JPS61132868A - 免疫学的分析方法 - Google Patents
免疫学的分析方法Info
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- JPS61132868A JPS61132868A JP25520584A JP25520584A JPS61132868A JP S61132868 A JPS61132868 A JP S61132868A JP 25520584 A JP25520584 A JP 25520584A JP 25520584 A JP25520584 A JP 25520584A JP S61132868 A JPS61132868 A JP S61132868A
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(技術分野)
本発明は免疫学的分析方法に関するものである。
(従来技術)
血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等の蛋白質、
ホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造が類似して
いたり、ごく微量であるために、通常の分析方法では同
定、定量が困難である。そこで、これらの物質の分析に
は、一般に抗原抗体反応を利用した免疫学的な分析方法
が用いられている。。
ホルモン、細菌、ウィルス等はその分子構造が類似して
いたり、ごく微量であるために、通常の分析方法では同
定、定量が困難である。そこで、これらの物質の分析に
は、一般に抗原抗体反応を利用した免疫学的な分析方法
が用いられている。。
このような免疫学的分析方法には、例えば標識物質を用
いるものとして、RIA(ラジオイムノアッセイ)、E
IA(エンザイムイムノアッセイ)、FIA(フルオロ
イムノアッセイ)等がある。また、これらの標識物質を
用いる分析方法は、測定系において、例えば標識物質で
標識した抗体(抗原)とサンプル中の抗原(抗体)とが
抗原抗体反応を起こした免疫複合体(Bound)と、
抗原抗体反応に関与せず、自由(Free)な状態で残
余する標識抗体(抗原)とを分離する操作、いわゆるB
−F分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要としな
いホモジニアス法とに分類される。
いるものとして、RIA(ラジオイムノアッセイ)、E
IA(エンザイムイムノアッセイ)、FIA(フルオロ
イムノアッセイ)等がある。また、これらの標識物質を
用いる分析方法は、測定系において、例えば標識物質で
標識した抗体(抗原)とサンプル中の抗原(抗体)とが
抗原抗体反応を起こした免疫複合体(Bound)と、
抗原抗体反応に関与せず、自由(Free)な状態で残
余する標識抗体(抗原)とを分離する操作、いわゆるB
−F分離を必要とするヘテロジニアス法と、必要としな
いホモジニアス法とに分類される。
上記のへテロジニアス法による分析方法としては、特開
昭53−10495号公報において、カラムクロマトグ
ラフィーを利用してB−F分離をけうよにうしたものが
提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物f(F
ree)を選択的に吸着し、免疫複合体(Bound)
を吸収しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を有す
るゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤として用
いてB−F分離を行うというものである。
昭53−10495号公報において、カラムクロマトグ
ラフィーを利用してB−F分離をけうよにうしたものが
提案されている。これは、例えば溶液中の遊離物f(F
ree)を選択的に吸着し、免疫複合体(Bound)
を吸収しないイオン交換樹脂や、分子ふるい効果を有す
るゲルクロマトグラフィー用の充填剤を吸着剤として用
いてB−F分離を行うというものである。
しかし、このようにB−F分離をカラムクロマトグラフ
ィーを用いて行うものにおいては、免疫複合体の大きさ
や形状にばらつきがあったり、免疫複合体と遊離物質と
の大きさが近接しているとB−F分離が困難となり、精
度が悪くなる。このため、例えば免疫グロブリン等の試
薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類
似した分子の測定には使用できず、分析項目が極めて制
限される。
ィーを用いて行うものにおいては、免疫複合体の大きさ
や形状にばらつきがあったり、免疫複合体と遊離物質と
の大きさが近接しているとB−F分離が困難となり、精
度が悪くなる。このため、例えば免疫グロブリン等の試
薬として用いる抗体と同じ分子や、化学的、物理的に類
似した分子の測定には使用できず、分析項目が極めて制
限される。
(発明の目的)
本発明の目的は、上述した不具合を解決し、B−F分離
を常に確実に行うことができ、所望の分析を容易かつ高
精度にできる免疫学的分析方法を提供しようとするもの
である。
を常に確実に行うことができ、所望の分析を容易かつ高
精度にできる免疫学的分析方法を提供しようとするもの
である。
(発明の概要)
本発明の免疫学的分析方法は、サンプルと、抗原または
抗体を所定の物質で標識した標識抗原または抗体と、抗
原または抗体を固相化した担体とを反応させた後、その
反応液を流しながら前記担体を順次検出し、この検出し
た担体情報に基づいて前記担体に結合した標識抗原また
は抗体と、結合しないそれとを分離することを特徴とす
るものである。
抗体を所定の物質で標識した標識抗原または抗体と、抗
原または抗体を固相化した担体とを反応させた後、その
反応液を流しながら前記担体を順次検出し、この検出し
た担体情報に基づいて前記担体に結合した標識抗原また
は抗体と、結合しないそれとを分離することを特徴とす
るものである。
(実施例)
第1図は本発明の分析方法における反応模式図 ゛
の一例を示すものである。本例において、符号1は担体
に用いるラテックスで、例えば5μの均一な径のポリス
チレン製のものに物理的吸着により固相抗体2が固相化
されている。符号3はサンプルである血清等に含まれて
いる分析対象となる抗原で、符号4は抗原3に特異的に
結合する抗体をFITC等の螢光物質で標識した標識抗
体である。
の一例を示すものである。本例において、符号1は担体
に用いるラテックスで、例えば5μの均一な径のポリス
チレン製のものに物理的吸着により固相抗体2が固相化
されている。符号3はサンプルである血清等に含まれて
いる分析対象となる抗原で、符号4は抗原3に特異的に
結合する抗体をFITC等の螢光物質で標識した標識抗
体である。
また、符号5は抗原抗体反応後の免疫複合体(Boun
d)であり、符号6は残余の標識抗体(Free)であ
る。
d)であり、符号6は残余の標識抗体(Free)であ
る。
以下、ヒトIgEの分析を例にとって説明する。
この場合、ラテックス1には抗ヒトIgEモノクロナル
抗体2を吸着させる。モノクロナル抗体の使用はラテッ
クス粒子同志の凝集を防止し、より特異的に抗原と結合
させる目的による。サンプルとしての抗原はヒトIgE
3とし、標識抗体4には、FITC[識抗ヒトIgB
抗体を用いる。なお、標識抗体4は非特異吸着を少なく
、また反応速度を高める目的で、Fabフラグメントを
用いるのが望ましい。反応は、反応用緩衝液200μl
に固相抗体結合ラテレクス溶液50μlと、サンプル1
0μlと、標識抗体溶液50μlとを添加してjテわせ
る。
抗体2を吸着させる。モノクロナル抗体の使用はラテッ
クス粒子同志の凝集を防止し、より特異的に抗原と結合
させる目的による。サンプルとしての抗原はヒトIgE
3とし、標識抗体4には、FITC[識抗ヒトIgB
抗体を用いる。なお、標識抗体4は非特異吸着を少なく
、また反応速度を高める目的で、Fabフラグメントを
用いるのが望ましい。反応は、反応用緩衝液200μl
に固相抗体結合ラテレクス溶液50μlと、サンプル1
0μlと、標識抗体溶液50μlとを添加してjテわせ
る。
なお、これらの試薬類は、全て同時に添加しても、また
抗原を固相抗体と反応させて後、標識抗体と反応させる
ように逐次添加しても良い。
抗原を固相抗体と反応させて後、標識抗体と反応させる
ように逐次添加しても良い。
ここで、例えば37℃、10分間反応させると、固相抗
体−抗原−標識抗体の免疫複合体5と残余の標識抗体6
とが生成される。本例では、これを第2図に示すフロー
サイトメータに流して電気的にB−F分離する同時に測
定する。
体−抗原−標識抗体の免疫複合体5と残余の標識抗体6
とが生成される。本例では、これを第2図に示すフロー
サイトメータに流して電気的にB−F分離する同時に測
定する。
フローサイトメータは既に知られているように、細胞の
分析専用機であり、フローセルll中のニードル12に
反応液13を流し、レーザ光14をその流れに照射して
細胞から発する散乱光や螢光を測定する。通常、前方散
乱光はレーザ入射光とほぼ水平に位置するディテクタ1
5で検知され、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢
光は、レーザ光−14の入射角に対して垂直方向に位置
するディテクタ16で検知され、細胞表面の螢光物質等
の測定に用いられる。レーザ光14は単一波長であるた
め、使用できる螢光色素に制限があるが、本例の分析方
法において用いる螢光色素FITCは波長489no+
近くの光を吸収して波長515na+の螢光を発するの
で、この場合は波長488nmの光を発するArレーザ
を用いれば良い。
分析専用機であり、フローセルll中のニードル12に
反応液13を流し、レーザ光14をその流れに照射して
細胞から発する散乱光や螢光を測定する。通常、前方散
乱光はレーザ入射光とほぼ水平に位置するディテクタ1
5で検知され、主に細胞サイズの測定に用いられる。螢
光は、レーザ光−14の入射角に対して垂直方向に位置
するディテクタ16で検知され、細胞表面の螢光物質等
の測定に用いられる。レーザ光14は単一波長であるた
め、使用できる螢光色素に制限があるが、本例の分析方
法において用いる螢光色素FITCは波長489no+
近くの光を吸収して波長515na+の螢光を発するの
で、この場合は波長488nmの光を発するArレーザ
を用いれば良い。
このようにして、反応後の第1図に示す免疫複合体5と
残余の標識抗体6とが、混ざり合った反応液13をニー
ドル12からフローセル11中に導入し、ニードル12
中を流れる免疫複合体と残余の標識抗体等の各成分のレ
ーザ光14による散乱光および螢光をディテクタ15お
よび16でそれぞれ検知すれば、それらのパラメータに
よって第3図A、Bに示すようなサイトグラムが得られ
る。なお、第3図Aは抗原抗体が行われた場合のサイト
グラムを示し、この実施例では抗ヒトIgH[i!li
抗体が、サンプル中のIgEと結合した抗ヒトIgE
MCA固相ラテックスのxgg部、に結合し、その免疫
複合体の発する螢光がラテックス粒子の粒径に対応する
位置21に検出されている。一方、抗原抗体反応にあず
からなかった残余の標識抗体は粒子径が極小なので、位
置22あたりに検出される。このようにして、螢光量測
定値が得られれば、予め既知濃度抗原から同様にして求
めた螢光強度と抗原濃度との関係を表す検量線に基づい
てサンプル中のIBE濃度を求めることができる。
残余の標識抗体6とが、混ざり合った反応液13をニー
ドル12からフローセル11中に導入し、ニードル12
中を流れる免疫複合体と残余の標識抗体等の各成分のレ
ーザ光14による散乱光および螢光をディテクタ15お
よび16でそれぞれ検知すれば、それらのパラメータに
よって第3図A、Bに示すようなサイトグラムが得られ
る。なお、第3図Aは抗原抗体が行われた場合のサイト
グラムを示し、この実施例では抗ヒトIgH[i!li
抗体が、サンプル中のIgEと結合した抗ヒトIgE
MCA固相ラテックスのxgg部、に結合し、その免疫
複合体の発する螢光がラテックス粒子の粒径に対応する
位置21に検出されている。一方、抗原抗体反応にあず
からなかった残余の標識抗体は粒子径が極小なので、位
置22あたりに検出される。このようにして、螢光量測
定値が得られれば、予め既知濃度抗原から同様にして求
めた螢光強度と抗原濃度との関係を表す検量線に基づい
てサンプル中のIBE濃度を求めることができる。
また、サンプル中にIgBが少なかった場合は、第3図
Bに示すように、残余の標識抗体が位置22に集中し、
抗体結合ラテックスからは螢光は検出されない。
Bに示すように、残余の標識抗体が位置22に集中し、
抗体結合ラテックスからは螢光は検出されない。
このように、フローサイトメータを使って測定するラテ
ックスイムノアッセイを用いると、免疫複合体と残余の
標識抗体との粒子としての大きさが大きく異なるため、
測定上の識別が容易である。
ックスイムノアッセイを用いると、免疫複合体と残余の
標識抗体との粒子としての大きさが大きく異なるため、
測定上の識別が容易である。
また、抗原や抗体の大きさに比べ、ラテックス粒゛子の
大きさがかなり大きいから免疫複合体の大きさ、形状の
バラツキがかなり小さくなり、したがって高精度に分析
できる。更に、反応溶液を機械的にではなく電気的にB
−F分離するものであるから、そのまま測定することが
でき、したがって高速で、多検体測定が可能である。
大きさがかなり大きいから免疫複合体の大きさ、形状の
バラツキがかなり小さくなり、したがって高精度に分析
できる。更に、反応溶液を機械的にではなく電気的にB
−F分離するものであるから、そのまま測定することが
でき、したがって高速で、多検体測定が可能である。
なお、本発明は上述した例にのみ限定されるものではな
く、幾多の変更または変形が可能である。
く、幾多の変更または変形が可能である。
例えば、担体はラテックスに限らず、分子量の均一な人
工細胞等、測定対象に応じそ任意の形状や大きさのもの
を用いることができる。また、フローサイドメータにソ
ーティング機能を付加して免疫複合体、残余の標識抗体
をB−F分離してから測定を行うこともできる。このよ
うにすれば、螢光物質以外の各種の標識物質を用いるこ
とができる。更に、フローサイトメータに反応装置やオ
ートサンプラ等を付加することによって自動測定も容易
に行うことができる。この場合、フローサイトメータに
おける測定速度は約5.000粒子/secであるから
、1つのサンプルについてlXl0”粒子を測定したと
しても、3分前後で高速に分析することができる。また
、本発明は競合法による分析にも有効に適用することが
できる。
工細胞等、測定対象に応じそ任意の形状や大きさのもの
を用いることができる。また、フローサイドメータにソ
ーティング機能を付加して免疫複合体、残余の標識抗体
をB−F分離してから測定を行うこともできる。このよ
うにすれば、螢光物質以外の各種の標識物質を用いるこ
とができる。更に、フローサイトメータに反応装置やオ
ートサンプラ等を付加することによって自動測定も容易
に行うことができる。この場合、フローサイトメータに
おける測定速度は約5.000粒子/secであるから
、1つのサンプルについてlXl0”粒子を測定したと
しても、3分前後で高速に分析することができる。また
、本発明は競合法による分析にも有効に適用することが
できる。
(発明の効果)
以上述べたように、本発明によれば、担体を用いるから
その免疫複合体と残余の標識抗体との大きさが大きく異
なり、したがって測定上の分離が簡単にできると共に、
免疫複合体の大きさ、形状のばらつきを極めて小さくで
きるから精度の高い分析を行うことができる。また、担
体は任意の大きさ、形状のものを選ぶことができるから
、サンプル分子の種類や大きさに制限されない。更に、
上述した実施例によれば、反応液を電気的にB−F分離
しながら同時に測定できるから、高速度、多検体測定を
目的とした自動比が可能である。
その免疫複合体と残余の標識抗体との大きさが大きく異
なり、したがって測定上の分離が簡単にできると共に、
免疫複合体の大きさ、形状のばらつきを極めて小さくで
きるから精度の高い分析を行うことができる。また、担
体は任意の大きさ、形状のものを選ぶことができるから
、サンプル分子の種類や大きさに制限されない。更に、
上述した実施例によれば、反応液を電気的にB−F分離
しながら同時に測定できるから、高速度、多検体測定を
目的とした自動比が可能である。
第1図は本発明における一例の反応模式図、第2図はフ
ローサイトメータを説明するための図、 第3図AおよびBは測定データのサイトグラムを示す図
である。 1− ラテックス 2・−・固相抗体3−・抗
原 4−標識抗体5−・免疫複合体
6−残余の標識抗体11− フローセル 12
−・ニードル13−反応液 14・−レーザ
光15.16−ディテクタ 第1図 第2図 第3図 殺径□ aa→
ローサイトメータを説明するための図、 第3図AおよびBは測定データのサイトグラムを示す図
である。 1− ラテックス 2・−・固相抗体3−・抗
原 4−標識抗体5−・免疫複合体
6−残余の標識抗体11− フローセル 12
−・ニードル13−反応液 14・−レーザ
光15.16−ディテクタ 第1図 第2図 第3図 殺径□ aa→
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、サンプルと、抗原または抗体を所定の物質で標識し
た標識抗原または抗体と、抗原または抗体を固相化した
担体とを反応させた後、その反応液を流しながら前記担
体を順次検出し、この検出した担体情報に基づいて前記
担体に結合した標識抗原または抗体と、結合しないそれ
とを分離することを特徴とする免疫学的分析方法。 2、前記反応液をフローサイトメータに流して、前記担
体に結合した標識抗原または抗体と、結合しないそれと
を電気的に分離すると同時に、前記担体に結合した標識
抗原または抗体を測定するこを特徴とする特許請求の範
囲第1項記載の免疫学的分析方法。 3、前記担体に結合した標識抗原または抗体と、結合し
ないそれとを分離した後、前記担体に結合した標識抗原
または抗体を測定することを特徴とする特許請求の範囲
第1項記載の免疫学的分析方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25520584A JPS61132868A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25520584A JPS61132868A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61132868A true JPS61132868A (ja) | 1986-06-20 |
JPH0588422B2 JPH0588422B2 (ja) | 1993-12-22 |
Family
ID=17275478
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25520584A Granted JPS61132868A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | 免疫学的分析方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61132868A (ja) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
JPS5826268A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-02-16 | インタ−ナシヨナル・リモ−ト・イメ−ジング・システムズ | 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 |
-
1984
- 1984-12-03 JP JP25520584A patent/JPS61132868A/ja active Granted
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5215815A (en) * | 1975-07-23 | 1977-02-05 | Coulter Electronics | Measurement of presence of antigen or antibody within sample |
JPS5616872A (en) * | 1979-07-13 | 1981-02-18 | Ortho Diagnostics | Automatized identification and counting method of and apparatus for subclass of specified blood cell |
JPS5826268A (ja) * | 1981-07-22 | 1983-02-16 | インタ−ナシヨナル・リモ−ト・イメ−ジング・システムズ | 懸濁液中の粒子と液体との間の反応物質の分布の分析法 |
JPS5821166A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Fujitsu Ltd | 被測定物質分離方式 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0588422B2 (ja) | 1993-12-22 |
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