JPS6119491A - 組換えdnaを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体 - Google Patents
組換えdnaを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体Info
- Publication number
- JPS6119491A JPS6119491A JP60120735A JP12073585A JPS6119491A JP S6119491 A JPS6119491 A JP S6119491A JP 60120735 A JP60120735 A JP 60120735A JP 12073585 A JP12073585 A JP 12073585A JP S6119491 A JPS6119491 A JP S6119491A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacillus
- microorganism
- recombinant dna
- kanamycin
- bas
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 50
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 title claims description 38
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 title claims description 37
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 title claims description 37
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 title claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 48
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 42
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 41
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 41
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 41
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 41
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 17
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 12
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 12
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 12
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims description 10
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 7
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims description 4
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- -1 AMYl Chemical class 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 241000282596 Hylobatidae Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 108020001482 shikimate kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002623 sporogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アミラーゼをう−ドする遺伝子を含む組換え
DNA1び該組換えDNAを含む微生物及びアミラーゼ
を作るにおけるこれの使用に関する。
DNA1び該組換えDNAを含む微生物及びアミラーゼ
を作るにおけるこれの使用に関する。
ヨーロツノ(特許出願815005.7a2において、
バクテリア性供与体微生物から由来するDNAを開裂し
、得たDNAフラグメントを同様に開裂されたベクター
と結合させる(ベクターはプラスミド又はλファージの
誘導体のDNAを含む)インビトロプロセスによシ作ら
れるアミラーゼ暗号遺伝子を含む新規な組換えDNAを
本発明者は記載し、特許請求した。この組換えDliA
は、バクテリア性宿主生物に挿入されることができ、後
者はアミラーゼを作るために培養される。種々のバクテ
リア性供与体及びバクテリア性宿主生物がこのヨーロッ
パ特許出願に記載され、゛また多数の適当なプラスミド
及び2フアージの誘導体も記載される。
バクテリア性供与体微生物から由来するDNAを開裂し
、得たDNAフラグメントを同様に開裂されたベクター
と結合させる(ベクターはプラスミド又はλファージの
誘導体のDNAを含む)インビトロプロセスによシ作ら
れるアミラーゼ暗号遺伝子を含む新規な組換えDNAを
本発明者は記載し、特許請求した。この組換えDliA
は、バクテリア性宿主生物に挿入されることができ、後
者はアミラーゼを作るために培養される。種々のバクテ
リア性供与体及びバクテリア性宿主生物がこのヨーロッ
パ特許出願に記載され、゛また多数の適当なプラスミド
及び2フアージの誘導体も記載される。
微生物中へ遺伝子を導入するためにプラスミドを用いる
ことは、広く行われている手法である。この目的のため
に提案された多数のプラスミドの記述が最近の文献にあ
る。とくに二つの文献1ジーン(Gono ) 、
エルセビエルバイオメディカルプレス(K15evie
r BiomedicalPress )、15(19
81)、43−58、イルカパルバ(工’1kka P
a1va )ら、及び19(1982)、81−87、
イルヵパルバ、は、宿主として枯草菌を用いてダイレク
トショットガンクローニングによシバチルスアミロリク
イファシエンス(Bacillus amylo’1i
quefaciens )からα−アミラーゼをコード
する遺伝子を単離することを記述する。4バチルスアミ
ロリクイフアシエンスのゲノムはとくに、制限エンドヌ
クL/7−−WMbQ工によシ消化され、2〜5kl)
のフラグメントが単離され、プラスミドpUB110に
結合された。形質転換能力のある(competent
)枯草菌アミラーゼ−ネガティブ細胞がハイブリット
フラスミドによ多形質転換され、カナマイシン耐性形質
転換体がα−アミラーゼの生産のためにスクリーンされ
た。
ことは、広く行われている手法である。この目的のため
に提案された多数のプラスミドの記述が最近の文献にあ
る。とくに二つの文献1ジーン(Gono ) 、
エルセビエルバイオメディカルプレス(K15evie
r BiomedicalPress )、15(19
81)、43−58、イルカパルバ(工’1kka P
a1va )ら、及び19(1982)、81−87、
イルヵパルバ、は、宿主として枯草菌を用いてダイレク
トショットガンクローニングによシバチルスアミロリク
イファシエンス(Bacillus amylo’1i
quefaciens )からα−アミラーゼをコード
する遺伝子を単離することを記述する。4バチルスアミ
ロリクイフアシエンスのゲノムはとくに、制限エンドヌ
クL/7−−WMbQ工によシ消化され、2〜5kl)
のフラグメントが単離され、プラスミドpUB110に
結合された。形質転換能力のある(competent
)枯草菌アミラーゼ−ネガティブ細胞がハイブリット
フラスミドによ多形質転換され、カナマイシン耐性形質
転換体がα−アミラーゼの生産のためにスクリーンされ
た。
遺伝子的に操作された微生物を工業的規模で用いること
p問題の一つは、遺伝子工学プロセスで導入された組換
えDNAの安定性である。
p問題の一つは、遺伝子工学プロセスで導入された組換
えDNAの安定性である。
もし安定性が欠けているなら、組換えDNAは微生物の
連続的発生が行われるうちに失われる又は配列再配置を
受ける傾向があり、結局、アミラーゼ暗号遺伝子は子孫
の微生物によ)全く又はほとんど発現されなくなる。
連続的発生が行われるうちに失われる又は配列再配置を
受ける傾向があり、結局、アミラーゼ暗号遺伝子は子孫
の微生物によ)全く又はほとんど発現されなくなる。
さて本発明者は、ヨーロッパ特許用M8130057&
2に記載された成るアミラーゼ暗号遺伝子をなかんずく
含み、しかしそこには特に記載されていないプラスミド
から誘導される組換えDNAを開発した。このプラスミ
ドは、ジャーナル オフ バクテリオロジイ(Jour
nalof Bacteriology ) 197
B、Vol、134、p’9仝18−329にも記載さ
れたpUB110である。
2に記載された成るアミラーゼ暗号遺伝子をなかんずく
含み、しかしそこには特に記載されていないプラスミド
から誘導される組換えDNAを開発した。このプラスミ
ドは、ジャーナル オフ バクテリオロジイ(Jour
nalof Bacteriology ) 197
B、Vol、134、p’9仝18−329にも記載さ
れたpUB110である。
プラスミドpUB tlo 1J 、ヌクレオチジルト
ラ/ ′スフエラーゼ酵素によ多年活性化された
カナマイシン又は類似の抗生物質に対する耐性を暗号す
る遺伝子を含む。本発明者は、このプラスミドから誘導
された組換DNA及び成るアミラーゼ暗号遺伝子が宿主
微生物中に導入されうること、及びとくに宿主が枯草菌
である場合に突然変異株が作られ培養されることができ
、これは高められた安定性及び高いコピー数を持つこと
を見い出した。従って、この新規な組換えDNAを含む
突然変異微生物は、アミラーゼの生産のために、及び特
に−大苗(バチルスメガテリウム)のα−アミラーゼ(
特に有用な特性を持つアミラーゼである)の生産のため
に工業ベースで使用できる。
ラ/ ′スフエラーゼ酵素によ多年活性化された
カナマイシン又は類似の抗生物質に対する耐性を暗号す
る遺伝子を含む。本発明者は、このプラスミドから誘導
された組換DNA及び成るアミラーゼ暗号遺伝子が宿主
微生物中に導入されうること、及びとくに宿主が枯草菌
である場合に突然変異株が作られ培養されることができ
、これは高められた安定性及び高いコピー数を持つこと
を見い出した。従って、この新規な組換えDNAを含む
突然変異微生物は、アミラーゼの生産のために、及び特
に−大苗(バチルスメガテリウム)のα−アミラーゼ(
特に有用な特性を持つアミラーゼである)の生産のため
に工業ベースで使用できる。
従って本発明は、新規な組成物として、供与、体微生物
から由来するDNAを開裂し、アミラーゼ暗号遺伝子を
含む得たDN春フラグメントを、プラスミドである同°
様に開裂されたベクターと結合するインビトロ法により
作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組換えDNAにお
いて、供与体微生物がバチルスコアグランス(Baci
llusooagu:L&ne )、バチルスコアグラ
ンス(Bacillus circulana )、巨
大苗(バチルスメカチリウム)、バチルスセレウス(B
acillusCerθuB)又uクレプクエラニュー
モニア 。
から由来するDNAを開裂し、アミラーゼ暗号遺伝子を
含む得たDN春フラグメントを、プラスミドである同°
様に開裂されたベクターと結合するインビトロ法により
作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組換えDNAにお
いて、供与体微生物がバチルスコアグランス(Baci
llusooagu:L&ne )、バチルスコアグラ
ンス(Bacillus circulana )、巨
大苗(バチルスメカチリウム)、バチルスセレウス(B
acillusCerθuB)又uクレプクエラニュー
モニア 。
(1lebsirlla pneumoniae :肺
炎桿菌)であり、プラスミ、ドがpUB110であると
ころの組換えDNAを包含する。
炎桿菌)であり、プラスミ、ドがpUB110であると
ころの組換えDNAを包含する。
用いうる特定の供与体微生物としては、肺炎桿菌ATC
CNo. 15050 が挙げられる。他の有用な供
与体生物としては、バチルスコアグランスN(!IB
& 11571 が挙げられ、この供与体及び開御−
同様にバチルスセレウスATOOllk+ 31102
及生物巨大苗NCより 7% 1156B は、
α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼを各々コードする遺
伝子を含み、特に有用な組換えDNAは、α−アミラー
ゼをコードする遺伝子を含む巨大菌belBIl&11
568のDIJAのフラグメントと開裂したベクターp
UB110の組合せから生じ、本発明者がpAMY 1
00 と名付けたものである。開裂したベクターpU
B110とβ−アミラーゼをコードする遺伝子を含むフ
ラグメントからの類似の組換えDNAはpAMY 40
0 と名付けられた6本明細書において巨大苗という
言葉は、とくにベルゲイ(Bergθy)の”マニュア
ル オフデターミネイティブ バクテリオロジイ1 ・
(Manual of Determinative
Bacteriology )、第8版、R,E、ブカ
ナy (Buchanan ) 及びN、 Ili。
CNo. 15050 が挙げられる。他の有用な供
与体生物としては、バチルスコアグランスN(!IB
& 11571 が挙げられ、この供与体及び開御−
同様にバチルスセレウスATOOllk+ 31102
及生物巨大苗NCより 7% 1156B は、
α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼを各々コードする遺
伝子を含み、特に有用な組換えDNAは、α−アミラー
ゼをコードする遺伝子を含む巨大菌belBIl&11
568のDIJAのフラグメントと開裂したベクターp
UB110の組合せから生じ、本発明者がpAMY 1
00 と名付けたものである。開裂したベクターpU
B110とβ−アミラーゼをコードする遺伝子を含むフ
ラグメントからの類似の組換えDNAはpAMY 40
0 と名付けられた6本明細書において巨大苗という
言葉は、とくにベルゲイ(Bergθy)の”マニュア
ル オフデターミネイティブ バクテリオロジイ1 ・
(Manual of Determinative
Bacteriology )、第8版、R,E、ブカ
ナy (Buchanan ) 及びN、 Ili。
ギボンス(Gibbons )共編、第537頁に記載
されるバチルスカロタルム(Bacillus car
ota−rum )を含む巨大苗の認められる異名を含
むことを意図されることが指摘されねばならない。
されるバチルスカロタルム(Bacillus car
ota−rum )を含む巨大苗の認められる異名を含
むことを意図されることが指摘されねばならない。
本発明に従う組換えDNAの製造は、この明細書で後述
する実施例に記載されるような慣用の周知手法を用いて
行われる。
する実施例に記載されるような慣用の周知手法を用いて
行われる。
工業的使用のために、本発明の組換えDNAは初めに宿
主微生物中に入れられる。宿主は酵母又はバクテリアで
あることができ、後者が好ましい。組換えDNAは、ヨ
ーロッパ特許出願8130057a2に記載される宿主
バクテリアの任意のものに入れられることができ、枯草
菌を用いることが好ましい。すなわち、枯草菌れている
後者のアスボロジエニック(非胞子発生的)突然変異体
(以下ではBAS 8と呼ばれる)である。後者が組換
えD N A pAMY 100 のための宿主であ
る場合、新しい微生物(寄託番号枯草菌No工、B 1
1980 ) が得られる(以下ではBAS 35
と呼ばれる)。
主微生物中に入れられる。宿主は酵母又はバクテリアで
あることができ、後者が好ましい。組換えDNAは、ヨ
ーロッパ特許出願8130057a2に記載される宿主
バクテリアの任意のものに入れられることができ、枯草
菌を用いることが好ましい。すなわち、枯草菌れている
後者のアスボロジエニック(非胞子発生的)突然変異体
(以下ではBAS 8と呼ばれる)である。後者が組換
えD N A pAMY 100 のための宿主であ
る場合、新しい微生物(寄託番号枯草菌No工、B 1
1980 ) が得られる(以下ではBAS 35
と呼ばれる)。
改善された安定性及び高コピー数を得るために、下記の
手法を用いて、これら望ましい特性が高められている生
物を与えるように突然変異するためにRAS 35
を生じさせることができることが見い出された。BAH
35は初めに、ヌク □レオチジルトランスフエ
ラーゼ酵゛素によ゛シネ活性化されうる250−μf/
−のカナマイシン又は類似の抗生物質を含む栄養培養基
上で生育される。いくつかのコロニーはこの培養基で生
育でき、他のものは生育できず、前者がよシ高いカナマ
イシン耐性を持つ。この培養基で生育する能力を持つコ
ロニーが選択され、次に別途に培養される。選択された
株はBAH55の突然変異体であることが判シ、枯草菌
N0IB 11984 として寄託された(以下では
BA872 と呼ぶ)。
手法を用いて、これら望ましい特性が高められている生
物を与えるように突然変異するためにRAS 35
を生じさせることができることが見い出された。BAH
35は初めに、ヌク □レオチジルトランスフエ
ラーゼ酵゛素によ゛シネ活性化されうる250−μf/
−のカナマイシン又は類似の抗生物質を含む栄養培養基
上で生育される。いくつかのコロニーはこの培養基で生
育でき、他のものは生育できず、前者がよシ高いカナマ
イシン耐性を持つ。この培養基で生育する能力を持つコ
ロニーが選択され、次に別途に培養される。選択された
株はBAH55の突然変異体であることが判シ、枯草菌
N0IB 11984 として寄託された(以下では
BA872 と呼ぶ)。
しかしもしこの新しい突然変異株が1−当9750μf
のカナマイシンを含む栄養培養基にことで移されると、
この培養基中で生育でき従って750μf/−のカナマ
イシン濃度に抵抗するよう適応された突然変異体の選択
が更に行われうる。この突然変異体が選ばれ、別途に生
育され、枯草菌N0TE 11985 として寄託さ
れた(以下ではBAH75と呼ばれる)。突然変異株B
AB 72 彫 BAR73の両者は、カナマイシン
耐性を持つ他に、高められた安定性及び増加されたコピ
ー数1を示す。すなわちBAH55のコピー数は約15
であfi、BA872 のそれは少くとも25、BA
873 のそれは少くとも35である。
のカナマイシンを含む栄養培養基にことで移されると、
この培養基中で生育でき従って750μf/−のカナマ
イシン濃度に抵抗するよう適応された突然変異体の選択
が更に行われうる。この突然変異体が選ばれ、別途に生
育され、枯草菌N0TE 11985 として寄託さ
れた(以下ではBAH75と呼ばれる)。突然変異株B
AB 72 彫 BAR73の両者は、カナマイシン
耐性を持つ他に、高められた安定性及び増加されたコピ
ー数1を示す。すなわちBAH55のコピー数は約15
であfi、BA872 のそれは少くとも25、BA
873 のそれは少くとも35である。
この手順は、た゛とえば5 Q 00 pt/mtpで
のよシ高い濃度の抗生物質に対してさえ抵抗し、従 ・
つてよシ高いコピー数をもつ突然変異株を作るために用
いうる。
のよシ高い濃度の抗生物質に対してさえ抵抗し、従 ・
つてよシ高いコピー数をもつ突然変異株を作るために用
いうる。
安定性及び高いプラスミドコピー数ヲ持つのに適してい
る。なぜなら、この両者はこのアミラーゼをコードする
遺伝子を含む組換えDNApAMY 100 を含む
からである。同様にBAS 8又は枯草菌BGEIOl
A289 から出発して、その中でアミラーゼをコー
ドする遺伝子が他の供与体から誘導されたところの本発
明の組換えDNAを導入することができる。たとえば本
発明者は、枯草菌NCIB 11981 (以下では
BAs56 と呼ぶ)、枯草菌NCIB11982(
以下ではBAS 57 と呼ぶ)及び枯草菌NCIB
11983(以下ではBAS 5B と呼ぶ)として
各々寄託された新しい微生物を与えるために1組換えD
N A pAMY 20o、 pAMY300及びp
AMY 400をBAS B に導入した。これら三
つの株は、増大された安定性及び高いコピー数を持つカ
ナマイシン耐・性突然変異体を与えるために、類似のB
)、835について記述した方法により突然変異されう
る。 。
る。なぜなら、この両者はこのアミラーゼをコードする
遺伝子を含む組換えDNApAMY 100 を含む
からである。同様にBAS 8又は枯草菌BGEIOl
A289 から出発して、その中でアミラーゼをコー
ドする遺伝子が他の供与体から誘導されたところの本発
明の組換えDNAを導入することができる。たとえば本
発明者は、枯草菌NCIB 11981 (以下では
BAs56 と呼ぶ)、枯草菌NCIB11982(
以下ではBAS 57 と呼ぶ)及び枯草菌NCIB
11983(以下ではBAS 5B と呼ぶ)として
各々寄託された新しい微生物を与えるために1組換えD
N A pAMY 20o、 pAMY300及びp
AMY 400をBAS B に導入した。これら三
つの株は、増大された安定性及び高いコピー数を持つカ
ナマイシン耐・性突然変異体を与えるために、類似のB
)、835について記述した方法により突然変異されう
る。 。
高コピー数突然変異株を工業的使用のためによシ安定に
するために、各微生物に含まれる組換えDNAからカナ
マイシン耐性をコードする遺伝子を除去することが好ま
しい。これは、公知の遺伝子工学手法、たとえば組換え
DNAが微生物から除かれ、インビトロで開裂され、そ
してそれからカナマイシン耐性をコードする遺伝子が制
限エンドヌクレアーゼにより除去され宿主たとえばBA
S 8又は“治ゆされた”形のBAR72又はBAS
73中に再挿入される。
するために、各微生物に含まれる組換えDNAからカナ
マイシン耐性をコードする遺伝子を除去することが好ま
しい。これは、公知の遺伝子工学手法、たとえば組換え
DNAが微生物から除かれ、インビトロで開裂され、そ
してそれからカナマイシン耐性をコードする遺伝子が制
限エンドヌクレアーゼにより除去され宿主たとえばBA
S 8又は“治ゆされた”形のBAR72又はBAS
73中に再挿入される。
本発明の組換えDNAを含む微生物は種々のアミラーゼ
を作るように加工されうるが、それらは特に、本発明者
の英国特許出願−a4142yzで記述したように多糖
類たとえば澱粉の転化及び部分的澱粉加水分解を触媒す
る活性を持つ酵素である巨大筒NCより ffi 1j
568 のα−アミラーゼを作るために特に有用であ
る。
を作るように加工されうるが、それらは特に、本発明者
の英国特許出願−a4142yzで記述したように多糖
類たとえば澱粉の転化及び部分的澱粉加水分解を触媒す
る活性を持つ酵素である巨大筒NCより ffi 1j
568 のα−アミラーゼを作るために特に有用であ
る。
本発明を下記の実施例によシ更に説明する。
そこでは下記の寄託された株及びプラスミドが用いられ
た。
た。
枯草菌BGSOlA289
この生物は、α−アミラーゼをコードする遺伝子におい
て欠陥のある突然変異体である。それは、オハイオ州立
大学のバチルス遺伝子貯蔵センターから得られた。
て欠陥のある突然変異体である。それは、オハイオ州立
大学のバチルス遺伝子貯蔵センターから得られた。
UB110
前述した通りである。
1)AMYl(寄託番号NCIB 11570 とし
て大腸菌に入れられた) 巨大筒N0IIB 11568 のα−アミラーゼ暗
号遺伝子を持つ2.2 kb Hlnd TJi挿入物
を有する大腸菌プラスミドpBR,!+22の誘導体。
て大腸菌に入れられた) 巨大筒N0IIB 11568 のα−アミラーゼ暗
号遺伝子を持つ2.2 kb Hlnd TJi挿入物
を有する大腸菌プラスミドpBR,!+22の誘導体。
このプラスミ 0ドはヨーロッパ特許出願8150
057a2に記載されている。
057a2に記載されている。
RAMY2(寄託番号N01B 11575 として
大腸菌に入れられた) バチルスコアグランスNCより 11571 のα−
アミラーゼ暗号遺伝子を持つl 3 kb lco、R
I 挿入物を有する大腸菌プラスミドpBR522の
誘導体。
大腸菌に入れられた) バチルスコアグランスNCより 11571 のα−
アミラーゼ暗号遺伝子を持つl 3 kb lco、R
I 挿入物を有する大腸菌プラスミドpBR522の
誘導体。
このプラスミドはヨーロッパ特許出願8150057a
2に記載されている。
2に記載されている。
pAMy′5(寄託番号NCIB 11602 とし
て大腸菌に入れられた) バチルスセレウスATC!031102 のβ−アミ
ラーゼ暗号遺伝子を持つ& 2 kt)ic@、RI挿
入物を有する大腸菌プラスミドpBR322の誘導体。
て大腸菌に入れられた) バチルスセレウスATC!031102 のβ−アミ
ラーゼ暗号遺伝子を持つ& 2 kt)ic@、RI挿
入物を有する大腸菌プラスミドpBR322の誘導体。
このプラスミドはヨーロッパ特許出願8130057a
2に記載されている。
2に記載されている。
実施例1
pAMYloO: pUB 110 から由来し、巨
大5菌NCIB 1156B のα−アミラーゼをコ
ードするD N、 Aセグメントを有する組換えプラス
ミド(プラスミド地図は第1図参照) 供与体DNAはpAMY 1 であり、インビトロ組
換えが、1 pfのpAMY I DNAとE(D、、
R工制限ニージョン)は、コンカテマーを作るためにT
4DIムリガーゼの1単位の存在下で高濃度(75μt
DNA /、1 ) で行われた。
大5菌NCIB 1156B のα−アミラーゼをコ
ードするD N、 Aセグメントを有する組換えプラス
ミド(プラスミド地図は第1図参照) 供与体DNAはpAMY 1 であり、インビトロ組
換えが、1 pfのpAMY I DNAとE(D、、
R工制限ニージョン)は、コンカテマーを作るためにT
4DIムリガーゼの1単位の存在下で高濃度(75μt
DNA /、1 ) で行われた。
得られた生成物は、クロウニス(01ovres )と
ハイス(Hlg”es ) Wasエクスペリメンツイ
ンマイクロバイアル ジエネテイツクス(Experi
ments in Microbial Geneti
cs )、ブラックウニA/ (Blackwell
)、1968、に記載される手順によl BG801A
289 を形質転換するために用いられた。カナマイ
シン耐性でアミラーゼを産出するクローンが、10μf
/lのカナマイシン及び1%澱粉を与えられたLB培養
基中で同定された。アミラーゼを産出するクローンは、
ヨーロッパ特許出願8130057a2、第20頁、段
落Bに記載される手法によりョウ素蒸気で同定される。
ハイス(Hlg”es ) Wasエクスペリメンツイ
ンマイクロバイアル ジエネテイツクス(Experi
ments in Microbial Geneti
cs )、ブラックウニA/ (Blackwell
)、1968、に記載される手順によl BG801A
289 を形質転換するために用いられた。カナマイ
シン耐性でアミラーゼを産出するクローンが、10μf
/lのカナマイシン及び1%澱粉を与えられたLB培養
基中で同定された。アミラーゼを産出するクローンは、
ヨーロッパ特許出願8130057a2、第20頁、段
落Bに記載される手法によりョウ素蒸気で同定される。
陽性クローンから、pAMY 100 、 全pUB
110を保持するプラスミド、AMYフラグメント、及
びAMYフラグメントをフランク(flank )する
Hlnd l[部位により制限されたpBR522の僅
か少さな部分を有するクローンが選択された。
110を保持するプラスミド、AMYフラグメント、及
びAMYフラグメントをフランク(flank )する
Hlnd l[部位により制限されたpBR522の僅
か少さな部分を有するクローンが選択された。
次にpAMY 100 D N Aがこの株から抽出
され、実施例5に記載するようにBAS 8を形質転換
するために用いられた。
され、実施例5に記載するようにBAS 8を形質転換
するために用いられた。
実施例2
pAMY 200 : pUB 110から由来し、
バチルスコアグランスNCIB 11571 のα−
アミラーゼをコードするDNAセグメントを有する組換
えプラスミド(プラスミド地図は第2図参照)。′実施
例1記載の手法によl) pAMY 2 D NAと
pUB 110 D N Aの間でイソビトロ組換えが
行われた。pAMY 200 が、pUB110の1
c!Q、R工部忙中の五3゜kb 挿入物として得られ
た。このプラスミド(7,8kb) は、実施例8記
載のようにBAS Bを形質転換するために用いられた
。
バチルスコアグランスNCIB 11571 のα−
アミラーゼをコードするDNAセグメントを有する組換
えプラスミド(プラスミド地図は第2図参照)。′実施
例1記載の手法によl) pAMY 2 D NAと
pUB 110 D N Aの間でイソビトロ組換えが
行われた。pAMY 200 が、pUB110の1
c!Q、R工部忙中の五3゜kb 挿入物として得られ
た。このプラスミド(7,8kb) は、実施例8記
載のようにBAS Bを形質転換するために用いられた
。
実施例3
pAMY 500 : pUB 110から由来し、
バチルスセレウスATOO31102のβ−アミラーゼ
遺伝子をコードするDNAセグメントを有する組換えプ
ラスミド(プラスミド地図は第3図参照)。
バチルスセレウスATOO31102のβ−アミラーゼ
遺伝子をコードするDNAセグメントを有する組換えプ
ラスミド(プラスミド地図は第3図参照)。
供与体はpAMY 3 であり、組換えは実施例1記
載の手法で行われた。pAMY 300 が、pUB
110のlICC0,R工部忙中のA 2 kb挿入物
として得られた。このプラスミドは実施例9記載のよう
にBAS8を形質転換するために用いられた。
載の手法で行われた。pAMY 300 が、pUB
110のlICC0,R工部忙中のA 2 kb挿入物
として得られた。このプラスミドは実施例9記載のよう
にBAS8を形質転換するために用いられた。
実施例4
枯草菌BGSC1A 289のアスボロジエナス(非胞
子的)未然変異体、枯草菌BAS8の調製BG8CIA
289の一夜培養物のサンプルにUV光を放射し、下
記の培養基を連続的継代培養でイノキュレートするため
に用いた。
子的)未然変異体、枯草菌BAS8の調製BG8CIA
289の一夜培養物のサンプルにUV光を放射し、下
記の培養基を連続的継代培養でイノキュレートするため
に用いた。
ディ7コ(DlfCO)酵母抽出物 12M g
S 04・7HIO2001HiFe804 ・7H2
010W MnSO4@H107’? 0aO−4@2B10 .734
po4緩衝液pH7,00,067M グルタミン酸塩 0.1Mメチオニン
40119芳香族アミノ酸
40キ H!01L この培養基は、ベルゲレ(Bergere )及びヘル
ミエル(Hermiθr)によシ胞子形成誘発培養基と
して記載されている( Ann、工net+ past
eur106、214.2351964 )。このよ、
うな培養基における連続的継代培養は、栄養細胞(胞子
゛形成できない)対胞子(増殖できる前に最初に発芽し
なければならない)に対して選択の利点を与は、6回の
継代培養後に単離された。
S 04・7HIO2001HiFe804 ・7H2
010W MnSO4@H107’? 0aO−4@2B10 .734
po4緩衝液pH7,00,067M グルタミン酸塩 0.1Mメチオニン
40119芳香族アミノ酸
40キ H!01L この培養基は、ベルゲレ(Bergere )及びヘル
ミエル(Hermiθr)によシ胞子形成誘発培養基と
して記載されている( Ann、工net+ past
eur106、214.2351964 )。このよ、
うな培養基における連続的継代培養は、栄養細胞(胞子
゛形成できない)対胞子(増殖できる前に最初に発芽し
なければならない)に対して選択の利点を与は、6回の
継代培養後に単離された。
枯草菌BGS01A 289について報告された遺伝l
マーカーは下記のものである。
マーカーは下記のものである。
amy−K : a−アミラーゼの不存在を結果する、
枯草菌のα−アミラーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 aro I 906 : 芳香族アミノ酸(フェニルア
ラニン、チロシン、及びトリプトファン) に対する要求(栄養要求性)を結果す る、シキメートキナーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 mθtB5:メチオニンに対する要求を結果する、メチ
オニン生合成経路の酵素の1つを コードする構造遺伝子における突然変 異 θao A 321 :蔗糖異化に関係する酵素をコー
ドする構造遺伝子における突然変異であ 、シ、蔗糖を異化することの不能を結果する 紫外線処理の効果は、胞子形成の不能を結果する未知遺
伝子における突然変異を作ることであった。突然変異体
BAS 8は、前述した胞子形成培養基中で107のバ
クテリア当シ1未満の胞子を作シ、一方、枯草菌BG8
01A 289は同じ条件下で2つのバクテリア当シ1
つの胞子を作る。突然変異物枯草菌BAS 8は、遺伝
lマーカ−apo−8を含むが、しかず同時に突然変°
異過程でマーカーaro工906及びsa、c A 3
21を失った。
枯草菌のα−アミラーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 aro I 906 : 芳香族アミノ酸(フェニルア
ラニン、チロシン、及びトリプトファン) に対する要求(栄養要求性)を結果す る、シキメートキナーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 mθtB5:メチオニンに対する要求を結果する、メチ
オニン生合成経路の酵素の1つを コードする構造遺伝子における突然変 異 θao A 321 :蔗糖異化に関係する酵素をコー
ドする構造遺伝子における突然変異であ 、シ、蔗糖を異化することの不能を結果する 紫外線処理の効果は、胞子形成の不能を結果する未知遺
伝子における突然変異を作ることであった。突然変異体
BAS 8は、前述した胞子形成培養基中で107のバ
クテリア当シ1未満の胞子を作シ、一方、枯草菌BG8
01A 289は同じ条件下で2つのバクテリア当シ1
つの胞子を作る。突然変異物枯草菌BAS 8は、遺伝
lマーカ−apo−8を含むが、しかず同時に突然変°
異過程でマーカーaro工906及びsa、c A 3
21を失った。
実施例5
組換えD N A pAMY 100 を含むBAs
35 ova製 実施例1及び前述のエクスベリメンツ インマイクロバ
イアルジェネテックス記載の方法によ#)BAS 8を
形質変換するためK pAMY 100 を用いた。
35 ova製 実施例1及び前述のエクスベリメンツ インマイクロバ
イアルジェネテックス記載の方法によ#)BAS 8を
形質変換するためK pAMY 100 を用いた。
BAH55(D 7’ ラxミド安定性は、プラスミド
pUB110がそれに対する耐性を与えるところの抗生
物質カナマイシンなしで完全培養基(ディフコ トリプ
トン1%;ディフコ酵素抽出物1%、Mal:!t α
5%)中で37℃で連続的継代培養することによシ測定
された。
pUB110がそれに対する耐性を与えるところの抗生
物質カナマイシンなしで完全培養基(ディフコ トリプ
トン1%;ディフコ酵素抽出物1%、Mal:!t α
5%)中で37℃で連続的継代培養することによシ測定
された。
最初の継代培養は、20p1/l1gのカナマイシンの
存在下で生育した一夜培養物のサンプルでイノキュレー
トされた。各継代培養について、発生の数を測定するた
めに、イノキュレーフヨン及び生長の直後に肉眼カウン
トを用いた。
存在下で生育した一夜培養物のサンプルでイノキュレー
トされた。各継代培養について、発生の数を測定するた
めに、イノキュレーフヨン及び生長の直後に肉眼カウン
トを用いた。
57℃の完全培養基における指数増殖期におけるBAS
35 0発生時間I/′i、30分間である。
35 0発生時間I/′i、30分間である。
各継代培養の後に、アミラーゼ陽性クローン(プラスミ
ドを保持している)のバーセントヲIIJ定した。結果
は下記の通シであった。
ドを保持している)のバーセントヲIIJ定した。結果
は下記の通シであった。
世代数 AD17 のクローンの係29
90.7 35 5&746
14.4 5i5 4.9実施例6 EAS 55 の突然変異体、BAS 72 の調
製(これは増大されたカナマイシン耐性及びプラスミド
安定性をコードする未知遺伝子における突然変異を含む
) 約30μf/dの最大濃度のカナマイシンに対する耐性
を与えるグラスミドpAMY 100を含むEAS 3
5 が、完全培養基において一夜生育された。突然変
異原処理なしでQ、1−のサンプルを、完全培養基を含
みかつ250μV/−のカナマイシンを補われたプレー
ト上に広げた。37℃で2EJf)イ:yキュペークヨ
ンの後に、この濃度のカナマイシンに耐性のクローンが
イ/キュベートされたBAH55細胞当り10−6の確
率で生じた。BA872 と名付けられた一つのクロ
ーンが耐性クローンから選ばれ、増大された耐性をカナ
マイシン表現型に与える突然変異は1rk−72と名付
けられた。この表現型は、抗生物質の不存在下での数回
の継代培養後にその安定性を維持した。37℃での完全
培養における指数増殖期のBAH72の発生時間は60
分間である。
90.7 35 5&746
14.4 5i5 4.9実施例6 EAS 55 の突然変異体、BAS 72 の調
製(これは増大されたカナマイシン耐性及びプラスミド
安定性をコードする未知遺伝子における突然変異を含む
) 約30μf/dの最大濃度のカナマイシンに対する耐性
を与えるグラスミドpAMY 100を含むEAS 3
5 が、完全培養基において一夜生育された。突然変
異原処理なしでQ、1−のサンプルを、完全培養基を含
みかつ250μV/−のカナマイシンを補われたプレー
ト上に広げた。37℃で2EJf)イ:yキュペークヨ
ンの後に、この濃度のカナマイシンに耐性のクローンが
イ/キュベートされたBAH55細胞当り10−6の確
率で生じた。BA872 と名付けられた一つのクロ
ーンが耐性クローンから選ばれ、増大された耐性をカナ
マイシン表現型に与える突然変異は1rk−72と名付
けられた。この表現型は、抗生物質の不存在下での数回
の継代培養後にその安定性を維持した。37℃での完全
培養における指数増殖期のBAH72の発生時間は60
分間である。
BAH72中でのpAMY 10G の安定性安定性
はBAS 35 の場合のように測定された。
はBAS 35 の場合のように測定された。
結果は下記の通りである。pAMY 100 は、B
AG35 におけるよりもBAH72中では”るかに
よ多安定であることは明らかである。
AG35 におけるよりもBAH72中では”るかに
よ多安定であることは明らかである。
世代数 Any クローンの係実施例7
先の実施例におけるよシも高いカナマイシン耐性を与え
る未知遺伝子の突然変異を含むBAS73 の調製 RAS 72 (250pi/vt濃度のカナマイ’
/7に耐性である)の完全培養基中での一夜培養物の0
.1−のサンプルを、750 pfl/艷のカナマイシ
ンを補われた完全培養基を含むプレート上に広げた。こ
の濃度の抗生物質に自発的耐性のクローンが、プレート
された細胞当シ10−6の確率で生じた。そのようなり
ローフの一つを精製し、BAH7B と名付けた。7
s o pt、/−のカナマイシンに対するその耐性
は、抗生物質不存在での数回の継代培養後に安定に維持
された。
る未知遺伝子の突然変異を含むBAS73 の調製 RAS 72 (250pi/vt濃度のカナマイ’
/7に耐性である)の完全培養基中での一夜培養物の0
.1−のサンプルを、750 pfl/艷のカナマイシ
ンを補われた完全培養基を含むプレート上に広げた。こ
の濃度の抗生物質に自発的耐性のクローンが、プレート
された細胞当シ10−6の確率で生じた。そのようなり
ローフの一つを精製し、BAH7B と名付けた。7
s o pt、/−のカナマイシンに対するその耐性
は、抗生物質不存在での数回の継代培養後に安定に維持
された。
57℃での完全培養基中での指数増殖期におけるRAS
75 0発生時間は60分間である。
75 0発生時間は60分間である。
BAS 75 中でのpAMY 1”OOの安定性プ
ラスミド安定性がRAS 35 の場合のように測定
され、結果を下記に示す。pANY 100 は、B
AS 35 におけるよシもBAS 75 におい
てはるかに安定であることは明らかである。
ラスミド安定性がRAS 35 の場合のように測定
され、結果を下記に示す。pANY 100 は、B
AS 35 におけるよシもBAS 75 におい
てはるかに安定であることは明らかである。
世代数 Amy クローンの係実施例8
組換えD N A pAMY 200を含むBAS
56の調製 実施例1で述べられ、前述めエクスペリメyツ イン
マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される方法に
よfi BAS 8を形質転換するためにpAMY 2
00 D M Aが用いられた。
56の調製 実施例1で述べられ、前述めエクスペリメyツ イン
マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される方法に
よfi BAS 8を形質転換するためにpAMY 2
00 D M Aが用いられた。
BAH55におけるpAMY 100 の場合と同じ
方法で、プラスミド安定性を測定した。結果を゛下記に
示す。
方法で、プラスミド安定性を測定した。結果を゛下記に
示す。
世代数 Am7クローンの僑
20 17.656
5.8.52
0.4 実施例9 − 組換えD N A pAMY 300を含むBAS
37 の調製 イン マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される
方法によfi BAS 8を形質転換するためにpAM
Y 500 D N Aが用いられた。
5.8.52
0.4 実施例9 − 組換えD N A pAMY 300を含むBAS
37 の調製 イン マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される
方法によfi BAS 8を形質転換するためにpAM
Y 500 D N Aが用いられた。
2ρQ
BAS 55 におけるpAMY Jr43−fk
の場合と同じ方法で、プラスミド安定性を測定した。結
果を下 P記に示す。
の場合と同じ方法で、プラスミド安定性を測定した。結
果を下 P記に示す。
世代数 Amy クローンの係26
1 DO実施例10 pAMY 400 : pUB 110から由来し、
巨大苗NCIB11568のβ−アミラーゼ遺伝子を コードするDNAセグメ/トを有 する組換えプラスミド(プラスミ ド地図は第4図参照) 巨大苗NCIB 11568 のβ−アミラーゼをコ
ードする遺伝子は最初に、新しい組換プラスミド1)A
MY 4 (NCIB 11986として大腸菌HB1
01 中で寄託)を作るために、大腸菌プラスミドp
BR322中で継代培養される前に77−ジλによって
大腸菌中でクローニングされた。プラスミドpAMY
4 は次に、β−アミラーゼ暗号遺伝子をpUB11
0中に導入するために用いられた。手順を下記に示す。
1 DO実施例10 pAMY 400 : pUB 110から由来し、
巨大苗NCIB11568のβ−アミラーゼ遺伝子を コードするDNAセグメ/トを有 する組換えプラスミド(プラスミ ド地図は第4図参照) 巨大苗NCIB 11568 のβ−アミラーゼをコ
ードする遺伝子は最初に、新しい組換プラスミド1)A
MY 4 (NCIB 11986として大腸菌HB1
01 中で寄託)を作るために、大腸菌プラスミドp
BR322中で継代培養される前に77−ジλによって
大腸菌中でクローニングされた。プラスミドpAMY
4 は次に、β−アミラーゼ暗号遺伝子をpUB11
0中に導入するために用いられた。手順を下記に示す。
ファージλにおける巨大苗N0IB 1156B の
DNAのクローンユング 2μfの巨大菌N市B 1156B 全D″MAを、1
0単位の制限エンドヌクレアーゼH1nd m で3
7℃で2時間開裂した。め1μVのファージλNM S
90 が同時に、同じ酵素により切断された。二つの
消化されたDNAが混合され、DNAフラグメントの粘
着末端のアニーリング及び共有結合を許すために1単位
のT4D1’lA +)ガーゼ口のキャプシド封入(
encapsidation ’) [161製物に加
えられ、キャプシド封入されたDNAは感染のために大
腸菌HB101 細胞でインキュベートされ、形成さ
れたプラークの鹸粉寒天培養基70%上の広がった物は
組換え分子を含む。プレートをヨウ素蒸気に曝した後に
、白いエリアで囲まれたプラークは、800の組換えプ
ラク上で1の確率で見い出されたニ一つが取上げられ、
λNM 950βamylと呼ばれる。そのDNA制限
後に、5 kb H1nd11フラグメントの挿入が観
察され喪。
DNAのクローンユング 2μfの巨大菌N市B 1156B 全D″MAを、1
0単位の制限エンドヌクレアーゼH1nd m で3
7℃で2時間開裂した。め1μVのファージλNM S
90 が同時に、同じ酵素により切断された。二つの
消化されたDNAが混合され、DNAフラグメントの粘
着末端のアニーリング及び共有結合を許すために1単位
のT4D1’lA +)ガーゼ口のキャプシド封入(
encapsidation ’) [161製物に加
えられ、キャプシド封入されたDNAは感染のために大
腸菌HB101 細胞でインキュベートされ、形成さ
れたプラークの鹸粉寒天培養基70%上の広がった物は
組換え分子を含む。プレートをヨウ素蒸気に曝した後に
、白いエリアで囲まれたプラークは、800の組換えプ
ラク上で1の確率で見い出されたニ一つが取上げられ、
λNM 950βamylと呼ばれる。そのDNA制限
後に、5 kb H1nd11フラグメントの挿入が観
察され喪。
゛ 大腸菌pB1322プラスミド中のβ−アミラー
ゼ遺伝子のサブクローニング 1 pfのλNM 590βamy1のDNA及び(L
6混合物は、大腸菌HB101 形質転換可能細胞を
形質転換するために用いられ、アンピクリン耐性につい
て選択され、テトラサイクリ/感応性及びアミラーゼ生
産についてスクリーンされた。
ゼ遺伝子のサブクローニング 1 pfのλNM 590βamy1のDNA及び(L
6混合物は、大腸菌HB101 形質転換可能細胞を
形質転換するために用いられ、アンピクリン耐性につい
て選択され、テトラサイクリ/感応性及びアミラーゼ生
産についてスクリーンされた。
Amy+ プラスミドの一つのタイプが6qbの確率で
見い出された:これはpBR522+ 5 kb H1
nd■異種フラグメントの挿入であり、巨大苗NCIB
11568からのβ−アミラーゼを含む。このプラスミ
ドはpAMY 4 と呼ばれる。
見い出された:これはpBR522+ 5 kb H1
nd■異種フラグメントの挿入であり、巨大苗NCIB
11568からのβ−アミラーゼを含む。このプラスミ
ドはpAMY 4 と呼ばれる。
枯草菌I)UB 110プラスミド中のβ−アミラーゼ
遺伝子のサブクローニア/f Hltul 11 制限部位を利用できないことが、p
UB110におけるサブクローニングを可能にするため
に、β−アミラーゼの両側上の他の部位の同定を必要と
した。
遺伝子のサブクローニア/f Hltul 11 制限部位を利用できないことが、p
UB110におけるサブクローニングを可能にするため
に、β−アミラーゼの両側上の他の部位の同定を必要と
した。
詳細な制限地図作成の後に、二つのBgl 11部位が
、2.5kb 対を取シ囲む5kl)異種フラグメント
において見い出された。このサイズの部位は、活性β−
アミラーゼ遺伝子を含みうる。
、2.5kb 対を取シ囲む5kl)異種フラグメント
において見い出された。このサイズの部位は、活性β−
アミラーゼ遺伝子を含みうる。
さ−らに、Bgl n粘着末端は、Bam H工 末端
と結合しうる( pUB 110は彼者のためのユニー
ク制限部位を持つ)o2ptのpUB110をBamH
工で切断し、1 ptのpAMY 4をBgIIIとH
lna mで切断した。フラグメントを、1単位のT
DNAリガーゼの存在下でアニーリングした。実施例1
記載の方法で形質転換後に、Any+組換えプラスミド
の一つのタイプが枯草菌中に見い出され九。この新しい
プラスミドは、pUB 110のBam H工 部位に
おいて2.5kl)挿入物を含む。
と結合しうる( pUB 110は彼者のためのユニー
ク制限部位を持つ)o2ptのpUB110をBamH
工で切断し、1 ptのpAMY 4をBgIIIとH
lna mで切断した。フラグメントを、1単位のT
DNAリガーゼの存在下でアニーリングした。実施例1
記載の方法で形質転換後に、Any+組換えプラスミド
の一つのタイプが枯草菌中に見い出され九。この新しい
プラスミドは、pUB 110のBam H工 部位に
おいて2.5kl)挿入物を含む。
この7 kl) プラスミドはpAMY QOと呼ば
れ、RAS5B を発生するためにBAR8に導入さ
れた。
れ、RAS5B を発生するためにBAR8に導入さ
れた。
実施例11
枯草菌■ム1145及びBAEI 73によるα−アミ
ラーゼの製造 重f/体積パーセントで1%のバクトペプトン、3俤の
酵母抽出物、0.5%のグルコース及びO,SSのNa
0L を含む15Lの培養基を含む四つの201培養器
を、同じ培養基中に含まれる予備培譬物の1俤でイノキ
ュレートした。予備培養物は、培養器の前の最後段階で
約35世代が作られるように数回の継代培養を行うこと
により作られた。
ラーゼの製造 重f/体積パーセントで1%のバクトペプトン、3俤の
酵母抽出物、0.5%のグルコース及びO,SSのNa
0L を含む15Lの培養基を含む四つの201培養器
を、同じ培養基中に含まれる予備培譬物の1俤でイノキ
ュレートした。予備培養物は、培養器の前の最後段階で
約35世代が作られるように数回の継代培養を行うこと
により作られた。
二つの培養器は、カナマイシンの存在下(5pf/ad
)及び不存在下で株BA835 を接種され、二つは
カナマイシンの存在下(5μf/lRg)及び不存在下
で株BA875 を接種された。培養器を250 r
pmで攪拌し、α154空気/1/分で空気を吹き込み
、40℃で55時間保った。6時間後及びさらに48時
間の間、゛培養器に加えられたグルコース合計がt s
% (w/v )となるようにグルコース溶液を連続
的に培養器に加えた。醗酵の終了時に、培養ブロス中の
α−アミ
)及び不存在下で株BA835 を接種され、二つは
カナマイシンの存在下(5μf/lRg)及び不存在下
で株BA875 を接種された。培養器を250 r
pmで攪拌し、α154空気/1/分で空気を吹き込み
、40℃で55時間保った。6時間後及びさらに48時
間の間、゛培養器に加えられたグルコース合計がt s
% (w/v )となるようにグルコース溶液を連続
的に培養器に加えた。醗酵の終了時に、培養ブロス中の
α−アミ
第1図〜第4図は各々、pAMY 100 、、 pA
MY200 、 pAMY 300及びpAMY 40
0の制限地図を示す。 第4図において、8AU!lAIの他の部位はまだ決定
されていない。
MY200 、 pAMY 300及びpAMY 40
0の制限地図を示す。 第4図において、8AU!lAIの他の部位はまだ決定
されていない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、供与体微生物から由来するDNAを開裂し、アミラ
ーゼ暗号遺伝子を含む得たDNAフラグメントを、プラ
スミドである同様に開裂されたベクターと結合するイン
ビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組
換えDNAにおいて、供与体微生物が巨大菌 (Bacillus megaterium)、バチル
スコアグランス(Bacillus coagulan
s)、バチルスシルキュランス(Bacillus c
irculans)、バチルスセレウス(Bacill
us cereus)又は肺炎桿菌(Klebsiel
la pneumoniae)であり、プラスミドがp
UB 110であることを特徴とする組換えDNA。 2、供与体微生物が肺炎桿菌ATCC No.1505
0である特許請求の範囲第1項記載の組換えDNA。 3、供与体微生物が巨大菌NCIB No.11568
であり、α−アミラーゼを暗号する遺伝子を含む組換え
DNAがpAMY 100と名付けられる特許請求の範
囲第1項記載の組換えDNA。 4、供与体微生物がバチルスコアグランスNCIB N
o.11571であり、組換えDNAがpAMY 20
0と名付けられる特許請求の範囲第1項記載の組換えD
NA。 5、供与体微生物がバチルスセレウスATCC No.
31102であり、組換えDNAがpAMY 300と
名付けられる特許請求の範囲第1項記載の組換えDNA
。 6、供与体微生物が巨大菌NCIB 11568であり
、β−アミラーゼを暗号する遺伝子を含む組換えDNA
がpAMY 400と名付けられる特許請求の範囲第1
項記載の組換えDNA。 7、供与体微生物から由来するDNAを開裂し、アミラ
ーゼ暗号遺伝子を含む得たDNAフラグメントを、プラ
スミドである同様に開裂されたベクターと結合するイン
ビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組
換えDNAであって、供与体微生物が巨大菌 (Bacillus megaterium)、バチル
スコアグランス(Bacillus coagulan
s)、バチルスシルキュランス(Bacillus c
irculans)、バチルスセレウス(Bacill
us cereus)又は肺炎桿菌(Klebsiel
la pneumoniae)であり、プラスミドがp
UB 110であるところの組換えDNAを含むことを
特徴とする遺伝子工学的に処理された微生物。 8、微生物が枯草菌である特許請求の範囲第7項記載の
微生物。 9、枯草菌が枯草菌BGSC1A289である特許請求
の範囲第8項記載の微生物。 10、枯草菌がNCIB 11979(BAS 8)で
ある特許請求の範囲第8項記載の微生物。 11、組換えDNAがpAMY 100であり、新規微
生物が枯草菌NCIB 11980(BAS 35)で
ある特許請求の範囲第10項記載の微生物。 12、新規微生物が、少くとも250μg/mlのカナ
マイシンを含む栄養素培養基で生育しうる枯草菌NCI
B 11980(BAS 35)のカナマイシン耐性突
然変異体である特許請求の範囲第11項記載の微生物。 13、枯草菌NCIB 11984(BAS 72)で
ある特許請求の範囲第12項記載の微生物。 14、枯草菌NCIB 11980(BAS 35)の
カナマイシン耐性突然変異体が少くとも750μg/m
lのカナマイシンを含む栄養素培養基で生育しうる特許
請求の範囲第12項記載の微生物。 15、枯草菌NCIB 11985(BAS 73)で
ある特許請求の範囲第14項記載の微生物。 16、少くとも25のプラスミドコピー数を持つ特許請
求の範囲第12〜15項のいずれか一つに記載の微生物
。 17、少くとも35のプラスミドコピー数を持つ特許請
求の範囲第16頂記載の微生物。 18、供与体微生物から由来するDHAを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たDNAフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えDNAであって、供与体微生物が巨大菌 (Bacillus megaterium)、バチル
スコアグランス(Bacillus coagulan
s)、バチルスシルキュランス(Bacillus c
irculans)、バチルスセレウス(Bacill
us cereus)又は肺炎桿菌(Klebsiel
la pneumoniae)であり、プラスミドがp
UB 110であるところの組換えDNA pAMY
100を含む枯草菌NCIB 11979(BAS 8
)である枯草菌NCIB 11980(BAS 35)
の、少くとも250μg/mlのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体を作る方法において、(a)250μg/mlのカ
ナマイシンを含む栄養素培養基で枯草菌NCIB 11
980(BAS 35)を培養すること、 (b)この培養基で生育する一又は二以上のコロニーを
選択すること、 (c)該コロニーを新しい栄養素培養基に移すこと、及
び (d)上記選ばれたコロニーを上記新しい培養基で培養
すること を特徴とする方法。 19、供与体微生物から由来するDNAを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たDNAフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えDNAであって、供与体微生物が巨大菌 (Bacillus megaterium)、バチル
スコアグランス(Bacillus coagulan
s)、バチルスシルキュランス(Bacillus c
irculans)、バチルスセレウス(Bacill
us cereus)又は肺炎桿菌(Klebsiel
la pneumoniae)であり、プラスミドがp
UB 110であるところの組換えDNA pAMY
100を含む枯草菌NCIB 11979(BAS 8
)である枯草菌NCIB 11980(BAS 35)
の、少くとも750μg/mlのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体を作る方法において、(a)少くとも250μg/
mlのカナマイシンを含む栄養素培養基において生育し
うる枯草 菌NCIB 11980(BAS 35)のカナマイシ
ン耐性突然変異体を750μg/mlのカナマイシンを
含む栄養素培養基において培養するこ と、 (b)この培養基で生育する一又は二以上のコロニーを
選択すること、 (c)該コロニーを新しい栄養素培養基に移すこと、及
び (d)上記選ばれたコロニーを上記新しい培養基で培養
すること を特徴とする方法。 20、供与体微生物から由来するDNAを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たDNAフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えDNAであって、供与体微生物が巨大菌 (Bacillus megaterium)、バチル
スコアグランス(Bacillus coagulan
s)、バチルスシルキュランス(Bacillus c
irculans)、バチルスセレウス(Bacill
us cereus)又は肺炎桿菌(Klebsiel
la pneumoniae)であり、プラスミドがp
UB 110であるところの組換えDNA pAMY
100を含む枯草菌NCIB 11979(BAS 8
)である枯草菌NCIB 11980(BAS 35)
の、少くとも250μg/mlのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体NCIB 11984(BAS 72)を用いる方
法において、上記微生物が含む組換えDNAをインビト
ロに開裂し、制限エンドヌクレアーゼによってカナマイ
シン耐性を暗号する遺伝子を切除し、該遺伝子を含まな
い組換えDNAをリガーゼによって連結し、そしてこの
連結された組換えDNAを枯草菌宿主に再導入すること
を特徴とする方法。 21、供与体微生物から由来するDNAを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たDNAフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えDNAであって、供与体微生物が巨大菌 (Bacillus megaterium)、バチル
スコアグランス(Bacillus coagulan
s)、バチルスシルキュランス(Bacillus c
irculans)、バチルスセレウス(Bacill
us cereus)又は肺炎桿菌(Klebsiel
la pneumoniae)であり、プラスミドがp
UB 110であるところの組換えDNA pAMY
100を含む枯草菌NCIB 11979(BAS 8
)である枯草菌NCIB 11980(BAS 35)
の、少くとも250μg/mlのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体又はこれの組換えDNAからカナマイシン耐性を暗
号する遺伝子が除かれたところの微生物を、アミラーゼ
生産条件下で培養することを特徴とするアミラーゼの製
造法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB848414271A GB8414271D0 (en) | 1984-06-05 | 1984-06-05 | Recombinant dna |
GB8414271 | 1984-06-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6119491A true JPS6119491A (ja) | 1986-01-28 |
JPH0779683B2 JPH0779683B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=10561932
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60120735A Expired - Lifetime JPH0779683B2 (ja) | 1984-06-05 | 1985-06-05 | 組換えdnaを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4806426A (ja) |
EP (1) | EP0165002B1 (ja) |
JP (1) | JPH0779683B2 (ja) |
AT (1) | ATE76902T1 (ja) |
AU (1) | AU4313285A (ja) |
BR (1) | BR8502681A (ja) |
CA (1) | CA1279590C (ja) |
DE (1) | DE3586145T2 (ja) |
DK (1) | DK170735B1 (ja) |
ES (2) | ES8702947A1 (ja) |
FI (1) | FI91885C (ja) |
GB (1) | GB8414271D0 (ja) |
IE (1) | IE58259B1 (ja) |
MX (1) | MX7725E (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
US5209938A (en) * | 1989-09-13 | 1993-05-11 | Cpc International Inc. | Method for retarding staling of baked goods |
US6300115B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-09 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56128796A (en) * | 1980-02-15 | 1981-10-08 | Cpc International Inc | Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
DK135983D0 (da) * | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Novo Industri As | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
-
1984
- 1984-06-05 GB GB848414271A patent/GB8414271D0/en active Pending
-
1985
- 1985-05-22 IE IE128785A patent/IE58259B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-23 US US06/737,311 patent/US4806426A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 FI FI852084A patent/FI91885C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-30 AU AU43132/85A patent/AU4313285A/en not_active Abandoned
- 1985-06-03 MX MX85956U patent/MX7725E/es unknown
- 1985-06-04 EP EP85303947A patent/EP0165002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 AT AT85303947T patent/ATE76902T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 BR BR8502681A patent/BR8502681A/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 DE DE8585303947T patent/DE3586145T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 ES ES543860A patent/ES8702947A1/es not_active Expired
- 1985-06-04 DK DK251485A patent/DK170735B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-05 JP JP60120735A patent/JPH0779683B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-05 CA CA000483212A patent/CA1279590C/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-01-28 ES ES551307A patent/ES8802536A1/es not_active Expired
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56128796A (en) * | 1980-02-15 | 1981-10-08 | Cpc International Inc | Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3586145T2 (de) | 1992-12-03 |
IE58259B1 (en) | 1993-08-25 |
DK170735B1 (da) | 1995-12-27 |
ES543860A0 (es) | 1987-01-16 |
ATE76902T1 (de) | 1992-06-15 |
BR8502681A (pt) | 1986-02-12 |
JPH0779683B2 (ja) | 1995-08-30 |
DK251485D0 (da) | 1985-06-04 |
FI91885C (fi) | 1994-08-25 |
US4806426A (en) | 1989-02-21 |
GB8414271D0 (en) | 1984-07-11 |
ES8802536A1 (es) | 1988-07-16 |
ES551307A0 (es) | 1988-07-16 |
AU4313285A (en) | 1985-12-12 |
MX7725E (es) | 1991-01-30 |
EP0165002A3 (en) | 1987-09-02 |
EP0165002B1 (en) | 1992-06-03 |
IE851287L (en) | 1985-12-05 |
DK251485A (da) | 1985-12-06 |
CA1279590C (en) | 1991-01-29 |
FI852084L (fi) | 1985-12-06 |
FI91885B (fi) | 1994-05-13 |
ES8702947A1 (es) | 1987-01-16 |
FI852084A0 (fi) | 1985-05-24 |
EP0165002A2 (en) | 1985-12-18 |
DE3586145D1 (de) | 1992-07-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU1838410C (ru) | Способ получени альфа-амилазы | |
JPS59205983A (ja) | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 | |
SU1200853A3 (ru) | Способ конструировани гибридной плазмиды,содержащей генетический код термостойкой альфа-амилазы | |
US4695546A (en) | Transforming Bacillus stearothermophilus with plasmid vector pTB 19 | |
Copeland et al. | Identification of conserved genetic functions in Bacillus by use of temperature-sensitive mutants | |
CA1150169A (en) | Broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
JPS62503074A (ja) | 不安定な遺伝性レプリコンの安定化方法 | |
DE69028890T2 (de) | Ergiebige Herstellung von Protease-Mutanten | |
JPS6119491A (ja) | 組換えdnaを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体 | |
IL103811A (en) | DNA sequence encoding betaine utilization, vectors containing it, microorganisms transformed in it and their uses | |
Zou et al. | Characteristics of plasmids in Rhizobium huakuii | |
HU205388B (en) | Process for genetic transformation of plants | |
US4376164A (en) | Process for preparing broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
EP0164117B1 (en) | Amylase-negative, asporogenous mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
JPH04287686A (ja) | 無胞子性菌株バシラス・サチリス sms275 | |
Tichý et al. | Isolation of the pMI 10 plasmid from the α-amylase producing strain of Bacillus subtilis | |
JPH0829083B2 (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
FI75367B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en genetiskt manipulerad mikroorganism innehaollande en foer amylas kodande rekombinant-dna, och ett foerfarande foer framstaellning av amylas. | |
JPH0198475A (ja) | 新規バチルス・ステアロサーモフィルス | |
KOPECKO | MEETING ABSTRACTS | |
CS217313B1 (cs) | Nový bakteriální kmen Bacillus amylolíquefaciens CCM 3502 | |
JPS59175887A (ja) | カナマイシン耐性遺伝子およびプラスミド | |
JPH0771487B2 (ja) | 新規耐熱性β―ガラクトシダーゼ及びその製造法 |