JPS6112547B2

JPS6112547B2 -

Info

Publication number: JPS6112547B2
Application number: JP53081851A
Authority: JP
Inventors: Uorutaa Erudoretsudo Emetsuto; Yakobu Hooru Shuumeikaa Hyuubaato
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1977-07-05
Filing date: 1978-07-05
Publication date: 1986-04-09
Also published as: FR2396976A1; FR2396976B1; GB1575998A; JPS5417119A; CA1084394A; DE2824903C2; US4128629A; DE2824903A1

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は液体中の非常に低濃度の物質を測定す
るための分析方法に関する。さらに詳細には本発
明はコルチゾールの免疫分析（immunoassay）
に関する。免疫分析Ａとは分泌液中の物質の存在あるい
は濃度を測定する方法を意味し、この方法はある
意味で抗体と、それに対してこの抗体が特異であ
る物質（抗原あるいはハプテン）との合成
（complexation）を必要とする。ある特定の物質
の抗体はその物質に対して著しく特異となること
が知られており、この特異性は従来血液のような
人体分泌液中に非常に少量存在する物質の存在あ
るいは濃度を測定するための種々の免疫分析技術
に用いられている。典型的な免疫分析は、ある特定の物質の分子と
標識化されている同様の分子の間の、この物質
（標識化されてないものと標識化されているもの
の両方）に対して特異である抗体上の限られた数
の反応場所（complexing site）のための競争に
基いて行なわれる。反応場所のための競争の後、
合成された物質は反応溶液から分離され、分離さ
れた物質あるいは残りの溶液中の標識物質
（label）の量が定量される。この定量はあらかじ
め調製した標準に照して行なわれ標識化されてな
い物質の存在あるいは量が定量される。種々の標識物質が知られており、免疫分析に用
いられている。例えば、米国特許第3940475号に
は螢光免疫分析（FIA）に有用な螢光物質が述べ
られている。米国特許第3654090号に説明されて
いるように、酵素標識物質は酵素免疫分析
（EIA）を行なうために抗体あるいは抗原と結合
される。米国特許第3555143号に述べられている
ように、放射線免疫分析（RIA）を行なうために
抗体あるいは物質（抗原あるいはハプテン）中に
放射性同位元素が混合される。本明細書で用いら
れる「標識物質」、「標識」、「トレーサー」あるい
はこれらと同意義の表現は、これらの既知の標識
物質の何れをも含む。先に述べたように、免疫分析はある意味でいず
れか一方が標識化されている物質とその抗体との
間の免疫化学的合成を必要とする。その間に標識
化された物質が標識化されてない物質と争い、あ
るいはそれと反応し、あるいはそれを置換する適
当な培養時間を与え、そ後標識化物質を定量する
ことによつて、既知の方法で未知のものを測定す
るこができる。しかしながら、定量の前に免疫化学的に合成さ
れた生成物（少なくともいくらかの標識物質を含
んでいなければならない）を周囲の培養媒体（残
りの標識物質を含む）から分離する必要がある。
この分離は合成種（complexing species）の１
つを固定された（不溶性化された）しかし活性な
形状で与えることによつて容易に行なうことがで
きる。例えば、抗原物質、ハプテンあるいはその
抗体は、生物学的あるいは免疫化学的活動度を実
質的に失うことなく種々の水に不溶性の担体材料
に付けられあるいは混合され得ることが知られて
いる。このことは例えば米国特許第3555143号
（有機支持体あるいは担体）および米国特許第
3652761号（無機担体）に述べられている。免疫
分析における反応物のいずれかがこのような固定
化された形状で用いられる場合には、標識物質定
量のために容易に分離可能な（例えば遠心分離に
よつて）固体相が存在する。実質的に水に不溶液
の担体材料と結合された、すなわちその上に固定
された抗体あるいは抗原からなる複合体の使用
は、通常固体相免疫分析（SPIA）と呼ばれる。
固体相放射性免疫分析（SPRIA）において無機
珪質材料を抗体の支持体として使用することが米
国特許第3975511号に述べられている。血清中に存在する物質の濃度を測定するにあた
つての主な問題は、しばしばより高濃度で存在す
る他の物質による妨害である。この妨害のほとん
どは蛋白質によるものである。デブロツキング剤
（deblocking agent）として知られる化学薬品を
使用することよつて、抗体に重大な影響をおよぼ
すことなくある妨害性の蛋白質を時には不活性に
することができることが知られている。例えば米
国特許第3911096号には、甲状線ホルモンの免疫
分析（SPIAではない）のために、８−アニリノ
−１−ナフタレンスルホン酸（ANS）およびこ
れに関連する化合物のようなデブロツキング剤を
使用することが述べられている。残念なことに、
ある脱ブロツキング剤があるIA系中で有効な量
使用される時、抗体はその活動度の一部を失うこ
とが見出された。このことは既知のデブロツキン
グ剤のある系への使用、特に抗体の妨害性の蛋白
質がデブロツキング剤によつて同じ程度に不活性
化される系への使用を躊躇させるものである。人体の分泌液（例えば血清）中のコルチゾール
の濃度を正確に測定することが望ましいことであ
ることはよく知られている。コルチゾール副腎皮
質によつて生成され分泌される主なグルココルチ
コイドであり、その存在は多くの人体機能に影響
をおよぼす。従つてコルチゾールの濃度の測定は
種々の病気の診断および治療に有用である。臨床
的に重要なコルチゾールの濃度範囲は非常に低い
ので（例えば約12.5乃至800ng／ml）、コルチゾー
ルの濃度は通常免疫分析技術によつて測定され
る。血清中にはコルチゾールの免疫分析を妨害する
いくつかのコルチゾール結合性蛋白質が存在す
る。最もよく引用される妨害性の蛋白質はトラン
スコルチン（TC）である。トランスコルチンは
比較的低濃度で存在しているとは言え、かなり高
いコルチゾール結合能力を有している。従つて何
れのコルチゾール分析においても、精度を上げる
ためにTCおよびその他のコルチゾール結合性蛋
白質の妨害効果を除去するか、あるいは少なくと
も最少にすることが必要である。本明細書におい
てはTCとその他のコルチゾール結合性蛋白質と
をまとめて「TC」と呼ぶことにする。 TCからコルチゾールを確実に解放するために
デブロツキング剤を使用することは、デブロツキ
ング剤がコルチゾール抗体をも不活性にしがちで
あるのでうまく行かない。従つてTCの除去ある
いは不活性化のためには、労力を要しまた時間が
かかる抽出工程あるいは熱変性工程を使用するこ
とが必要である。これらの付加される工程は厄介
なものであるのみならず、工程が付加されたこと
による誤つた結果の可能性を生ぜしめる。全く驚くべき事に、本発明者等は室温で行なう
ことができる抽出不用のコルチゾールの免疫分析
方法を発明した。本発明の分析方法の詳細および
その好ましい態様を以下に述べる。血清試料中のコルチゾールの濃度を測定するた
めの本発明の免疫分析方法はａ試料、標識化されたコルチゾールおよび有効
な量のデブロツキング剤を、負に帯電された支
持体材料とこの支持体材料の表面に固定された
抗コルチゾール抗体とからなる複合体と共に水
媒体中で、約4.0乃至約6.5の範囲のPH値で、一
部が上記標識化されたコルチゾールを含む免疫
化学的合成物が上記複合体上に形成されるのに
充分な条件の下で培養する工程、ｂ上記免疫化学的合成物が表面に形成された上
記複合体を培養媒体から分離する工程、ｃ分離された複合体上の、あるいは残つた培養
媒体中の標識物質の量を測定する工程、およびｄ上記測定工程で測定された測定値から、標準
に基づいて試料中のコルチゾールの濃度を測定
する工程からなる。好ましい具体例においては、反コルチゾール抗
体は広い表面積を有する珪質粒子の表面に固定さ
れ、デブロツキング剤としてANSが用いられ
る。本発明は、抗コルチゾール抗体が活性の状態で
ある負に帯電された支持体物質上に固定された場
合、抗体の最適PH値範囲は約7.0乃至8.0の通常の
範囲から4.0乃至6.5の酸性範囲に移動する傾向に
あるという事の発見にいくぶんかは基づくもので
ある。この低いPH値において、抗体は固定される
前のより高いPH値における場合と同じように作用
する。この現象は抗体の微環境における変化のた
めであると考えられる。そしてこの現象は既知の
デブロツキング剤と共にコルチゾールの免疫分析
においてTC抽出工程あるいは熱変性工程を回避
するのに用いることができる。低いPH値（より酸
性）においてTCはすでに部分的に不活性化され
ており、TCの妨害なく分析を行なうためには比
較的低濃度のデブロツキング剤のみが必要とされ
る。本発明のすべての根拠は第１図、第２図および
第３図に見ることができる。第１図および第２図
において、ΔＢはコルチゾール免疫分析における
TC妨害効果の量であり、TCが存在しない場合の
コルチゾールの結合パーセント（％Ｂ）とTCが
存在する場合の％Ｂの差を表わす。第１図に示さ
れるように、TCすなわち“トランスコルチン”
（トランスコルチン自体に関連するコルチゾール
結合性物質を加えたもの）の最適PH値は明らかに
アルカリ性範囲（約８乃至９）にある。このこと
は反応混合物のPH値がこのPH値から離れれば離れ
るほどTC結合による妨害はより小さくなること
を意味する。第２図はPH5.5およびPH8.5の場合の異なつたデ
ブロツキング剤濃度におけるコルチゾールのTC
への結合を示すグラフである。第２図から明らか
なように、低いPH値においてはより少量のANS
しか必要でない。残念なことにANSのようなデ
ブロツキング剤はわずかに抗体を不活性化する傾
向にあるので、これは有益な効果である。従つ
て、できるだけ少量のデブロツキング剤を使用し
てコルチゾールを解放するのが有利である。第３図は抗体支持体を使用して得られや最適PH
値を示すグラフである。第３図においてCPGと
は制御れた細孔を有するガラスを意味する。第３
図に示されるように、珪質支持体が使用される場
合、最適PH値は通常の7.0乃至8.0の生理学的範囲
から4.0乃至6.5のいくぶん異常な範囲に移動す
る。これは抗体のコルチゾール結合能力を低下さ
せることなく起る。この現象はTCがアルカリ性
領域に最適PH値を有している事実と共に抗体系に
対して最小の逆効果しか与えない比較的少量のデ
ブロツキング剤の使用を可能にする（少量である
ためにデブロツキング剤は有効に使用され得
る）。このように、第１図、第２図および第３図
の結果を組み合わせたものが本発明のすべての根
拠を構成する。有効なデブロツキング剤は当業者
であれば容易に決めることができ、その最適量は
第２図のデーターをとるために本発明者等が行な
つたように実験的に決めることができる。非常に好ましい具体例において、負に帯電され
た抗体支持体材料は溶融シリカの微細粒子あるい
は多孔性ガラス（例えばCPG）のような珪質材
料からなる。米国特許第39575511号に詳細に述べ
られている理由から、好ましい支持体の粒子サイ
ズは0.7乃至3.0ミクロンの範囲である。この粒子
サイズ範囲は培養工程中に全ての複合体が懸濁す
ることを可能にする。従つて反応物の最大の露出
を確実に行なうことができる。またこの粒子サイ
ズ範囲は複合体を分離するのに一般的な遠心分離
機の使用を可能にする。支持体に要求されること
は主として、抗コルチゾール抗体がそれに付けら
れる時最適PH値が酸性範囲（7.0以下）に移動す
るように負に帯電された表面を有することであ
る。単位重量当りの表面積が非常に広いことは最
大の抗体装填を確実に行なうのに非常に望まし
く、これは微細な粒子状支持体を使用することに
よつて満たされる。抗体は単純な吸着や化学的方法（共有結合）の
ような種々の方法によつて支持体上に付けられす
なわち固定され得るが、非常に好ましい具体例に
おいては、抗体はシランカツプリング剤を介在さ
せて珪質支持体上に結合される。種々の生物学的
に活性な物質（例えば抗体、抗原、酵素、助酵素
等）を無機表面に付けるのにこれらのカツプリン
グ剤を使用することはよく知られている。以下に
示される実施例においては、支持体はシラン化さ
れた多孔性ガラスおよびシラン化された溶融シリ
カからなる。用いられるデブロツキング剤は酸性環境中で充
分に作用するものである。デブロツキング剤に要
求されることは主として、酸性のPH値、特にPH
4.0乃至6.5の範囲において固定された抗コルチゾ
ール抗体よりもTCを不活性化することである。
この要求を満たすタイプのデブロツキング剤は米
国特許第3911096号に述べられている。好ましい
デブロツキング剤は上記特許に述べられている
ANSおよびこれに関連する化合物である。コルチゾール分子と結合あるいは混合可能な適
当な標識物質は何れも使用することができるが、
一般に使用されており、高度の分析感度を与える
放射性同位元素標識物質を用いるのが好ましい。
以下に述べる実施例においてトレーサーと呼ばれ
る標識化されたコルチゾールは、既知の方法によ
つて調製された¹²⁵によつて標識化されたコル
チゾールのチラミン誘導体からなる。この物質は
普通の下水溝システムによつて処分することがで
きる。本発明の分析方法は最初の培養工程、分離工
程、標識物質定量工程および測定工程の４つの基
本的な工程からなる。他のほとんどの分析方法と
違つて、本発明の分析方法はピペツトによる採集
操作は３回しか必要でなく、従つて操作誤りの可
能性を減らすことができる。培養工程は室温で１
時間で行なうことができ、これは明らかに有利で
ある。以下の標準曲線に示されるように、本発明
の分析方法は12.5ng／ml乃至約800ng／mlの範囲
の確認された感度を有しており、これはAMおよ
びPM両方の臨床的に重要な血清コルチゾールの
範囲を容易にカバーする。次に実施例によつて本発明を説明する。実施例確認されたガラス試験管中でトレーサー（約
50000DPM）、200μｇのANSおよびPBSの親液性
混合物に水を加え100μの水溶液を調製した。
この水溶液に未知のコルチゾール濃度を有する血
清試料25μｇをピペツトで加えた。ダーキースス
タツフブランド（Durkees staff brand）のよう
な非妨害性の赤色染料をトレーサーの存在を示す
ためにトレーサー溶液に含ませてもよい。次に、固定された抗体（0.20mgの抗コルチゾ
ール抗体がＮ−ハイドロオキシスクシニミド結合
によつて約1.7ミクロンの平均粒子サイズを有す
るシラン化されたガラス粒子に化学的に結合され
たもの）の懸濁液１mlをピペツトで試験管に入れ
た。試験管を２，３秒渦動し、固定された抗体の
複合体を懸濁させた後室温で約１時間培養した。
次に試験管を約10分間約1400乃至1600の引力ｇで
遠心分離した。比較的高密度のガラス支持体はこ
の分離工程を容易にする。遠心分離の後、上澄み
液をデカンテーシヨンで分離し、この上澄み液あ
るいは試験管の底の複合体の放射能をカウントし
た。最初のトレーサーの１分間当りの崩壊
（DPM）における放射能量は知られているので、
既知の相関技術を使用することによつて、複合体
と結合した量（未知のコルチゾールと複合体上の
サイドを争つた量）から存在するコルチゾールの
示度を得ることができる。相関工程のための標準曲線を確立するために、
既知の濃度に対して既知の量の標識化されたコル
チゾールの結合％における差異をプロツトする必
要がある。“既知”のコルチゾール濃度の代表的
な標準は0ng／ml、12.5ng／ml、25ng／ml、
50ng／ml、100ng／ml、200ng／ml、400ng／mlお
よび800ng／mlである。このようにして、未知の
濃度における結合％（％Ｂ）（結合したトレーサ
ーのDPMによつて測定される）を標準曲線の同
じ％Ｂと相関することによつて、未知の濃度を測
定することができる。第４図においては上記技術
が用いられているが、各標準の％Ｂは0ng／mlに
おける％Ｂに正規化されており、％Ｂ標準×／％
Ｂ標準０×100で表わされている。このＢ／B₀プ
ロツトは日常的に使用される。この方法および第
４図の典型的な標準曲線の信頼性は、未知の血清
試料を用いて臨床試験においてくり返し確認され
た。 TCからコルチゾールを解放するに際してのデ
ブロツキング剤の値を下記第１表に示す。第１表
においては、ANSとPHによつて血清試料から解
放されたコルチゾール量が、TCを変性する典型
的な加熱工程によつて解放されたコルチゾールの
量と比較して示されている。この加熱工程は、血
清試料を100℃で約10分間加熱することによつて
行なわれるものである。第１表は２つの技術によ
つて得られる典型的な患者のコルチゾール値
（ng／ml）を示している。 The present invention relates to an analytical method for determining very low concentrations of substances in liquids. More specifically, the present invention relates to an immunoassay of cortisol.
Regarding. Immunoassay A refers to a method of measuring the presence or concentration of a substance in a secreted fluid; complexity). Antibodies for a particular substance are known to be highly specific to that substance, and this specificity is traditionally used to measure the presence or concentration of a substance that is present in very small amounts in human secretions such as blood. It is used in various immunoanalytical techniques. Typical immunoassays are specific for a given substance (both unlabeled and labeled) between molecules of a given substance and similar molecules that are labeled. It is based on competition for a limited number of complexing sites on the antibody. After competition for reaction places,
The synthesized substance is separated from the reaction solution, and the amount of the separated substance or label in the remaining solution is quantified. This quantification is performed with reference to a previously prepared standard, and the presence or amount of unlabeled substances is quantified. Various labeling substances are known and used in immunoassays. For example, US Pat. No. 3,940,475 describes fluorophores useful in fluorescence immunoassay (FIA). As described in US Pat. No. 3,654,090, enzyme labels are combined with antibodies or antigens to perform enzyme immunoassays (EIA). As described in US Pat. No. 3,555,143, radioisotopes are mixed into antibodies or substances (antigens or haptens) to perform radioimmunoassays (RIA). As used herein, the terms "labeling substance,""label,""tracer," or expressions synonymous with these include any of these known labeling substances. As mentioned above, immunoassays in some sense require immunochemical synthesis between a substance, one of which is labeled, and its antibody. By providing an appropriate incubation time during which the labeled substance competes with, reacts with, or displaces the unlabeled substance, and then quantifying the labeled substance, using known methods. can measure unknown things. However, before quantification, it is necessary to separate the immunochemically synthesized product (which must contain at least some labeled substance) from the surrounding culture medium (which contains the remaining labeled substance).
This separation is one of the complexing species.
This can be easily accomplished by providing the two in a fixed (insoluble) but active form. For example, it is known that antigenic substances, haptens, or antibodies thereof can be attached to or mixed with various water-insoluble carrier materials without substantial loss of biological or immunochemical activity. This is true for example in US Pat. No. 3,555,143 (organic support or carrier) and US Pat.
No. 3652761 (inorganic carriers). If any of the reactants in the immunoassay are used in such immobilized form, there is a solid phase that is easily separable (eg, by centrifugation) for label quantification. The use of a complex consisting of an antibody or antigen bound to, ie immobilized on, a substantially water-insoluble carrier material is commonly referred to as solid phase immunoassay (SPIA).
The use of inorganic siliceous materials as supports for antibodies in solid phase radioimmunoassay (SPRIA) is described in US Pat. No. 3,975,511. The main problem in measuring the concentration of substances present in serum is interference by other substances, which are often present in higher concentrations. Most of this interference is due to proteins. It is known that certain interfering proteins can sometimes be rendered inactive without significantly affecting the antibody by using chemicals known as deblocking agents. For example, US Pat. No. 3,911,096 describes the use of deblocking agents such as 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) and related compounds for immunoassays (not SPIA) of thyroid hormones. That is stated. Unfortunately,
It has been found that when certain deblocking agents are used in effective amounts in certain IA systems, the antibody loses some of its activity. This discourages the use of known deblocking agents in certain systems, particularly in systems where the interfering proteins of the antibody are inactivated to the same extent by the deblocking agent. It is well known that it is desirable to accurately measure the concentration of cortisol in human secretions (eg, serum). Cortisol is the main glucocorticoid produced and secreted by the adrenal cortex, and its presence influences many human body functions. Therefore, measuring the concentration of cortisol is useful in the diagnosis and treatment of various diseases. Because the clinically important cortisol concentration range is very low (eg, about 12.5 to 800 ng/ml), cortisol concentrations are usually measured by immunoassay techniques. There are several cortisol-binding proteins in serum that interfere with immunoassays of cortisol. The most commonly cited interfering protein is transcortin (TC). Although transcortin is present in relatively low concentrations, it has a fairly high cortisol binding capacity. Therefore, in order to increase the accuracy of any cortisol assay, it is necessary to eliminate or at least minimize the interfering effects of TC and other cortisol-binding proteins. In this specification, TC and other cortisol-binding proteins are collectively referred to as "TC." The use of deblocking agents to ensure the release of cortisol from TCs is unsuccessful because deblocking agents also tend to inactivate cortisol antibodies. To remove or inactivate TC, it is therefore necessary to use laborious and time-consuming extraction or heat denaturation steps. These added steps are not only cumbersome, but also create the possibility of erroneous results due to the added steps. Quite surprisingly, the inventors have devised an extraction-free immunoassay method for cortisol that can be performed at room temperature. Details of the analysis method of the present invention and preferred embodiments thereof will be described below. The immunoassay method of the present invention for determining the concentration of cortisol in a serum sample comprises a) combining a sample, labeled cortisol and an effective amount of a deblocking agent with a negatively charged support material and An immunochemical composition comprising a portion of the labeled cortisol is applied to the conjugate in an aqueous medium with a conjugate comprising an anti-cortisol antibody immobilized on a surface at a pH value ranging from about 4.0 to about 6.5. b. separating the complex on the surface of which the immunochemical compound is formed from the culture medium; c. , or measuring the amount of labeling substance in the remaining culture medium; and d) measuring the concentration of cortisol in the sample based on a standard from the measured value in the above measuring step. In a preferred embodiment, anti-cortisol antibodies are immobilized on the surface of siliceous particles having a large surface area and ANS is used as the deblocking agent. The present invention provides that when an anti-cortisol antibody is immobilized on a negatively charged support material in an active state, the optimal pH range of the antibody ranges from a normal range of about 7.0 to 8.0 to an acidic range of about 4.0 to 6.5. It is based in part on the discovery that there is a tendency to move towards At this low PH value, the antibody acts in the same way as it did at the higher PH value before being immobilized. This phenomenon is thought to be due to changes in the antibody microenvironment. This phenomenon can then be used in conjunction with known deblocking agents to avoid the TC extraction step or heat denaturation step in cortisol immunoassays. At low PH values (more acidic) the TC is already partially inactivated and only relatively low concentrations of deblocking agent are required to perform the analysis without interference of the TC. The entire rationale for the invention can be seen in FIGS. 1, 2 and 3. In Figures 1 and 2, ΔB is in the cortisol immunoassay.
It is the amount of TC interfering effect and represents the difference between percent cortisol binding (%B) in the absence of TC and %B in the presence of TC. As shown in Figure 1, TC or “transcortin”
The optimum PH value for transcortin (plus cortisol-binding substances associated with it itself) is clearly in the alkaline range (approximately 8-9). This means that the farther the PH value of the reaction mixture is from this PH value, the less interference will be caused by TC binding. Figure 2 shows the TC of cortisol at different deblocking agent concentrations at PH5.5 and PH8.5.
FIG. As is clear from Figure 2, at lower pH values, a smaller amount of ANS
only necessary. This is a beneficial effect since unfortunately deblocking agents such as ANS tend to slightly inactivate antibodies. Therefore, it is advantageous to use as little deblocking agent as possible to release cortisol. Figure 3 shows the optimal pH obtained using the antibody support.
It is a graph showing values. In FIG. 3, CPG means controlled pore glass. Third
As shown in the figure, when a siliceous support is used, the optimum PH value moves from the normal physiological range of 7.0 to 8.0 to the somewhat abnormal range of 4.0 to 6.5. This occurs without reducing the antibody's ability to bind cortisol. This phenomenon, together with the fact that TC has an optimum PH value in the alkaline region, allows the use of relatively small amounts of deblocking agents that have minimal adverse effects on the antibody system (the small amount of deblocking agents can be used effectively). Thus, the combination of the results of FIGS. 1, 2, and 3 constitutes the entire basis of the present invention. Effective deblocking agents can be readily determined by those skilled in the art, and their optimum amounts can be determined experimentally, as was done by the inventors to generate the data in FIG. In highly preferred embodiments, the negatively charged antibody support material comprises fine particles of fused silica or a siliceous material such as porous glass (eg, CPG). For reasons detailed in US Pat. No. 3,957,5511, the preferred support particle size ranges from 0.7 to 3.0 microns. This particle size range allows all complexes to be suspended during the culturing process. Maximum exposure of reactants can thus be ensured. This particle size range also allows the use of common centrifuges to separate the complexes. The main requirement of the support is that it has a negatively charged surface so that when anti-cortisol antibodies are attached to it, the optimum PH value shifts to the acidic range (7.0 or less). A very high surface area per unit weight is highly desirable to ensure maximum antibody loading, and this is met by the use of fine particulate supports. Antibodies can be attached or immobilized onto the support by a variety of methods, such as simple adsorption or chemical methods (covalent bonding), but in a highly preferred embodiment, the antibodies can be attached or immobilized via a silane coupling agent. and bonded onto a siliceous support. The use of these coupling agents to attach various biologically active substances (eg, antibodies, antigens, enzymes, coenzymes, etc.) to inorganic surfaces is well known. In the examples shown below, the support consists of silanized porous glass and silanized fused silica. The deblocking agent used is one that works well in an acidic environment. The main requirements for deblocking agents are acidic PH values, especially PH values.
It inactivates TC better than immobilized anti-cortisol antibodies in the range of 4.0 to 6.5.
A deblocking agent of the type meeting this requirement is described in US Pat. No. 3,911,096. Preferred deblocking agents are described in the above patents.
ANS and related compounds. Any suitable labeling substance that can bind or mix with cortisol molecules can be used, but
It is preferred to use radioisotope labeled substances that are commonly used and provide a high degree of analytical sensitivity.
The labeled cortisol, referred to as tracer in the examples described below, consists of a tyramine derivative of cortisol labeled with ¹²⁵ prepared by known methods. This material can be disposed of through conventional sewer systems. The analysis method of the present invention consists of four basic steps: an initial culture step, a separation step, a labeling substance quantification step, and a measurement step. Unlike most other analytical methods, the analytical method of the present invention requires only three pipetting operations, thus reducing the possibility of operational errors. The culturing process is carried out at room temperature.
This can be done in hours, which is a clear advantage. As shown in the standard curve below, the analytical method of the present invention has a confirmed sensitivity ranging from 12.5 ng/ml to approximately 800 ng/ml, which is a clinically important Easily covers the range of serum cortisol. Next, the present invention will be explained with reference to Examples. EXAMPLE Tracer (approx.
50000 DPM), 200 μg of ANS and PBS were added to water to prepare a 100 μg aqueous solution.
25 μg of a serum sample with an unknown cortisol concentration was pipetted into this aqueous solution. A non-interfering red dye, such as Durkees staff brand, may be included in the tracer solution to indicate the presence of the tracer. Next, the immobilized antibody (0.20 mg of anti-cortisol antibody was chemically coupled to silanized glass particles with an average particle size of approximately 1.7 microns by N-hydroxysuccinimide linkage). 1 ml of the suspension was pipetted into a test tube. The test tube was vortexed for a few seconds to suspend the immobilized antibody complex, and then incubated at room temperature for about 1 hour.
The tubes were then centrifuged for about 10 minutes at about 1400-1600 g. A relatively dense glass support facilitates this separation step. After centrifugation, the supernatant was separated by decantation, and the radioactivity of the supernatant or the complex at the bottom of the test tube was counted. Since the amount of radioactivity in decays per minute (DPM) of the initial tracer is known,
By using known correlation techniques, an indication of the cortisol present can be obtained from the amount bound to the complex (the amount that competes with the unknown cortisol to side on the complex). To establish a standard curve for the correlation process,
It is necessary to plot the difference in percent binding of a known amount of labeled cortisol against a known concentration. Typical standards for “known” cortisol concentrations are 0ng/ml, 12.5ng/ml, 25ng/ml,
50ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml, 400ng/ml and 800ng/ml. In this way, the unknown concentration can be determined by correlating the % binding (%B) at the unknown concentration (as measured by the DPM of the bound tracer) with the same %B of the standard curve. I can do it. In Figure 4, the above technique is used, but the %B of each standard is normalized to %B at 0ng/ml, %B standard x / %
B standard is expressed as 0x100. This B/B ₀ plot is used routinely. The reliability of this method and the typical standard curve of Figure 4 was repeatedly confirmed in clinical trials using unknown serum samples. The value of deblocking agents in releasing cortisol from TC is shown in Table 1 below. In Table 1, the amount of cortisol released from serum samples by ANS and PH is shown compared to the amount of cortisol released by a typical heating step to denature TC. This heating step is performed by heating the serum sample at 100° C. for about 10 minutes. Table 1 shows typical patient cortisol values (ng/ml) obtained by the two techniques.

【表】本発明の分析方法の交差反応比抗コルチゾール抗体複合体のある物質に対する
交差反応性は、抗体から50％の標識化された抗原
を置換するのに必要とされるコルチゾールの量の
同じ置換を起こすのに必要とされる交差反応物質
の量に対する比で表わすことができる。[Table] Cross-reactivity ratio of the analytical method of the present invention The cross-reactivity of the anti-cortisol antibody complex to a certain substance is the same as the amount of cortisol required to displace 50% of the labeled antigen from the antibody. It can be expressed as a ratio to the amount of cross-reacting material required to cause displacement.

【表】上記結果は本発明に用いられる固定された反コ
ルチゾール複合体が高度の交差反応比を有してい
ることを示す。本発明の分析方法の精度フイブリンが除去された、炭素抽出された血し
よう試料から既知の量のコルチゾールを回収する
実験を行なつた結果、98％乃至107％が回収され
ることが判明した。いくつかの結果は100％を越
えているが、これは所定量よりも多量に秤量され
たコルチゾールの添加、精度誤差、希釈誤差等の
実験誤差によるものである。なお、90乃至110％
の間の回収値はこの技術分野においては優秀であ
るとされている。TABLE The above results show that the immobilized anticortisol complex used in the present invention has a high degree of cross-reactivity. Accuracy of the Analytical Method of the Invention Experiments in which known amounts of cortisol were recovered from fibrin-depleted, carbon-extracted blood samples showed recovery of between 98% and 107%. Some results exceed 100%, but this is due to experimental errors such as addition of a larger amount of cortisol than expected, precision errors, dilution errors, etc. In addition, 90 to 110%
Recovery values between 1 and 2 are considered to be excellent in this technical field.

【表】【table】

【表】好ましい具体例においては、生物学的成長を予
防するために親液性反応物にアジ化ナトリウムあ
るいはマーサイオレートのような防腐剤をごく少
量加えてもよい。In a preferred embodiment, a very small amount of a preservative such as sodium azide or marthiolate may be added to the lyophilic reactant to prevent biological growth.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図はPH値とTC妨害効果との関係を示すグ
ラフである。第２図はPH5.5およびPH8.5である場
合のANS濃度とTC妨害効果との関係を示すグラ
フである。第３図は珪質担体を用いた固定された
抗コルチゾール抗体の最適PH値を示すグラフであ
る。第４図はコルチゾール免疫分析のための典型
的な標準曲線を示すグラフである。 FIG. 1 is a graph showing the relationship between PH value and TC interference effect. FIG. 2 is a graph showing the relationship between ANS concentration and TC interference effect at PH5.5 and PH8.5. FIG. 3 is a graph showing the optimum PH value of anti-cortisol antibody immobilized using a siliceous carrier. FIG. 4 is a graph showing a typical standard curve for cortisol immunoassay.

Claims

【特許請求の範囲】１ａ試料、標識化されたコルチゾールおよび
有効な量のデブロツキング剤を、負に帯電され
た支持体材料とこの支持体材料の表面に固定さ
れた抗コルチゾール抗体とからなる複合体と共
に水媒体中で、約4.0乃至約6.5の範囲のPH値
で、一部が上記標識化されたコルチゾールを含
む免疫化学的合成物が上記複合体上に形成され
るのに充分な条件の下で培養する工程、ｂ上記免疫化学的合成物が表面に形成された上
記複合体を培養媒体から分離する工程、ｃ分離された複合体上の、あるいは残つた培養
媒体中の標識物質の量を測定する工程、およびｄ上記測定工程で測定された測定値から、標準
に基づいて試料中のコルチゾールの濃度を測定
する工程からなる血清試料中のコルチゾールの濃度を測
定するための免疫分析方法。２上記抗体が珪質粒子表面に固定されることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析
方法。３上記珪質粒子がシラン化された珪質粒子であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の
免疫分析方法。４上記デブロツキング剤が８−アニリノ−１−
ナフタレンスルホン酸あるいはその塩であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分
析方法。５上記培養工程が約１時間よりも短かいことを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析
方法。６上記すべての工程が室温で行なわれることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析
方法。７上記標識化されたコルチゾールがコルチゾー
ル¹²⁵チラミン誘導体であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。８上記血清試料の量が約25マイクロリツターで
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の免疫分析方法。[Scope of Claims] 1 a. A sample, labeled cortisol and an effective amount of a deblocking agent are prepared in a complex consisting of a negatively charged support material and an anti-cortisol antibody immobilized on the surface of this support material. in an aqueous medium with the body at a PH value ranging from about 4.0 to about 6.5, conditions are sufficient for an immunochemical compound to form on the complex, including a portion of the labeled cortisol. (b) separating the complex on the surface of which the immunochemical compound is formed from the culture medium; (c) determining the amount of the labeled substance on the separated complex or in the remaining culture medium; and d) measuring the concentration of cortisol in the sample based on a standard from the measured value in the measurement step. An immunoassay method for measuring the concentration of cortisol in a serum sample. 2. The immunoassay method according to claim 1, wherein the antibody is immobilized on the surface of a siliceous particle. 3. The immunoassay method according to claim 2, wherein the siliceous particles are silanized siliceous particles. 4 The deblocking agent is 8-anilino-1-
The immunoassay method according to claim 1, characterized in that naphthalenesulfonic acid or a salt thereof is used. 5. The immunoassay method according to claim 1, wherein the culturing step is shorter than about 1 hour. 6. The immunoassay method according to claim 1, wherein all of the above steps are performed at room temperature. 7. The immunoassay method according to claim 1, wherein the labeled cortisol is a cortisol ¹²⁵ tyramine derivative. 8. The immunoassay method according to claim 1, wherein the amount of the serum sample is about 25 microliters.