JPS6119491A - 組換えｄｎａを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体 - Google Patents
組換えｄｎａを含む遺伝子工学的に作りだされた枯草菌のカナマイシン突然変異体Info
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- JPS6119491A JPS6119491A JP60120735A JP12073585A JPS6119491A JP S6119491 A JPS6119491 A JP S6119491A JP 60120735 A JP60120735 A JP 60120735A JP 12073585 A JP12073585 A JP 12073585A JP S6119491 A JPS6119491 A JP S6119491A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アミラーゼをう−ドする遺伝子を含む組換え
ＤＮＡ１び該組換えＤＮＡを含む微生物及びアミラーゼ
を作るにおけるこれの使用に関する。
ＤＮＡ１び該組換えＤＮＡを含む微生物及びアミラーゼ
を作るにおけるこれの使用に関する。
ヨーロツノ（特許出願８１５００５．７ａ２において、
バクテリア性供与体微生物から由来するＤＮＡを開裂し
、得たＤＮＡフラグメントを同様に開裂されたベクター
と結合させる（ベクターはプラスミド又はλファージの
誘導体のＤＮＡを含む）インビトロプロセスによシ作ら
れるアミラーゼ暗号遺伝子を含む新規な組換えＤＮＡを
本発明者は記載し、特許請求した。この組換えＤｌｉＡ
は、バクテリア性宿主生物に挿入されることができ、後
者はアミラーゼを作るために培養される。種々のバクテ
リア性供与体及びバクテリア性宿主生物がこのヨーロッ
パ特許出願に記載され、゛また多数の適当なプラスミド
及び２フアージの誘導体も記載される。
バクテリア性供与体微生物から由来するＤＮＡを開裂し
、得たＤＮＡフラグメントを同様に開裂されたベクター
と結合させる（ベクターはプラスミド又はλファージの
誘導体のＤＮＡを含む）インビトロプロセスによシ作ら
れるアミラーゼ暗号遺伝子を含む新規な組換えＤＮＡを
本発明者は記載し、特許請求した。この組換えＤｌｉＡ
は、バクテリア性宿主生物に挿入されることができ、後
者はアミラーゼを作るために培養される。種々のバクテ
リア性供与体及びバクテリア性宿主生物がこのヨーロッ
パ特許出願に記載され、゛また多数の適当なプラスミド
及び２フアージの誘導体も記載される。
微生物中へ遺伝子を導入するためにプラスミドを用いる
ことは、広く行われている手法である。この目的のため
に提案された多数のプラスミドの記述が最近の文献にあ
る。とくに二つの文献１ジーン（Ｇｏｎｏ ） 、
エルセビエルバイオメディカルプレス（Ｋ１５ｅｖｉｅ
ｒ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ ）、１５（１９
８１）、４３−５８、イルカパルバ（工’１ｋｋａ Ｐ
ａ１ｖａ ）ら、及び１９（１９８２）、８１−８７、
イルヵパルバ、は、宿主として枯草菌を用いてダイレク
トショットガンクローニングによシバチルスアミロリク
イファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏ’１ｉ
ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）からα−アミラーゼをコード
する遺伝子を単離することを記述する。４バチルスアミ
ロリクイフアシエンスのゲノムはとくに、制限エンドヌ
クＬ／７−−ＷＭｂＱ工によシ消化され、２〜５ｋｌ）
のフラグメントが単離され、プラスミドｐＵＢ１１０に
結合された。形質転換能力のある（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
）枯草菌アミラーゼ−ネガティブ細胞がハイブリット
フラスミドによ多形質転換され、カナマイシン耐性形質
転換体がα−アミラーゼの生産のためにスクリーンされ
た。
ことは、広く行われている手法である。この目的のため
に提案された多数のプラスミドの記述が最近の文献にあ
る。とくに二つの文献１ジーン（Ｇｏｎｏ ） 、
エルセビエルバイオメディカルプレス（Ｋ１５ｅｖｉｅ
ｒ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ ）、１５（１９
８１）、４３−５８、イルカパルバ（工’１ｋｋａ Ｐ
ａ１ｖａ ）ら、及び１９（１９８２）、８１−８７、
イルヵパルバ、は、宿主として枯草菌を用いてダイレク
トショットガンクローニングによシバチルスアミロリク
イファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏ’１ｉ
ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）からα−アミラーゼをコード
する遺伝子を単離することを記述する。４バチルスアミ
ロリクイフアシエンスのゲノムはとくに、制限エンドヌ
クＬ／７−−ＷＭｂＱ工によシ消化され、２〜５ｋｌ）
のフラグメントが単離され、プラスミドｐＵＢ１１０に
結合された。形質転換能力のある（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
）枯草菌アミラーゼ−ネガティブ細胞がハイブリット
フラスミドによ多形質転換され、カナマイシン耐性形質
転換体がα−アミラーゼの生産のためにスクリーンされ
た。
遺伝子的に操作された微生物を工業的規模で用いること
ｐ問題の一つは、遺伝子工学プロセスで導入された組換
えＤＮＡの安定性である。
ｐ問題の一つは、遺伝子工学プロセスで導入された組換
えＤＮＡの安定性である。
もし安定性が欠けているなら、組換えＤＮＡは微生物の
連続的発生が行われるうちに失われる又は配列再配置を
受ける傾向があり、結局、アミラーゼ暗号遺伝子は子孫
の微生物によ）全く又はほとんど発現されなくなる。
連続的発生が行われるうちに失われる又は配列再配置を
受ける傾向があり、結局、アミラーゼ暗号遺伝子は子孫
の微生物によ）全く又はほとんど発現されなくなる。
さて本発明者は、ヨーロッパ特許用Ｍ８１３００５７＆
２に記載された成るアミラーゼ暗号遺伝子をなかんずく
含み、しかしそこには特に記載されていないプラスミド
から誘導される組換えＤＮＡを開発した。このプラスミ
ドは、ジャーナル オフ バクテリオロジイ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） １９７
Ｂ、Ｖｏｌ、１３４、ｐ’９仝１８−３２９にも記載さ
れたｐＵＢ１１０である。
２に記載された成るアミラーゼ暗号遺伝子をなかんずく
含み、しかしそこには特に記載されていないプラスミド
から誘導される組換えＤＮＡを開発した。このプラスミ
ドは、ジャーナル オフ バクテリオロジイ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） １９７
Ｂ、Ｖｏｌ、１３４、ｐ’９仝１８−３２９にも記載さ
れたｐＵＢ１１０である。
プラスミドｐＵＢ ｔｌｏ １Ｊ 、ヌクレオチジルト
ラ／ ′スフエラーゼ酵素によ多年活性化された
カナマイシン又は類似の抗生物質に対する耐性を暗号す
る遺伝子を含む。本発明者は、このプラスミドから誘導
された組換ＤＮＡ及び成るアミラーゼ暗号遺伝子が宿主
微生物中に導入されうること、及びとくに宿主が枯草菌
である場合に突然変異株が作られ培養されることができ
、これは高められた安定性及び高いコピー数を持つこと
を見い出した。従って、この新規な組換えＤＮＡを含む
突然変異微生物は、アミラーゼの生産のために、及び特
に−大苗（バチルスメガテリウム）のα−アミラーゼ（
特に有用な特性を持つアミラーゼである）の生産のため
に工業ベースで使用できる。
ラ／ ′スフエラーゼ酵素によ多年活性化された
カナマイシン又は類似の抗生物質に対する耐性を暗号す
る遺伝子を含む。本発明者は、このプラスミドから誘導
された組換ＤＮＡ及び成るアミラーゼ暗号遺伝子が宿主
微生物中に導入されうること、及びとくに宿主が枯草菌
である場合に突然変異株が作られ培養されることができ
、これは高められた安定性及び高いコピー数を持つこと
を見い出した。従って、この新規な組換えＤＮＡを含む
突然変異微生物は、アミラーゼの生産のために、及び特
に−大苗（バチルスメガテリウム）のα−アミラーゼ（
特に有用な特性を持つアミラーゼである）の生産のため
に工業ベースで使用できる。
従って本発明は、新規な組成物として、供与、体微生物
から由来するＤＮＡを開裂し、アミラーゼ暗号遺伝子を
含む得たＤＮ春フラグメントを、プラスミドである同°
様に開裂されたベクターと結合するインビトロ法により
作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組換えＤＮＡにお
いて、供与体微生物がバチルスコアグランス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｏｏａｇｕ：Ｌ＆ｎｅ ）、バチルスコアグラ
ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎａ ）、巨
大苗（バチルスメカチリウム）、バチルスセレウス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓＣｅｒθｕＢ）又ｕクレプクエラニュー
モニア 。
から由来するＤＮＡを開裂し、アミラーゼ暗号遺伝子を
含む得たＤＮ春フラグメントを、プラスミドである同°
様に開裂されたベクターと結合するインビトロ法により
作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組換えＤＮＡにお
いて、供与体微生物がバチルスコアグランス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｏｏａｇｕ：Ｌ＆ｎｅ ）、バチルスコアグラ
ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎａ ）、巨
大苗（バチルスメカチリウム）、バチルスセレウス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓＣｅｒθｕＢ）又ｕクレプクエラニュー
モニア 。
（１ｌｅｂｓｉｒｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ：肺
炎桿菌）であり、プラスミ、ドがｐＵＢ１１０であると
ころの組換えＤＮＡを包含する。
炎桿菌）であり、プラスミ、ドがｐＵＢ１１０であると
ころの組換えＤＮＡを包含する。
用いうる特定の供与体微生物としては、肺炎桿菌ＡＴＣ
ＣＮｏ． １５０５０ が挙げられる。他の有用な供
与体生物としては、バチルスコアグランスＮ（！ＩＢ
＆ １１５７１ が挙げられ、この供与体及び開御−
同様にバチルスセレウスＡＴＯＯｌｌｋ＋ ３１１０２
及生物巨大苗ＮＣより ７％ １１５６Ｂ は、
α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼを各々コードする遺
伝子を含み、特に有用な組換えＤＮＡは、α−アミラー
ゼをコードする遺伝子を含む巨大菌ｂｅｌＢＩｌ＆１１
５６８のＤＩＪＡのフラグメントと開裂したベクターｐ
ＵＢ１１０の組合せから生じ、本発明者がｐＡＭＹ １
００ と名付けたものである。開裂したベクターｐＵ
Ｂ１１０とβ−アミラーゼをコードする遺伝子を含むフ
ラグメントからの類似の組換えＤＮＡはｐＡＭＹ ４０
０ と名付けられた６本明細書において巨大苗という
言葉は、とくにベルゲイ（Ｂｅｒｇθｙ）の”マニュア
ル オフデターミネイティブ バクテリオロジイ１ ・
（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）、第８版、Ｒ，Ｅ、ブカ
ナｙ （Ｂｕｃｈａｎａｎ ） 及びＮ、 Ｉｌｉ。
ＣＮｏ． １５０５０ が挙げられる。他の有用な供
与体生物としては、バチルスコアグランスＮ（！ＩＢ
＆ １１５７１ が挙げられ、この供与体及び開御−
同様にバチルスセレウスＡＴＯＯｌｌｋ＋ ３１１０２
及生物巨大苗ＮＣより ７％ １１５６Ｂ は、
α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼを各々コードする遺
伝子を含み、特に有用な組換えＤＮＡは、α−アミラー
ゼをコードする遺伝子を含む巨大菌ｂｅｌＢＩｌ＆１１
５６８のＤＩＪＡのフラグメントと開裂したベクターｐ
ＵＢ１１０の組合せから生じ、本発明者がｐＡＭＹ １
００ と名付けたものである。開裂したベクターｐＵ
Ｂ１１０とβ−アミラーゼをコードする遺伝子を含むフ
ラグメントからの類似の組換えＤＮＡはｐＡＭＹ ４０
０ と名付けられた６本明細書において巨大苗という
言葉は、とくにベルゲイ（Ｂｅｒｇθｙ）の”マニュア
ル オフデターミネイティブ バクテリオロジイ１ ・
（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）、第８版、Ｒ，Ｅ、ブカ
ナｙ （Ｂｕｃｈａｎａｎ ） 及びＮ、 Ｉｌｉ。
ギボンス（Ｇｉｂｂｏｎｓ ）共編、第５３７頁に記載
されるバチルスカロタルム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒ
ｏｔａ−ｒｕｍ ）を含む巨大苗の認められる異名を含
むことを意図されることが指摘されねばならない。
されるバチルスカロタルム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒ
ｏｔａ−ｒｕｍ ）を含む巨大苗の認められる異名を含
むことを意図されることが指摘されねばならない。
本発明に従う組換えＤＮＡの製造は、この明細書で後述
する実施例に記載されるような慣用の周知手法を用いて
行われる。
する実施例に記載されるような慣用の周知手法を用いて
行われる。
工業的使用のために、本発明の組換えＤＮＡは初めに宿
主微生物中に入れられる。宿主は酵母又はバクテリアで
あることができ、後者が好ましい。組換えＤＮＡは、ヨ
ーロッパ特許出願８１３００５７ａ２に記載される宿主
バクテリアの任意のものに入れられることができ、枯草
菌を用いることが好ましい。すなわち、枯草菌れている
後者のアスボロジエニック（非胞子発生的）突然変異体
（以下ではＢＡＳ ８と呼ばれる）である。後者が組換
えＤ Ｎ Ａ ｐＡＭＹ １００ のための宿主であ
る場合、新しい微生物（寄託番号枯草菌Ｎｏ工、Ｂ １
１９８０ ） が得られる（以下ではＢＡＳ ３５
と呼ばれる）。
主微生物中に入れられる。宿主は酵母又はバクテリアで
あることができ、後者が好ましい。組換えＤＮＡは、ヨ
ーロッパ特許出願８１３００５７ａ２に記載される宿主
バクテリアの任意のものに入れられることができ、枯草
菌を用いることが好ましい。すなわち、枯草菌れている
後者のアスボロジエニック（非胞子発生的）突然変異体
（以下ではＢＡＳ ８と呼ばれる）である。後者が組換
えＤ Ｎ Ａ ｐＡＭＹ １００ のための宿主であ
る場合、新しい微生物（寄託番号枯草菌Ｎｏ工、Ｂ １
１９８０ ） が得られる（以下ではＢＡＳ ３５
と呼ばれる）。
改善された安定性及び高コピー数を得るために、下記の
手法を用いて、これら望ましい特性が高められている生
物を与えるように突然変異するためにＲＡＳ ３５
を生じさせることができることが見い出された。ＢＡＨ
３５は初めに、ヌク □レオチジルトランスフエ
ラーゼ酵゛素によ゛シネ活性化されうる２５０−μｆ／
−のカナマイシン又は類似の抗生物質を含む栄養培養基
上で生育される。いくつかのコロニーはこの培養基で生
育でき、他のものは生育できず、前者がよシ高いカナマ
イシン耐性を持つ。この培養基で生育する能力を持つコ
ロニーが選択され、次に別途に培養される。選択された
株はＢＡＨ５５の突然変異体であることが判シ、枯草菌
Ｎ０ＩＢ １１９８４ として寄託された（以下では
ＢＡ８７２ と呼ぶ）。
手法を用いて、これら望ましい特性が高められている生
物を与えるように突然変異するためにＲＡＳ ３５
を生じさせることができることが見い出された。ＢＡＨ
３５は初めに、ヌク □レオチジルトランスフエ
ラーゼ酵゛素によ゛シネ活性化されうる２５０−μｆ／
−のカナマイシン又は類似の抗生物質を含む栄養培養基
上で生育される。いくつかのコロニーはこの培養基で生
育でき、他のものは生育できず、前者がよシ高いカナマ
イシン耐性を持つ。この培養基で生育する能力を持つコ
ロニーが選択され、次に別途に培養される。選択された
株はＢＡＨ５５の突然変異体であることが判シ、枯草菌
Ｎ０ＩＢ １１９８４ として寄託された（以下では
ＢＡ８７２ と呼ぶ）。
しかしもしこの新しい突然変異株が１−当９７５０μｆ
のカナマイシンを含む栄養培養基にことで移されると、
この培養基中で生育でき従って７５０μｆ／−のカナマ
イシン濃度に抵抗するよう適応された突然変異体の選択
が更に行われうる。この突然変異体が選ばれ、別途に生
育され、枯草菌Ｎ０ＴＥ １１９８５ として寄託さ
れた（以下ではＢＡＨ７５と呼ばれる）。突然変異株Ｂ
ＡＢ ７２ 彫 ＢＡＲ７３の両者は、カナマイシン
耐性を持つ他に、高められた安定性及び増加されたコピ
ー数１を示す。すなわちＢＡＨ５５のコピー数は約１５
であｆｉ、ＢＡ８７２ のそれは少くとも２５、ＢＡ
８７３ のそれは少くとも３５である。
のカナマイシンを含む栄養培養基にことで移されると、
この培養基中で生育でき従って７５０μｆ／−のカナマ
イシン濃度に抵抗するよう適応された突然変異体の選択
が更に行われうる。この突然変異体が選ばれ、別途に生
育され、枯草菌Ｎ０ＴＥ １１９８５ として寄託さ
れた（以下ではＢＡＨ７５と呼ばれる）。突然変異株Ｂ
ＡＢ ７２ 彫 ＢＡＲ７３の両者は、カナマイシン
耐性を持つ他に、高められた安定性及び増加されたコピ
ー数１を示す。すなわちＢＡＨ５５のコピー数は約１５
であｆｉ、ＢＡ８７２ のそれは少くとも２５、ＢＡ
８７３ のそれは少くとも３５である。
この手順は、た゛とえば５ Ｑ ００ ｐｔ／ｍｔｐで
のよシ高い濃度の抗生物質に対してさえ抵抗し、従 ・
つてよシ高いコピー数をもつ突然変異株を作るために用
いうる。
のよシ高い濃度の抗生物質に対してさえ抵抗し、従 ・
つてよシ高いコピー数をもつ突然変異株を作るために用
いうる。
安定性及び高いプラスミドコピー数ヲ持つのに適してい
る。なぜなら、この両者はこのアミラーゼをコードする
遺伝子を含む組換えＤＮＡｐＡＭＹ １００ を含む
からである。同様にＢＡＳ ８又は枯草菌ＢＧＥＩＯｌ
Ａ２８９ から出発して、その中でアミラーゼをコー
ドする遺伝子が他の供与体から誘導されたところの本発
明の組換えＤＮＡを導入することができる。たとえば本
発明者は、枯草菌ＮＣＩＢ １１９８１ （以下では
ＢＡｓ５６ と呼ぶ）、枯草菌ＮＣＩＢ１１９８２（
以下ではＢＡＳ ５７ と呼ぶ）及び枯草菌ＮＣＩＢ
１１９８３（以下ではＢＡＳ ５Ｂ と呼ぶ）として
各々寄託された新しい微生物を与えるために１組換えＤ
Ｎ Ａ ｐＡＭＹ ２０ｏ、 ｐＡＭＹ３００及びｐ
ＡＭＹ ４００をＢＡＳ Ｂ に導入した。これら三
つの株は、増大された安定性及び高いコピー数を持つカ
ナマイシン耐・性突然変異体を与えるために、類似のＢ
）、８３５について記述した方法により突然変異されう
る。 。
る。なぜなら、この両者はこのアミラーゼをコードする
遺伝子を含む組換えＤＮＡｐＡＭＹ １００ を含む
からである。同様にＢＡＳ ８又は枯草菌ＢＧＥＩＯｌ
Ａ２８９ から出発して、その中でアミラーゼをコー
ドする遺伝子が他の供与体から誘導されたところの本発
明の組換えＤＮＡを導入することができる。たとえば本
発明者は、枯草菌ＮＣＩＢ １１９８１ （以下では
ＢＡｓ５６ と呼ぶ）、枯草菌ＮＣＩＢ１１９８２（
以下ではＢＡＳ ５７ と呼ぶ）及び枯草菌ＮＣＩＢ
１１９８３（以下ではＢＡＳ ５Ｂ と呼ぶ）として
各々寄託された新しい微生物を与えるために１組換えＤ
Ｎ Ａ ｐＡＭＹ ２０ｏ、 ｐＡＭＹ３００及びｐ
ＡＭＹ ４００をＢＡＳ Ｂ に導入した。これら三
つの株は、増大された安定性及び高いコピー数を持つカ
ナマイシン耐・性突然変異体を与えるために、類似のＢ
）、８３５について記述した方法により突然変異されう
る。 。
高コピー数突然変異株を工業的使用のためによシ安定に
するために、各微生物に含まれる組換えＤＮＡからカナ
マイシン耐性をコードする遺伝子を除去することが好ま
しい。これは、公知の遺伝子工学手法、たとえば組換え
ＤＮＡが微生物から除かれ、インビトロで開裂され、そ
してそれからカナマイシン耐性をコードする遺伝子が制
限エンドヌクレアーゼにより除去され宿主たとえばＢＡ
Ｓ ８又は“治ゆされた”形のＢＡＲ７２又はＢＡＳ
７３中に再挿入される。
するために、各微生物に含まれる組換えＤＮＡからカナ
マイシン耐性をコードする遺伝子を除去することが好ま
しい。これは、公知の遺伝子工学手法、たとえば組換え
ＤＮＡが微生物から除かれ、インビトロで開裂され、そ
してそれからカナマイシン耐性をコードする遺伝子が制
限エンドヌクレアーゼにより除去され宿主たとえばＢＡ
Ｓ ８又は“治ゆされた”形のＢＡＲ７２又はＢＡＳ
７３中に再挿入される。
本発明の組換えＤＮＡを含む微生物は種々のアミラーゼ
を作るように加工されうるが、それらは特に、本発明者
の英国特許出願−ａ４１４２ｙｚで記述したように多糖
類たとえば澱粉の転化及び部分的澱粉加水分解を触媒す
る活性を持つ酵素である巨大筒ＮＣより ｆｆｉ １ｊ
５６８ のα−アミラーゼを作るために特に有用であ
る。
を作るように加工されうるが、それらは特に、本発明者
の英国特許出願−ａ４１４２ｙｚで記述したように多糖
類たとえば澱粉の転化及び部分的澱粉加水分解を触媒す
る活性を持つ酵素である巨大筒ＮＣより ｆｆｉ １ｊ
５６８ のα−アミラーゼを作るために特に有用であ
る。
本発明を下記の実施例によシ更に説明する。
そこでは下記の寄託された株及びプラスミドが用いられ
た。
た。
枯草菌ＢＧＳＯｌＡ２８９
この生物は、α−アミラーゼをコードする遺伝子におい
て欠陥のある突然変異体である。それは、オハイオ州立
大学のバチルス遺伝子貯蔵センターから得られた。
て欠陥のある突然変異体である。それは、オハイオ州立
大学のバチルス遺伝子貯蔵センターから得られた。
ＵＢ１１０
前述した通りである。
１）ＡＭＹｌ（寄託番号ＮＣＩＢ １１５７０ とし
て大腸菌に入れられた） 巨大筒Ｎ０ＩＩＢ １１５６８ のα−アミラーゼ暗
号遺伝子を持つ２．２ ｋｂ Ｈｌｎｄ ＴＪｉ挿入物
を有する大腸菌プラスミドｐＢＲ，！＋２２の誘導体。
て大腸菌に入れられた） 巨大筒Ｎ０ＩＩＢ １１５６８ のα−アミラーゼ暗
号遺伝子を持つ２．２ ｋｂ Ｈｌｎｄ ＴＪｉ挿入物
を有する大腸菌プラスミドｐＢＲ，！＋２２の誘導体。
このプラスミ ０ドはヨーロッパ特許出願８１５０
０５７ａ２に記載されている。
０５７ａ２に記載されている。
ＲＡＭＹ２（寄託番号Ｎ０１Ｂ １１５７５ として
大腸菌に入れられた） バチルスコアグランスＮＣより １１５７１ のα−
アミラーゼ暗号遺伝子を持つｌ ３ ｋｂ ｌｃｏ、Ｒ
Ｉ 挿入物を有する大腸菌プラスミドｐＢＲ５２２の
誘導体。
大腸菌に入れられた） バチルスコアグランスＮＣより １１５７１ のα−
アミラーゼ暗号遺伝子を持つｌ ３ ｋｂ ｌｃｏ、Ｒ
Ｉ 挿入物を有する大腸菌プラスミドｐＢＲ５２２の
誘導体。
このプラスミドはヨーロッパ特許出願８１５００５７ａ
２に記載されている。
２に記載されている。
ｐＡＭｙ′５（寄託番号ＮＣＩＢ １１６０２ とし
て大腸菌に入れられた） バチルスセレウスＡＴＣ！０３１１０２ のβ−アミ
ラーゼ暗号遺伝子を持つ＆ ２ ｋｔ）ｉｃ＠、ＲＩ挿
入物を有する大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２の誘導体。
て大腸菌に入れられた） バチルスセレウスＡＴＣ！０３１１０２ のβ−アミ
ラーゼ暗号遺伝子を持つ＆ ２ ｋｔ）ｉｃ＠、ＲＩ挿
入物を有する大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２の誘導体。
このプラスミドはヨーロッパ特許出願８１３００５７ａ
２に記載されている。
２に記載されている。
実施例１
ｐＡＭＹｌｏＯ： ｐＵＢ １１０ から由来し、巨
大５菌ＮＣＩＢ １１５６Ｂ のα−アミラーゼをコ
ードするＤ Ｎ、 Ａセグメントを有する組換えプラス
ミド（プラスミド地図は第１図参照） 供与体ＤＮＡはｐＡＭＹ １ であり、インビトロ組
換えが、１ ｐｆのｐＡＭＹ Ｉ ＤＮＡとＥ（Ｄ、、
Ｒ工制限ニージョン）は、コンカテマーを作るためにＴ
４ＤＩムリガーゼの１単位の存在下で高濃度（７５μｔ
ＤＮＡ ／、１ ） で行われた。
大５菌ＮＣＩＢ １１５６Ｂ のα−アミラーゼをコ
ードするＤ Ｎ、 Ａセグメントを有する組換えプラス
ミド（プラスミド地図は第１図参照） 供与体ＤＮＡはｐＡＭＹ １ であり、インビトロ組
換えが、１ ｐｆのｐＡＭＹ Ｉ ＤＮＡとＥ（Ｄ、、
Ｒ工制限ニージョン）は、コンカテマーを作るためにＴ
４ＤＩムリガーゼの１単位の存在下で高濃度（７５μｔ
ＤＮＡ ／、１ ） で行われた。
得られた生成物は、クロウニス（０１ｏｖｒｅｓ ）と
ハイス（Ｈｌｇ”ｅｓ ） Ｗａｓエクスペリメンツイ
ンマイクロバイアル ジエネテイツクス（Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ）、ブラックウニＡ／ （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
）、１９６８、に記載される手順によｌ ＢＧ８０１Ａ
２８９ を形質転換するために用いられた。カナマイ
シン耐性でアミラーゼを産出するクローンが、１０μｆ
／ｌのカナマイシン及び１％澱粉を与えられたＬＢ培養
基中で同定された。アミラーゼを産出するクローンは、
ヨーロッパ特許出願８１３００５７ａ２、第２０頁、段
落Ｂに記載される手法によりョウ素蒸気で同定される。
ハイス（Ｈｌｇ”ｅｓ ） Ｗａｓエクスペリメンツイ
ンマイクロバイアル ジエネテイツクス（Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ）、ブラックウニＡ／ （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
）、１９６８、に記載される手順によｌ ＢＧ８０１Ａ
２８９ を形質転換するために用いられた。カナマイ
シン耐性でアミラーゼを産出するクローンが、１０μｆ
／ｌのカナマイシン及び１％澱粉を与えられたＬＢ培養
基中で同定された。アミラーゼを産出するクローンは、
ヨーロッパ特許出願８１３００５７ａ２、第２０頁、段
落Ｂに記載される手法によりョウ素蒸気で同定される。
陽性クローンから、ｐＡＭＹ １００ 、 全ｐＵＢ
１１０を保持するプラスミド、ＡＭＹフラグメント、及
びＡＭＹフラグメントをフランク（ｆｌａｎｋ ）する
Ｈｌｎｄ ｌ［部位により制限されたｐＢＲ５２２の僅
か少さな部分を有するクローンが選択された。
１１０を保持するプラスミド、ＡＭＹフラグメント、及
びＡＭＹフラグメントをフランク（ｆｌａｎｋ ）する
Ｈｌｎｄ ｌ［部位により制限されたｐＢＲ５２２の僅
か少さな部分を有するクローンが選択された。
次にｐＡＭＹ １００ Ｄ Ｎ Ａがこの株から抽出
され、実施例５に記載するようにＢＡＳ ８を形質転換
するために用いられた。
され、実施例５に記載するようにＢＡＳ ８を形質転換
するために用いられた。
実施例２
ｐＡＭＹ ２００ ： ｐＵＢ １１０から由来し、
バチルスコアグランスＮＣＩＢ １１５７１ のα−
アミラーゼをコードするＤＮＡセグメントを有する組換
えプラスミド（プラスミド地図は第２図参照）。′実施
例１記載の手法によｌ） ｐＡＭＹ ２ Ｄ ＮＡと
ｐＵＢ １１０ Ｄ Ｎ Ａの間でイソビトロ組換えが
行われた。ｐＡＭＹ ２００ が、ｐＵＢ１１０の１
ｃ！Ｑ、Ｒ工部忙中の五３゜ｋｂ 挿入物として得られ
た。このプラスミド（７，８ｋｂ） は、実施例８記
載のようにＢＡＳ Ｂを形質転換するために用いられた
。
バチルスコアグランスＮＣＩＢ １１５７１ のα−
アミラーゼをコードするＤＮＡセグメントを有する組換
えプラスミド（プラスミド地図は第２図参照）。′実施
例１記載の手法によｌ） ｐＡＭＹ ２ Ｄ ＮＡと
ｐＵＢ １１０ Ｄ Ｎ Ａの間でイソビトロ組換えが
行われた。ｐＡＭＹ ２００ が、ｐＵＢ１１０の１
ｃ！Ｑ、Ｒ工部忙中の五３゜ｋｂ 挿入物として得られ
た。このプラスミド（７，８ｋｂ） は、実施例８記
載のようにＢＡＳ Ｂを形質転換するために用いられた
。
実施例３
ｐＡＭＹ ５００ ： ｐＵＢ １１０から由来し、
バチルスセレウスＡＴＯＯ３１１０２のβ−アミラーゼ
遺伝子をコードするＤＮＡセグメントを有する組換えプ
ラスミド（プラスミド地図は第３図参照）。
バチルスセレウスＡＴＯＯ３１１０２のβ−アミラーゼ
遺伝子をコードするＤＮＡセグメントを有する組換えプ
ラスミド（プラスミド地図は第３図参照）。
供与体はｐＡＭＹ ３ であり、組換えは実施例１記
載の手法で行われた。ｐＡＭＹ ３００ が、ｐＵＢ
１１０のｌＩＣＣ０，Ｒ工部忙中のＡ ２ ｋｂ挿入物
として得られた。このプラスミドは実施例９記載のよう
にＢＡＳ８を形質転換するために用いられた。
載の手法で行われた。ｐＡＭＹ ３００ が、ｐＵＢ
１１０のｌＩＣＣ０，Ｒ工部忙中のＡ ２ ｋｂ挿入物
として得られた。このプラスミドは実施例９記載のよう
にＢＡＳ８を形質転換するために用いられた。
実施例４
枯草菌ＢＧＳＣ１Ａ ２８９のアスボロジエナス（非胞
子的）未然変異体、枯草菌ＢＡＳ８の調製ＢＧ８ＣＩＡ
２８９の一夜培養物のサンプルにＵＶ光を放射し、下
記の培養基を連続的継代培養でイノキュレートするため
に用いた。
子的）未然変異体、枯草菌ＢＡＳ８の調製ＢＧ８ＣＩＡ
２８９の一夜培養物のサンプルにＵＶ光を放射し、下
記の培養基を連続的継代培養でイノキュレートするため
に用いた。
ディ７コ（ＤｌｆＣＯ）酵母抽出物 １２Ｍ ｇ
Ｓ ０４・７ＨＩＯ２００１ＨｉＦｅ８０４ ・７Ｈ２
０１０Ｗ ＭｎＳＯ４＠Ｈ１０７’？ ０ａＯ−４＠２Ｂ１０ ．７３４
ｐｏ４緩衝液ｐＨ７，００，０６７Ｍ グルタミン酸塩 ０．１Ｍメチオニン
４０１１９芳香族アミノ酸
４０キ Ｈ！０１Ｌ この培養基は、ベルゲレ（Ｂｅｒｇｅｒｅ ）及びヘル
ミエル（Ｈｅｒｍｉθｒ）によシ胞子形成誘発培養基と
して記載されている（ Ａｎｎ、工ｎｅｔ＋ ｐａｓｔ
ｅｕｒ１０６、２１４．２３５１９６４ ）。このよ、
うな培養基における連続的継代培養は、栄養細胞（胞子
゛形成できない）対胞子（増殖できる前に最初に発芽し
なければならない）に対して選択の利点を与は、６回の
継代培養後に単離された。
Ｓ ０４・７ＨＩＯ２００１ＨｉＦｅ８０４ ・７Ｈ２
０１０Ｗ ＭｎＳＯ４＠Ｈ１０７’？ ０ａＯ−４＠２Ｂ１０ ．７３４
ｐｏ４緩衝液ｐＨ７，００，０６７Ｍ グルタミン酸塩 ０．１Ｍメチオニン
４０１１９芳香族アミノ酸
４０キ Ｈ！０１Ｌ この培養基は、ベルゲレ（Ｂｅｒｇｅｒｅ ）及びヘル
ミエル（Ｈｅｒｍｉθｒ）によシ胞子形成誘発培養基と
して記載されている（ Ａｎｎ、工ｎｅｔ＋ ｐａｓｔ
ｅｕｒ１０６、２１４．２３５１９６４ ）。このよ、
うな培養基における連続的継代培養は、栄養細胞（胞子
゛形成できない）対胞子（増殖できる前に最初に発芽し
なければならない）に対して選択の利点を与は、６回の
継代培養後に単離された。
枯草菌ＢＧＳ０１Ａ ２８９について報告された遺伝ｌ
マーカーは下記のものである。
マーカーは下記のものである。
ａｍｙ−Ｋ ： ａ−アミラーゼの不存在を結果する、
枯草菌のα−アミラーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 ａｒｏ Ｉ ９０６ ： 芳香族アミノ酸（フェニルア
ラニン、チロシン、及びトリプトファン） に対する要求（栄養要求性）を結果す る、シキメートキナーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 ｍθｔＢ５：メチオニンに対する要求を結果する、メチ
オニン生合成経路の酵素の１つを コードする構造遺伝子における突然変 異 θａｏ Ａ ３２１ ：蔗糖異化に関係する酵素をコー
ドする構造遺伝子における突然変異であ 、シ、蔗糖を異化することの不能を結果する 紫外線処理の効果は、胞子形成の不能を結果する未知遺
伝子における突然変異を作ることであった。突然変異体
ＢＡＳ ８は、前述した胞子形成培養基中で１０７のバ
クテリア当シ１未満の胞子を作シ、一方、枯草菌ＢＧ８
０１Ａ ２８９は同じ条件下で２つのバクテリア当シ１
つの胞子を作る。突然変異物枯草菌ＢＡＳ ８は、遺伝
ｌマーカ−ａｐｏ−８を含むが、しかず同時に突然変°
異過程でマーカーａｒｏ工９０６及びｓａ、ｃ Ａ ３
２１を失った。
枯草菌のα−アミラーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 ａｒｏ Ｉ ９０６ ： 芳香族アミノ酸（フェニルア
ラニン、チロシン、及びトリプトファン） に対する要求（栄養要求性）を結果す る、シキメートキナーゼをコードする 構造遺伝子における突然変異 ｍθｔＢ５：メチオニンに対する要求を結果する、メチ
オニン生合成経路の酵素の１つを コードする構造遺伝子における突然変 異 θａｏ Ａ ３２１ ：蔗糖異化に関係する酵素をコー
ドする構造遺伝子における突然変異であ 、シ、蔗糖を異化することの不能を結果する 紫外線処理の効果は、胞子形成の不能を結果する未知遺
伝子における突然変異を作ることであった。突然変異体
ＢＡＳ ８は、前述した胞子形成培養基中で１０７のバ
クテリア当シ１未満の胞子を作シ、一方、枯草菌ＢＧ８
０１Ａ ２８９は同じ条件下で２つのバクテリア当シ１
つの胞子を作る。突然変異物枯草菌ＢＡＳ ８は、遺伝
ｌマーカ−ａｐｏ−８を含むが、しかず同時に突然変°
異過程でマーカーａｒｏ工９０６及びｓａ、ｃ Ａ ３
２１を失った。
実施例５
組換えＤ Ｎ Ａ ｐＡＭＹ １００ を含むＢＡｓ
３５ ｏｖａ製 実施例１及び前述のエクスベリメンツ インマイクロバ
イアルジェネテックス記載の方法によ＃）ＢＡＳ ８を
形質変換するためＫ ｐＡＭＹ １００ を用いた。
３５ ｏｖａ製 実施例１及び前述のエクスベリメンツ インマイクロバ
イアルジェネテックス記載の方法によ＃）ＢＡＳ ８を
形質変換するためＫ ｐＡＭＹ １００ を用いた。
ＢＡＨ５５（Ｄ ７’ ラｘミド安定性は、プラスミド
ｐＵＢ１１０がそれに対する耐性を与えるところの抗生
物質カナマイシンなしで完全培養基（ディフコ トリプ
トン１％；ディフコ酵素抽出物１％、Ｍａｌ：！ｔ α
５％）中で３７℃で連続的継代培養することによシ測定
された。
ｐＵＢ１１０がそれに対する耐性を与えるところの抗生
物質カナマイシンなしで完全培養基（ディフコ トリプ
トン１％；ディフコ酵素抽出物１％、Ｍａｌ：！ｔ α
５％）中で３７℃で連続的継代培養することによシ測定
された。
最初の継代培養は、２０ｐ１／ｌ１ｇのカナマイシンの
存在下で生育した一夜培養物のサンプルでイノキュレー
トされた。各継代培養について、発生の数を測定するた
めに、イノキュレーフヨン及び生長の直後に肉眼カウン
トを用いた。
存在下で生育した一夜培養物のサンプルでイノキュレー
トされた。各継代培養について、発生の数を測定するた
めに、イノキュレーフヨン及び生長の直後に肉眼カウン
トを用いた。
５７℃の完全培養基における指数増殖期におけるＢＡＳ
３５ ０発生時間Ｉ／′ｉ、３０分間である。
３５ ０発生時間Ｉ／′ｉ、３０分間である。
各継代培養の後に、アミラーゼ陽性クローン（プラスミ
ドを保持している）のバーセントヲＩＩＪ定した。結果
は下記の通シであった。
ドを保持している）のバーセントヲＩＩＪ定した。結果
は下記の通シであった。
世代数 ＡＤ１７ のクローンの係２９
９０．７ ３５ ５＆７４６
１４．４ ５ｉ５ ４．９実施例６ ＥＡＳ ５５ の突然変異体、ＢＡＳ ７２ の調
製（これは増大されたカナマイシン耐性及びプラスミド
安定性をコードする未知遺伝子における突然変異を含む
） 約３０μｆ／ｄの最大濃度のカナマイシンに対する耐性
を与えるグラスミドｐＡＭＹ １００を含むＥＡＳ ３
５ が、完全培養基において一夜生育された。突然変
異原処理なしでＱ、１−のサンプルを、完全培養基を含
みかつ２５０μＶ／−のカナマイシンを補われたプレー
ト上に広げた。３７℃で２ＥＪｆ）イ：ｙキュペークヨ
ンの後に、この濃度のカナマイシンに耐性のクローンが
イ／キュベートされたＢＡＨ５５細胞当り１０−６の確
率で生じた。ＢＡ８７２ と名付けられた一つのクロ
ーンが耐性クローンから選ばれ、増大された耐性をカナ
マイシン表現型に与える突然変異は１ｒｋ−７２と名付
けられた。この表現型は、抗生物質の不存在下での数回
の継代培養後にその安定性を維持した。３７℃での完全
培養における指数増殖期のＢＡＨ７２の発生時間は６０
分間である。
９０．７ ３５ ５＆７４６
１４．４ ５ｉ５ ４．９実施例６ ＥＡＳ ５５ の突然変異体、ＢＡＳ ７２ の調
製（これは増大されたカナマイシン耐性及びプラスミド
安定性をコードする未知遺伝子における突然変異を含む
） 約３０μｆ／ｄの最大濃度のカナマイシンに対する耐性
を与えるグラスミドｐＡＭＹ １００を含むＥＡＳ ３
５ が、完全培養基において一夜生育された。突然変
異原処理なしでＱ、１−のサンプルを、完全培養基を含
みかつ２５０μＶ／−のカナマイシンを補われたプレー
ト上に広げた。３７℃で２ＥＪｆ）イ：ｙキュペークヨ
ンの後に、この濃度のカナマイシンに耐性のクローンが
イ／キュベートされたＢＡＨ５５細胞当り１０−６の確
率で生じた。ＢＡ８７２ と名付けられた一つのクロ
ーンが耐性クローンから選ばれ、増大された耐性をカナ
マイシン表現型に与える突然変異は１ｒｋ−７２と名付
けられた。この表現型は、抗生物質の不存在下での数回
の継代培養後にその安定性を維持した。３７℃での完全
培養における指数増殖期のＢＡＨ７２の発生時間は６０
分間である。
ＢＡＨ７２中でのｐＡＭＹ １０Ｇ の安定性安定性
はＢＡＳ ３５ の場合のように測定された。
はＢＡＳ ３５ の場合のように測定された。
結果は下記の通りである。ｐＡＭＹ １００ は、Ｂ
ＡＧ３５ におけるよりもＢＡＨ７２中では”るかに
よ多安定であることは明らかである。
ＡＧ３５ におけるよりもＢＡＨ７２中では”るかに
よ多安定であることは明らかである。
世代数 Ａｎｙ クローンの係実施例７
先の実施例におけるよシも高いカナマイシン耐性を与え
る未知遺伝子の突然変異を含むＢＡＳ７３ の調製 ＲＡＳ ７２ （２５０ｐｉ／ｖｔ濃度のカナマイ’
／７に耐性である）の完全培養基中での一夜培養物の０
．１−のサンプルを、７５０ ｐｆｌ／艷のカナマイシ
ンを補われた完全培養基を含むプレート上に広げた。こ
の濃度の抗生物質に自発的耐性のクローンが、プレート
された細胞当シ１０−６の確率で生じた。そのようなり
ローフの一つを精製し、ＢＡＨ７Ｂ と名付けた。７
ｓ ｏ ｐｔ、／−のカナマイシンに対するその耐性
は、抗生物質不存在での数回の継代培養後に安定に維持
された。
る未知遺伝子の突然変異を含むＢＡＳ７３ の調製 ＲＡＳ ７２ （２５０ｐｉ／ｖｔ濃度のカナマイ’
／７に耐性である）の完全培養基中での一夜培養物の０
．１−のサンプルを、７５０ ｐｆｌ／艷のカナマイシ
ンを補われた完全培養基を含むプレート上に広げた。こ
の濃度の抗生物質に自発的耐性のクローンが、プレート
された細胞当シ１０−６の確率で生じた。そのようなり
ローフの一つを精製し、ＢＡＨ７Ｂ と名付けた。７
ｓ ｏ ｐｔ、／−のカナマイシンに対するその耐性
は、抗生物質不存在での数回の継代培養後に安定に維持
された。
５７℃での完全培養基中での指数増殖期におけるＲＡＳ
７５ ０発生時間は６０分間である。
７５ ０発生時間は６０分間である。
ＢＡＳ ７５ 中でのｐＡＭＹ １”ＯＯの安定性プ
ラスミド安定性がＲＡＳ ３５ の場合のように測定
され、結果を下記に示す。ｐＡＮＹ １００ は、Ｂ
ＡＳ ３５ におけるよシもＢＡＳ ７５ におい
てはるかに安定であることは明らかである。
ラスミド安定性がＲＡＳ ３５ の場合のように測定
され、結果を下記に示す。ｐＡＮＹ １００ は、Ｂ
ＡＳ ３５ におけるよシもＢＡＳ ７５ におい
てはるかに安定であることは明らかである。
世代数 Ａｍｙ クローンの係実施例８
組換えＤ Ｎ Ａ ｐＡＭＹ ２００を含むＢＡＳ
５６の調製 実施例１で述べられ、前述めエクスペリメｙツ イン
マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される方法に
よｆｉ ＢＡＳ ８を形質転換するためにｐＡＭＹ ２
００ Ｄ Ｍ Ａが用いられた。
５６の調製 実施例１で述べられ、前述めエクスペリメｙツ イン
マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される方法に
よｆｉ ＢＡＳ ８を形質転換するためにｐＡＭＹ ２
００ Ｄ Ｍ Ａが用いられた。
ＢＡＨ５５におけるｐＡＭＹ １００ の場合と同じ
方法で、プラスミド安定性を測定した。結果を゛下記に
示す。
方法で、プラスミド安定性を測定した。結果を゛下記に
示す。
世代数 Ａｍ７クローンの僑
２０ １７．６５６
５．８．５２
０．４ 実施例９ − 組換えＤ Ｎ Ａ ｐＡＭＹ ３００を含むＢＡＳ
３７ の調製 イン マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される
方法によｆｉ ＢＡＳ ８を形質転換するためにｐＡＭ
Ｙ ５００ Ｄ Ｎ Ａが用いられた。
５．８．５２
０．４ 実施例９ − 組換えＤ Ｎ Ａ ｐＡＭＹ ３００を含むＢＡＳ
３７ の調製 イン マイクロバイアル ジエネテイクスに記載される
方法によｆｉ ＢＡＳ ８を形質転換するためにｐＡＭ
Ｙ ５００ Ｄ Ｎ Ａが用いられた。
２ρＱ
ＢＡＳ ５５ におけるｐＡＭＹ Ｊｒ４３−ｆｋ
の場合と同じ方法で、プラスミド安定性を測定した。結
果を下 Ｐ記に示す。
の場合と同じ方法で、プラスミド安定性を測定した。結
果を下 Ｐ記に示す。
世代数 Ａｍｙ クローンの係２６
１ ＤＯ実施例１０ ｐＡＭＹ ４００ ： ｐＵＢ １１０から由来し、
巨大苗ＮＣＩＢ１１５６８のβ−アミラーゼ遺伝子を コードするＤＮＡセグメ／トを有 する組換えプラスミド（プラスミ ド地図は第４図参照） 巨大苗ＮＣＩＢ １１５６８ のβ−アミラーゼをコ
ードする遺伝子は最初に、新しい組換プラスミド１）Ａ
ＭＹ ４ （ＮＣＩＢ １１９８６として大腸菌ＨＢ１
０１ 中で寄託）を作るために、大腸菌プラスミドｐ
ＢＲ３２２中で継代培養される前に７７−ジλによって
大腸菌中でクローニングされた。プラスミドｐＡＭＹ
４ は次に、β−アミラーゼ暗号遺伝子をｐＵＢ１１
０中に導入するために用いられた。手順を下記に示す。
１ ＤＯ実施例１０ ｐＡＭＹ ４００ ： ｐＵＢ １１０から由来し、
巨大苗ＮＣＩＢ１１５６８のβ−アミラーゼ遺伝子を コードするＤＮＡセグメ／トを有 する組換えプラスミド（プラスミ ド地図は第４図参照） 巨大苗ＮＣＩＢ １１５６８ のβ−アミラーゼをコ
ードする遺伝子は最初に、新しい組換プラスミド１）Ａ
ＭＹ ４ （ＮＣＩＢ １１９８６として大腸菌ＨＢ１
０１ 中で寄託）を作るために、大腸菌プラスミドｐ
ＢＲ３２２中で継代培養される前に７７−ジλによって
大腸菌中でクローニングされた。プラスミドｐＡＭＹ
４ は次に、β−アミラーゼ暗号遺伝子をｐＵＢ１１
０中に導入するために用いられた。手順を下記に示す。
ファージλにおける巨大苗Ｎ０ＩＢ １１５６Ｂ の
ＤＮＡのクローンユング ２μｆの巨大菌Ｎ市Ｂ １１５６Ｂ 全Ｄ″ＭＡを、１
０単位の制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄ ｍ で３
７℃で２時間開裂した。め１μＶのファージλＮＭ Ｓ
９０ が同時に、同じ酵素により切断された。二つの
消化されたＤＮＡが混合され、ＤＮＡフラグメントの粘
着末端のアニーリング及び共有結合を許すために１単位
のＴ４Ｄ１’ｌＡ ＋）ガーゼ口のキャプシド封入（
ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ’） ［１６１製物に加
えられ、キャプシド封入されたＤＮＡは感染のために大
腸菌ＨＢ１０１ 細胞でインキュベートされ、形成さ
れたプラークの鹸粉寒天培養基７０％上の広がった物は
組換え分子を含む。プレートをヨウ素蒸気に曝した後に
、白いエリアで囲まれたプラークは、８００の組換えプ
ラク上で１の確率で見い出されたニ一つが取上げられ、
λＮＭ ９５０βａｍｙｌと呼ばれる。そのＤＮＡ制限
後に、５ ｋｂ Ｈ１ｎｄ１１フラグメントの挿入が観
察され喪。
ＤＮＡのクローンユング ２μｆの巨大菌Ｎ市Ｂ １１５６Ｂ 全Ｄ″ＭＡを、１
０単位の制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄ ｍ で３
７℃で２時間開裂した。め１μＶのファージλＮＭ Ｓ
９０ が同時に、同じ酵素により切断された。二つの
消化されたＤＮＡが混合され、ＤＮＡフラグメントの粘
着末端のアニーリング及び共有結合を許すために１単位
のＴ４Ｄ１’ｌＡ ＋）ガーゼ口のキャプシド封入（
ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ’） ［１６１製物に加
えられ、キャプシド封入されたＤＮＡは感染のために大
腸菌ＨＢ１０１ 細胞でインキュベートされ、形成さ
れたプラークの鹸粉寒天培養基７０％上の広がった物は
組換え分子を含む。プレートをヨウ素蒸気に曝した後に
、白いエリアで囲まれたプラークは、８００の組換えプ
ラク上で１の確率で見い出されたニ一つが取上げられ、
λＮＭ ９５０βａｍｙｌと呼ばれる。そのＤＮＡ制限
後に、５ ｋｂ Ｈ１ｎｄ１１フラグメントの挿入が観
察され喪。
゛ 大腸菌ｐＢ１３２２プラスミド中のβ−アミラー
ゼ遺伝子のサブクローニング １ ｐｆのλＮＭ ５９０βａｍｙ１のＤＮＡ及び（Ｌ
６混合物は、大腸菌ＨＢ１０１ 形質転換可能細胞を
形質転換するために用いられ、アンピクリン耐性につい
て選択され、テトラサイクリ／感応性及びアミラーゼ生
産についてスクリーンされた。
ゼ遺伝子のサブクローニング １ ｐｆのλＮＭ ５９０βａｍｙ１のＤＮＡ及び（Ｌ
６混合物は、大腸菌ＨＢ１０１ 形質転換可能細胞を
形質転換するために用いられ、アンピクリン耐性につい
て選択され、テトラサイクリ／感応性及びアミラーゼ生
産についてスクリーンされた。
Ａｍｙ＋ プラスミドの一つのタイプが６ｑｂの確率で
見い出された：これはｐＢＲ５２２＋ ５ ｋｂ Ｈ１
ｎｄ■異種フラグメントの挿入であり、巨大苗ＮＣＩＢ
１１５６８からのβ−アミラーゼを含む。このプラスミ
ドはｐＡＭＹ ４ と呼ばれる。
見い出された：これはｐＢＲ５２２＋ ５ ｋｂ Ｈ１
ｎｄ■異種フラグメントの挿入であり、巨大苗ＮＣＩＢ
１１５６８からのβ−アミラーゼを含む。このプラスミ
ドはｐＡＭＹ ４ と呼ばれる。
枯草菌Ｉ）ＵＢ １１０プラスミド中のβ−アミラーゼ
遺伝子のサブクローニア／ｆ Ｈｌｔｕｌ １１ 制限部位を利用できないことが、ｐ
ＵＢ１１０におけるサブクローニングを可能にするため
に、β−アミラーゼの両側上の他の部位の同定を必要と
した。
遺伝子のサブクローニア／ｆ Ｈｌｔｕｌ １１ 制限部位を利用できないことが、ｐ
ＵＢ１１０におけるサブクローニングを可能にするため
に、β−アミラーゼの両側上の他の部位の同定を必要と
した。
詳細な制限地図作成の後に、二つのＢｇｌ １１部位が
、２．５ｋｂ 対を取シ囲む５ｋｌ）異種フラグメント
において見い出された。このサイズの部位は、活性β−
アミラーゼ遺伝子を含みうる。
、２．５ｋｂ 対を取シ囲む５ｋｌ）異種フラグメント
において見い出された。このサイズの部位は、活性β−
アミラーゼ遺伝子を含みうる。
さ−らに、Ｂｇｌ ｎ粘着末端は、Ｂａｍ Ｈ工 末端
と結合しうる（ ｐＵＢ １１０は彼者のためのユニー
ク制限部位を持つ）ｏ２ｐｔのｐＵＢ１１０をＢａｍＨ
工で切断し、１ ｐｔのｐＡＭＹ ４をＢｇＩＩＩとＨ
ｌｎａ ｍで切断した。フラグメントを、１単位のＴ
ＤＮＡリガーゼの存在下でアニーリングした。実施例１
記載の方法で形質転換後に、Ａｎｙ＋組換えプラスミド
の一つのタイプが枯草菌中に見い出され九。この新しい
プラスミドは、ｐＵＢ １１０のＢａｍ Ｈ工 部位に
おいて２．５ｋｌ）挿入物を含む。
と結合しうる（ ｐＵＢ １１０は彼者のためのユニー
ク制限部位を持つ）ｏ２ｐｔのｐＵＢ１１０をＢａｍＨ
工で切断し、１ ｐｔのｐＡＭＹ ４をＢｇＩＩＩとＨ
ｌｎａ ｍで切断した。フラグメントを、１単位のＴ
ＤＮＡリガーゼの存在下でアニーリングした。実施例１
記載の方法で形質転換後に、Ａｎｙ＋組換えプラスミド
の一つのタイプが枯草菌中に見い出され九。この新しい
プラスミドは、ｐＵＢ １１０のＢａｍ Ｈ工 部位に
おいて２．５ｋｌ）挿入物を含む。
この７ ｋｌ） プラスミドはｐＡＭＹ ＱＯと呼ば
れ、ＲＡＳ５Ｂ を発生するためにＢＡＲ８に導入さ
れた。
れ、ＲＡＳ５Ｂ を発生するためにＢＡＲ８に導入さ
れた。
実施例１１
枯草菌■ム１１４５及びＢＡＥＩ ７３によるα−アミ
ラーゼの製造 重ｆ／体積パーセントで１％のバクトペプトン、３俤の
酵母抽出物、０．５％のグルコース及びＯ，ＳＳのＮａ
０Ｌ を含む１５Ｌの培養基を含む四つの２０１培養器
を、同じ培養基中に含まれる予備培譬物の１俤でイノキ
ュレートした。予備培養物は、培養器の前の最後段階で
約３５世代が作られるように数回の継代培養を行うこと
により作られた。
ラーゼの製造 重ｆ／体積パーセントで１％のバクトペプトン、３俤の
酵母抽出物、０．５％のグルコース及びＯ，ＳＳのＮａ
０Ｌ を含む１５Ｌの培養基を含む四つの２０１培養器
を、同じ培養基中に含まれる予備培譬物の１俤でイノキ
ュレートした。予備培養物は、培養器の前の最後段階で
約３５世代が作られるように数回の継代培養を行うこと
により作られた。
二つの培養器は、カナマイシンの存在下（５ｐｆ／ａｄ
）及び不存在下で株ＢＡ８３５ を接種され、二つは
カナマイシンの存在下（５μｆ／ｌＲｇ）及び不存在下
で株ＢＡ８７５ を接種された。培養器を２５０ ｒ
ｐｍで攪拌し、α１５４空気／１／分で空気を吹き込み
、４０℃で５５時間保った。６時間後及びさらに４８時
間の間、゛培養器に加えられたグルコース合計がｔ ｓ
％ （ｗ／ｖ ）となるようにグルコース溶液を連続
的に培養器に加えた。醗酵の終了時に、培養ブロス中の
α−アミ
）及び不存在下で株ＢＡ８３５ を接種され、二つは
カナマイシンの存在下（５μｆ／ｌＲｇ）及び不存在下
で株ＢＡ８７５ を接種された。培養器を２５０ ｒ
ｐｍで攪拌し、α１５４空気／１／分で空気を吹き込み
、４０℃で５５時間保った。６時間後及びさらに４８時
間の間、゛培養器に加えられたグルコース合計がｔ ｓ
％ （ｗ／ｖ ）となるようにグルコース溶液を連続
的に培養器に加えた。醗酵の終了時に、培養ブロス中の
α−アミ
第１図〜第４図は各々、ｐＡＭＹ １００ 、、 ｐＡ
ＭＹ２００ 、 ｐＡＭＹ ３００及びｐＡＭＹ ４０
０の制限地図を示す。 第４図において、８ＡＵ！ｌＡＩの他の部位はまだ決定
されていない。
ＭＹ２００ 、 ｐＡＭＹ ３００及びｐＡＭＹ ４０
０の制限地図を示す。 第４図において、８ＡＵ！ｌＡＩの他の部位はまだ決定
されていない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、供与体微生物から由来するＤＮＡを開裂し、アミラ
ーゼ暗号遺伝子を含む得たＤＮＡフラグメントを、プラ
スミドである同様に開裂されたベクターと結合するイン
ビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組
換えＤＮＡにおいて、供与体微生物が巨大菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチル
スコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）、バチルスシルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）又は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、プラスミドがｐ
ＵＢ １１０であることを特徴とする組換えＤＮＡ。 ２、供与体微生物が肺炎桿菌ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５０５
０である特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ。 ３、供与体微生物が巨大菌ＮＣＩＢ Ｎｏ．１１５６８
であり、α−アミラーゼを暗号する遺伝子を含む組換え
ＤＮＡがｐＡＭＹ １００と名付けられる特許請求の範
囲第１項記載の組換えＤＮＡ。 ４、供与体微生物がバチルスコアグランスＮＣＩＢ Ｎ
ｏ．１１５７１であり、組換えＤＮＡがｐＡＭＹ ２０
０と名付けられる特許請求の範囲第１項記載の組換えＤ
ＮＡ。 ５、供与体微生物がバチルスセレウスＡＴＣＣ Ｎｏ．
３１１０２であり、組換えＤＮＡがｐＡＭＹ ３００と
名付けられる特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ
。 ６、供与体微生物が巨大菌ＮＣＩＢ １１５６８であり
、β−アミラーゼを暗号する遺伝子を含む組換えＤＮＡ
がｐＡＭＹ ４００と名付けられる特許請求の範囲第１
項記載の組換えＤＮＡ。 ７、供与体微生物から由来するＤＮＡを開裂し、アミラ
ーゼ暗号遺伝子を含む得たＤＮＡフラグメントを、プラ
スミドである同様に開裂されたベクターと結合するイン
ビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む組
換えＤＮＡであって、供与体微生物が巨大菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチル
スコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）、バチルスシルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）又は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、プラスミドがｐ
ＵＢ １１０であるところの組換えＤＮＡを含むことを
特徴とする遺伝子工学的に処理された微生物。 ８、微生物が枯草菌である特許請求の範囲第７項記載の
微生物。 ９、枯草菌が枯草菌ＢＧＳＣ１Ａ２８９である特許請求
の範囲第８項記載の微生物。 １０、枯草菌がＮＣＩＢ １１９７９（ＢＡＳ ８）で
ある特許請求の範囲第８項記載の微生物。 １１、組換えＤＮＡがｐＡＭＹ １００であり、新規微
生物が枯草菌ＮＣＩＢ １１９８０（ＢＡＳ ３５）で
ある特許請求の範囲第１０項記載の微生物。 １２、新規微生物が、少くとも２５０μｇ／ｍｌのカナ
マイシンを含む栄養素培養基で生育しうる枯草菌ＮＣＩ
Ｂ １１９８０（ＢＡＳ ３５）のカナマイシン耐性突
然変異体である特許請求の範囲第１１項記載の微生物。 １３、枯草菌ＮＣＩＢ １１９８４（ＢＡＳ ７２）で
ある特許請求の範囲第１２項記載の微生物。 １４、枯草菌ＮＣＩＢ １１９８０（ＢＡＳ ３５）の
カナマイシン耐性突然変異体が少くとも７５０μｇ／ｍ
ｌのカナマイシンを含む栄養素培養基で生育しうる特許
請求の範囲第１２項記載の微生物。 １５、枯草菌ＮＣＩＢ １１９８５（ＢＡＳ ７３）で
ある特許請求の範囲第１４項記載の微生物。 １６、少くとも２５のプラスミドコピー数を持つ特許請
求の範囲第１２〜１５項のいずれか一つに記載の微生物
。 １７、少くとも３５のプラスミドコピー数を持つ特許請
求の範囲第１６頂記載の微生物。 １８、供与体微生物から由来するＤＨＡを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たＤＮＡフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えＤＮＡであって、供与体微生物が巨大菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチル
スコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）、バチルスシルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）又は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、プラスミドがｐ
ＵＢ １１０であるところの組換えＤＮＡ ｐＡＭＹ
１００を含む枯草菌ＮＣＩＢ １１９７９（ＢＡＳ ８
）である枯草菌ＮＣＩＢ １１９８０（ＢＡＳ ３５）
の、少くとも２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体を作る方法において、（ａ）２５０μｇ／ｍｌのカ
ナマイシンを含む栄養素培養基で枯草菌ＮＣＩＢ １１
９８０（ＢＡＳ ３５）を培養すること、 （ｂ）この培養基で生育する一又は二以上のコロニーを
選択すること、 （ｃ）該コロニーを新しい栄養素培養基に移すこと、及
び （ｄ）上記選ばれたコロニーを上記新しい培養基で培養
すること を特徴とする方法。 １９、供与体微生物から由来するＤＮＡを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たＤＮＡフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えＤＮＡであって、供与体微生物が巨大菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチル
スコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）、バチルスシルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）又は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、プラスミドがｐ
ＵＢ １１０であるところの組換えＤＮＡ ｐＡＭＹ
１００を含む枯草菌ＮＣＩＢ １１９７９（ＢＡＳ ８
）である枯草菌ＮＣＩＢ １１９８０（ＢＡＳ ３５）
の、少くとも７５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体を作る方法において、（ａ）少くとも２５０μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含む栄養素培養基において生育し
うる枯草 菌ＮＣＩＢ １１９８０（ＢＡＳ ３５）のカナマイシ
ン耐性突然変異体を７５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを
含む栄養素培養基において培養するこ と、 （ｂ）この培養基で生育する一又は二以上のコロニーを
選択すること、 （ｃ）該コロニーを新しい栄養素培養基に移すこと、及
び （ｄ）上記選ばれたコロニーを上記新しい培養基で培養
すること を特徴とする方法。 ２０、供与体微生物から由来するＤＮＡを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たＤＮＡフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えＤＮＡであって、供与体微生物が巨大菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチル
スコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）、バチルスシルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）又は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、プラスミドがｐ
ＵＢ １１０であるところの組換えＤＮＡ ｐＡＭＹ
１００を含む枯草菌ＮＣＩＢ １１９７９（ＢＡＳ ８
）である枯草菌ＮＣＩＢ １１９８０（ＢＡＳ ３５）
の、少くとも２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体ＮＣＩＢ １１９８４（ＢＡＳ ７２）を用いる方
法において、上記微生物が含む組換えＤＮＡをインビト
ロに開裂し、制限エンドヌクレアーゼによってカナマイ
シン耐性を暗号する遺伝子を切除し、該遺伝子を含まな
い組換えＤＮＡをリガーゼによって連結し、そしてこの
連結された組換えＤＮＡを枯草菌宿主に再導入すること
を特徴とする方法。 ２１、供与体微生物から由来するＤＮＡを開裂し、アミ
ラーゼ暗号遺伝子を含む得たＤＮＡフラグメントを、プ
ラスミドである同様に開裂されたベクターと結合するイ
ンビトロ法により作られたアミラーゼ暗号遺伝子を含む
組換えＤＮＡであって、供与体微生物が巨大菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチル
スコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）、バチルスシルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）又は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、プラスミドがｐ
ＵＢ １１０であるところの組換えＤＮＡ ｐＡＭＹ
１００を含む枯草菌ＮＣＩＢ １１９７９（ＢＡＳ ８
）である枯草菌ＮＣＩＢ １１９８０（ＢＡＳ ３５）
の、少くとも２５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む栄
養素培養基において生育しうるカナマイシン耐性突然変
異体又はこれの組換えＤＮＡからカナマイシン耐性を暗
号する遺伝子が除かれたところの微生物を、アミラーゼ
生産条件下で培養することを特徴とするアミラーゼの製
造法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB848414271A GB8414271D0 (en) | 1984-06-05 | 1984-06-05 | Recombinant dna |
| GB8414271 | 1984-06-05 |
Publications (2)
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|---|---|
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| JPH0779683B2 JPH0779683B2 (ja) | 1995-08-30 |
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| US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
| US5209938A (en) * | 1989-09-13 | 1993-05-11 | Cpc International Inc. | Method for retarding staling of baked goods |
| US6300115B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-09 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
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