JPS61124376A - 正常上皮細胞の培養方法 - Google Patents
正常上皮細胞の培養方法Info
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- JPS61124376A JPS61124376A JP59246193A JP24619384A JPS61124376A JP S61124376 A JPS61124376 A JP S61124376A JP 59246193 A JP59246193 A JP 59246193A JP 24619384 A JP24619384 A JP 24619384A JP S61124376 A JPS61124376 A JP S61124376A
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- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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- C12N5/067—Hepatocytes
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は動物に由来する正常上皮細胞の長期間培養法に
関するものである。
関するものである。
近年、動物細胞の培養技術及び培養液の急速な発展が見
られ、動物細胞の培養は基礎研究分野だけでなく工業生
産にとってもｉｓ視されている。
られ、動物細胞の培養は基礎研究分野だけでなく工業生
産にとってもｉｓ視されている。
動物の機能を保有している癌細胞の培養はある程度の工
夫を行えばすべて可能となっているが、機能をもった正
常上皮細胞の長期間培養、特に初代培養は今後の大きな
課題となっている。
夫を行えばすべて可能となっているが、機能をもった正
常上皮細胞の長期間培養、特に初代培養は今後の大きな
課題となっている。
動物の培：４！細胞株を長期間培養すると形質転侠が生
じ腫瘍化しやすいなど母細胞とは違った機能変化を生じ
ることが多い。正常機能を有する長期培養株の樹立は生
体機能の解析、癌化の研究、生理活性物質の生産等で極
めて意義が大きい。］Ｉ！ｉ細胞で生産される生理活性
物質とその母細胞でろる正常細胞で生産される生理活性
物質が同じものであるかを決定することはその物質の利
用や、癌と正常の間の差を見出す診断手法に利用される
道を開くことにもなり、そういった観点からも正常機能
の正常上皮細胞の培養が着目されている。
じ腫瘍化しやすいなど母細胞とは違った機能変化を生じ
ることが多い。正常機能を有する長期培養株の樹立は生
体機能の解析、癌化の研究、生理活性物質の生産等で極
めて意義が大きい。］Ｉ！ｉ細胞で生産される生理活性
物質とその母細胞でろる正常細胞で生産される生理活性
物質が同じものであるかを決定することはその物質の利
用や、癌と正常の間の差を見出す診断手法に利用される
道を開くことにもなり、そういった観点からも正常機能
の正常上皮細胞の培養が着目されている。
一般に、正常上皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ （試験管内
）で初代培養すると細胞の生存期間が極めて短かい。
）で初代培養すると細胞の生存期間が極めて短かい。
その為、細胞の生理機能を調べたジ、生理活性物質の生
産等の面で大きな障害となっている。上皮細胞の中で最
も機能を多く保有している成熟型肝細胞の初代培養での
細胞の正存期間は１週間程度しかない。
産等の面で大きな障害となっている。上皮細胞の中で最
も機能を多く保有している成熟型肝細胞の初代培養での
細胞の正存期間は１週間程度しかない。
正常細胞の長期間維持については非上皮細胞、例えば＃
臓の線維芽細廊では約１０カ月の報告（Ｈａｙｆｌｉｃ
ｋ、 Ｍｏｏｒｈｅａｄ １９６１ ）がされている。
臓の線維芽細廊では約１０カ月の報告（Ｈａｙｆｌｉｃ
ｋ、 Ｍｏｏｒｈｅａｄ １９６１ ）がされている。
上皮細胞も現在迄に櫨々の改筑型単層培養法が検討され
ている。計時異機能を有する成熟型肝細胞の検討として
は培養液面に浮上させたコラーゲン膜上に単層培養する
浮上コラーゲン膜層−＃法（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏ
ｓ＋ ｏ、ｌ Ｐｉｔｏｔ、 Ｈ，Ｃ，： ｇｘｐ。
ている。計時異機能を有する成熟型肝細胞の検討として
は培養液面に浮上させたコラーゲン膜上に単層培養する
浮上コラーゲン膜層−＃法（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏ
ｓ＋ ｏ、ｌ Ｐｉｔｏｔ、 Ｈ，Ｃ，： ｇｘｐ。
Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、、 ９４ ニア０ 、 ’７５ ）
が報告されている。又、この方法では、コラーゲン膜の
収縮によりＩｖｆｌＩ胞が萎縮するという欠点がある為
、上記方法の改良法として、コラーゲン膜に代えてニト
ロセルローズ・フィルターや（Ｓａｖａｇｅ＋ Ｃ−几
−Ｊｒ、＋、Ｂｏｎｎｅｙ几、 Ｊ、 ： Ｅｘｐ、
Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、、 １１４ ：５０７ 。
が報告されている。又、この方法では、コラーゲン膜の
収縮によりＩｖｆｌＩ胞が萎縮するという欠点がある為
、上記方法の改良法として、コラーゲン膜に代えてニト
ロセルローズ・フィルターや（Ｓａｖａｇｅ＋ Ｃ−几
−Ｊｒ、＋、Ｂｏｎｎｅｙ几、 Ｊ、 ： Ｅｘｐ、
Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、、 １１４ ：５０７ 。
′７８）、コラーゲンゲル−ナイロンメツ７ユ上培責法
（５ｉｒｉｃａ、 Ａ、 Ｅ、 ｅｔ ａｌ ： Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、λｃａｄ。
（５ｉｒｉｃａ、 Ａ、 Ｅ、 ｅｔ ａｌ ： Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、λｃａｄ。
８ｃｉ、、０８人、 ７６ ：２８３ 、 ’７９ Ｃ
ａｎｃｅｒ几ｅｓ、。
ａｎｃｅｒ几ｅｓ、。
４０：５２５９．’８０）の報告もめる。又その他バイ
オマトリックス上培養法（ｂｊｋｉｎｄ、 Ｍｅｔ ａ
ｌ。
オマトリックス上培養法（ｂｊｋｉｎｄ、 Ｍｅｔ ａ
ｌ。
： Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、 ８７ ：２５５
、 ’８０ ）や繊維芽細胞をフィーダ一層とする方
法（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ。
、 ’８０ ）や繊維芽細胞をフィーダ一層とする方
法（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ。
Ｇ、 ｅｔ ａｌ、 ： ＩｎＶｉｔｒｏ、 １５ニア
９６． ’７９）（Ｌａｎｇａｎｂａｃｈ、 Ｒ，ｅｔ
ａｔ、 ： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、＋ ６９ ：５
５０９ 、’７９）の報告もある。
９６． ’７９）（Ｌａｎｇａｎｂａｃｈ、 Ｒ，ｅｔ
ａｔ、 ： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、＋ ６９ ：５
５０９ 、’７９）の報告もある。
しかしながら、培養法の改良によって実験が複雑化され
た９、形ｄｍ祭が困難となったり、加えられた複雑な要
因の影響の分析が容易でない。
た９、形ｄｍ祭が困難となったり、加えられた複雑な要
因の影響の分析が容易でない。
また、培養技術面での工夫が上記の様になされてきたが
、 薬剤の添加で大きな効果があったという報告はない。
、 薬剤の添加で大きな効果があったという報告はない。
不発明者らは、薬剤＠別による細胞維持効果があれば、
間便な培養法として、即時実用化できる利点があるとの
発想のもとに、細胞維持効果のある薬剤を求めて鋭意研
究したところ、意外にも催眠剤、抗てんかん剤として知
られているバルビタール誘導体が正常上皮ａ肥と長期間
維持し得ることｔ知ったのである。
間便な培養法として、即時実用化できる利点があるとの
発想のもとに、細胞維持効果のある薬剤を求めて鋭意研
究したところ、意外にも催眠剤、抗てんかん剤として知
られているバルビタール誘導体が正常上皮ａ肥と長期間
維持し得ることｔ知ったのである。
即ち、不発明者らは初代培養成熟ラット肝細胞を用いた
発癌促遥実験の過程で、培養培地に高濃度のフェノバル
ビタールを添加すると、試験管内で通常１週間で死細胞
化する成熟型肝細胞が培誉２６日目でも生存しているこ
とを見出したのである。
発癌促遥実験の過程で、培養培地に高濃度のフェノバル
ビタールを添加すると、試験管内で通常１週間で死細胞
化する成熟型肝細胞が培誉２６日目でも生存しているこ
とを見出したのである。
不発明は、この知見から完成されたものであって、正常
上皮細胞をバルビタール訪導体を添カロした培地で術養
することを特徴とする正常上皮細胞の長期間培養方法で
ある。
上皮細胞をバルビタール訪導体を添カロした培地で術養
することを特徴とする正常上皮細胞の長期間培養方法で
ある。
不発明においては、パルビタールー導体の培地への添加
によって、ヒトａｉ肥を含む動物正常上皮細胞の長期間
生存及び培養を可能とするものである。培養される正常
上皮細胞としては、成熟型ラット肝細胞、成熟ヒト膵臓
細線、ヒト正常胎児肝細胞などいずれの正常上皮細胞で
もよい。
によって、ヒトａｉ肥を含む動物正常上皮細胞の長期間
生存及び培養を可能とするものである。培養される正常
上皮細胞としては、成熟型ラット肝細胞、成熟ヒト膵臓
細線、ヒト正常胎児肝細胞などいずれの正常上皮細胞で
もよい。
また、１更用する培地は、一般に細胞培養に用いられ、
かつ正常上皮細胞が生育する培地であればいかなる培地
でもよい。
かつ正常上皮細胞が生育する培地であればいかなる培地
でもよい。
また、培地に添加されるバルビタール誘導体は次の式（
１） ただし、几、、Ｒ２は、水素原子、炭素原子１〜６から
なる直鎖あるいは分岐をもつアルキル基、〔置換アルキ
ル、飽和あるいは不飽和の環状炭化水素置換アミン基の
いずれかを示し、几、、ｋＬ４ｒｉ水素原子又は炭素原
子１〜２のアルキル基を示す。
１） ただし、几、、Ｒ２は、水素原子、炭素原子１〜６から
なる直鎖あるいは分岐をもつアルキル基、〔置換アルキ
ル、飽和あるいは不飽和の環状炭化水素置換アミン基の
いずれかを示し、几、、ｋＬ４ｒｉ水素原子又は炭素原
子１〜２のアルキル基を示す。
に示される化合物であるが、具体的には次のものが例示
される。
される。
フェノパルビタール：
ベ
ンドパルビタール：
υ
３Ｃ
アモバルビタール：
シフロバルビタール：
Ｕｒａｍｉｌ −Ｎｐ Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃ
ｉｄ ：ベキソノζルビタール： Ｎ−メチルフエノバルビタール： す ５−（１−ヒドロキシエチル）−トリオキソヘキサハイ
ドロピリミジン： ５−（１−アミノエチル）−トリオキソヘキサハイドロ
ピリミジン： ５−（１−ヒドロキシエチル）−６−カルボキシメチル
−トリオキソヘキサハイドロピリミジン：ＯＯＨ 亀 ５−（１−ヒドロキシエチル）−３−ハイトロキシエチ
ルートリオキソヘキサハイドロビＩＮｙ：ＣＨ，ＯＨ ５−（１−アミノエチル）−６〜アミノエチルートリオ
キソヘキナハイドロピ＋＞Ｓン：ＣＨ２ＮＨ。
ｉｄ ：ベキソノζルビタール： Ｎ−メチルフエノバルビタール： す ５−（１−ヒドロキシエチル）−トリオキソヘキサハイ
ドロピリミジン： ５−（１−アミノエチル）−トリオキソヘキサハイドロ
ピリミジン： ５−（１−ヒドロキシエチル）−６−カルボキシメチル
−トリオキソヘキサハイドロピリミジン：ＯＯＨ 亀 ５−（１−ヒドロキシエチル）−３−ハイトロキシエチ
ルートリオキソヘキサハイドロビＩＮｙ：ＣＨ，ＯＨ ５−（１−アミノエチル）−６〜アミノエチルートリオ
キソヘキナハイドロピ＋＞Ｓン：ＣＨ２ＮＨ。
バルビタール誘導体の培地への添加濃度は適宜でよいが
、高濃度の方が効果は尚い。例えば、初代培養において
は添加濃度［１１〜１０ｍＭ、 好ましくはＱ、５〜
５ｍＭ程度である。
、高濃度の方が効果は尚い。例えば、初代培養において
は添加濃度［１１〜１０ｍＭ、 好ましくはＱ、５〜
５ｍＭ程度である。
培養はいかなる方法でもよく、プＶ−ト層養、ローラー
ボトル培養、固定化培養、撹拌培養などいずれでもよい
。
ボトル培養、固定化培養、撹拌培養などいずれでもよい
。
培養に際しては、５％炭酸ガス濃度下となるようにし、
普通６７℃程度で培養される。
普通６７℃程度で培養される。
本発明に２いては、パルビタール誘導体の添加によって
従来１週間程度で死滅していた正常上置細胞が１ケ月以
上も生存することが可能となる。
従来１週間程度で死滅していた正常上置細胞が１ケ月以
上も生存することが可能となる。
また、赤血球膜ゲ定化剤であるインドメタジノの併用添
加は、これを添加した実験より、インドメタジノが長期
間の維持効果は示さないが肝細胞の形態的変性を効果的
に防ぐことから、バルビタール誘導体の細胞維持効果と
協同して細胞膜機能の安定化により結果をもたらすもの
と認められた。
加は、これを添加した実験より、インドメタジノが長期
間の維持効果は示さないが肝細胞の形態的変性を効果的
に防ぐことから、バルビタール誘導体の細胞維持効果と
協同して細胞膜機能の安定化により結果をもたらすもの
と認められた。
次に本発明の実施例を示す。
（実施例）
■、初代培養ラット成熟型肝細胞の培養試験■−１，サ
ンプルのｙ４ａ ６ケ月令のド／リュク系雄ラットの肝臓をコラゲナーゼ
で還流して肝−胞を分離し試験した。
ンプルのｙ４ａ ６ケ月令のド／リュク系雄ラットの肝臓をコラゲナーゼ
で還流して肝−胞を分離し試験した。
Ｉ−２，培地と培養
２０チ牛血清を含むＦｉａｇｌｅｓ ＭＥＮ （日水製
薬社晰基本培地として用いた。分離肝細胞の接層率を高
めるために、デキ丈メタシン（１０μＭ）とインシュリ
ン（１０μＭ／ｌ１ｌ）を含むＤＩ培地に分離肝細胞を
分散し、７ Ｘ Ｉ Ｑ’ ｃａｌｌｓ ／ ０−２ｒ
ｎｌ／ｄの密度でプラスチック皿に播種し、炭酸ガス培
養器内（炭酸ガス濃度５％）で培養した。
薬社晰基本培地として用いた。分離肝細胞の接層率を高
めるために、デキ丈メタシン（１０μＭ）とインシュリ
ン（１０μＭ／ｌ１ｌ）を含むＤＩ培地に分離肝細胞を
分散し、７ Ｘ Ｉ Ｑ’ ｃａｌｌｓ ／ ０−２ｒ
ｎｌ／ｄの密度でプラスチック皿に播種し、炭酸ガス培
養器内（炭酸ガス濃度５％）で培養した。
■−＆ フエノパルビタール添加試験
Ｉ−３，１実験方法
Ｉ−２の乗件下で培養２４時間目から次の４檜類の培地
に切９換えた。
に切９換えた。
■ 基本培地
■ 基不培地中３ ＋ｎＡ１のフェノパルビタール（Ｆ
Ｂ）（九石裂薬社製）を含む、ＰＢ培地■ ＤＩ培地に
３ ｍＭ Ｐ Ｂを添加したＰＢＤＩ培地 ■ ＤＩ培地 培地の更新は２日或は６日に１回の頻度で行った。
Ｂ）（九石裂薬社製）を含む、ＰＢ培地■ ＤＩ培地に
３ ｍＭ Ｐ Ｂを添加したＰＢＤＩ培地 ■ ＤＩ培地 培地の更新は２日或は６日に１回の頻度で行った。
冶養３５日目迄、経時的に次の測定を行った■ 生函数
■ 顕微鏡的観察
■ 培地中のアルブミン童（ラジオイムノアッセイ去り
■ 細胞中のグルコース６７オス７アターゼ（０６Ｐａ
５ｅ ）活性 （θ 細胞中のチロシンアミントランスフェラーゼ（Ｔ
ＡＴ）活性 ■ ■、■のデキサメ丈グンによるｄ導効果＠ チトク
ロームＰ−４５０（Ｐ−４５０）定量 ■ ＦＢ誘導Ｐ−４５０ＣＰ−４５０ｐａ）定量・Ｊ
メチルコランスン７（ＭＣ）誘導Ｐ−４５０（Ｐ−４５
０Ｍｃ）定量 Ｉ −３，２，結果 ｔｌ） 細胞生存の維持効果 ５＋４１図は４撞類の培地における成熟型肝細胞の生菌
数の経時的変化を示している。第１図における■、■、
■、■は上記培地の■、■、■、■を示している。
５ｅ ）活性 （θ 細胞中のチロシンアミントランスフェラーゼ（Ｔ
ＡＴ）活性 ■ ■、■のデキサメ丈グンによるｄ導効果＠ チトク
ロームＰ−４５０（Ｐ−４５０）定量 ■ ＦＢ誘導Ｐ−４５０ＣＰ−４５０ｐａ）定量・Ｊ
メチルコランスン７（ＭＣ）誘導Ｐ−４５０（Ｐ−４５
０Ｍｃ）定量 Ｉ −３，２，結果 ｔｌ） 細胞生存の維持効果 ５＋４１図は４撞類の培地における成熟型肝細胞の生菌
数の経時的変化を示している。第１図における■、■、
■、■は上記培地の■、■、■、■を示している。
第２．３．４．５図は経時的な細胞変化を顕微鏡で観察
したものでちる。図面にンける■、■。
したものでちる。図面にンける■、■。
■、■は上記培地の■、■、■、■を示している。
第２図は初代肝細胞培養に２ける培地の違いによる培養
７８俊のａＡ８の状況（Ｘ２００）ｔ−ボレーている。
７８俊のａＡ８の状況（Ｘ２００）ｔ−ボレーている。
ｇ３図は初代肝細胞培養に２ける培地の違いによる培養
１４日後の細胞の状況（Ｘ１００）ｔｌ−示している。
１４日後の細胞の状況（Ｘ１００）ｔｌ−示している。
第４図は■ＰＢ培池で初代培養させた３５日後の肝細胞
の状況（Ｘ２００）を示している。
の状況（Ｘ２００）を示している。
第５図は初代培養における成：４Ｓ型肝細胞の生存に及
ぼすＰＢ除去の効果を示している。
ぼすＰＢ除去の効果を示している。
５！４５図において、人は■ＰＢ培地で連続処理した培
″４１８日目の細胞の状況、Ｂは■ＰＢ培地で７日培養
し、ＰＢ除除去後１目目計８日培養の細胞の状況、Ｃは
■ＰＢ培地で連続処理した培養１５日目の細胞の状況、
Ｄは■ＰＢ培地で７日培養し、ＰＢ除除去後８目目細胞
の状況をそれぞれ示している。
″４１８日目の細胞の状況、Ｂは■ＰＢ培地で７日培養
し、ＰＢ除除去後１目目計８日培養の細胞の状況、Ｃは
■ＰＢ培地で連続処理した培養１５日目の細胞の状況、
Ｄは■ＰＢ培地で７日培養し、ＰＢ除除去後８目目細胞
の状況をそれぞれ示している。
これから明らかなように、ＰＢ無添７ＪＯ（基本及びＤ
Ｉ培地）の系では、成熟型肝細胞は培養１週頃より急速
に変性・壊死に至った（第１図、１１ｇ２図）。ま几、
培養１４日頃より細肥質の透明な上皮様細胞（ｃｌｅａ
ｒ ｃｅｌｌ ）が増殖した（第６図）。
Ｉ培地）の系では、成熟型肝細胞は培養１週頃より急速
に変性・壊死に至った（第１図、１１ｇ２図）。ま几、
培養１４日頃より細肥質の透明な上皮様細胞（ｃｌｅａ
ｒ ｃｅｌｌ ）が増殖した（第６図）。
しかし、Ｐ Ｉｊ（５ｍＭ ）添加（ＦＢ及びＤＩＰＢ
培地）の系では、成熟型肝細胞は時間経過と共に徐徐に
減少するものの、少なくとも培養４９日目まで認められ
、その形態も核化が顕著になることを除けば培養初期の
ものと殆んど変らなかった（第１．２，３．４図）。尚
、成熟型肝細胞の維持はＦＢＤＩＢ地の系が最も漬れて
いた（第１図）。
培地）の系では、成熟型肝細胞は時間経過と共に徐徐に
減少するものの、少なくとも培養４９日目まで認められ
、その形態も核化が顕著になることを除けば培養初期の
ものと殆んど変らなかった（第１．２，３．４図）。尚
、成熟型肝細胞の維持はＦＢＤＩＢ地の系が最も漬れて
いた（第１図）。
ＰＢＢ在下では上記上皮体細胞（ｃｌｅａｙ ｃ（４１
＋ ）の増殖は殆んど認められなかった（第２．５．４
図）。
＋ ）の増殖は殆んど認められなかった（第２．５．４
図）。
欠の表１はＰＢ処処理６後後ＰＢｆｉ度の違いによる肝
細胞の生薗数を示す。
細胞の生薗数を示す。
、表１から明らかなよりに、ＰＨによる成熟型肝細胞の
維持効果は濃度に強く影響され、５ ｍＭ濃度で維持効
果は高く認められた。
維持効果は濃度に強く影響され、５ ｍＭ濃度で維持効
果は高く認められた。
又、ＰＢが連続的に存在しなければ維持効果は達成され
なかった（第５図）。
なかった（第５図）。
（２）細胞機能の維持効果
ＰＢＢ在下で生存する成熟型肝細胞は比較的高いアルブ
ミン産生及びＴ人′ｒ活性を示した。
ミン産生及びＴ人′ｒ活性を示した。
アルブミン産生はいずれの系でも時間経過と共に減少す
るが、ＰＢＢ在下では培＃７日目以降殆んど変動せず、
少なくとも培養３５日目まで安定的に数μｊｉ／Ａｔの
オーダーで認められた。その経過は次の表２に示される
。
るが、ＰＢＢ在下では培＃７日目以降殆んど変動せず、
少なくとも培養３５日目まで安定的に数μｊｉ／Ａｔの
オーダーで認められた。その経過は次の表２に示される
。
ＴＡＴ活性は、ＰＢ無添〃口（基本及びＤＩ培地）の系
では、時間経過と共に減少するのみでめシ、培養７８目
の活性は各々肝均質化物の上ＴＷ（４４±７ｍＵ／ｆダ
蛋白の１０及び１５９ｂでめった。一方、ＰＢ添刀１１
（ＦＢ及びＰＢＤＩ培地）の系でもＴＡＴ活性は時間経
過と共に減少したが、培養７エマ以降は殆んど変動せず
、培養６５日エマも各各肝均質化物の上滑の２７及び５
７％の活性を示した。その経過は次の表３に示される。
では、時間経過と共に減少するのみでめシ、培養７８目
の活性は各々肝均質化物の上ＴＷ（４４±７ｍＵ／ｆダ
蛋白の１０及び１５９ｂでめった。一方、ＰＢ添刀１１
（ＦＢ及びＰＢＤＩ培地）の系でもＴＡＴ活性は時間経
過と共に減少したが、培養７エマ以降は殆んど変動せず
、培養６５日エマも各各肝均質化物の上滑の２７及び５
７％の活性を示した。その経過は次の表３に示される。
またＰＢ培地の系についてデキ丈メタゾ／（１０μＭ）
ＫよるＴＡＴ活性の誘導を試みた結果、少なくとも培養
６５日エマで殆んど変動なく６〜５倍の誘導率を示した
。その経過は次の＊４に示される。
ＫよるＴＡＴ活性の誘導を試みた結果、少なくとも培養
６５日エマで殆んど変動なく６〜５倍の誘導率を示した
。その経過は次の＊４に示される。
Ｇ ６ Ｐａｇｅ活性はＦＢ添７ＪＩｌ及び無添加の系
の間で差異は認められず、時間経過と共に減少するのみ
であり、培養７日月の活性はいずれも肝均質化物（５６
±５ ｍＵ ／ ｍ９蛋白）のｆｆＪ１５％であった。
の間で差異は認められず、時間経過と共に減少するのみ
であり、培養７日月の活性はいずれも肝均質化物（５６
±５ ｍＵ ／ ｍ９蛋白）のｆｆＪ１５％であった。
その経過は次の表５に示される。
また１表４から明らかなように、デキサメメゾンによる
Ｇ ６ Ｐａｇｅの誘導は認められなかった。
Ｇ ６ Ｐａｇｅの誘導は認められなかった。
３′−メチル−４−ジメチルアミノアゾベンゼン（５’
−Ｍｅ−ＤＡＢ）の細胞毒性に対し、ＦＢ存在下で生存
する成熟型肝細胞は著明な耐性を示した。
−Ｍｅ−ＤＡＢ）の細胞毒性に対し、ＦＢ存在下で生存
する成熟型肝細胞は著明な耐性を示した。
！６図は初代肝細肥培養におけるＰＢ６加の有無による
５’−Ｍｅ −ＤＡＢの細胞毒性効果を示している。
５’−Ｍｅ −ＤＡＢの細胞毒性効果を示している。
第６図から明らかなように、ＰＢによる成熟型肝細胞の
維持効果は解毒能力の上昇による可能性が考えられ、次
に代表的な解毒酵素であるＰ−４５０について検討した
。、ＰＢはＰ−４５０総量の減少をやや抑制するが、少
なくともＰ −４５０Ｐ。
維持効果は解毒能力の上昇による可能性が考えられ、次
に代表的な解毒酵素であるＰ−４５０について検討した
。、ＰＢはＰ−４５０総量の減少をやや抑制するが、少
なくともＰ −４５０Ｐ。
の誘導は認められなかった。その経過は次の表６に示さ
れる。
れる。
また、ＰＢと同様にｉｎ ｖｉｖｏでｐ−ａｓｏｒ強く
誘導するＭＣｔ−添加した場会、Ｐ−４５０，ｃが著明
に誘導され、ｐ−４５０１祉もやや増加の傾向を示した
、その経過は次の表７に示される。
誘導するＭＣｔ−添加した場会、Ｐ−４５０，ｃが著明
に誘導され、ｐ−４５０１祉もやや増加の傾向を示した
、その経過は次の表７に示される。
しかしＭＣにはＦＢで見られる様な成熟型肝細胞の維持
効果は認められなかった。
効果は認められなかった。
初代肝細胞培養における肝細胞生存に及ぼすＭＣの効果
については次の表８に示される。
については次の表８に示される。
第７図は初代肝細胞Ｊ＠誉７日エマ細胞の状況（Ｘ１０
０）：と示している。Ｅは接種１日後にＭＣ処理（１０
μＭ）したもの、ＦはＰＢ処理（３ｍＭ）を６日間行っ
たものを示している。
０）：と示している。Ｅは接種１日後にＭＣ処理（１０
μＭ）したもの、ＦはＰＢ処理（３ｍＭ）を６日間行っ
たものを示している。
これらから明らかなように、ＦＢによる成熟型肝ｆ＃Ｂ
廊の維持効果が解毒能力の上昇によるという可能性はま
ずない様に思われる。
廊の維持効果が解毒能力の上昇によるという可能性はま
ずない様に思われる。
Ｉ−４，ＰＢ以外の肝発癌プロモーター剤の細胞維持効
果試験：ＰＢは肝発癌のプロモーターとして知られてい
る。そこで他の肝発癌プロモーターであるＢＨＴ及びＤ
ＤＴ、またＤＤＴのアナログであるＤＤＥがＰＢと同様
の効果を示すか否かについて調べた。
果試験：ＰＢは肝発癌のプロモーターとして知られてい
る。そこで他の肝発癌プロモーターであるＢＨＴ及びＤ
ＤＴ、またＤＤＴのアナログであるＤＤＥがＰＢと同様
の効果を示すか否かについて調べた。
いずれの物質にも細胞毒性は認められるが、成熟型肝細
肥の維持効果は認められなかった。その経過については
次の表９に示される。
肥の維持効果は認められなかった。その経過については
次の表９に示される。
また、ＰＢのアナログであるアモバルビタールが発禎プ
ロモーター効果がないという報告（前述）から、アモバ
ルビタールがＰＢと同様の細胞維持効果かめるか検討し
た結果、０．７５ｍＭ で成熟型肝細胞の維持効果はＰ
Ｂと同程度でめった。その経過については次の表１０に
示される。
ロモーター効果がないという報告（前述）から、アモバ
ルビタールがＰＢと同様の細胞維持効果かめるか検討し
た結果、０．７５ｍＭ で成熟型肝細胞の維持効果はＰ
Ｂと同程度でめった。その経過については次の表１０に
示される。
健って成熟型肝細胞の維持作用がすべての肝発癌プロモ
ーターに共通する性質ではないことが判明した。
ーターに共通する性質ではないことが判明した。
一方、ＰＢの類縁化合物であるはントバルビタール（表
９中のＰｅｎｔｏ ）について検討した結果、０．７５
ｍＭで成熟型肝細胞の維持効果が認められた（表９）。
９中のＰｅｎｔｏ ）について検討した結果、０．７５
ｍＭで成熟型肝細胞の維持効果が認められた（表９）。
しかし、その作用はＰＢに比べてやや劣った。
Ｉ−５，赤血球膜安定化剤の細胞維持効果試験赤血球膜
の安定化剤として仰られているインドメタシン及びクロ
ルプロマジンについても上記と同様の検討を行った。
の安定化剤として仰られているインドメタシン及びクロ
ルプロマジンについても上記と同様の検討を行った。
クロルプロマジンは細胞毒性が強く、成熟型肝細胞の維
持効果を示さなかったが、インドメタシ／（１ｍＭ ）
は成熟型肝細胞の形態的変性を効果的に防いだ。しかし
、同時に細胞毒性もめるので、ＰＢの様な長時間の維持
は不可能であった（表９）。
持効果を示さなかったが、インドメタシ／（１ｍＭ ）
は成熟型肝細胞の形態的変性を効果的に防いだ。しかし
、同時に細胞毒性もめるので、ＰＢの様な長時間の維持
は不可能であった（表９）。
従って、細胞膜機能の安定化がＰＢによる成熟型肝細胞
の長期間組持の一因となっているｏＴ能性が水製された
。
の長期間組持の一因となっているｏＴ能性が水製された
。
ｕ、ハルビタール誘導体の細胞維持効果アモバルビター
ル及び−！：／ドパルビタールがＰＢとＩｍｅ細肥維持
効果を示すことから、パルビタール彷導体につき細胞維
持効果を検討した。各試薬濃度は５ｍＭ、１．５ ｃｎ
Ｍ、０．７５ ｍＭの６水準とした。
ル及び−！：／ドパルビタールがＰＢとＩｍｅ細肥維持
効果を示すことから、パルビタール彷導体につき細胞維
持効果を検討した。各試薬濃度は５ｍＭ、１．５ ｃｎ
Ｍ、０．７５ ｍＭの６水準とした。
６０１１１シヤーノ内培地に１４０Ｘ１０’の成熟ラッ
ト肝細胞を播種。２４時間培賽後（１０６，９±１３．
６ｘ１０’細胞数／シヤーレ）、各試薬を各一度で添加
した。ヘキサバルビタールとメホバルビタールは０．５
チＤＭ８００＃度で、他の試薬は基本培地に直接添加し
た。
ト肝細胞を播種。２４時間培賽後（１０６，９±１３．
６ｘ１０’細胞数／シヤーレ）、各試薬を各一度で添加
した。ヘキサバルビタールとメホバルビタールは０．５
チＤＭ８００＃度で、他の試薬は基本培地に直接添加し
た。
播糧後７日、１４日口の生細胞率ｔ−調べた。
結果を表１１に示す。
−哨 Ｖ−噂へ の
−Ｈ−Ｈ＋ｌ−Ｈ＋Ｉ−Ｈ−）−１−Ｈ−Ｈ旧 制 ＋
＋ 七 制ｈＩｆ） 膿
膿唖−ｃ３噂−ｄ哨−ｄ哨−ｄ哨ｄ１ 試薬によって適正強酸の遵いがあるが、バルビッール酸
では効果がなくアモパルビタール、ヘキンバルビタール
、メホバルビタール、シフロバルビタール、１，５−ジ
メテルバルビタール酸、−！：ントバルビタール、ウラ
ミルＮ 、 Ｎ’ −シ匪敏、フェノパルビタールに細
胞維持効果が認められ、パルビタール誘導体に効果があ
ることが確認された。
＋ 七 制ｈＩｆ） 膿
膿唖−ｃ３噂−ｄ哨−ｄ哨−ｄ哨ｄ１ 試薬によって適正強酸の遵いがあるが、バルビッール酸
では効果がなくアモパルビタール、ヘキンバルビタール
、メホバルビタール、シフロバルビタール、１，５−ジ
メテルバルビタール酸、−！：ントバルビタール、ウラ
ミルＮ 、 Ｎ’ −シ匪敏、フェノパルビタールに細
胞維持効果が認められ、パルビタール誘導体に効果があ
ることが確認された。
粥１図はＰＢ添加による肝細胞の生存の経時的変化を示
す図で、第２．５．４．５図はＰＢ添加もしくは無添加
による肝細胞の顕微鏡写真である。 第６図は肝細胞培養における５’−Ｍｅ −ＤＡＢの細
胞毒性効果を示す図である。 第７因はＭＣ処理した肝細胞の顕微鏡写真である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 手続補正書（方式） 昭和６０年４月ｌＬ日
す図で、第２．５．４．５図はＰＢ添加もしくは無添加
による肝細胞の顕微鏡写真である。 第６図は肝細胞培養における５’−Ｍｅ −ＤＡＢの細
胞毒性効果を示す図である。 第７因はＭＣ処理した肝細胞の顕微鏡写真である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 手続補正書（方式） 昭和６０年４月ｌＬ日
Claims (4)
- （１）正常上皮細胞をバルビタール誘導体を添加した培
地で培養することを特徴とする正常上皮細胞の長期間培
養方法。 - （２）正常上皮細胞が肝臓に由来する初代細胞である特
許請求の範囲第１項記載の培養方法。 - （３）正常上皮細胞が膵臓に由来する初代細胞である特
許請求の範囲第１項記載の培養方法。 - （４）バルビタール誘導体が、式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼ の構造を有するもののうち、Ｒ＿１、Ｒ＿２が、水素原
子、炭素原子１〜６からなる直鎖あるいは分岐をもつア
ルキル基及び置換アルキル基、飽和あるいは不飽和の環
状炭化水素、置換アミノ基のいずれかであり、且つＲ＿
３、Ｒ＿４が、水素原子又は炭素原子１〜２のアルキル
基からなる特許請求範囲第１項記載の培養方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59246193A JPS61124376A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | 正常上皮細胞の培養方法 |
| GB08511993A GB2175007A (en) | 1984-11-22 | 1985-05-11 | Culturing epithelial cells in a medium containing a barbituric acid derivative |
| DE19853517609 DE3517609A1 (de) | 1984-11-22 | 1985-05-15 | Verfahren zum kultivieren normaler epithelzellen |
| FR8507682A FR2582315B1 (fr) | 1984-11-22 | 1985-05-22 | Procede de culture de cellules epitheliales normales |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59246193A JPS61124376A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | 正常上皮細胞の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61124376A true JPS61124376A (ja) | 1986-06-12 |
Family
ID=17144895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59246193A Pending JPS61124376A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | 正常上皮細胞の培養方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61124376A (ja) |
| DE (1) | DE3517609A1 (ja) |
| FR (1) | FR2582315B1 (ja) |
| GB (1) | GB2175007A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3711699A1 (de) * | 1987-04-07 | 1988-11-10 | Fraunhofer Ges Forschung | Medium zur kultivierung und proliferation von epithelialen zelltypen |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4456687A (en) * | 1978-11-16 | 1984-06-26 | President And Fellows Of Harvard College | Agents for promoting growth of epithelial cells |
-
1984
- 1984-11-22 JP JP59246193A patent/JPS61124376A/ja active Pending
-
1985
- 1985-05-11 GB GB08511993A patent/GB2175007A/en not_active Withdrawn
- 1985-05-15 DE DE19853517609 patent/DE3517609A1/de not_active Withdrawn
- 1985-05-22 FR FR8507682A patent/FR2582315B1/fr not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3517609A1 (de) | 1986-11-20 |
| GB8511993D0 (en) | 1985-06-19 |
| GB2175007A (en) | 1986-11-19 |
| FR2582315A1 (fr) | 1986-11-28 |
| FR2582315B1 (fr) | 1987-09-04 |
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