JPS61155398A - 抗緑膿菌ヒトモノクロ−ナル抗体及びその製造法並びにそれを有効成分とする治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、緑ｍ菌（シュードモナス・エルギノーザ、　
Ｐｓｅｕｄｏｍｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対す
るヒトモノクローナル抗体とその製造法、並びにそれを
有効成分とする緑膿菌感染症の治療剤に関する。その目
的とするところは、緑ｌｌＩ菌感染症の診断及び治療等
に役立つところの、抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体を
提供することにある。

（ロ）従来の技術 緑膿菌（シュードモナス・エルギノーザ、Ｐｓｅｕｄｏ
＊ｏｎａｓ　ａｅｒｕｏｉｎｏｓａ　）は本来病原性の
低い菌であるが、最近は、抗生物質の投与による菌交代
性増殖の結果、薬剤耐性緑膿菌による感染症が増え、し
ばしば免疫不全、とりわけシスティックファイブローシ
ス（のう飽性線維症）、熱傷、ガン等の患者に発症し重
篤な症状を呈するようになっている。この感染症におい
ては、緑膿菌が薬剤耐性をもっていることが多いため、
又患者の免疫力が弱まっている等のため、抗生物質によ
る治療が必ずしも十分な威力を発揮しないという問題が
ある。

従って、抗緑膿菌抗体によるいわゆる免疫治療法が考え
られ研究されつつあるが、未だ臨床に供されるに至って
いない。また、緑膿菌感染症の治療を適格に行なうため
には、その早期診断が必要であるが、従来の抗血清を用
いる方法は満足すべき状況にないという問題がある。こ
れらの問題点を解決するためには、抗緑膿菌モノクロー
ナル抗体が必要である。

一方、緑膿菌の表面抗原としては、リポ多糖（ＬＰＳ）
、外層蛋白（Ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎ、ＯＭＰ）、ペン毛、スライム由来の多糖等が知
られている。このうちＬＰＳは緑膿菌の血清型を決定す
る〇−多糖側鎖を有し、今まで１から１６までの１６種
類の血清型（Ｈｏｍ１ａの分類による）が知られている
。ＬＰＳは〇−多糖側鎖の他にコアーリージョン、リピ
ドＡを有し、リビドＡが緑膿菌の外層（Ｏｕｔｅｒ　ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ　）にうずもれ、これより２−ケト−３
−デオキシオフトン酸を介しコアーリージョンが外層外
に伸び、コアリージョンがら〇−多糖側鎖が更に外側に
伸展している。ＬＰＳに対する抗体は、ヒトや動物にお
いて作られやすく、感染防御的に働く事が知られている
。抗ＬＰＳ抗体は、緑膿菌のＬＰＳと結合し、この抗原
抗体複合体に補体が結合し、免疫溶菌を受けるか、もし
くは多形核白血球などの食細胞により処理され、生体が
緑膿菌感染症から免れる事ができると言われている。緑
膿菌の感染が成立している患者では、緑ＩＩ菌抗原が多
く、抗ＬＰＳ抗体が不足になりがちである。これを防ぎ
治療するために、従来からヒトの血液から調製したＩｇ
ＧｔＪ剤が使われてきたが、その製剤に含まれている緑
ｍ菌の抗体価は極めて少なく、感染治療上十分ではなか
った。

ところで、細胞融合の技術を用いて、特異的な抗体を産
生ずるがやがては死滅する運命にあるリンパ球又はＢ細
胞（抗体産生細胞）と、培養器の中で永久に増殖しつづ
けるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）を融合させることに
より、特異抗体を永続的に産生分泌するハイブリドーマ
（融合細胞）株を樹立させる方法は公知である。かかる
方法によって作成されたハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体は、高い精度と信頼度をもつ純粋な化学
試薬として、検査試薬や標識試薬、アフィニティークロ
マトグラフィーなどに応用ができる他、各種疾病の治療
薬、予防薬としての応用も期待できるものである。

モノクローナルな抗緑膿菌抗体を得ようとする場合には
、抗緑膿菌抗体産生性胞とミエローマ細胞とを融合させ
、クローニングによって抗緑膿菌抗体産生性のハイブリ
ドーマを得ればよいことは一般論としては知られている
。そして、具体的には、例えば、特開昭５９−２９６２
２号公報には、緑膿菌のＬＰＳで免疫されたＢＡＬＢ／
Ｃマウスの牌臓細胞（抗体産生網ｗ＆）と、マウスのミ
エローマ細胞（Ｐ３−Ｘ　　６３−ＡｔＪ　　８−Ｌｉ
２株）とを融合させハイブリドーマを得、これをクロー
ニングすることによって、モノクローナルな抗緑膿菌マ
ウス抗体を産生するマウス−マウスハイブリドーマを得
たこと、そして得られたマウスモノクローナル抗体は、
緑膿菌感染に防御効果を示したことが開示されている。

（／９　発明が解決しようとする問題点以上のごとく、
抗緑膿菌抗体に関しては、具体的な成功例は抗緑膿菌マ
ウスモノクローナル抗体だけである。しかし、ヒトの病
気の診断や治療のためには、同種タンパクである抗緑ｍ
菌ヒト抗体の方が有用でかつ安全であり、そのためには
、ヒトの抗体産生細胞を用いてマウス−ヒトハイブリド
ーマやヒト−ヒトハイブリドーマを樹立する必要がある
。しかしながら、動物の場合と異なり、ヒトの場合には
、ヒトをあらかじめ多量の緑膿菌やその表面抗原で免疫
し、有効に刺激された抗体産生細胞を採取して細胞融合
に用いるといった方法をとるわけにはいかないので、適
切な抗体産生細胞の採取・調整が困難であるといった問
題等があり、未だ明確な成功例の報告がない。

に）　問題点を解決するための手段（その−）本発明者
らは、抗緑Ｉｏ菌ヒト抗体を得るために、マウス−ヒト
ハイブリドーマに関し鋭意研究を行なった結果、細胞融
合法と形質転換法によって、特定の抗緑膿菌抗体を得る
ことができた。

即ち、本発明は、緑膿菌のリポ多１！！（０−多糖側鎖
、コアーリージョン、リビットＡ等からなる）を認識す
る性質を有する、抗緑膿菌と、トモツクローナル抗体で
あり、好ましくは、リポ多糖のＯ−多糖側鎖を認識する
モノクローナル抗体である。

かかるモノクローナル抗体、ヒトの抗緑膿菌抗体産生細
胞とマウスのミエローマ細胞とのマウス−ヒトハイブリ
ドーマを作成し、該ハイブリドーマ及び／又はそれに由
来する細胞株を培養し、培養物から緑膿菌のリポ多糖に
結合する性質を有するヒトモノクローナル抗体を採取す
る方法によって得られる。

本発明においてヒトの抗体産生細胞とは、ヒトのリンパ
球（又はＢ１１胞）であって、抗体を分泌している又は
分泌する能力を持った細胞をいう。

これは牌臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイ
ド等の細胞の中に含まれている。本発明の目的のために
は、いかなるソースのリンパ球でも用いることができる
が、好ましいの扁桃腺又は牌臓から採取されたものであ
る。

マウスのミエローマ細胞としては、８−７ザグアニン耐
性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、Ｂ
ＡＬＢ／ＣマウスのＰ３−Ｘ６３−Ａａ　８　、　Ｐ３
−Ｘ６３−Ａａ　８−ｔＪｌ　、　Ｐ３−ＮＳ１　／１
−Ａｏ　４−１　、　Ｐ３−Ｘ６３−　Ａｇ８−６．５
．３．　Ｓ　Ｐ２１０−Ａｇ１４　、　ＦＯ，ＭＰＣｌ
ｌ　−４５，６７Ｇ　１．７などがある。

本発明においては、まず、抗原である特定のＬＰＳを有
する緑膿菌を選ぶ。次にヒトのリンパ球を扁桃腺、リン
パ節、牌臓及び末梢血等の組織からモノヌクリアーセル
（単核細胞）として調製する。このモノヌクリアーセル
を５日〜７日、ホークライードマイトジェン等のマイト
ジェンの添加もしくは無添加の条件下で、５％ＣＯ２イ
ンキュベーターで培養し、その培養上清液中の抗体を、
前記緑膿菌を固定したプレートで酵素抗体法により測定
し、望ましいモヌクリアーセルを含む組織を選ぶ。次い
で、この組織のリンパ球とミエローマ細胞Ｉ胞を融合さ
せ、ハイブリドーマの異質集落を形成させる。細胞融合
は公知の方法で行なうことができる。例えば、抗体産生
細胞とミエローマ細胞融を１０：１〜１：１０．好まし
くは１：１〜１：３の比率で混合し、適当な細胞融合用
溶液、例えば約３５％ポリエチレングリコール（分子＠
　１，０００〜６，０００程度）および約７．５％ジメ
チルスルホキシドを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０を加えて
、室ｍ〜３７℃で１〜数分間撹拌し、その後１０％ＦＣ
８７ＸＩＲＰＭ１１６４０で徐々に希釈し、洗浄の後Ｈ
ＡＴ　（ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
選択培養液にて細胞濃度が１〜５ｘ１０５１１／ｄとな
るように調整する。これを０．２ｄずつ、例えば９６穴
プレートに分注し、５％ＣＯ２を含む空気中で３５〜３
８℃で２〜３週間培養する。ＨＡＴＩＩＩ液中ではハイ
ブリドーマのみが存在し、８−７ザグアニン耐性のミエ
ローマ細胞及びミエローマ同士の融合ｌ１ｌＩ１１は生
存し得ないく未融合の抗体産生細胞は数日で死滅する。

）次に、このハイブリドーマ集落から、緑膿菌ＬＰＳに
対し特異的なヒトモノクローナル抗体を分泌するものだ
け選別する。この選別工程（クローニング）は、異なる
ハイブリドーマより産生されたヒトモノクローナル抗体
を、目的とする血清型を有する緑ＩＩＩ菌又は緑膿菌Ｌ
ＰＳを固定したプレートを用いて、酵素抗体法を用いて
行なう事ができる。全ての緑膿菌の血清型に反応するヒ
トモノクローナル抗体を得る為には、１６種類の異る血
清型の緑膿菌を使用しなくてはならない。

これらの緑膿菌は、アメリカン・タイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）から入手できる。

目的とする緑膿菌に対するモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマは、次にり０−ニングによりクローン
化細胞にしなくてはならない。この工程は、具体的には
軟寒天法を用い行う事ができる。約２〜３３！！間後、
轍寒天中で生育したコロニーを拾い、再び酵素抗体法で
緑膿菌に対する抗体活性を調べ選別する。選別したハイ
ブリドーマを培養して、所望のＬＰＳ特異特異的ヒトモ
ノクーナル抗体を主成させる。

モノクローナル抗体を得るためのもう一つの方法は、ヒ
トの抗緑ＩＩ菌抗体産生を細胞にエプスタイン・バー・
ウィルス（Ｅ　ＤＳｔｅｉｎ−Ｂ　ａｒｒ　Ｖ　１ｒｔ
ｌｓ。

以下Ｅ−８ウィルスと略称する）を感染させて形質転換
細胞を作成し、該形質転換細胞及び／又はそれに由来す
る細胞株を培養し、培養物から緑膿菌のリポ多糖に結合
する性質を有するヒトモノクローナル抗体を採取する方
法である。

Ｅ−８ウイルスは、バーキットリンパ腫や鼻咽頭ガンの
原因ウィルスとされている、ヘルペスウィルス群に属す
るウィルスである。前記と同様なヒトのリンパ球のモノ
ヌクリアーセルをＥ−８ウイルスに感染させ、約２〜３
週間、５％ＣＯ２インキユベータで培養し、多くの異質
集落から成る形質転換細胞（トランスフォームドセル）
を形成させる。次に、この形質転換細胞から、Ｉ！膿菌
ＬＰＳに対し特異的なヒトモノクローナル抗体を分泌す
るものだけを、前記と同様な方法で選別する。

そして、前記と同様にして、クローン化された形質転換
細胞を得ことができる。

次に、本発明においては、選択したハイブリドーマ又は
形質転換細胞を培養して、所望の特異的ヒトモノクロー
ナル抗体を生成させる。

クローニングによって選択された、抗緑膿菌ヒト抗体を
産生するマウス−ヒトハイブリドーマ又はヒト形質転換
細胞は凍結して保存することができ、また、これを適当
な方法で大量に培養することもできる。そして、培養上
清から緑膿菌ＬＰＳに特異的に結合するモノクローナル
な抗緑膿菌ヒト抗体を得ることができる。また、かかる
細胞を動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清から抗
緑膿菌ヒト抗体を得ることもできる。抗緑膿菌ヒト抗体
の精製は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティク
ロマトグラフィー等の方法によって行なわれる。

（栃　　作　　用 抗緑膿菌ＬＰＳヒトモノクローナル抗体は、緑ａ菌ＬＰ
Ｓに特異的に結合して補体により緑膿菌を免疫溶菌させ
る。また、緑膿菌感染マウスモデル実験の系でマウスを
感染から防御することもできる。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、互いに混合され、
緑膿菌の全ての１６種の血清型に結合させる事ができる
。抗緑膿菌ＬＰＳヒトモノクローナル抗体は、血清型特
異的に結合し、感染モデル実験系で感染防御能を発揮す
る。すなわち、ある血清型に特異的なヒトモノクローナ
ル抗体は、同じ血清型の緑膿菌には、１００％結合し得
るが、異る血清型の緑膿菌には全く結合できない。従っ
て、各ヒトモノクローナル抗体を混ぜ合せる車上より、
現在わかっている全ての血清型の緑膿菌に結合せしめる
事ができる。

（へ）問題点を解決するための手段（その二）本発明の
緑膿菌のリポ多糖を認識する性質を有する抗緑膿菌ヒト
モノクローナル抗体は、他の通常の医薬助剤と共に医薬
製剤とすることができ、これはヒト及び動物の緑Ｓ菌感
染症の治療剤として用いられる。かかる製剤においては
、全ての血清型に対応するモノクローナル抗体を混合す
ることは必ずしも必要ではなく、少なくとも血清型が１
型、５型、７型、８型及び１０型の緑膿菌に対する抗緑
ｍ菌ヒトモノクローナル抗体を含む製剤とすれば、緑ｎ
菌感染症の７０％以上を治療することができる。

本発明のヒトモノクローナル抗体の投与方法は個々の状
況たとえば処置すべき緑膿菌感染症の状況により変化し
、同様に投与ｍ及び投与の頻度に応じて変化する。一般
に、抗体は投与前に非毒性の医薬上許容し得るキャリア
物質、例えば、通常の食塩水と混合され、任意の医療上
適当な方法、例えば、静脈投与によって投与される。一
般に、抗体はキャリア中に約０．５μ９抗体／ｄ〜５０
０μり抗体／Ｉｄの濃度で存在させる。１回の投与する
抗体の量は、一般に体重１にｌ値り１０μｇ〜１０ＩＩ
Ｉｇの抗体の範囲である。成る場合には、１回以上の一
連の投与が必要とされる。

（ト）　実施例 以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１ （１）　　抗緑膿菌抗体産生細胞の選別８人の扁桃製患
者より８０ツトの扁桃腺を得、これよりファイコールバ
ックを用いモノヌクリアーセルを調製した。１１胞濃度
が５Ｘ１０’／Ａｄになる様に、モノヌクリアーセルを
培養液Ａ（ＲＰＭｌ　１６４０＋　１０％胎児牛血清＋
２−Ｍグルタミン＋１ｉＭピルビン酸＋〇、０２　ｑ／
ｘｉセリン＋８０ｔｌ　ｇ／ｄゲンタマイシン）に浮遊
させ、これに、ホークライードマイトジェン（ＰＷＭ）
を２０μｇ／Ｉｌｉになる様に加えた。この試料を２０
０μ文づつ培養プレートに入れ、ＣＯ２インキユベータ
（５％ＣＯ２）で６〜７日培養した。その後、それぞれ
の培養上清液１００μ文を緑膿菌をコートしたプレート
に移し、酵素抗体法で測定を行ったところ、１０ツトだ
け強く抗緑膿菌抗体を産生していた。

このロフトのモノヌクリアーセルを、マウスミエローマ
Ｐ３−Ｘ　６３−ＡＩＪ８−　Ｕ　Ｉ　（以下Ｐ３ＬＩ
Ｉと略記する）との細胞融合に用いた。

（２細胞融合 前もってＰ３Ｕｌを培養液Ａ中で培養しておいた。使用
時の細胞濃度は６　Ｘ　１０’個／Ｉｄであった。

上記の抗緑膿菌抗体産生がすぐれていた扁桃腺ロフトの
リンパ球とＰ３ＵＩを、それぞれ別々に無血清ＲＰＭ　
Ｉ　ｌ６４０で２回洗浄し。そして、リンパ球と５　Ｘ
　１０６個のＰ３ＵＩとを試験管の中で一緒にし、次い
で１５００ｒｌ）Ｉｆで５分間遠心し、上清を捨てた。

細胞ベレットを、試験管をたたくことによって、よ（分
散させた。これに０．５−のポリエチレングリコール液
（ＲＰＭ　Ｉ　　１６４０５．７５　ｍ＋ポリエチレン
グリコール１５００　３．５ｄ＋ジメチルスルホキサイ
ド０．７５　ｄ）（ＰＥＧ液と略記する）を加えて、細
胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０．５ｄ　＋　Ｒ
Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０を加え、さらに１分後に１ｄＲＰ
ＭＩ、さらに２分後に４ｄのＨＡＩ培養液（ＲＰＭ　Ｉ
　１６４０＋２０％胎児牛血清＋８０μ９／ｌｄゲンタ
マインシン＋９５μＭヒボキサンチン＋０．４μＭアミ
ノプテリン＋１．６μＭチミジン）、さらに２分後には
４ｍの）−ＩＡＴ培養液を加えた。最後に、ＨＡＴ＠養
液で２５ｉｄ　ｔｉ＆胞浮遊液とした。これを培養プレ
ート（９６穴）１枚に蒔いて、３１℃、５％ＣＯ２含有
空気中で培養した。−週間毎に半ｍの培養液を新しいＨ
Ｔｉ８Ｎ液（ＨＡＴからＡを除去したもの）で交換して
いきハイブリドーマを得た。

（３）　　クローニング及び培養 得られたハイブリドーマの上清をホルマリン死滅縁ｍ菌
をコーライングしたプレートを用いてＥＬＩＳＡ法で測
定を行った結果、緑膿菌血清型ＨＯＩＩｌｌａもｔＶＩ
）８５に結合するヒトモノクローナル抗体Ｐ３を得た。

そこで、Ｐ３を産生ずるハイブリドーマを、２回限界希
釈法によりクローニングを行い（９６穴プレ一ト２枚）
最終的にＰ２Ｏ３というヒトモノクローナル抗体（Ｉａ
Ｇ、λ）を産生ずるマウス−ヒトハイブリドーマを得た
。

本ハイブリドーマを、無血清培地ＲＤＦ／ＴＥＳ培地（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　
ｖｏｌ。

７９．１１５８−１１６２参照）１文で培養を行い、Ｐ
２Ｏ３を含む培養液を限外濾過膜ＰＭ３Ｄ（アミコン社
製）を用いて濃縮を行い、３０ｄとした。そしてＤ　Ｅ
　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｃｅｌ　テカラムクロマトヲ行
イ、Ｐ２Ｏ３を精製し１２ｑを侍だ。

（４）　　モノクローナル抗体の感染防御効果Ｐ３Ｄ９
の感染防御効果を調べるため、緑膿菌臨床分離株Ｎ−２
及び９７が選ばれた。Ｎ−２の血清型は、Ｈｏｍ１ａ　
ｔｙｐｅ　５で、９１のそれはＨ０ｌｌｌａｔＶｌ）ｅ
　７であったり ４退会のＩＣＲマウス（雄１体重１６〜２０ｇ）に２又
は４Ｌ［）５０のＮ−２株又は９７株を腹腔に投与した
。（一群１０匹）そして、１時間俊に、１０μ９又は１
μ９のＰ３Ｄ９を腹腔内に投与した。ポジティブコント
ロールとして、ヒト血清から精製したＩｇＧを腹腔内に
投与した。ネガティブコントロールとして、生理食塩水
を同量投与した。５日間観察後の結果を第１表に示した
。

第１表 第１表から、本発明のヒトモノクローナル抗体Ｐ３Ｄ９
は、緑膿菌のＮ−２株（Ｈｏ＋ｕ＋ａ　ｔｙｐｅ　５　
）に特異的な感染防御効果を示すことがわかる。

実施例２ （１）　　ヒトの牌細胞を用いる以外は、実施例１の場
合と同様にして、抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行
なった。得られたハイブリドーマの上清を、ホルマリン
死滅緑膿菌をコーティングしたプレートを用いてＥＬＩ
ＳＡ法で測定を行った結果、緑膿菌血清型Ｈｏｍｌ１ｌ
ａ　ｔｙｐｅ　２　、　ｌ−１ｏｉａｉａ　ｔｙｐｅ　
７　、　Ｈｏｌｌａ　ｔｙｐｅ　１３．のいずれとも結
合するヒトモノクローナル抗体Ｂ８を得た。Ｂ８を産生
ずるハイブリドーマを、２回限界希釈法によりクローニ
ングを行い、８８Ｅ２というヒトモノクローナル抗体（
ＩａＧ、λ）を産生ずるマウス−ヒトハイブリドーマを
得た。

本ハイブリドーマを、１０％Ｆ　Ｃ３ＲＰＭ　１１６４
０１文で培養を行い、８８Ｅ２を硫安沈澱（５０％飽和
）により回収した。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｃｅ
ｌ　テ部分精製を行った。ヒトＩｏｆｌｌは、−元平板
免疫拡散法（ＳＲＩＤ）により定量を行い、８■の８８
Ｅ２を含む抗体溶液を得た。本モノクローナル抗体は、
Ｈｏｉｍａ　ｔｙｐｅ　２　、　Ｈｏａ＋ｓａ　ｔｙｐ
ｅ　７及びＨｏｗｍａ　ｔｙｐｅ　１３から、　　Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　　Ｐｅｒｒｙ（Ｃａｎ。

Ｊ　、　ｍ１ｃｒｏｂｉｏｌ　１９７６　ｙｏ１２２　
：　２９−３４９の方法により抽出したＬＰＳ及びその
熱処理（１００℃−３０分）ＬＰＳをコーティングした
プレートを用いたＥＬＩＳＡ法で、それぞれのＬＰＳに
結合する事が確められ、ＬＰＳを認識するモノクローナ
ル抗体である事がわかった。

（２１モノクローナル抗体の感染防御効果８８Ｅ２の感
染防御効果を実施例１の場合と全く同様にして、緑膿菌
臨床分離株Ｎ−２（ｔｙｐｅ５　）と９７　（ｔＶＤｅ
７　）を用いて行ない、結果を第２表に示した。

（以下余白） 第２表 （以下余白） 第２表より、本発明のヒトモノクローナル抗体Ｂ８Ｅ２
は、緑ｍ菌の９１株（ｔｙｐｅ７）　１．：特異的に感
染防御効果を呈していることがわかる。

実験例３ ヒトの扁桃腺Ｓ＋Ｕｌを用い、実施例１の場合同様にし
て、抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行なった。得ら
れたハイブリドーマの上清を、ホルマリン死滅１１１１
菌をコーティングしたプレートを用いてＥＬＩＳＡ法で
測定を行った結果、緑膿菌血清型ＨＯ１ｌａ　ｔｙｐｅ
　１に融合する３１−７．同ｔｙｐｅ　７に結合する３
１−８　、同ｔｅｌ）８８に結合する３１−９゜及び同
ｔｙｐｅ１ｏに結合する３１−１２を得た。これらのヒ
トモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを、限
界希釈法及び軟寒天法により２回クローニングを行い（
９６穴プレ一ト５枚）それぞれ３ｌ−７−２Ａ、３ｌ−
８−５Ｇ、３ｌ−９−Ｆ４，３ｌ−１２−Ｈ３のヒト型
１ａＧを産生ずるバイプリドーマを得た。

かかるハイブリドーマを実施例２と同様の方法で培養し
、部分精製を行い、それぞれのモノクローナル抗体が反
応する抗原部位を決定すべく、ＬＰＳ及び熱処理（１０
０℃Ｘ２ｈｒ）ＬＰＳとの結合性をＥＬ［ＳＡにより実
施した。その結果を第３表に示した。（反応時間は６０
分）。

（以下余白） 第３表 （以下余白） 第３表から、ヒトモノクローナル抗体はそれぞれ特異な
ＬＰＳに結合していることがわかる。

実施例４ 実施例１〜３で得られたマウス−ヒトハイブリドーマが
産生するヒトモノクローナル抗体の、緑膿菌シュードモ
ナス属の菌株及び腸内細菌科グラム陽性の菌株に対する
、結合スペクトラムをＥＬＩＳＡ法で測定した。その結
果を第４表に示した。

（以下余白） 第４表から、ヒトモノクローナル抗体は特異性を有する
ことがわかる。

実施例５ 抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体Ｐ３Ｄ９．ＢａＦ２，
３ｌ−７−２Ａ、３ｌ−８−５Ｇ、３ｌ−９−Ｆ　４　
、３１−１２−８３の自−血清型の緑膿菌に対する結合
性をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果を第５表に示し
た。表からそれぞれのモノクローナル抗体が、同一血清
型の緑膿菌と１００％完全に反応していることがわかる
。

（以下余白） 第５表 実施例６ １μｇ／ｌ１１１１度のＰ３Ｄ９の０．５ｍを２　Ｘ　
１０’ＣＦＵ／ｌ１１１１度の緑膿菌Ｎ−２（ｔｙｐｅ
５）の０．５ｄ及び２Ｘ１０’　ＣＦＬＪ／ａｄ！ＩＩ
度緑膿菌０−６４（ｔｙｐｅ６　）の０．５ｍとそれぞ
れ混ぜ合せ、該当菌株で吸収を行ったモルモット生捕体
を０．２ｍ加え、３１℃で培養した。そして、３０分、
１時間、２時間毎に０．３ｄづつサンプリングし、ＨＩ
Ａ培地上で生育させてコロニー数を測定した。結果を第
６表に示した。

（以下余白） 第６表 （以下余白） Ｐ　３　Ｄ　９　ハｔｙｐｅ５のＮ−２のみを選択的に
攻撃していることがわかる。

実施例７ ヒトの扁桃腺細胞を用いて、実施例１の場合と同様に抗
体産生細胞の選別及び細胞融合を行った。

得られたハイブリドーマの上清をホルマリン死滅縁ｍ菌
をコーティングしたプレートを用いて、第２次抗体をヤ
ギ抗ヒトＩｆｌ１Ｍ抗体くアルカリフオスノアターゼ標
識）として、ＥＬＩＳＡを行った結果、血清型が）−１
ｏｍｍａ　ｔｙｐｅ　５　、　ｔｙｐｅ７　、　ｔｙｐ
ｅ３に反応するＩｑＭ型ヒトモノクローナル抗体が得ら
れた。これらのヒトモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマを、限界希釈法及び軟寒天法により２回クロ
ーニングを行い、それぞれ、３１３−ａ、　　３１３−
ｂ、　　３１３−ｃのヒトモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを得た。その後、実施例２と同様の方
法により部分精製を行い、それぞれのモノクローナル抗
体が反応する抗原部位を決定すべく、ＬＰＳ及び熱処理
ＬＰＳとの結合性をＥＬＩＳＡ法により検討した。その
結果を第７表に示した。

（以下余白） 第７表 （以下余白） 実施例８ 緑膿菌敗血症患者の末梢リンパ球を用いて実施例１の場
合と同様に細胞融合を行ない、スクリーニングによりＨ
Ｏｌｌａ　ｔｙｐｅ　５にのみ反応するヒトＩｇＡモノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ４　Ｈ１１Ｄ
　１０を得た。

４）（１１［）１０は血清型がｔｙｐｅ　５の９つの株
ニハすべて反応した。結果は第８表に示した。

（以下余白） 実施例９ 健常人より１０ｄのヘパリン旭静脈血を入手した。

これから、フィコールパック液で処理し、リンパ球画分
を含むモノヌクリアーセルを単離した。このモノヌクリ
アーセル５　Ｘ　１０Ｇ個に、１３９５−８株の培養上
清中に含まれるＥ−８ウイルス（トランスフォーメーシ
ョン　ドース５０Ｔ　Ｄ　５０−１０５／　ｄ　）を、
ｉ、ｏ、ｉ　　（感染の多重性）を０．１として感染さ
せた。次いで、２Ｘ１０５／１１！になる様に、２０％
ＦＣ８ＲＰＭＩ培地で希釈を行い、その１００μ隻づつ
を９６穴平底プレートに入れ、約２週間ＣＯ２インキユ
ベータで培養を行った。生育した形質転換細胞の培養上
清液を、緑膿菌をコーティングしたプレートでＥＬＩＳ
Ａ法によりアッセイした結果、Ｈｏｍｍａの血清型１．
４．５のそれぞれの菌株に反応する上清液を産生ずる形
質転換細胞が選別された。軟寒天培養でこれらの細胞を
クローニングし、第９表のような抗緑膿菌ヒトモノクロ
ーナル抗体を産生ずる形質細胞株を樹立した。

第９表 で決定した。

（以下余白） 実施例１０ 実施例１とは異る健常人よりヘパリン加静脈面を入手し
た。実施例９と同じ方法で、抗緑ｗａｒｍヒトーモノク
ローナル抗体を産生ずるＥ−８ウイルス形質転換ヒト細
胞をクローニングした。その結果を第１０表に示した。

（以下余白） 第１０表 １−１０１１８標準血清型６型、　１０型のそれぞれの
菌株に反応するモノクローナル抗体を産生ずる形質転換
ヒト細胞株が樹立できた。また、５Ｅ１１株は、２型、
７型、１３型のいずれにも反応するというブロードな性
質を示した。

実施例１１ 異る健常人よりヘパリン加面静脈を入手した。

実施例９と同じ方法で、抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗
体を産生ずるＥ−Ｂウィルス形質転換認識胞をクローニ
ングした。そのクローニング細胞株の性状を第１１表に
示した。

第１１表 （以下余白） 実施例１２ 扁桃ｌ！細胞をヒト扁桃腺よりａｌｔし、実施例９と同
じ方法で、抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体を産生ずる
Ｅ−８ウィルス形質転換細胞４−３Ｄ８をクローニング
した。４−３Ｄ８はＩ（ＩＭで、ＨＯ１ｌａ標準血清型
ｔＶＩ）＋３５とのみ反応した。

次に、血清型がｔｙｐｅ５に属する緑膿菌８株との結合
異性を調べたところ、第１２表に示したように、８株中
８株に反応した。

（以下余白） 第１２表 以下余白 実施例１３ 緑膿菌０−６４株（Ｈ０１ｌａ　ｔｉｐｅ　６　’）を
ＩＣＲマウス（４退会、雄、一群５匹）の腹腔に１ｘ１
ｏｓ個（３ＬＤ５０）感染後１時間して、実施例１０で
得られた形質転換細胞Ｓ　Ｅ　１０より粗精製（硫酸ア
ンモニウム沈澱）したモノクローナル抗体（ＭＣＡ−Ｓ
　Ｅ　１０）を投与し、感染防御が成立するかどうか調
べた。５Ｅ１０の産生ずる抗体層は、シングルラディア
ルイミュノデイフユージョン法により算出した。コント
ロールモノクローナル抗体として、実施例１２のｔＹＩ
）ｅ５に反応する４−３Ｄ８　（ＭＣＡ−４−３Ｄ８）
を用いた。結果を第１３表に示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、緑膿菌のリポ多糖を認識する性質を有する抗緑膿菌
   ヒトモノクローナル抗体。 ２、リポ多糖のＯ−多糖側鎖を認識する特許請求の範囲
   第１項記載の抗緑膿菌モノクローナル抗体。 ３、緑膿菌の血清型が１型、５型、７型、８型及び１０
   型のいずれかである、特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載の抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体。 ４、モノクローナル抗体ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体又はＩ
   ９Ａ抗体である、特許請求の範囲第１〜３項のうちいず
   れか１項記載の抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体。 ５、ヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞とマウスのミエローマ
   細胞とのマウス−ヒトハイブリドーマを作成し、該ハイ
   ブリドーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、
   培養物から緑膿菌のリポ多糖に結合する性質を有するヒ
   トモノクローナル抗体を採取することからなる、抗緑膿
   菌ヒトモノクローナル抗体の製造法。 ６、ヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞にエプスタイン・バー
   ・ウィルスを感染させて形質転換細胞を合成し、該形質
   転換細胞及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、培
   養物から緑膿菌のリポ多糖に結合する性質を有するヒト
   モノクローナル抗体を採取することからなる、抗緑膿菌
   ヒトモノクローナル抗体の製造法。 ７、緑膿菌のリポ多糖を認識する性質を有する抗緑膿菌
   ヒトモノクローナル抗体を有効成分とする緑膿菌感染症
   治療剤。 ８、少なくとも血清型が１型、５型、７型、８型及び１
   ０型の緑膿菌に対する抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体
   を含む、特許請求の範囲第７項記載の緑膿菌感染症治療
   剤。