JPS61132868A - 免疫学的分析方法 - Google Patents
免疫学的分析方法Info
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- JPS61132868A JPS61132868A JP25520584A JP25520584A JPS61132868A JP S61132868 A JPS61132868 A JP S61132868A JP 25520584 A JP25520584 A JP 25520584A JP 25520584 A JP25520584 A JP 25520584A JP S61132868 A JPS61132868 A JP S61132868A
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- antigen
- carrier
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は免疫学的分析方法に関するものである。
（従来技術）
血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等の蛋白質、
ホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造が類似して
いたり、ごく微量であるために、通常の分析方法では同
定、定量が困難である。そこで、これらの物質の分析に
は、一般に抗原抗体反応を利用した免疫学的な分析方法
が用いられている。。
ホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造が類似して
いたり、ごく微量であるために、通常の分析方法では同
定、定量が困難である。そこで、これらの物質の分析に
は、一般に抗原抗体反応を利用した免疫学的な分析方法
が用いられている。。
このような免疫学的分析方法には、例えば標識物質を用
いるものとして、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、Ｅ
ＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＦＩＡ（フルオロ
イムノアッセイ）等がある。また、これらの標識物質を
用いる分析方法は、測定系において、例えば標識物質で
標識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原（抗体）とが
抗原抗体反応を起こした免疫複合体（Ｂｏｕｎｄ）と、
抗原抗体反応に関与せず、自由（Ｆｒｅｅ）な状態で残
余する標識抗体（抗原）とを分離する操作、いわゆるＢ
−Ｆ分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要としな
いホモジニアス法とに分類される。
いるものとして、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、Ｅ
ＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＦＩＡ（フルオロ
イムノアッセイ）等がある。また、これらの標識物質を
用いる分析方法は、測定系において、例えば標識物質で
標識した抗体（抗原）とサンプル中の抗原（抗体）とが
抗原抗体反応を起こした免疫複合体（Ｂｏｕｎｄ）と、
抗原抗体反応に関与せず、自由（Ｆｒｅｅ）な状態で残
余する標識抗体（抗原）とを分離する操作、いわゆるＢ
−Ｆ分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要としな
いホモジニアス法とに分類される。
上記のへテロジニアス法による分析方法としては、特開
昭５３−１０４９５号公報において、カラムクロマトグ
ラフィーを利用してＢ−Ｆ分離をけうよにうしたものが
提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物ｆ（Ｆ
ｒｅｅ）を選択的に吸着し、免疫複合体（Ｂｏｕｎｄ）
を吸収しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を有す
るゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤として用
いてＢ−Ｆ分離を行うというものである。
昭５３−１０４９５号公報において、カラムクロマトグ
ラフィーを利用してＢ−Ｆ分離をけうよにうしたものが
提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物ｆ（Ｆ
ｒｅｅ）を選択的に吸着し、免疫複合体（Ｂｏｕｎｄ）
を吸収しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を有す
るゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤として用
いてＢ−Ｆ分離を行うというものである。
しかし、このようにＢ−Ｆ分離をカラムクロマトグラフ
ィーを用いて行うものにおいては、免疫複合体の大きさ
や形状にばらつきがあったり、免疫複合体と遊離物質と
の大きさが近接しているとＢ−Ｆ分離が困難となり、精
度が悪くなる。このため、例えば免疫グロブリン等の試
薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類
似した分子の測定には使用できず、分析項目が極めて制
限される。
ィーを用いて行うものにおいては、免疫複合体の大きさ
や形状にばらつきがあったり、免疫複合体と遊離物質と
の大きさが近接しているとＢ−Ｆ分離が困難となり、精
度が悪くなる。このため、例えば免疫グロブリン等の試
薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類
似した分子の測定には使用できず、分析項目が極めて制
限される。
（発明の目的）
本発明の目的は、上述した不具合を解決し、Ｂ−Ｆ分離
を常に確実に行うことができ、所望の分析を容易かつ高
精度にできる免疫学的分析方法を提供しようとするもの
である。
を常に確実に行うことができ、所望の分析を容易かつ高
精度にできる免疫学的分析方法を提供しようとするもの
である。
（発明の概要）
本発明の免疫学的分析方法は、サンプルと、抗原または
抗体を所定の物質で標識した標識抗原または抗体と、抗
原または抗体を固相化した担体とを反応させた後、その
反応液を流しながら前記担体を順次検出し、この検出し
た担体情報に基づいて前記担体に結合した標識抗原また
は抗体と、結合しないそれとを分離することを特徴とす
るものである。
抗体を所定の物質で標識した標識抗原または抗体と、抗
原または抗体を固相化した担体とを反応させた後、その
反応液を流しながら前記担体を順次検出し、この検出し
た担体情報に基づいて前記担体に結合した標識抗原また
は抗体と、結合しないそれとを分離することを特徴とす
るものである。
（実施例）
第１図は本発明の分析方法における反応模式図 ゛
の一例を示すものである。本例において、符号１は担体
に用いるラテックスで、例えば５μの均一な径のポリス
チレン製のものに物理的吸着により固相抗体２が固相化
されている。符号３はサンプルである血清等に含まれて
いる分析対象となる抗原で、符号４は抗原３に特異的に
結合する抗体をＦＩＴＣ等の螢光物質で標識した標識抗
体である。
の一例を示すものである。本例において、符号１は担体
に用いるラテックスで、例えば５μの均一な径のポリス
チレン製のものに物理的吸着により固相抗体２が固相化
されている。符号３はサンプルである血清等に含まれて
いる分析対象となる抗原で、符号４は抗原３に特異的に
結合する抗体をＦＩＴＣ等の螢光物質で標識した標識抗
体である。
また、符号５は抗原抗体反応後の免疫複合体（Ｂｏｕｎ
ｄ）であり、符号６は残余の標識抗体（Ｆｒｅｅ）であ
る。
ｄ）であり、符号６は残余の標識抗体（Ｆｒｅｅ）であ
る。
以下、ヒトＩｇＥの分析を例にとって説明する。
この場合、ラテックス１には抗ヒトＩｇＥモノクロナル
抗体２を吸着させる。モノクロナル抗体の使用はラテッ
クス粒子同志の凝集を防止し、より特異的に抗原と結合
させる目的による。サンプルとしての抗原はヒトＩｇＥ
３とし、標識抗体４には、ＦＩＴＣ［識抗ヒトＩｇＢ
抗体を用いる。なお、標識抗体４は非特異吸着を少なく
、また反応速度を高める目的で、Ｆａｂフラグメントを
用いるのが望ましい。反応は、反応用緩衝液２００μｌ
に固相抗体結合ラテレクス溶液５０μｌと、サンプル１
０μｌと、標識抗体溶液５０μｌとを添加してｊテわせ
る。
抗体２を吸着させる。モノクロナル抗体の使用はラテッ
クス粒子同志の凝集を防止し、より特異的に抗原と結合
させる目的による。サンプルとしての抗原はヒトＩｇＥ
３とし、標識抗体４には、ＦＩＴＣ［識抗ヒトＩｇＢ
抗体を用いる。なお、標識抗体４は非特異吸着を少なく
、また反応速度を高める目的で、Ｆａｂフラグメントを
用いるのが望ましい。反応は、反応用緩衝液２００μｌ
に固相抗体結合ラテレクス溶液５０μｌと、サンプル１
０μｌと、標識抗体溶液５０μｌとを添加してｊテわせ
る。
なお、これらの試薬類は、全て同時に添加しても、また
抗原を固相抗体と反応させて後、標識抗体と反応させる
ように逐次添加しても良い。
抗原を固相抗体と反応させて後、標識抗体と反応させる
ように逐次添加しても良い。
ここで、例えば３７℃、１０分間反応させると、固相抗
体−抗原−標識抗体の免疫複合体５と残余の標識抗体６
とが生成される。本例では、これを第２図に示すフロー
サイトメータに流して電気的にＢ−Ｆ分離する同時に測
定する。
体−抗原−標識抗体の免疫複合体５と残余の標識抗体６
とが生成される。本例では、これを第２図に示すフロー
サイトメータに流して電気的にＢ−Ｆ分離する同時に測
定する。
フローサイトメータは既に知られているように、細胞の
分析専用機であり、フローセルｌｌ中のニードル１２に
反応液１３を流し、レーザ光１４をその流れに照射して
細胞から発する散乱光や螢光を測定する。通常、前方散
乱光はレーザ入射光とほぼ水平に位置するディテクタ１
５で検知され、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢
光は、レーザ光−１４の入射角に対して垂直方向に位置
するディテクタ１６で検知され、細胞表面の螢光物質等
の測定に用いられる。レーザ光１４は単一波長であるた
め、使用できる螢光色素に制限があるが、本例の分析方
法において用いる螢光色素ＦＩＴＣは波長４８９ｎｏ＋
近くの光を吸収して波長５１５ｎａ＋の螢光を発するの
で、この場合は波長４８８ｎｍの光を発するＡｒレーザ
を用いれば良い。
分析専用機であり、フローセルｌｌ中のニードル１２に
反応液１３を流し、レーザ光１４をその流れに照射して
細胞から発する散乱光や螢光を測定する。通常、前方散
乱光はレーザ入射光とほぼ水平に位置するディテクタ１
５で検知され、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢
光は、レーザ光−１４の入射角に対して垂直方向に位置
するディテクタ１６で検知され、細胞表面の螢光物質等
の測定に用いられる。レーザ光１４は単一波長であるた
め、使用できる螢光色素に制限があるが、本例の分析方
法において用いる螢光色素ＦＩＴＣは波長４８９ｎｏ＋
近くの光を吸収して波長５１５ｎａ＋の螢光を発するの
で、この場合は波長４８８ｎｍの光を発するＡｒレーザ
を用いれば良い。
このようにして、反応後の第１図に示す免疫複合体５と
残余の標識抗体６とが、混ざり合った反応液１３をニー
ドル１２からフローセル１１中に導入し、ニードル１２
中を流れる免疫複合体と残余の標識抗体等の各成分のレ
ーザ光１４による散乱光および螢光をディテクタ１５お
よび１６でそれぞれ検知すれば、それらのパラメータに
よって第３図Ａ、Ｂに示すようなサイトグラムが得られ
る。なお、第３図Ａは抗原抗体が行われた場合のサイト
グラムを示し、この実施例では抗ヒトＩｇＨ［ｉ！ｌｉ
抗体が、サンプル中のＩｇＥと結合した抗ヒトＩｇＥ
ＭＣＡ固相ラテックスのｘｇｇ部、に結合し、その免疫
複合体の発する螢光がラテックス粒子の粒径に対応する
位置２１に検出されている。一方、抗原抗体反応にあず
からなかった残余の標識抗体は粒子径が極小なので、位
置２２あたりに検出される。このようにして、螢光量測
定値が得られれば、予め既知濃度抗原から同様にして求
めた螢光強度と抗原濃度との関係を表す検量線に基づい
てサンプル中のＩＢＥ濃度を求めることができる。
残余の標識抗体６とが、混ざり合った反応液１３をニー
ドル１２からフローセル１１中に導入し、ニードル１２
中を流れる免疫複合体と残余の標識抗体等の各成分のレ
ーザ光１４による散乱光および螢光をディテクタ１５お
よび１６でそれぞれ検知すれば、それらのパラメータに
よって第３図Ａ、Ｂに示すようなサイトグラムが得られ
る。なお、第３図Ａは抗原抗体が行われた場合のサイト
グラムを示し、この実施例では抗ヒトＩｇＨ［ｉ！ｌｉ
抗体が、サンプル中のＩｇＥと結合した抗ヒトＩｇＥ
ＭＣＡ固相ラテックスのｘｇｇ部、に結合し、その免疫
複合体の発する螢光がラテックス粒子の粒径に対応する
位置２１に検出されている。一方、抗原抗体反応にあず
からなかった残余の標識抗体は粒子径が極小なので、位
置２２あたりに検出される。このようにして、螢光量測
定値が得られれば、予め既知濃度抗原から同様にして求
めた螢光強度と抗原濃度との関係を表す検量線に基づい
てサンプル中のＩＢＥ濃度を求めることができる。
また、サンプル中にＩｇＢが少なかった場合は、第３図
Ｂに示すように、残余の標識抗体が位置２２に集中し、
抗体結合ラテックスからは螢光は検出されない。
Ｂに示すように、残余の標識抗体が位置２２に集中し、
抗体結合ラテックスからは螢光は検出されない。
このように、フローサイトメータを使って測定するラテ
ックスイムノアッセイを用いると、免疫複合体と残余の
標識抗体との粒子としての大きさが大きく異なるため、
測定上の識別が容易である。
ックスイムノアッセイを用いると、免疫複合体と残余の
標識抗体との粒子としての大きさが大きく異なるため、
測定上の識別が容易である。
また、抗原や抗体の大きさに比べ、ラテックス粒゛子の
大きさがかなり大きいから免疫複合体の大きさ、形状の
バラツキがかなり小さくなり、したがって高精度に分析
できる。更に、反応溶液を機械的にではなく電気的にＢ
−Ｆ分離するものであるから、そのまま測定することが
でき、したがって高速で、多検体測定が可能である。
大きさがかなり大きいから免疫複合体の大きさ、形状の
バラツキがかなり小さくなり、したがって高精度に分析
できる。更に、反応溶液を機械的にではなく電気的にＢ
−Ｆ分離するものであるから、そのまま測定することが
でき、したがって高速で、多検体測定が可能である。
なお、本発明は上述した例にのみ限定されるものではな
く、幾多の変更または変形が可能である。
く、幾多の変更または変形が可能である。
例えば、担体はラテックスに限らず、分子量の均一な人
工細胞等、測定対象に応じそ任意の形状や大きさのもの
を用いることができる。また、フローサイドメータにソ
ーティング機能を付加して免疫複合体、残余の標識抗体
をＢ−Ｆ分離してから測定を行うこともできる。このよ
うにすれば、螢光物質以外の各種の標識物質を用いるこ
とができる。更に、フローサイトメータに反応装置やオ
ートサンプラ等を付加することによって自動測定も容易
に行うことができる。この場合、フローサイトメータに
おける測定速度は約５．０００粒子／ｓｅｃであるから
、１つのサンプルについてｌＸｌ０”粒子を測定したと
しても、３分前後で高速に分析することができる。また
、本発明は競合法による分析にも有効に適用することが
できる。
工細胞等、測定対象に応じそ任意の形状や大きさのもの
を用いることができる。また、フローサイドメータにソ
ーティング機能を付加して免疫複合体、残余の標識抗体
をＢ−Ｆ分離してから測定を行うこともできる。このよ
うにすれば、螢光物質以外の各種の標識物質を用いるこ
とができる。更に、フローサイトメータに反応装置やオ
ートサンプラ等を付加することによって自動測定も容易
に行うことができる。この場合、フローサイトメータに
おける測定速度は約５．０００粒子／ｓｅｃであるから
、１つのサンプルについてｌＸｌ０”粒子を測定したと
しても、３分前後で高速に分析することができる。また
、本発明は競合法による分析にも有効に適用することが
できる。
（発明の効果）
以上述べたように、本発明によれば、担体を用いるから
その免疫複合体と残余の標識抗体との大きさが大きく異
なり、したがって測定上の分離が簡単にできると共に、
免疫複合体の大きさ、形状のばらつきを極めて小さくで
きるから精度の高い分析を行うことができる。また、担
体は任意の大きさ、形状のものを選ぶことができるから
、サンプル分子の種類や大きさに制限されない。更に、
上述した実施例によれば、反応液を電気的にＢ−Ｆ分離
しながら同時に測定できるから、高速度、多検体測定を
目的とした自動比が可能である。
その免疫複合体と残余の標識抗体との大きさが大きく異
なり、したがって測定上の分離が簡単にできると共に、
免疫複合体の大きさ、形状のばらつきを極めて小さくで
きるから精度の高い分析を行うことができる。また、担
体は任意の大きさ、形状のものを選ぶことができるから
、サンプル分子の種類や大きさに制限されない。更に、
上述した実施例によれば、反応液を電気的にＢ−Ｆ分離
しながら同時に測定できるから、高速度、多検体測定を
目的とした自動比が可能である。
第１図は本発明における一例の反応模式図、第２図はフ
ローサイトメータを説明するための図、 第３図ＡおよびＢは測定データのサイトグラムを示す図
である。 １− ラテックス ２・−・固相抗体３−・抗
原 ４−標識抗体５−・免疫複合体
６−残余の標識抗体１１− フローセル １２
−・ニードル１３−反応液 １４・−レーザ
光１５．１６−ディテクタ 第１図 第２図 第３図 殺径□ ａａ→
ローサイトメータを説明するための図、 第３図ＡおよびＢは測定データのサイトグラムを示す図
である。 １− ラテックス ２・−・固相抗体３−・抗
原 ４−標識抗体５−・免疫複合体
６−残余の標識抗体１１− フローセル １２
−・ニードル１３−反応液 １４・−レーザ
光１５．１６−ディテクタ 第１図 第２図 第３図 殺径□ ａａ→
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、サンプルと、抗原または抗体を所定の物質で標識し
た標識抗原または抗体と、抗原または抗体を固相化した
担体とを反応させた後、その反応液を流しながら前記担
体を順次検出し、この検出した担体情報に基づいて前記
担体に結合した標識抗原または抗体と、結合しないそれ
とを分離することを特徴とする免疫学的分析方法。 ２、前記反応液をフローサイトメータに流して、前記担
体に結合した標識抗原または抗体と、結合しないそれと
を電気的に分離すると同時に、前記担体に結合した標識
抗原または抗体を測定するこを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の免疫学的分析方法。 ３、前記担体に結合した標識抗原または抗体と、結合し
ないそれとを分離した後、前記担体に結合した標識抗原
または抗体を測定することを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の免疫学的分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25520584A JPS61132868A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25520584A JPS61132868A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61132868A true JPS61132868A (ja) | 1986-06-20 |
| JPH0588422B2 JPH0588422B2 (ja) | 1993-12-22 |
Family
ID=17275478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25520584A Granted JPS61132868A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61132868A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
| JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
| JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
| JPS5826268A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-02-16 | インタ−ナシヨナル・リモ−ト・イメ−ジング・システムズ | 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 |
-
1984
- 1984-12-03 JP JP25520584A patent/JPS61132868A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
| JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
| JPS5826268A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-02-16 | インタ−ナシヨナル・リモ−ト・イメ−ジング・システムズ | 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 |
| JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0588422B2 (ja) | 1993-12-22 |
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