以外はｐｙαｆＧＭ−２と同じ構造を持つプラスミド
ｐＹαｆで同様に酵母宿主の形質転換を行ない、培養上
清の生物学的活性を検定した。ｐＹαｆ対照プラスミド
由来の上清からは活性は認められなかったのに対し、ｐ
ＹαｆＧＭ−２０上清は骨髄コロニーアッセイ（ａｓｓ
ａｙ　）において高水準のＧＭ−Ｏ８Ｆ活性を生じさせ
ることが確認された。The pYαfGM-2 expression plasmid is transformed into an appropriate strain of yeast, Saccharomyces cerevisiae (8, cerevielaθ). Preferred strains include yeast strain number 79, X2181-IB, DBY 746.
, YNN282.20B-12, each of the above strains,
All α,Trpl in terms of compatibility with the α-factor promoter and selection of Trp transformants. All of the above bacterial species are widely available; for example, strain 79 was obtained from the Department of Biophysics and Medical Physics, Yeast Gene Storage Center, University of California (the Yeast G61n8t).
iC5tock Center, nepartme
ntof Biophysics and Medicine
9) (a) Physics) (Partale, CA-94702) F is also available. Culture supernatants are assayed for biological activity for their ability to induce the formation of mixed granulocyte and macrophage colonies from human bone marrow cells. As a control, a yeast host was similarly transformed with plasmid pYαf having the same structure as pyαfGM-2 except that it lacked the GM-087 base sequence, and the biological activity of the culture supernatant was assayed. No activity was observed from the supernatant derived from the pYαf control plasmid, whereas pYαf
YαfGM-20 supernatant was subjected to bone marrow colony assay (ass
ay ) was confirmed to produce a high level of GM-O8F activity.

ｍＲＮＡの分析 ＧＭ−０８Ｆ’ｉ合成する細胞の利用可能性は限られて
いるため、以前に他の０８Ｆの形質発現をすると報告さ
れた多種の細胞からのＧＭ−Ｃ８ＦｍＲＮＡの形質発現
全研究した。上記細胞からのＲＮＡのノザ／・プロット
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ　）　ｆ　ｐＨＧ２３
由来のＲＮＡプローブとのノーイブリッド形成によって
分析した。第４図に示される工うに、グローブは、ＰＭ
ＡおよびＣｏｎ　Ａによって活性化された末梢血液Ｔ細
胞由来および、ＨＵＴ　−１０２細胞由来の各単−ＲＮ
ムバンドと強くノーイブリッド形成した（列３および列
１）。ヒト膀胱腫瘍細胞系由来のＲＮＡは、低水準の７
１イブリツド形成を示した（列６）。また、活性化され
ていないＴ細胞、リポポリサッカライドで活性化された
マクロファージ、およびヒト０準臓腫瘍細胞系では、ハ
イブリッド形成は起こらなかった（列２，４お工び５）
。上記の結果は、活性化された末梢血液Ｔ細胞およびＨ
ＵＴ　−１０２細胞由来のＧＭ−Ｃ８Ｆ’との関連が判
明している生物学的活性の水準と一致する。Analysis of mRNA Because of the limited availability of cells that synthesize GM-08F'i, we investigated the expression of GM-C8F mRNA from a variety of cell types previously reported to express 08F. Northern blots of RNA from the above cells f pHG23
The analysis was performed by noibrid formation with the derived RNA probe. In the construction shown in Figure 4, the glove is PM
Each single RN derived from peripheral blood T cells and HUT-102 cells activated by A and Con A
strongly nobridized with the band (column 3 and column 1). RNA from human bladder tumor cell lines has low levels of 7
1 hybrid formation (column 6). Additionally, no hybridization occurred with unactivated T cells, lipopolysaccharide-activated macrophages, and the human 0 subvisceral tumor cell line (columns 2, 4 and 5).
. The above results demonstrate that activated peripheral blood T cells and H
This is consistent with the level of biological activity found to be associated with GM-C8F' from UT-102 cells.

ヒトゲノムＤＮＡ内のＧＭ−（３ＳＦ関連遺伝子の数は
、ＩｍｐでラベルしたヒトＧＭ−０８’Ｆ　プローブを
、ヒトゲノムＤＮＡ　フラグメントとハイブリッド形成
させる、サザン・プロット法で確認した。各フラグメン
トは、ＤＮＡを比較的少ない箇所で明所すると思われる
、数種の制限醇素で、ヒトゲノムＤＮＡを消化して調製
した。第５図に示されたように、Ｈｌｎｄ　Ｉ％Ｅｃｏ
　Ｒ工、あるいはｐａｔ工で消化したヒトゲノムＤムＩ
Ａはそれぞれ１本のバンド全形成し、Ｂｇｌ　　Ｍに工
ろ消化では２本の）１イブリツド形成バンド會示した。The number of GM-(3SF-related genes in human genomic DNA was confirmed by Southern blotting in which Imp-labeled human GM-08'F probe was hybridized with human genomic DNA fragments. Each fragment was compared with DNA Human genomic DNA was prepared by digesting human genomic DNA with several kinds of restriction substances that are thought to be bright in few places.As shown in Figure 5, Hlnd I%Eco
Human genome DmuI digested with R or PAT
One band was formed in each case of A, and two (2) bands were formed in BglM when the digestion was performed.

上記の結果から、ＧＭ−Ｃｌ３Ｆは、ヒトゲノムＤＮＡ
中に於いて、単一コピー遺伝子として存在することが判
明した。From the above results, GM-Cl3F is derived from human genomic DNA.
It was found that the gene exists as a single copy of the gene.

本発明の過程および生成物につき、以下の実施例に詳述
する。The process and products of the invention are detailed in the Examples below.

１ｄ当たシ約２Ｘ１０＠細胞の濃度ＯＨ１］Ｔ−１０２
細胞を、１０チ（Ｖ／）ウシ胎児血清（”　ＦＣ！Ｓ″
）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｄベニシリ／お工び
１００μｇ／ＩＬｌストレプトマイシフ？Ｉｌ”加エタ
、Ｉ　Ｑ　Ｏ−ｓ　Ｏｏ　ｗのロスウェル・パーク・メ
モリアル・インステイテユート（ＲＰＭ工）−１６４０
培地で培養した。細胞は、５チＣ０２を含む湿潤大気中
で約３−５日間培養した。上記期間の後、生存細胞を、
遠心分離によって集めた。Approximately 2X10@cell concentration OH1 per 1 d] T-102
The cells were treated with 10 V/V of fetal calf serum ("FC!S").
), 2mM Glutamine, 100U/dVenicilli/Original 100μg/ILl Streptomysif? Rothwell Park Memorial Institute (RPM)-1640
Cultured in medium. Cells were cultured for approximately 3-5 days in a humidified atmosphere containing 50% C02. After the above period, the viable cells are
Collected by centrifugation.

全ＲＮＡは、チャーウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　）ら（
前出）に二る、標準的な方法によって、ＨＵＴ−１０２
細胞から抽出した。本過程に於いて、ＲＮアーゼを含め
た細胞タンパクを、ＲＮアーゼによるＲＮＡの加水分解
の程度を越える程度に変性するのに、グアニジニウム量
チオシアネー１使用した。Total RNA was obtained from Chirgwin et al.
HUT-102 by the standard method mentioned above)
Extracted from cells. In this process, the amount of guanidinium thiocyanate was used to denature cellular proteins, including RNase, to an extent that exceeds the degree of RNA hydrolysis by RNase.

ｍＲＮＡは、塩化セシウム濃厚クッションでの超遠心に
よって、細胞タンパクから分離した。mRNA was separated from cellular proteins by ultracentrifugation in a cesium chloride thick cushion.

その後、抽出されたタンパク７３ｈらマニアテイス（Ｍ
ａｎｉａｔｉ日）他（前出１９７）による標準的方法を
用いて、オリゴ（ｄＴ）−セルロース　クロマトグラフ
ィーカラム上により、ポリアデニル化されたｍＲＮＡ　
ｆ分離した。略述すると、カラムは一適用バツファー（
２０ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，６）、０．
５ＭＮ５Ｃ１，１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｉ！ｊ
ＤＴＡ”）および　０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（
′″ＳＤＳ”））でＡ装した。ベレット状タンパク質は
、水および適用バッファーに溶解し、カラムに充填した
。吸着されなかったタンパク員は、捷ず適用バッファー
で洗浄してカラムから除去し、続いて０．１　Ｍ　Ｎａ
１ｌ　ｆ含む適用バッファーでさらに洗浄を行なった。After that, the extracted protein 73h et al.
polyadenylated mRNA on an oligo(dT)-cellulose chromatography column using the standard method of Aniati et al. (supra, 197).
f separated. Briefly, a column has one applied buffer (
20mM Tris-HCl (pH 7,6), 0.
5MN5C1, 1mM ethylenediaminetetraacetic acid (I!j
DTA”) and 0.1% sodium dodecyl sulfate (
A-packed with ``SDS'')). The protein pellets were dissolved in water and application buffer and loaded into the column. Unadsorbed proteins were removed from the column by washing with application buffer without stirring, followed by 0.1 M Na
A further wash was performed with application buffer containing 1lf.

カラムに保持されたポリアデニル化されたｍＲＮＡは、
ｌＱｍＭトリス−ＭＣＩ　　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　
ＫＤＴＡお工び０．０５％８Ｄ８刀）もなる低イオン強
度のバッファーで溶離した。溶出したポリアデニル化さ
れたｍＲＮＡは、−２０℃で、１翁　葉の酢酸すｌ−１
７ラム（３Ｍ、ｐＨ５，２）おＬび２．２倍量のエタノ
ールで沈殿させた。ポリアデニル化されたｍ　ＲＮＡの
オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムからの溶出後、マニ
アナイス他の標準的方法（前出、１９９）に工って、ア
ガロースゲル電気泳動で、ポリアデニル化されたｍＲＮ
Ａの完全性を確認した。The polyadenylated mRNA retained on the column is
lQmM Tris-MCI (pH 7,5), 1mM
It was eluted with a low ionic strength buffer containing 0.05% KDTA (8D8). The eluted polyadenylated mRNA was treated with 1 ml of acetic acid at -20°C.
It was precipitated with 7 L of rum (3M, pH 5,2) and 2.2 times the amount of ethanol. After elution of the polyadenylated mRNA from the oligo(dT)-cellulose column, the polyadenylated mRNA was analyzed by agarose gel electrophoresis using the standard method of Manniais et al. (supra, 199).
The integrity of A was confirmed.

１Ｍ１当たり約２Ｘ１０’細胞の濃度の末梢血液’Ｉ’
　−ＩＪン７＜）１ｍ細胞（ボートランド、オレゴン・
レッド−クロスからの混合物）を、１０ｑｂ（ｖ／Ｖ　
）Ｆｅ２．２ｍＭグルタミン、１００［］／ａ／ペニシ
リン、１００μｇ　／　ｄストレプトマイシン、さらに
、２０　／ＩｇコンカナバリンＡ（”０ｏｎＡ”）（フ
ァルマシア−７アイン・ケミカルズ、ニューシャーシー
州ピ、ヌカタウエイ）およびｌＯμｇ　／　ｄホルボー
ルミリステートアセテート（′″ＰＭＡ″）（シグマ・
ケミカル社、ミズーリ州　セントルイス）を加えた１０
０−５００ｄのＩ’ｔＰＭニー１６４０培地で培養した
。上記細胞は、大気中に５　％　Ｃｏ、　′に含む、湿
潤大気中で約２０時間培養した。上記期間後、生存細胞
を、遠心分離によって得た。その後、全ＲＮＡ　１に末
梢血液Ｔ細胞から抽出し、上記実施例１に示した方法で
、抽出したタンパク質からポリアデニル化されたｍＲＮ
Ａ　ｆ調製した。Peripheral blood 'I' at a concentration of approximately 2X10' cells per 1 M1
-IJn7<)1m cells (Boatland, Oregon)
10 qb (v/V
)Fe2.2mM glutamine, 100[]/a/penicillin, 100μg/d streptomycin, plus 20/Ig concanavalin A (“0onA”) (Pharmacia-7 Ain Chemicals, Nucataway, New Jersey) and lOμg/d streptomycin. d phorbol myristate acetate (''PMA'') (Sigma・
Chemical Company, St. Louis, Missouri)
Cultured in I'tPM Nee 1640 medium from 0 to 500 d. The cells were cultured for about 20 hours in a humid atmosphere containing 5% Co,' in the atmosphere. After the above period, viable cells were obtained by centrifugation. Thereafter, total RNA 1 was extracted from peripheral blood T cells, and polyadenylated mRNA was extracted from the extracted protein using the method described in Example 1 above.
A f was prepared.

ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡ　ライブラＩＪ　−
は、マニアテイスらによる標準的方法（前出。Double-stranded cDNA library corresponding to mRNA IJ-
is the standard method by Maniathes et al. (supra).

２２９）に１って、実施例１おＬびＩＡに於いて純粋化
された全ｍＲＮＡρ為ら調製した。オリゴ−ｄＴを１上
記ｍＲＮＡのポリアデニル化されたラベル（ｔａｉｌ　
）とハイブリッド形成させ、ｃＤＮＡの第１の鎖の逆転
写のためのプライマーとした。トリ骨髄性白血病ウィル
ス（ａＶｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒ
ｕｓ、’ＡＭＶ”）逆転写酵素で、上記ｍＲＮＡ　ｆ鋳
型として第１の（！ＤＮＡ鎖七合成した。上記操作によ
って、第１のｃＤＮＡ鎖の３′末端に、第２のｃＤＮＡ
鎖のための内在性プライマーとして働くヘアピンループ
が形成された。ｍＲＮＡ鎖會Ｎｍ０）１で分解した後、
第２のｃＤＮＡ　＠１ＤＩＪＡポリメラーゼ■を使用し
て合成した。次に、ヘアピンループをヌクレアーゼＳ工
で除去し、二本鎖ｃＤＮＡ分子を形成させた。229), total mRNA ρ purified in Example 1 and IA was prepared. Oligo-dT was added to the polyadenylated tail of the mRNA above.
) and used as a primer for reverse transcription of the first strand of cDNA. Avian myeloblastic leukemia virus (aVian myeloblastosisvir)
The first (!DNA strand) was synthesized using the above mRNA f template using reverse transcriptase (us, 'AMV''). By the above procedure, the second cDNA was added to the 3' end of the first cDNA strand.
A hairpin loop was formed that served as an endogenous primer for the strand. After decomposing the mRNA chain Nm0)1,
The second cDNA was synthesized using @1DIJA polymerase ■. The hairpin loop was then removed with nuclease S to form a double-stranded cDNA molecule.

上記二本鎖ＣＤＮＡは、セファクリル （Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　８−４００　（ファルマシア
・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ：Ｌｓ）ニューシャーシー州ビスカ
タウエイ）カラムクロマトグラフィーで、分子の大きさ
に工っで分画し、末端をラベルしたｐＢＲ３２２ＤＮＡ
　餅片を分子量マーカーとして、アルカリアガロース電
気泳動に工って分析し、検討した。５　（Ｊ　Ｏｂｐ以
下の鎖長のｃＤＮＡは、これら短いｃＤＮＡ　Ｍ片の不
要なりローニッグを避けるために除去した。The double-stranded CDNA was obtained from Sephacryl 8-400 (Pharmacia Fine Chemicals).
e Chemica: Ls) Biscataway, New Chassis) column chromatography to fractionate the molecular size and label the ends of pBR322 DNA.
Mochi pieces were used as molecular weight markers for alkaline agarose electrophoresis and analysis. cDNAs with a chain length of 5 (J Obp or less) were removed to avoid unnecessary Ronig of these short cDNA fragments.

上記二本鎖ｃＤＮＡの各フラクションは、マニアナイス
他による標準的方法（前出、２３９−　）によって、ｐ
ＢＲ３２２プラスミドのＰｓｔ工切断部位に挿入された
。上記操作において、二本鎖ｃＤＮＡのそれぞれの３′
末端に、ポＩＪ　（ｄＣ）のティ／Ｉ／ヲ付加した。プ
ラスミドｐＢＲ３２２（ファルマシア嗜ファイン・ケミ
カルズ）は、Ｐａｔエエンドヌクレアーゼで切断し、３
′末端にポリ（ｄＧ　）のラベルを付加した。ティリン
グされたプラスミドＤＮＡおよびティリングされＣＣＤ
ＮＡは、アニーリングバッファー（０，１Ｍ　ＮａＣ１
，１０ｍＭ　）リス−Ｈ０Ｉ　（ｐＨ７，８）およびｌ
　ＯｍＭ　ＩＩＣＤＴＡ　）中でアニーリングさせ、組
み換えプラスミドを形成させた。上記操作中で使用した
全ての制限酵素は、ニュー・イングランド・バイオラプ
ズ（Ｎｅｗ］！！ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　（
？サチューセツツ州　ベバリー）から市販されており、
入手可能である。Each fraction of the above double-stranded cDNA was purified by the standard method of Manniais et al. (supra, 239-).
It was inserted into the Pst engineering cleavage site of the BR322 plasmid. In the above operation, each 3′ of the double-stranded cDNA
At the end, T/I/ of poIJ (dC) was added. Plasmid pBR322 (Pharmacia Fine Chemicals) was cleaved with Pat endonuclease and
A poly(dG) label was added to the 'end. Tilled plasmid DNA and tilled CCD
NA is annealing buffer (0,1M NaCl
, 10mM) Lis-H0I (pH 7,8) and l
The recombinant plasmid was formed by annealing in OmM IICDTA). All restriction enzymes used in the above procedures were purchased from New England Biolabs (New! England Biolabs) (
? It is commercially available from Beverly, S.C.
available.

上記組み換えプラスミドは、ハナハン （Ｈａｎａｈａｎ　）による標準的方法（前出］に工っ
て、大腸菌（Ｋ、　ｃｏｌｌ　）　ＭＭ　２９４株中に
形質転換を行ない、その際上記大腸菌細胞は、Ｍｇ”濃
度を上昇させた状態で培ｇ！調製したものを使用した。The recombinant plasmid was transformed into E. coli (K, coll) strain MM 294 using the standard method of Hanahan (supra), during which the E. coli cells had an elevated Mg concentration. A culture medium prepared under the condition of 100% was used.

形質転換宿生細胞は、適宜濃度でプレートに播いて、テ
トラサイクリンｔｌ−表現型同定物質として使用し、形
質転換体を同定した。上記方法によって、本発明者らは
、約２Ｘ１０’の独立な形質転換体を得た。Transformed host cells were plated at appropriate concentrations and used as a tetracycline tl-phenotyping agent to identify transformants. By the above method, we obtained approximately 2×10′ independent transformants.

Ｉ、ＢＲＭ　−３３−５Ａ　４細胞から、全ＲＮＡを抽
出し、実施例１お工びＩＡに示された方法にＬつて、オ
リゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーカラムで
上記全ＲＮＡからポリアデニル化されたｍＲＮＡ　ｆ分
離した。ＬＢＲＭ−３３−５Ａ４細胞系は、アメリカン
・タイプ・カルチャーＯコレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｏｕｒ℃ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ、　１２３０１　　Ｐａｒｋ　Ｌａｗｎ　Ｄｒｉ
ｖｅ。Total RNA was extracted from BRM-33-5A 4 cells and polyadenylated from the total RNA using an oligo(dT)-cellulose chromatography column according to the method described in Example 1 and IA. The mRNA f was isolated. The LBRM-33-5A4 cell line was purchased from the American Type Culture O Collection (the Ame
rican Type Our℃ureCollect
ion, 12301 Park Lawn Dri
ve.

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２　、υ、Ｓ、
Ａ、ｌｋら入手できる（工ＡＴＣＣ！−ＣＲＬ　−８０
８０）。完全なポリアデニル化ｍＲＮＡが得られたこと
は、アガロースゲル電気泳動に工ってａｇさｎた。マク
スｍＲＮＡに対応する二本鎖ＣＤＮＡのライプラ＋７−
は、上記実施例２の方法で調製された。得られた５　０
０　ｂｐ以上の鎖長の二本鎖ｃＲＮＡ　フラクションは
、実施例２に述べた。ホモポリマーによるテーリ／グ法
（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇｍｅｔ
ｈｏｄ）に工って、ｐＢＲ３２２グラスミドのＰｓｔ　
工切断部位に挿入された。組み換えプラスミドは、大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）　ＭＭ　２９４１！Ｊ株中に取り込
ませて形質転換を行ない、矢に、形質転換体は、テトラ
サイクリンを表現型同定物質として、同定された。上記
操作によって、本発明者らは約６×１０の独立した形質
転換棒金同定した。Rockville, MD 20852, υ, S,
A, lk etc. are available (engineering ATCC!-CRL-80
80). Obtaining complete polyadenylated mRNA was confirmed by agarose gel electrophoresis. Lypra+7-, a double-stranded CDNA corresponding to Max mRNA
was prepared by the method of Example 2 above. obtained 50
The double-stranded cRNA fraction with chain length greater than or equal to 0 bp was described in Example 2. Homopolymeric tailing method
pBR322 Grasmid Pst
inserted into the amputation site. The recombinant plasmid is E. coli (E, coll) MM 2941! Transformation was carried out by incorporation into strain J, and transformants were identified using tetracycline as a phenotypic identification substance. Through the above procedure, the present inventors identified approximately 6 x 10 independent transformed rods.

合成オリゴヌクレオチドプローブは、スート（ＳＯＯｄ
）ら（前出）、お工びヒロセら（前出）に詳述されてい
る、標準的なトリエステル法によって化学的に合成され
、次に、マウスｃＤＮＡ　ライブラリーのスクリーニン
グに使用するために、Ｐで放射性標識を行なった。上記
プローブは、以下のヌクレオチド配列を有する：　５’
−ＴＧＡＴＧＧ（ｊ。Synthetic oligonucleotide probes are soot (SOOd)
) and Hirose et al. (supra), and then for use in screening mouse cDNA libraries. Radiolabeling was performed with ,P. The probe has the following nucleotide sequence: 5'
-TGATGG(j.

ＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＴＣ！０ＡＡＧＧＣ＋：！ＧＧＧ
ＴＡＡＣＡＡＴＴＡＴ−３′。放射性標識上促進するた
めに・オリゴヌクレオチドの５′末端をｏｎ末端として
合成し、それによって、ＤＮＡ　フラグメントを放射性
標識する際に、一般的には使用しなければならないホス
ファターゼ処理を省くことができる。放射性標識の方法
は、１６μ２の”Ｐ−ＡＴＰ（７００（１１７ｍＭ）、
ｌμＪｌ（ＩＯＵ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼお
！び２μ２の１０倍濃度キナーゼバッファーＩ（０，５
Ｍトリス−Ｈｃｌ　（ｐＨ７，６）、０．１Ｍｇ０１．
．５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン（
８ｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）おＬびｌ　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ）
に１μ２の合成オリゴヌクレオチド管加えることによっ
た。反応は３７℃で３０分間行ない、その後フェノール
／りロロフォルムで合成オリゴヌクレオチドを抽出した
。ラベルされたプローブは、セファデックスＧ　−５０
（８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０）カラム（ファルマシア
舎ファイン１１ケミカルズ社）に工って、ラベルのなさ
れていないオリゴヌクレオチドから分離された。TCTACATGCTTC! 0AAGGC+:! GGG
TAACAATTAT-3′. To facilitate radiolabeling - The 5' end of the oligonucleotide is synthesized as the on-end, thereby eliminating the phosphatase treatment that typically must be used when radiolabeling DNA fragments. The radiolabeling method was as follows: 16μ2 of “P-ATP (700 (117mM),
lμJl (IOU) of T4 polynucleotide kinase! and 2μ2 of 10x concentration Kinase Buffer I (0,5
M Tris-Hcl (pH 7,6), 0.1Mg01.
．． 50mM dithiothreitol, 1mM spermidine (
8permidine) EDTA)
by adding 1 μ2 of synthetic oligonucleotide tubes to the tube. The reaction was carried out at 37°C for 30 minutes, after which the synthetic oligonucleotides were extracted with phenol/lyloform. The labeled probe was Sephadex G-50
(8ephadex G-50) column (Pharmacia Fine 11 Chemicals) to separate it from unlabeled oligonucleotides.

マウスｃＤＮＡ　　ライブラリーの初めのスクリーニン
グを促進するために、形質転換された培養菌を、それぞ
れ約３０００の異なっｆこクローンを有するクールに分
割した。プラスミドＤＮＡは、イツシューホロウィッッ
（工ａｈ−ＨＯｒＯＷｉＣＺ　）お工びプルク（Ｂｕｒ
ｋｅ　）著、９　Ｎｕｌｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。To facilitate initial screening of the mouse cDNA library, the transformed culture was divided into courses, each containing approximately 3000 different clones. Plasmid DNA was obtained from Ishu HorowiCZ and Burk.
ke), 9 Null, Ac1ds Res.

２９８９（１９８１年）に詳述されている。標準的なア
ルカリ溶菌法に工って宿主細菌試料から除去した。単離
されたプラスミドは、標準的方法に工って、Ｐｖｕｌｌ
おＬびＨｌｎｄ　Ｉｆで完全に分解した。2989 (1981). Host bacteria were removed from samples using standard alkaline lysis methods. The isolated plasmid is engineered using standard methods to
Completely disassembled with L and Hlnd If.

次に、上記グラスミド分解物’ｔ、０．８％アガロース
ゲル電気泳動で分画し、標準的なサザンの方法（前出）
に↓つてニトロセルロースフィルター上にプロットした
。ニトロセルロースフィルターに結合されたＤＮＡは、
実施例４（浸出）に詳述さレタ方法で、ラベルされた合
成オリゴヌクレオチドグローブとハ・イブリッド形成さ
せた。ＤＮＡのハイブリッドバンドを生じた、クローン
の候補プールは、放射性標ｍｋした合成プローブと直接
コ　　。The above Grasmid digest was then fractionated by 0.8% agarose gel electrophoresis, using the standard Southern method (supra).
↓ and plotted on a nitrocellulose filter. The DNA bound to the nitrocellulose filter is
Hybridization was performed with labeled synthetic oligonucleotide globes using the Letta method detailed in Example 4 (Leaking). The candidate pool of clones that yielded a hybrid band of DNA was directly combined with a radiolabeled synthetic probe.

ロニーハイブリッド形成させることによってスクリーニ
ング全行ない、一つの陽性のコロニーを同定した、 プラスミドＤＮＡは、上記方法によって、同定されたコ
ロニーから１４製し、実施例５に述べる工うに配列決定
を行なった。単離されたマウスプラスミドＤＮＡフラグ
メントのヌクレオチド配列（第１図）は、実質的にマウ
スＧＭ−Ｃ８Ｆ４伝子の読み枠のヌクレオチド配列およ
び上記遺伝子の５′末端の付加配列お工び上記遺伝子の
コード領域の中間部位に、一つの付加コドン（ヌクレオ
チド番号２０１−２０３　）を含有することが判明し、
純粋化されたマウスプラスミドＤＮＡがＧＭ−ＣｉＳＦ
をコードしていることが確認できた。第１図に示した工
うに、さらに数個の重要ではない相違が数個のコドンの
第３のヌクレオチドに存在するが、コードされているア
ミノ酸の変化を起こ丁ものではない。All screenings were carried out by hybridization and one positive colony was identified. Plasmid DNA was prepared from 14 colonies identified by the above method and sequenced as described in Example 5. The nucleotide sequence of the isolated mouse plasmid DNA fragment (Figure 1) consists essentially of the nucleotide sequence of the reading frame of the mouse GM-C8F4 gene, an additional sequence at the 5' end of the gene, and the code of the gene. It was found to contain one additional codon (nucleotide numbers 201-203) in the middle of the region,
Purified mouse plasmid DNA is GM-CiSF
It was confirmed that the code is In the structure shown in Figure 1, a few additional minor differences exist in the third nucleotide of several codons, but do not result in a change in the encoded amino acid.

＠１図の下線で示されたマウスＧＭ−Ｃ８ＦｃＤＮＡク
ローンの３５６　ｂｐフラグメント（ヌクレオチド番号
４５乃至４００１、上記実施例２で調製されたヒトプラ
スミドＤＮＡのスクリーニングの際のプローブとして選
択した。プローブフラグメントは、制限酵素Ｐｓｔ工お
工びＩ（Ｓｅ厘による２重の分解の後、アガロースゲル
電気泳動を行ない、マクスｃＤＮＡクローンから分解し
た。The 356 bp fragment (nucleotide numbers 45 to 4001) of the mouse GM-C8F cDNA clone shown underlined in Figure @1 was selected as a probe for screening the human plasmid DNA prepared in Example 2 above. The probe fragment was After double digestion with the restriction enzyme Pst I (Se), agarose gel electrophoresis was performed to digest from the Max cDNA clone.

０ＤＮＡ　プローブは、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔ、
ｉａ　）らの方法（前出、１０８　）および本明細書「
放射性標識されｙ、ＨｃＤＮＡ　スクリーニングプロー
ブの調製」で述べた標準的方法で、ニックトランスレー
ションに１って放射性標識を行なった。上記操作によっ
て、グローブは、約５　Ｘ　１０’　ｃｐＭ／μｇ　Ｉ
）ＮＡの比活性を持つようにラベルされ１こ。0 DNA probe was Maniat.
ia) et al. (ibid., 108) and herein "
Nick translation was followed by radiolabeling using the standard method described in ``Preparation of Radiolabeled HcDNA Screening Probes''. By the above procedure, the globe has approximately 5 X 10' cpM/μg I
) is labeled to have a specific activity of NA.

スクリーニング法に使用するのに先立ち、ラベルされた
プローブを１００℃の沸騰水中で１０分間煮沸し、続い
て水中で冷却し、変性させた。Prior to use in the screening method, the labeled probes were boiled in boiling water at 100° C. for 10 minutes, followed by cooling in water and denaturation.

上記実施例２でｇｉ４展されたｃＤＮＡ　ライブラリー
の初めのスクリーニングを促進するＴこめに、形質転換
培養菌を各々約１００，０００　の相異なるクローンを
有するプールに分割した。プラスミドＤＮＡはイツシュ
ーホロウイツツ（工ｓｈ　−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ　）お工
びプルク（Ｂｕｒｋｅ　）　著、９ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ
　Ｒｓｓ、　　２９８９　（１９８１年）に詳述された
標準的なアルカリ浴菌法によって、宿主細胞の試料から
分離した。単離されたプラスミドはＰａｔ工で切断され
、適当な大きさのマーカーとともに、１．０％アガロー
スゲルでＩＩｔ気泳動に工つて分画した。アガロースゲ
ルは、サザン（８ｏｕｔｈｅｒｎ　）による方法（前出
）で、ニトロセルロースフィルター上にプロットした。To facilitate the initial screening of the gi4-expanded cDNA library in Example 2 above, the transformed cultures were divided into pools each having approximately 100,000 distinct clones. Plasmid DNA was prepared by Ish-Horowicz and Burke, 9 Nucl Acids.
It was isolated from a sample of host cells by the standard alkaline bacterium method detailed in J.R.S., 2989 (1981). The isolated plasmid was cut with Pat and fractionated using IIt electrophoresis on a 1.0% agarose gel together with a marker of an appropriate size. Agarose gels were plotted on nitrocellulose filters by the method of 8outhern (supra).

形質転換過程の後、フィルターを乾燥させ、真空巾約８
０℃で２時間熱処理し、ＤＮＡ　７ラグメントヲニトロ
セルロースと結合させた。After the transformation process, dry the filter and vacuum width approx.
Heat treatment was performed at 0° C. for 2 hours to bind the DNA 7 fragments to nitrocellulose.

結合させたＤＮＡは、次に、ラベルされたｃ　ＤＮＡプ
ローブとハイブリッド形成させた。略述すると、熱処理
したニトロセルロースｔ、６　Ｘ　ＳｅＧ　　、０．５
％ＮＰ４０洗浄剤、０，１％サルコシル（５ａｒｃｏａ
ｙｌ　）。The bound DNA was then hybridized with a labeled cDNA probe. Briefly, heat-treated nitrocellulose t,6X SeG, 0.5
%NP40 detergent, 0.1% Sarcosyl (5arcoa
yl).

５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ａ　５ｏｌｕ
ｔｉｏｎ　）（ｏ、０２％フィコ−＃　（Ｆｉｃｏｌｌ
　）、０．０２％　ポリビニルピロリド／、０．０２％
ＢＳＡ　）お工び１００μｇ　／　ｄの変性させたサケ
***ＤＮＡ　　（シグマ・タイプ■、ナトリウム塩１に
成分とするプレノ翫イブリッド形成バッファー中で２−
４時間５５℃に保つに０次に上記フィルター’ｋ”Ｐで
ラベルされたｃＤＮＡグローブ（１０’　ｃｐｍ　／ｄ
　）　（実施例３Ｌす）とともに、上記ノ・イブリッド
形成溶液中で一晩５５℃に保った。−晩ノ）イブリッド
形成を行なつた後、フィルターを室温で、６ｘＢＢＣを
用いて十分に洗浄し、更に６ｘＢＢＧを用いて４２℃で
１時間、５５℃で１．５時間洗浄した。風乾後、フィル
ターは、−７０℃に於いてオートラジオグラフィーを行
なった。5x Denhardt's solution
tion ) (o, 02% Ficoll
), 0.02% polyvinylpyrrolid/, 0.02%
BSA) 100 μg/day of denatured salmon sperm DNA (Sigma type ■, 2-2% in hybrid formation buffer containing 1 part sodium salt)
Keep at 55 °C for 4 hours and then filter the cDNA globe labeled with 'k'P (10' cpm/d) above.
) (Example 3L) and kept at 55°C overnight in the hybrid formation solution described above. - Evening) After hybridization, the filters were washed extensively at room temperature with 6xBBC and then with 6xBBG for 1 hour at 42°C and 1.5 hours at 55°C. After air drying, the filters were autoradiographed at -70°C.

オートラジオグラフィーの結果工り、本発明者らは多数
の強くハイブリッド形成をしたバンドを得た。一つの、
強いハイブリッド形成バンドを示したプラスミドＤＮＡ
１与えた候補クローンのプールを、約７０００の形質転
換体を含むプールに再分し、ハイブリッド形成スクリー
ニング法を繰り返した０次に、ＤＮＡの強いハイブリッ
ド形成バンドの見られたサブプール全プレートに播いて
培養した。得られたコロニーは、上記のハイブリッド形
成条件で、既知のグルンシュタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉ
ｎ　）　′ｓ？Ｌびホグネス（Ｈｏ６ｎａｅ８）の方法
（前出）に工って、放射性標識されたｃＤＮＡヌクレオ
チドグローブを用いて調べた。上記過程によって、一つ
の陽性の宿主コロニーが同定された。As a result of autoradiography, we obtained a number of strongly hybridized bands. one,
Plasmid DNA that showed strong hybridization bands
1 The pool of candidate clones given was subdivided into pools containing about 7000 transformants and the hybridization screening procedure was repeated.Next, the subpools that showed strong hybridization bands of DNA were plated on all plates. Cultured. The obtained colonies were grown under the above hybridization conditions using known Grunstein
n)'s? The investigation was carried out using a radiolabeled cDNA nucleotide globe, adapted from the method of L. Hognes (supra). One positive host colony was identified by the above process.

実施例５　スクリーニングされたｃＤＮＡの塩基配列決
定 ｐＨ０２３と命名されたプラスミドは、実施例４で述べ
られた方法で、同定された陽性のコロニー由来のｃＤＩ
ＪＡ　ｋ用いてｖ４製され１こ。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
　）　ｋ形質転換した宿主プラスミドのサンプルは、Ａ
ＴＣＣに、受託番号３９９００として寄託されている。Example 5 Sequencing of Screened cDNA A plasmid designated pH023 was isolated from cDI from positive colonies identified by the method described in Example 4.
This was made in v4 using JAk. Escherichia coli (E. coli)
) A sample of the transformed host plasmid was
It has been deposited with the TCC under accession number 39900.

このプラスミドＤＮＡを陽性宿主コロニーから単離し、
挿入ＣＤＮＡを調製し、これについて、アマ−ジャム・
ハンドブック（Ａｍｓｒａｈａｍ　Ｈａｎｄ’ｂｏｏｋ
　、前出）に述べられた標準的なチェイ／・ターミネー
ション法全基本とし、以下の変更を加えた方法で塩基配
列決定を行なっ１こ。挿入ＣＤＮＡは、Ｐｓｔ　Ｉお工
び（または）Ｒｓ＆工で消化し、ＭＢ単鎖線状ファージ
ベクターの菌株ｍｐ１８お工びｍｐ　１９　（アマージ
ャム社、イリノイ州アーリントンφハイッ）にサブクロ
ーン化した。ノーランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　）ら
、前出によると、ｍｐ１８お工びｍｐ　１９フアージベ
クターは、以下の特異的なりローニッグ部位を含有する
；　Ｈｌｎｄ［；　Ｓｐｈ工；ｐｅｔ工；　Ｓａｄ工；
ＡＣｅ工；１ｉｎｅ　ｕ　　；　Ｘ’ｂａ工　；Ｂａｍ
Ｈ工；　　Ｘｍａ工；８ｍａＩ；Ｋｐｎ　Ｉ；　Ｓｅｔ
　Ｉお工び、ＥｃｏＲＩ。ｍｐ１８お工びｍｐ　１９ベ
クターの構造は、上記同定された制限醇素切断部位の配
列が、ｍｐ　ｔ　９ベクターでは逆向きである以外は、
同等であり、そのため挿入ｃＤＮＡの二本の鎖はともに
、二つのベクターで都合よく配列決定しうろ。挿入され
たｃＤＮＡ。This plasmid DNA is isolated from positive host colonies,
Prepare insert CDNA and use Amajam.
Amsraham Hand'book
The base sequence was determined using the standard Chey termination method described in 1999, supra), with the following modifications. The inserted CDNA was digested with PstI or Rs& and subcloned into the MB single-stranded linear phage vector strain mp18 and mp19 (Amerjam, Arlington, IL). According to Norrander et al., supra, the mp18 and mp19 phage vectors contain the following specific gene sites: Hlnd[; Sph; pet; Sad;
ACe; 1ine u; X'ba; Bam
H; Xma; 8maI; Kpn I; Set
I'm sorry, EcoRI. The structure of the mp18 and mp19 vectors is as follows, except that the sequence of the restriction enzyme cleavage site identified above is in the opposite direction in the mpt9 vector.
are equivalent, so both strands of the inserted cDNA may be conveniently sequenced in the two vectors. Inserted cDNA.

相当する′ｐ４を有するｍｐ１８お工びｍｐ１９ペク・
′ターは、大腸菌（Ｋ、ｃｏｌｌ　）菌株に１２の、７
Ｍ１０７（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ。mp18 work mp19 pek with corresponding 'p4
'Tar is 12 and 7 in Escherichia coli (K, coll) strain.
M107 (Bethesda Research Laboratories.

メリーランド州　ペセスダ）に移入して形質転換させ、
含情報および非情報ＤＮＡ−末鎖挿入配列を含む複製単
鎖ＤＮＡの鋳型を生成した。Pethesda, Maryland) and transformed.
Replicated single-stranded DNA templates containing informative and non-informative DNA-terminal insert sequences were generated.

汎用合成ブライマー；　５’　−（！ＱＣ！ＡＧＴ（！
ＡＣ！ＧＡＯＧＴＴ−３’（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社
、ウィスコンシン州ミルウオーキー）を上記鋳型単鎖Ｄ
ＮＡとアニーリングさせ、前出「スクリーニングされた
ｃＤＮＡの塩基配列決定」で述べたようにＤＮＡ合成を
開始させるのに使用した。その後、伸長フラグメントラ
ゲル電気泳動で、大きさによ９分画し、オートラジオグ
ラフィーを行ない、その結果から、７ラグメントのヌク
レオチド配列を推定した。General-purpose synthetic brimer; 5'-(!QC!AGT(!
AC! GAOGTT-3' (PL Biochemicals, Milwaukee, Wis.) was added to the above template single-strand D.
It was annealed with NA and used to initiate DNA synthesis as described in "Sequencing of Screened cDNA" above. Thereafter, the fragments were fractionated into nine sizes by extended fragment gel electrophoresis, and autoradiography was performed. From the results, the nucleotide sequences of the seven fragments were estimated.

別のクライマーとして、５’　−（）ＧＣ！ＴＧ（）Ｃ
ＩＣＡＴＯＡＴＧＧＴＣ−３の構造を有するブライマー
（ＨｃＤＮＡクローンの含情報鎖の中間部位から合成を
開始させるのＫｉ！！用した。付加ブライマー鎖の構造
は、一般的ブライマーの使用にニジ決定したＣＤＮＡサ
ブクローンの塩基配列から決定した。上記１ウオーク　
ダウｙ　（ｗ９）（ａ）ｋ　ｄｏｗｎ　）法にＬつて、
ｃＤＮＡクローンの二本鎖は、過剰に、重複して塩基配
列決定され、その結果によってヌクレオチド配列全確認
した。本発明の範囲を逸脱することなく、ｃＤＮＡクロ
ーンの鎖の相異なる部位ηλらＤＮＡ鎖の伸長を開始さ
せるのに、他の合成プライマーも使用可能であることは
、理解されるべきである。As another climber, 5'-()GC! TG()C
A primer with the structure of ICATOATGGTC-3 (Ki!!, which initiates synthesis from the intermediate site of the information-containing strand of the HcDNA clone) was used.The structure of the additional primer chain was determined based on the use of a general primer, and Determined from the base sequence. 1 walk above
According to the (w9)(a)k down) law,
The double strands of the cDNA clones were sequenced in excess and in duplicate, and the results confirmed the entire nucleotide sequence. It should be understood that other synthetic primers can be used to initiate elongation of the DNA strand at different sites ηλ on the strand of the cDNA clone without departing from the scope of the invention.

ジデオキシ塩基配列決定反応において、デオキシアデノ
シ７５′（アルファー〔８６Ｓ〕チオ）３リン酸（以下
″ａＡＴＰ　（アルファーｆｉｌｌＢ）″）を放射活性
標識として使用した。また、アマ−ジャム・ハンドブッ
ク３６ページに述べられにゲルを使用する工９も、６％
ポリアクリルアミトゲＡＩ（６チポリアクリルアミドゲ
ル、厚さ０．４ｍ、７Ｍ尿素、１００　ｍＭ　）リスホ
ウ酸（ｐＨ８，ｔ）、および２　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む
）を反用した。In the dideoxy base sequencing reaction, deoxyadenocy75'(alpha[86S]thio)triphosphate (hereinafter referred to as "aATP (alphafillB)") was used as a radioactive label. In addition, 6% of the techniques described on page 36 of the AmarJam Handbook, which use gels,
Polyacrylamide Toge AI (6 polyacrylamide gel, 0.4 m thick, containing 7 M urea, 100 mM lithoboric acid (pH 8, t), and 2 mM EDTA) was used.

ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、前記のとおり第２図に
示す。第２図に示した↓うに、ヒ）ＧＭ−Ｏ８Ｆ遺伝゛
子のコード領域は、ヌクレオチド番号１４（アラニン（
Ａｌａ）残基）からヌクレオチド番号３９４（グルタミ
ン識（Ｇｌｕ）残基）に至る。ヌクレオチド配り１ノか
ら決定された、対応するアミノ酸は、コド／の下に示し
た。The nucleotide sequence of the cDNA is shown in FIG. 2 as described above. The coding region of the GM-O8F gene shown in Figure 2 is nucleotide number 14 (alanine (
(Ala) residue) to nucleotide number 394 (glutamine (Glu) residue). The corresponding amino acid, determined from the nucleotide sequence 1, is shown below the /.

実施例６　成熟ＧＭ−Ｏ３Ｆの発現 実質的に、ＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子の全コード領域および３
′末端側領域の一部を、第２図のｃＤＮＡクローンから
分離し、酵母（ｙｅａｓｔ　）宿生細胞内でＧＭ−Ｃ８
Ｆ　を発現させる、ｐｙαｔｏＭ−２と分名され１こ組
み換え形質発現プラスミドの形成に便用した。ｐＹαｆ
ＧＭ−２形質発現プラスミドは、受託番号５３１５７と
してＡＴＯＣに寄、託されている。第３図に示した工う
に、ｐＹαｆＧＭ　−２は、複製起点およびプラスミド
ｐＢＲ３２２由来のＡｐｒ抵抗性遺伝子（太線部分）を
含有する。また、上記形質発現グラスミドは、酵母２μ
環の複製起点および、形質転換された酵母宿主細胞の選
択に使用するＴｒｐ工遺伝子（Ｔｒｐ−［Ｔｒｐ要求株
〕、第３図細線部）も含有する。さらに、上記形質発現
グラスミドは、ＧＭ−Ｃ８Ｆ　−ｉｉ転写お工び分泌せ
しめるα−因因子グセモーター工び、リーダー配列も含
有する（塗りつぶしの箱枠部分）。ＧＭ−（！８Ｆ塩基
配列（斜線箱枠部分）は、以下に詳述する合成オリゴヌ
クレオチドによってα−因子塩基配列と融合させる。Example 6 Expression of mature GM-O3F Substantially the entire coding region of the GM-C8F gene and 3
A part of the terminal region of GM-C8 was isolated from the cDNA clone shown in FIG.
This plasmid, designated pyαtoM-2, was used to form a recombinant expression plasmid for expressing F. pYαf
The GM-2 expression plasmid has been deposited and entrusted to ATOC under accession number 53157. As shown in FIG. 3, pYαfGM-2 contains an origin of replication and an Apr resistance gene (bold line) derived from plasmid pBR322. In addition, the above-mentioned trait-expressing grasmid has yeast 2μ
It also contains a circular origin of replication and a Trp engineering gene (Trp- [Trp auxotroph], thin line in Figure 3) used for selection of transformed yeast host cells. Furthermore, the above-mentioned expression grasmid also contains a leader sequence (filled box), which is an alpha factor factor motor mechanism that allows GM-C8F-ii to be transcribed and secreted. The GM-(!8F base sequence (hatched boxed part) is fused to the α-factor base sequence using a synthetic oligonucleotide described in detail below.

８ｆａ　ＮＩ切断部位から、Ｎｅｏ　Ｉ切断部位に至る
、実質的なＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子の全コード領域は、例エ
ハマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）らの方法（前出
、１０４）のような標準的方法で、制限酵素５ｆａＮ工
お工びＮｅｏ工の使用により、ｐＨ０２３クローンかも
分離した。正確に成熟タンパク質のコード領域の５′末
端（ヌクレオチド番号１４）に対応する制限酵素切断部
位は存在しなかったため、ＧＭ−Ｏ８Ｆ’遺伝子断片は
、ヌクレオチド番号１４から、２ヌクレオチド下流に位
置する・Ｓｆａ　Ｎ工切断部位に於いて、ｐＨ０２３ク
ローンから切々ｉされた。成熟０Ｍ−０８Ｆ遺伝子のコ
ード領域の５′末端部分を再生するため、および、ＧＭ
−Ｏ８Ｆ′に一成熟した形態で分泌させるためのシグナ
ルの完全なプロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　）
を行なわせるＬうに、第２のα−因子グロセツシング部
位を付加するために、オリゴヌクレオチドを化学的に合
成した。このオリゴヌクレオチドの構造は、以下の表工
、および第３図に示した工うに、Ｈ１ｎａ璽５′付着端
（ｃｏｈｅθｉｖｅ　５’　ｔｅｒｍｉｎａ’ｌ　）、
続いて、塩基配列ｒ、ＴＯＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡ
　　Ｊを有するカテグシｙ　（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　）
　Ｂ様成熟部位、および成熟ＧＭ−Ｃ１３Ｆ　タンパク
質の最初の二つのアミノ酸残基金コードする５ｆａＮ工
３′　付着端を含有する。表工に示したオリゴヌクレオ
チドは、スート（５ｏｏｄ　）他（前出）お工びヒロセ
他（前出）に詳述されたトリエステル法によって化学的
に合成されるのであるが、ホスホジエステル法の工うな
、異なる方法によっても、オリゴヌクレオチドを調製し
うろことは、理解されるべきである。Substantially the entire coding region of the GM-C8F gene, from the 8fa NI cleavage site to the Neo I cleavage site, is digested with restriction enzymes using standard methods such as the method of Maniatis et al. (supra, 104). A pH023 clone was also isolated by using the 5faN technology and Neo technology. Since there was no restriction enzyme cleavage site that corresponded exactly to the 5' end (nucleotide number 14) of the coding region of the mature protein, the GM-O8F' gene fragment was located two nucleotides downstream from nucleotide number 14. At the N-cleavage site, the DNA was excised from the pH023 clone. To regenerate the 5'-end portion of the coding region of the mature 0M-08F gene, and GM
- Complete processing of the signal to cause O8F' to be secreted in its mature form.
Oligonucleotides were chemically synthesized to add a second α-factor grossing site to the enzyme. The structure of this oligonucleotide is as shown in the table below and in Figure 3.
Subsequently, the base sequence r, TOTTTGGGATAAAAGA
cathepsin with J
It contains a B-like maturation site and a 5faN engineered 3' cohesive end that encodes the first two amino acid residues of the mature GM-C13F protein. The oligonucleotides shown in Table 1 are chemically synthesized by the triester method detailed by Soot et al. (supra) and Hirose et al. (supra), but the phosphodiester method It should be understood that oligonucleotides may also be prepared by different methods.

表１ ５’　Ａ　ＧＯＴ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　
ＡＧＡ　Ｇｏ　　　　３’ＡＧＡ　ＡＡＯＣＴＡ　ＴＴ
Ｔ　ＴＣＴ　ＯＧＴ　ＧＧＧＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　
Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ｐｒ。Table 1 5' A GOT TCT TTG GAT AAA
AGA Go 3'AGA AAOCTA TT
T TCT OGT GGGSer Leu Asp
Lys Arg Ala pr.

別の標準的組み換えＤＮＡ技術も、同等な形質発現ベク
ターを生成するのに使用可能であり、上記構造は、ｐＹ
αｆＧＭ−２形質発現ベクターに挿入するＧＭ−Ｃ８Ｆ
　　ｃＤＮＡ　フラグメントの調製に使用しうる、多種
の方法の一例に丁ぎないことは、理解されるべきである
。Other standard recombinant DNA techniques can also be used to generate equivalent expression vectors;
GM-C8F inserted into αfGM-2 expression vector
It should be understood that this is not just one example of the many different methods that can be used to prepare cDNA fragments.

ｐＹαｆＧＭ−２を、標準的方法によるＴｒｐ形質転換
体を選択するｋめ、ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの酵母菌
株７９（α＊　Ｔｒｐｌ−１、Ｌｅｕ　２−１　）に対
して形質転換を行なつ１こ。形質転換に先立ち、菌株７
９はＹＰ−グルコース培地で２　Ｘ　１０’　　細胞／
−の濃度まで培養された。細胞は、２２℃で５分間、１
０００８　ｇの遠心分離に工って回収し、得られたペレ
ットは、無菌蒸留水で洗浄した。pYαfGM-2 was transformed into the yeast strain 79 (α*Trpl-1, Leu 2-1 ) of S. cerevisiae selecting for Trp transformants by standard methods. Prior to transformation, strain 7
9 in YP-glucose medium 2 X 10' cells/
It was cultured to a concentration of -. Cells were grown for 5 min at 22°C.
The pellet was collected by centrifugation at 0.0008 g and washed with sterile distilled water.

次に、酵母細胞を、体＄１イ。の１３１ｆ：Ｄ（１Ｍソ
ルビトール、２５　ｍＭ　ＦＳＤＴＡ　［ｐＨ８，０］
、および５０　ｍＭ　　ジチオトレイトール）に再懸濁
し、３０℃で１０分間温め、濃縮した。細胞−バッファ
ー混合液は、次に５分間３００Ｘｇで遠心分離を行なっ
た。ペレットは、体積　イ０の１Ｍソルビトールで一度
洗浄し、細胞は２０　ミ＋）　＋）ットルのＳＣＥ　（
１Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ
５，８３，０，０１Ｍ　ＫＤＴＡ　’）に再懸濁した。Next, add yeast cells for $1. 131f:D (1M sorbitol, 25mM FSDTA [pH 8,0]
, and 50 mM dithiothreitol), warmed to 30° C. for 10 minutes, and concentrated. The cell-buffer mixture was then centrifuged at 300×g for 5 minutes. The pellet was washed once with 0 volume of 1M sorbitol, and the cells were washed with 20 liters of SCE (
1M sorbitol, 0.1M sodium citrate (pH
5,83,0,01M KDTA').

細胞壁を破壊するために、グルスラーゼ（Ｇｌｕｓｕｌ
ａｓｅ　）　ｆ、溶液に、体積で１０１１加え、溶液を
時折静かに振とうさせながら、３０分間３０℃に保った
。スフェロプラスト （ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓ℃Ｂ）の存在は、顕微孔スライ
ド上に於いて、１滴の５％８ＤＳ　（ｗｔ、／ｖｏ１．
　）で１０マイクロリツトルの酵母細胞を希釈し、４０
０Ｘ位相差顕微憶で”ゴース）　（ｇｈｏｓｔｓど會観
察することによって検定した。次に、細胞混合液の遠心
分離上３分間３００×ｇで行なった。得られたペレット
は、’／ｉｏ量の１Ｍソルビトールで２度洗浄した。次
に、ペレツ）をｃａ８　　（１Ｍソルビトール、１０　
ｍＭ　０９）（ａ）ｌ、　）で１度洗浄した。Glusulase (Glusulase) is used to destroy cell walls.
ase) f, by volume, was added to the solution and the solution was kept at 30° C. for 30 minutes with occasional gentle shaking. The presence of spheroplasts (spheroplasts C.B.) was determined using a drop of 5% 8DS (wt, /vol.
) and dilute 10 microliters of yeast cells with 40
It was assayed by observing "ghosts" in a 0X phase-contrast microscopy.The cell mixture was then centrifuged at 300xg for 3 minutes.The resulting pellet was Washed twice with 1M sorbitol. Then pellets) were washed with ca8 (1M sorbitol, 10
Washed once with mM 09)(a)l, ).

次に、酵母スフェロプラストは、ペッグス（Ｂｅｇｇ、
ｅ　）の方法（前出）で、ららηλじめ調製されたプラ
スミドベクターで形質転換を行なった。Next, yeast spheroplasts were isolated from Beggs (Begg,
Transformation was performed with the plasmid vector prepared using the plasmid vector e) (described above).

ペレット化さｇたスフェロプラスト’４ｏｏ　　　量の
Ｏａ８　ｔｉｃ懸濁し、１．５ｄエツペ／ドル７試験管
（Ｋｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔｕｂｅｓ　）に１００マイク
ロリツトルずつ分画した。次に、ｌ乃至１０μ２のグラ
スミドＤＮＡ　’ｉ各分画に加えた（０．５乃至５μｇ
）。The pelleted spheroplasts were suspended in Oa8 tic in an amount of 40 g and fractionated into 100 microliter portions in 1.5 d Kppendorf tubes. Next, 1 to 10 μ2 of Grasmid DNA'i was added to each fraction (0.5 to 5 μg
).

混合物は１０分間室温に保ち、次に、ＤＮＡの取り込み
を促進させるため、１　ｍｌのｐｇｏ（２０％ＰＥＧ　
　４０００　、ｌｏｍＭ　　（！ａｃ］４．１０　ｍＭ
　　トリス−塩酸［ｐＨ７，４］）を各分画に加えた。The mixture was kept at room temperature for 10 min and then added with 1 ml of pgo (20% PEG) to promote DNA uptake.
4000, lomM (!ac) 4.10 mM
Tris-HCl [pH 7,4]) was added to each fraction.

１０分間室温に保った後、混合液の遠心弁１！Ｆ、１５
分間３５０Ｘｇで行なった。得られたベレツ１．１５０
μＬの８０８（２Ｍ　ソルビトール１０ｄ、６．７ｍ＃
のＹＫＰ〔１％（ｗｔ　／　ｖｏｗ　）　酵母抽出物、
２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペブト：／　、　２％　（ｗｔ／
ｖｏｌ）グルコース〕、ＩＭＯａＣ１２ｏ、ｉ　３ｄ、
１％トリグトファ／２７μ２、お工び水３．７ｄ）に再
懸濁した。上記混合液を、３０℃に２０分間保った。次
に、細胞をプレートに播くか、あるいは、数日間まで、
４℃に保存した。After keeping the mixture at room temperature for 10 minutes, centrifugal valve 1! F, 15
The test was carried out at 350×g for minutes. Obtained beretu 1.150
μL of 808 (2M Sorbitol 10d, 6.7m#
of YKP [1% (wt/vow) yeast extract,
2% (wt/vol) Pebut: / , 2% (wt/vol)
vol) glucose], IMOaC12o, i 3d,
The mixture was resuspended in 1% trigtofa/27 μ2 and 3.7 d of fresh water. The mixture was kept at 30°C for 20 minutes. Cells are then plated or kept for up to several days.
Stored at 4°C.

プロトプラス）／ＤＮＡ混合物のグレーティング（播種
）に先立ち、選択プレートはあらかじめ３７℃に保温し
ておいた。ソルビトール１８．２ｍ／。Prior to grating (seeding) the protoplast)/DNA mixture, the selection plate was kept warm at 37°C in advance. Sorbitol 18.2m/.

寒天２ｇ、ディフコ（ＤｉｆＯＯ）酵母窒素ペース（ア
ミノ酸を含まない）０．６ｇ、グルコース２ｇ１１チア
デニン０．１　ｄ％　１％ウラシル０．４ｄお工び必要
なアミノ酸から成る、ＩＬＪｔｉ用の融解した寒天３−
を、形質転換された細胞の各分画に加え、試験管内容物
全選択プレートに注いだ。プレートは、２乃至４日間３
０℃に保温した。Ｔｒｐ−ｔイナス培地で増殖しにコロ
ニーは、Ｔｒｐ　　１遺伝子を有するプラスミド、丁な
わち、形質転換されたグラスミドを含有していた。Melted agar for ILJti 3, consisting of 2 g agar, 0.6 g DifOO Yeast Nitrogen Pace (without amino acids), 2 g glucose 11 thiadenine 0.1 d% 1% uracil 0.4 d and the required amino acids. −
was added to each fraction of transformed cells and the entire tube contents were poured into selection plates. Plates should be kept for 2 to 4 days.
The temperature was kept at 0°C. Colonies grown on Trp-t cell culture medium contained a plasmid containing the Trp 1 gene, ie, transformed grasmids.

生物学的検定に先立ち、形質転換体は、３３℃に於いて
、２０〜５０ｄ、の栄養に富んだ培地（ｌチ酵母抽出物
、２％ペプトン、２チグルコース）で、定常期（ｓｔａ
ｔｉｏｎａｒｙ　ｐｈａｓｅ　）まで培養した。Prior to bioassays, transformants were grown in stationary phase (sta) in a nutrient-rich medium (l.
tionary phase).

収穫時には、プロテアーゼインヒビター、フェニルメチ
ルスルフォニル（ＰＭ８Ｆ　）およびペプスタチンＡを
１最終濃度がそれぞれ１ｍＭお工びｌＯμＭｉＣなるＬ
うに加えた。細胞は、４００Ｘｇでの遠心分離に１って
分離し、培地は０．４５μセルロース酢酸フイルターで
ｒ過した。At the time of harvest, the protease inhibitors, phenylmethylsulfonyl (PM8F) and pepstatin A were added to a final concentration of 1mM each.
Added sea urchin. Cells were separated by centrifugation at 400×g, and the medium was passed through a 0.45μ cellulose acetate filter.

実施例６で酵母培養菌から得たヒトＧＭ−Ｃ８Ｆの存在
は、培地上清か、寒天中のヒト骨髄コロニーの成長を促
進する能力の検定に二って確認した。The presence of human GM-C8F obtained from the yeast culture in Example 6 was confirmed by assaying for its ability to promote growth of human bone marrow colonies in medium supernatant or agar.

検定に使用するために、健康な提供者の腸骨先端部のヒ
ト骨髄上、ヘパリン処理された注入器に採集し１こ。骨
髄細胞は、室温で、リン酸で緩衝化された生理的食塩水
（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄｓ９）（ａ）
ｉｎｅ　、　ＰＢＳ　）で１：３に希釈し、５４チパー
コール（ｐｅｒｃｏｌｌ　）　（ファルクシア・７アイ
ン一ケミカルズ社）溶液上に重層した。室温で２０分間
５００Ｘｇで遠心分離を行なった後、中間層を集め、２
０倍量のＰＢＳで洗浄した。次に、懸濁液を、室温で１
０分間２５０Ｘｇで遠心した。次に、細胞を、細胞数測
定および生存度決定のために、１０ｄのヌクレオチドを
含むα−最小必須培地（α−Ｍ１ｎｉｍ’９）（ａ）ｎ
：Ｘｊ、ａｅｎｔｉ９）（ａ）　Ｍｅｄｉｕｍ、α−Ｍ
ａｍ　。For use in the assay, human bone marrow from the distal ilium of a healthy donor was collected into a heparinized syringe. Bone marrow cells were incubated in phosphate buffered saline (a) at room temperature.
The mixture was diluted 1:3 with Percoll® 54 (PBS) and layered on a solution of 54 Percoll (Falxia® 7ine Chemicals Co., Ltd.). After centrifugation at 500×g for 20 min at room temperature, the middle layer was collected and
Washed with 0x volume of PBS. The suspension was then mixed at room temperature for 1
Centrifuged at 250×g for 0 min. Cells were then cultured in α-minimal essential medium containing 10d nucleotides (α-M1nim'9) (a) n
:Xj, aenti9) (a) Medium, α-M
am.

ギプコ（Ｇｉｂｃｏ　）社）に再懸濁した。Ｆｅ２　ｆ
次に加え、細胞懸濁液は、検定が行なわれるまで水中で
保存した。The suspension was resuspended in Gibco (Gibco). Fe2 f
The cell suspension was then added and stored in water until the assay was performed.

検定において、上記骨髄細胞は、以下の組成を持つ培地
に最終濃度がｌＸｌ０’／ｍｌとなるように加えＩＳ　
：　（ａ）　２８．１％ＦＯ８、Ｑ、７Ｘ　１０”　Ｍ
ｌ−メルカグトエタノール、Ｏ，ｌ　２　！ｖ／　Ｍｌ
　７　、ｘ、パラキ７．０．７ｑ／ｒｄグルタミン、ペ
ニシリンＧ１５０ユニツト、ストレプトマイシン１５０
ユニツト、ヌクレオチドを含む１．１Ｘα−ＭＥＭ　、
お工び２．２×ビタミン（ギプコ社）を含む溶液７部；
お工び、（’ｂ）　１．４％バクトー寒天溶液（’ｂａ
ｃｔｏ　−ａｇａｒ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　（ディフ
コ社）３部。培要細胞は、５％ＣＯ，の存在下で湿潤空
ヌ（中３７℃に保温した。７日乃至１４日間の培養後、
コロニーの数お工び型、丁なわち、顆粒球、マクロファ
ージ、あるいは顆粒球−マクロファージ混合物のいずれ
であるかと決定した。本発明者らは、ｐｙαｆＬＪＭ−
２クローン由来のＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子は、１．２５Ｘ１
０６コロニ一形成単位（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ
ｕｎｉｔｓ　、”ＣＦＵ″）／ｍｌという高水準の活性
を有するＧＭ−Ｃ８Ｆ　ｉ合成せしめることを発見した
。活性水準は、最大コロニー数の５０チを与える希釈度
の逆数を５０倍することで決定した。本発明者らは、ｌ
　Ｘ　１０”の骨髄細胞′ｘＪ為ら得られるコロニーの
平均数は９６±２９でおるという結果を得た。In the assay, the above bone marrow cells were added to a medium with the following composition at a final concentration of 1X10'/ml and IS
: (a) 28.1%FO8,Q,7X 10”M
l-mercagtoethanol, O, l 2 ! v/Ml
7, x, paraki7.0.7q/rd glutamine, penicillin G150 units, streptomycin 150
unit, 1.1Xα-MEM containing nucleotides,
7 parts of a solution containing 2.2x vitamins (Gipco);
('b) 1.4% Bakutou agar solution ('ba
cto-agar solution) (Difco) 3 parts. Cultured cells were kept at 37°C in a humid atmosphere in the presence of 5% CO. After culturing for 7 to 14 days,
The number of colonies was determined to be either granulocytes, macrophages, or a granulocyte-macrophage mixture. The present inventors pyαfLJM-
GM-C8F gene derived from 2 clones is 1.25X1
06 colony forming unit
It has been discovered that GM-C8F i can be synthesized with a high level of activity of "CFU" units, "CFU")/ml. Activity levels were determined by multiplying by 50 the reciprocal of the dilution that gave the maximum colony count of 50. The inventors l
The average number of colonies obtained from x10'' bone marrow cells was 96±29.

組み換えＧＭ−（ＳＦに工って１４日間培養したコロニ
ーは、明確に区別され、３つの型に分けられた：約バの
顆粒球−マクロファージ混合コロニー８約％の密集した
顆粒球コロニー、おＬび約バの散在するマクロファージ
コロニーで６４゜本発明の形質発現系の対照実験として
、さらに、ＧＭ−Ｏ８Ｆ塩基塩勾配欠いている以外は、
ｐＹαｆＧＭ−２と相同なプラスミドも、酵母菌株７９
に対して形質転換全行なった。上記酵母からの培養上清
液からは、骨髄コロニー検定においてＧＭ−Ｏ８？活性
は得られなかった。Colonies cultured for 14 days in recombinant GM-SF were clearly differentiated and divided into three types: approximately 8% dense granulocyte colony, 8% mixed granulocyte-macrophage colony; As a control experiment for the expression system of the present invention at 64° with scattered macrophage colonies of B.
A plasmid homologous to pYαfGM-2 was also used in yeast strain 79.
All transformations were carried out. From the culture supernatant from the above yeast, GM-O8? No activity was obtained.

陽性対照実験として、天然のＧＭ−Ｃ８Ｆ源でちる、ヒ
ト胎盤細胞からの上清液も、コロニー形成活性の検定を
行なった。ヒト胎盤細胞は、５％ウシ胎児血清の存在下
で６日間、１．２　Ｘ　１０”　／ｄで培養した。骨髄
コロニー検定に於いて、培養された胎盤細胞由来の上清
は、約５　Ｘ　Ｉ　Ｏ”　Ｏ？Ｕ−０７ｄの活性を示し
、それぞれのコロニーの型の割合も、はぼ同じであった
：％の顆粒球−マクロファージ混合コロニー、％の密集
した顆粒球コロニー、お工び、％の散在するマクロファ
ージコロニー。As a positive control experiment, supernatant fluid from human placental cells with a natural source of GM-C8F was also assayed for colony forming activity. Human placental cells were cultured at 1.2 x 10"/d for 6 days in the presence of 5% fetal bovine serum. In bone marrow colony assays, supernatants from cultured placental cells were cultured at approximately 5 x 10"/d. I O” O? The proportions of each colony type were almost the same: % mixed granulocyte-macrophage colonies, % dense granulocyte colonies, and % scattered macrophages. colony.

実施例８　　ｍＲＮＡの分析 地塊のｃ　ｓ　Ｆ’ｉ＋形質発現すると、既に報告され
てきた、多種の細胞型由来のＧＭ−ＣＢＦ　　ｍＲＮＡ
の形質発現の研究をした。上記細胞由来のＲＮＡのノザ
ンΦプロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂ’ｌｏｌ＋　）は
、１）ＨＧ２３由来のグローブとのハイブリッド形成に
よって分析された。このため、以下に挙げる細胞から、
実施例１（前出）で述べた、グアニジニウムチオシアネ
ート／塩化セシウム法によって、ノザンープロット法の
ための全Ｉ’ｊＮＡを単離した：（１）Ｈｕｔ　−１０
２細胞；（２）活性化されていない末梢血液Ｔ細胞；（
３）前出実施例ＩＡで述べた、ｃｏｎＡお工びＰＭＡで
活性化された末梢血液Ｔ細胞；（４）リポポリサッカラ
イドで活性化された末梢血液マクロファージ；（５）ハ
拳臓癌細胞系１４２０　（ＡＴ（Ｃ工り）；お工び、（
６）膀胱癌細胞系５６３７（ＡＴＣＣニジ）。上記ＲＮ
Ａ試料は、ＲＮＡのゲル中での移動度が分子量に比例す
る工うにするためにＲＮＡを変性させるホルムアルデヒ
ドを含有する、１．１チアガロースゲルを用いて電気線
ｌＩＪを行ない。分画した。ホルムアルデヒドを含有す
るアガロースゲルの使用によるＲＮＡ　Ｉ）電気泳動の
標準的方法は、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）他
（前出。Example 8 Analysis of mRNA GM-CBF mRNA derived from various cell types, which has been reported to express csF'i+ expression in the ground mass.
We conducted research on the expression of these traits. Northern Φ plots (Northern b'lol+) of RNA from the above cells were analyzed by 1) hybridization with HG23-derived globes; Therefore, from the cells listed below,
Total I'jNA for the Northern plot method was isolated by the guanidinium thiocyanate/cesium chloride method described in Example 1 (supra): (1) Hut-10
2 cells; (2) unactivated peripheral blood T cells; (
3) Peripheral blood T cells activated with conA and PMA as described in Example IA above; (4) Peripheral blood macrophages activated with lipopolysaccharide; (5) Haken cancer cell line 1420 (AT (C machining); machining, (
6) Bladder cancer cell line 5637 (ATCC Niji). Above RN
For sample A, electric wire IIJ was performed using a 1.1 thiagarose gel containing formaldehyde to denature RNA so that the mobility of RNA in the gel is proportional to the molecular weight. Fractionated. A standard method for RNA I) electrophoresis by the use of agarose gels containing formaldehyde is described by Maniatis et al. (supra).

２０２）に工って詳述されている。202) and is detailed in detail.

電気泳動後、ホルムアルデヒドで変性されたＲＮＡは、
マ＝アテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）らの標準的な方法
（前出、２０３）でニトロセルロースフィルターに移さ
れ、次に、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら著、３２　Ｃｅ１
１６８１　（１９８１年３月）に述べられた方法によっ
て、ＢＰ６ポリメラーゼを用いて１ｎ　ｖｉｔｒｏで転
写された　Ｉｍｐで標識されたＲＮＡ　とハイブリッド
を形成させた。”Ｐ−ＲＮＡプローブは、ｐｓｐ６４ベ
クター（プロメガ−バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ　）社）にサブクローン化されたｐＨ０２３
のＰａｔ　ＩからＮｃｏ工までの６００塩基対からなる
フラグメントから合成した。ニトロセルロースフィルタ
ーに結合し７ＣＲＮＡを、スターク（５ｔａｒｋ　）の
完全バッファー（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　’ｂｕｆｆｅｒ　
）中、６３℃で１６時間、ラベルされたＲＮＡグローブ
（１０’　ｃｐｍ　／　ｓ＋／）とハイブリッド形成を
行なった２使用したバッファーは以下の組成を有する：
５ＸＳＳＣ；５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４Ｃ’ＰＨ２，５）　
；　１５０ｎｇ　／　ｄ変性サケ***ＤＮＡ；　　２Ｘ
デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ；’ａｓｏｌｕｔｉ
ｏｎ　）　（０，０４％（ｗｔ／　ｖｏｌ）　フィコー
ル（Ｆｉｃｏｌｌ）　　＃　０Ω４％　（Ｗｔ／ＶＯ１
）ポリビニルピロリドン、０．０４％（ｗｔ　／　ｖｏ
ｌ　）　ＢＡＡ　）　；０．１％ＥＩＤＳ　；　２０ｎ
ｏＭ　Ｎａ、　ＥＤＴＡ　　；　　お工び、５０　ｆｂ
　（、ｗｔ／　ｖｏｌ）ホルムアミド。ノーイブリッド
形成後、フィルターを６３℃に於いて、６ｘＳ８Ｃで２
時間、次にＱ、１ＸＳ８Ｇで２時間洗浄し、続いて一７
０℃で増感スクリーンを用いて４時間オートラジオグラ
フィーを行なった。After electrophoresis, RNA denatured with formaldehyde is
transferred to a nitrocellulose filter using the standard method of Maniatis et al. (supra, 203) and then transferred to a nitrocellulose filter by the standard method of Maniatis et al.
1681 (March 1981) using BP6 polymerase to hybridize with Imp-labeled RNA transcribed in vitro using BP6 polymerase. “The P-RNA probe was prepared using the psp64 vector (Promega Biotic).
pH023 subcloned into
It was synthesized from a fragment consisting of 600 base pairs from Pat I to Nco engineering. Bind the 7C RNA to a nitrocellulose filter and transfer it to 5tark's complete buffer.
Hybridization was carried out with labeled RNA globes (10' cpm/s+/) for 16 h at 63 °C in )2 The buffer used has the following composition:
5XSSC; 50mM KH2PO4C'PH2,5)
; 150ng/d denatured salmon sperm DNA; 2X
Denhardt's solution
on ) (0.04% (wt/vol) Ficoll #0Ω4% (Wt/VO1
) Polyvinylpyrrolidone, 0.04% (wt/vo
l) BAA); 0.1% EIDS; 20n
oM Na, EDTA; 50 fb
(, wt/vol) formamide. After no-brid formation, the filter was incubated at 63°C with 6xS8C for 2 hours.
Wash for 2 hours with Q, 1XS8G, followed by 17 hours.
Autoradiography was performed for 4 hours using an intensifying screen at 0°C.

オートラジオグラフィーの結果は、ｉ＠４図に示されて
おり、ＰＭＡお工びＣｏｎ　Ａで活性化痰れに末梢血液
Ｔ細胞由来の全ＲＮＡ　、お工び、Ｈｕｔ１０２細胞由
来の全ＲＮＡの５μｇ中の、約９００ヌクレオチドのバ
ンドに、強いノ）イブリッド形成を示している（列３お
工び４）、ヒト膀胱癌細胞系５６３７由来のポリアデニ
ル化されたＲＮＡ１．５μｇには、低水準のノーイブリ
ッド形成が見られた（列６）。活性化されていない末梢
血液Ｔ細胞由来の全ＲＮＡ　　５μｇ、（列２）、リポ
ポリサッカライドで活性化された末梢血液マクロファー
ジ由来の、ポリアデニル化されたＲＮＡ　　１．・５μ
ｇ（列４）、およびヒト臓癌細胞系１４２０（列５）に
は、ハイブリッド形成は見られなかった。第４図に見ら
れる、別の高分子量バンド、丁なわち１８Ｓと２８Ｓは
、プローブが、リボゾームＲＮＡ　とのハイブリッドを
形成したことに工ろものである。ノザン・プロット分析
の結果は、活性化された末梢血液Ｔ細胞および、１（Ｕ
Ｔ　−１０２細胞由来のＧＭ−Ｃ８Ｆに関して見られる
高水準の生物学的活性と一致する。The autoradiography results are shown in Figure i@4, in which 5 μg of total RNA from peripheral blood T cells and 5 μg of total RNA from Hut102 cells were injected into activated sputum with PMA Con A. 1.5 μg of polyadenylated RNA from human bladder cancer cell line 5637 showed strong hybridization in a band of approximately 900 nucleotides (column 3). Ibrid formation was observed (row 6). 5 μg total RNA from unactivated peripheral blood T cells (row 2), polyadenylated RNA from peripheral blood macrophages activated with lipopolysaccharide 1.・5μ
No hybridization was observed with g (column 4) and human visceral cancer cell line 1420 (column 5). The other high molecular weight bands seen in Figure 4, namely 18S and 28S, are a result of the probe hybridizing with the ribosomal RNA. The results of Northern plot analysis show that activated peripheral blood T cells and 1(U
Consistent with the high level of biological activity seen for GM-C8F derived from T-102 cells.

ヒトゲノムＤＮＡ中のＧＭ−Ｃ８Ｆ関連遺伝子数を決定
するため、標識されたＧＭ−Ｃ８Ｆ　ＣＤＮＡプローブ
を、比較的ＤＮＡ　’ｉ少ない箇所で切断すると思われ
る制限酵素で切断したヒトＤＮＡのサザン・プロット（
５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ　）とハイブリッド形成
させた。プローブは、３′末端のヌクレオチド番号が１
６１である、ｐＨ０２３全塩基配列（第２図）を含み、
マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉθ）らの標準的方法（前
出、１０８）お工び本明細書「放射性標識されたｃＤＮ
Ａスクリーニンググローブの調製」で述べた標準的方法
に従い、ニックトランスレーションによって放射性標識
を行なった。In order to determine the number of GM-C8F-related genes in human genomic DNA, a labeled GM-C8F CDNA probe was digested with a restriction enzyme that is thought to cleave at a relatively small DNA site.
5outhern blots). The probe has a nucleotide number of 1 at the 3' end.
61, including the entire pH023 base sequence (Figure 2),
The standard method of Maniati θ et al. (supra, 108) was used and described herein
Radiolabeling was performed by nick translation according to the standard method described in A. Preparation of Screening Gloves.

ハイブリッド形成に先立ち、標準的方法により、１０　
μｇのヒトゲノムＤＮＡ　ｔｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩ、Ｅｃ
ＯＲ工、Ｐｓｔ工、あるいはＢｇｌ　Ｉで完全に消化さ
れたヒ）ＤＮＡは、適当な大きさのマーカーとともに１
０．７％アガロースゲル中で電気泳動を行ない、分画し
た。アガロースゲルは、サザン（Ｓｏ℃１ｔｈｅｒｎ　
）の方法（前出）に従い、ニトロセルロースフィルター
上にプロットした。転写過程後、フィルターを風乾し、
８０℃で２時間加熱処理し、ＤＮＡフラグメントをニト
ロセルロースに結合させた。続いて結合され１こＤＮＡ
は前記実施例４で述べたように、ラベルされ７ＣＣＤＮ
Ａ　プローブとノーイブリッド形成させた後、室温に於
いて２　ｘ　ｓｓｃ　、　ｏ、ｓ％ＳＤＳで十分洗浄し
、次に６５℃に於いて４５分間、０，１ｘｓｓｃ、０．
５％ＳＤＳで洗浄した。Prior to hybridization, 10
μg of human genomic DNA tl-Hlnd II, Ec
Human DNA that has been completely digested with OR, Pst, or Bgl I is added to the DNA with a marker of an appropriate size.
Electrophoresis was performed in a 0.7% agarose gel and fractionation was performed. Agarose gel was prepared using Southern (SoC1thern) gel.
) (supra) and plotted on nitrocellulose filters. After the transfer process, air dry the filter.
Heat treatment was performed at 80° C. for 2 hours to bind the DNA fragments to nitrocellulose. Then, one piece of DNA is combined
is labeled and 7CCDN as described in Example 4 above.
After forming a no-brid with the A probe, it was thoroughly washed with 2 x ssc, o, s% SDS at room temperature, and then incubated at 65°C for 45 minutes with 0, 1 x ssc, 0.
Washed with 5% SDS.

風乾後、フィルターを一７０℃でオートラジオグラフィ
ーにかけ１こ。After air drying, the filter was subjected to autoradiography at -70°C.

オートラジオグラフィーの結果は、第５図に示し１こ。The autoradiography results are shown in Figure 5.

第５図に於いて分子量マーカー（キロ塩基対で表示）は
、バタテリオファージ入ＤＮＡ　？Ｈ１ｎｄ　Ｉで消化
したものに由来する。第５図に示ｔ、ｒｚうに、ヒトＤ
ＮＡ　をＨｌｎｄ　＊、Ｅｃｏ　Ｒ工およびＰｓｔ工で
消化したもの（それぞれ列１゜２．３）は、単一のバン
ドを与え、Ｂｇｌ　ｍ　で消化したものは、２本のバン
ドを形成した。上記結果より、ＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子は、
ヒトゲノムＤＮＡに於いて単一コピーの遺伝子として存
在することが明らかとなった。In Figure 5, the molecular weight markers (expressed in kilobase pairs) indicate the DNA contained in the batataeri phage. Derived from H1nd I digestion. Figure 5 shows t, rz, human D
Digestion of NA with Hlnd *, Eco R, and Pst (row 1°2.3, respectively) gave a single band, and digestion with Bgl m formed two bands. From the above results, the GM-C8F gene is
It has been revealed that this gene exists as a single copy of the gene in human genomic DNA.

本発明の要求される分野の技術者には明らかな工うに、
本発明は、その意図および本質的性格から逸脱すること
なく、特に前述した以外の形で具体化され得る。従って
、前述した本発明の一具体例は、全ての点において、例
証的であって、限定的なものではないと、考えられるべ
きである。本発明の範囲は、前記特許請求の範囲で述べ
られたものであって、それに続く記述に含まれる実施例
に制限されるものではない。As will be obvious to those skilled in the art to which the present invention is required,
The present invention may be embodied in other forms than those specifically described herein without departing from its spirit or essential character. Therefore, the specific example of the present invention described above should be considered in all respects to be illustrative and not restrictive. The scope of the invention is defined in the claims and is not limited to the examples contained in the description that follows.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

本発明の代表的具体例の詳細は、添付図面に関連して述
べられている： 第１図はマウスＧＭ−Ｏ８Ｆ　４コードする遺伝子のア
ミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示したものであっ
て、ヒトｃＤＮＡ　　ライブラリーのスクリーニングの
定めのプローブとして使用される上記遺伝子の一部を下
線で示しており；第１図中の上段は、マウス顆粒球−マ
クロファージコロニー促進因子遺伝子のヌクレオチド配
列お工び下段は、アミノ酸配列である。ＧＯｕｇｈ他、
３０９　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　７６３　　（
１９８４年）参照。合成オリゴヌクレオチドプローブで
単離されたプラスミドＤＮＡは、ヌクレオチド番号１乃
至６００である。上線部分（ヌクレオチド番号１−２８
お工び２０１−２０３　）は、単離されたプラスミドＤ
ＮＡには含まれていたが、Ｇｏｕｇｈらのものには含ま
れていなかった。ヌクレオチド番号５０５は、単離され
たプラスミドＤＮＡには含まれていない。 単離されたプラスミド］）　Ｎ　Ａのヌクレオチド配列
の他の相異点は、Ｇｏｕｇｈらによる遺伝子の塩基配列
の対応するヌクレオチドの上段に示す；第２図は３′末
端非コード領域を含む、ヒ）ＧＭ−〇ＳＦ遺伝子のアミ
ノ酸配列お工びヌクレオチド配列を示したものであシ；
第２図中の上段は、顆粒球−マクロファージコロニー促
進因子遺伝子をコードするヒトプラスミドＤＮＡ％　ｐ
ＨＧ　２３のヌクレオチド配列および下段はアミノ酸配
列を示す。 −９ｙバク質はアスタリスク（＊）から始まる；第３図
は、宿主細胞が機能するヒ）ＧＭ−（！８Ｆを形質発現
する↓うに形質転換を行なう際に使用する、ＧＭ−Ｃ８
Ｆ遺伝子のコード領域を挿入されたｐＹαｆａＭ−２形
質発現ベクターを示したものであり； 第４図は、多種の細胞源由来のＧＭ−（８ＦｍＲＮＡ　
ｆノザン・プロット分析でＧＭ−ＯｆｌｌｌＦ’グロー
ブとハイブリッド形成させた結果を示したものであり；
列１はＨＵＴ　−１０２細胞の全ＲＮＡ５μｇ１列２は
活性化されていない末梢血液Ｔ細胞の全ＲＮＡ　５μｇ
１列３はコンカナバリンＡおよびホルボールミリステー
トアセテートで活性化された末梢血液Ｔ細胞の全ＲＮＡ
　５μｇ１列４はリポポリサッカライドで活性化された
末梢血液マクロファージのポリアデニル化されたＲＮＡ
　　１．５μｇ、列５は８拳臓癌細胞系１４２０のポリ
アデニル化されたＲＮＡ１．５μｇ、列６は膀胱癌細胞
系５６３７のポリアデニル化されたＲＮＡ１．５μｇの
結果である。１８８および２８Ｂの部分にｒＲＮＡのバ
ンドが見られろ；そして 第５図は、ヒトゲノムＤＮＡ　’ｉサザン・プロット分
析でＧＭ−Ｏ８Ｆ　ｃＤＮＡ　とハイブリッド形成させ
た結果を示したものであり、各列のゲノムＤＮＡは、Ｈ
ｌｎ９）（ａ）（列１）、ＥｃｏＲ工（列２）、Ｐｅｔ
工（列３）、Ｂｇ工■（列４）で消化したものである。 （外５名）′ ８゜ 図面の浄書ζ内容に変更なし） 一ノｕｕＬコト１（ ＨｉｎｄＷ− ＦＩＧ、３ 図面の浄Ｆ内容に変更なし）　　　　　　　図面の浄］
（内容に変更なし）ＦＩＧ、４ 手続補正書（方式） 昭和６１年　２月２６日Details of representative embodiments of the invention are set forth in connection with the accompanying drawings: Figure 1 shows the amino acid and nucleotide sequences of the mouse GM-O8F4-encoding gene, and shows the human cDNA. Some of the above genes used as routine probes for library screening are underlined; the upper row in Figure 1 shows the nucleotide sequence of the mouse granulocyte-macrophage colony-promoting factor gene, and the lower row shows It is an amino acid sequence. Gough et al.
309 Nature (London) 763 (
(1984). Plasmid DNA isolated with synthetic oligonucleotide probes is nucleotide number 1-600. Overlined portion (nucleotide numbers 1-28
201-203) is the isolated plasmid D
It was included in NA, but not in Gough et al. Nucleotide number 505 is not included in the isolated plasmid DNA. Other differences in the nucleotide sequence of NA (isolated plasmid) are shown in the upper row of the corresponding nucleotide sequence of the gene by Gough et al.; ) This shows the amino acid sequence and nucleotide sequence of the GM-〇SF gene;
The upper row in Figure 2 shows human plasmid DNA encoding the granulocyte-macrophage colony-promoting factor gene.
The nucleotide sequence of HG 23 and the lower row the amino acid sequence are shown. -9y bacteria starts with an asterisk (*); Figure 3 shows GM-C8, which is used when transforming host cells into functional human sea urchins that express GM-(!8F).
This shows a pYαfaM-2 expression vector into which the coding region of the F gene has been inserted; FIG.
This shows the results of hybridization with GM-OflllF'globe by f Northern plot analysis;
Column 1: 5 μg total RNA from HUT-102 cells; Column 2: 5 μg total RNA from unactivated peripheral blood T cells.
Column 1, column 3, total RNA of peripheral blood T cells activated with concanavalin A and phorbol myristate acetate.
5 μg 1 Row 4 is polyadenylated RNA of peripheral blood macrophages activated with lipopolysaccharide.
1.5 μg, column 5 is the result of 1.5 μg polyadenylated RNA of 8 fist cancer cell line 1420, column 6 is the result of 1.5 μg polyadenylated RNA of bladder cancer cell line 5637. rRNA bands can be seen in the 188 and 28B regions; Figure 5 shows the results of hybridization with GM-O8F cDNA in human genomic DNA 'i Southern blot analysis, and the genome in each column is shown in Figure 5. DNA is H
ln9) (a) (column 1), EcoR engineering (column 2), Pet
This is what was digested by Bg (column 3) and Bg (column 4). (5 other people)' 8゜No change in the contents of the drawing ζ) 1 (HindW-FIG, 3 No change in the contents of the drawing F)
(No change in content) FIG, 4 Procedural amendment (method) February 26, 1985

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）ヒトコロニー促進因子の発現をコードする実質的
に純粋なＤＮＡ。(1) Substantially pure DNA encoding expression of human colony promoting factor. （２）第２図に於ける核酸塩基番号１４乃至核酸塩基番
号３９４の核酸塩基配列を持つ、特許請求の範囲第１項
記載のＤＮＡ。(2) The DNA according to claim 1, which has the nucleobase sequences of nucleobase numbers 14 to 394 in FIG. （３）第２図に於けるアミノ酸残基番号１乃至アミノ酸
残基番号１２７のアミノ酸配列をコードしている、特許
請求の範囲第１項又は第２項記載のＤＮＡ。(3) The DNA according to claim 1 or 2, which encodes the amino acid sequence of amino acid residue number 1 to amino acid residue number 127 in FIG. （４）原核生物宿主および真核生物宿主内に於けるヒト
コロニー促進因子分子の発現をコードしている、特許請
求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載のＤＮ
Ａ。(4) The DN according to any one of claims 1 to 3, which encodes the expression of a human colony promoting factor molecule in a prokaryotic host and a eukaryotic host.
A. （５）特許請求の範囲第１項乃至第３項で規定された核
酸塩基配列を持つＤＮＡによってコードされるアミノ酸
鎖。(5) An amino acid chain encoded by DNA having the nucleobase sequence defined in claims 1 to 3. （６）ヒト顆粒球−マクロファージコロニー促進因子の
遺伝子を含むｃＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡク
ローニングベクター。(6) A recombinant DNA cloning vector containing a cDNA sequence containing the gene for human granulocyte-macrophage colony promoting factor. （７）（ａ）第２図に於ける核酸塩基番号１４乃至核酸
塩基番号３９２の核酸塩基配列；あるいは；（ｂ）第２
図に於けるアミノ酸残基番号１乃至アミノ酸残基番号１
２７のアミノ酸配列をコードする核酸塩基配列； のいずれかである、特許請求の範囲第６項記載の組み換
えＤＮＡクローニングベクター。(7) (a) Nucleic acid base sequence of nucleobase number 14 to nucleobase number 392 in FIG. 2; or; (b) second
Amino acid residue number 1 to amino acid residue number 1 in the diagram
The recombinant DNA cloning vector according to claim 6, which is any one of the following: a nucleobase sequence encoding a 27 amino acid sequence. （８）ヒト顆粒球−マクロファージコロニー促進因子の
遺伝子を含むｃＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ発
現ベクター。(8) A recombinant DNA expression vector containing a cDNA sequence containing the gene for human granulocyte-macrophage colony promoting factor. （９）（ａ）第２図に於ける核酸塩基番号１４乃至核酸
塩基番号３９２の核酸塩基配列；あるいは、（ｂ）第２
図に於けるアミノ酸残基番号１乃至アミノ酸残基番号１
２７のアミノ酸配列をコードする核酸塩基配列； のいずれかである、特許請求の範囲第８項記載の組み換
えＤＮＡ発現ベクター。(9) (a) Nucleic acid base sequence of nucleobase number 14 to nucleobase number 392 in FIG. 2; or (b) second
Amino acid residue number 1 to amino acid residue number 1 in the diagram
The recombinant DNA expression vector according to claim 8, which is any one of the following: a nucleobase sequence encoding a 27 amino acid sequence. （１０）ヒト顆粒球−マクロファージコロニー促進因子
の効率的合成を促進するための酵母接合フェロモンα−
因子のプロモーター配列及びリーダー配列を含有する、
特許請求の範囲第８項又は、第９項記載の組み換えＤＮ
Ａ発現ベクター。(10) Yeast mating pheromone α- to promote efficient synthesis of human granulocyte-macrophage colony-promoting factor
containing the promoter sequence and leader sequence of the factor;
Recombinant DN according to claim 8 or 9
A expression vector. （１１）特許請求の範囲第６項乃至第１０項記載のベク
ターによって形質転換された宿主。(11) A host transformed with the vector according to claims 6 to 10. （１２）第２図に於けるアミノ酸残基番号１乃至アミノ
酸残基番号１２７を含むアミノ酸配列を含有するポリペ
プチド主鎖よりなる均質な顆粒球−マクロファージコロ
ニー促進因子。(12) A homogeneous granulocyte-macrophage colony promoting factor consisting of a polypeptide main chain containing an amino acid sequence containing amino acid residue number 1 to amino acid residue number 127 in FIG.