JPS6098347A - 電気的に帯電された巨大分子を電気的に溶離するための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特許請求の範囲第１項の前半において記述さ
れている形式の、電気的に帯電された巨大分子を電気的
に溶離するための装置にかかわる。

更に特定するに１本発明は、一般に電気的に帯電された
生物学的巨大分子を電気泳動ゲルから電気的に溶離する
だめの方法にかかわる。

この形式の装置は、１９８２年発行、”Ｊｏｕｒｎａｌ
　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ’１ｓｔｒｙ
　１２４．２Ｈ〜３０２頁において開示されている。こ
の周知の装置はポリアクリレート金ガラスからなる板状
立方体であり、そこでは幾つかの相互に平行な溶離チャ
ネルがその立方体の片側から反対側にまで連続して延在
しそして頂部で開放しているＵ字状溝において形成され
る。溶離チャネルの各々の１つの端部領域には、袋すな
わちバッグの形態におけるナイロン争ガーゼが挿入され
、それは、チャネル壁から、フィルタ様式において密封
され、そして例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、たんばく質又はリ
ボポリ・サツカリドの巨大分子に対する吸着ゲルで満た
される。

電気的溶離の問題は、巨大分子が普通に分留される電気
泳動ゲルが作用するときに生じる。ターゲット一定分画
を含む電気泳動ゲルの片は切断されてそして電気的溶離
装置のチャネル内に置かれる。その後、その装置は、電
気泳動チャンバにおいて発生される電界が電気的溶離装
置の溶はチャネルに平行にあるように水平状電気泳動チ
ャンバに入れられる。それから、その電気泳動チャンバ
は、相互に平行せるチャネル間に置かれている分離壁土
にまで流れがあるとして、そのすぐ下のレベルまで緩衝
剤で満たされる。電界がスイッチ・オンされると、電気
的に帯電された生物学的巨大分子がそのＩａ衝剤内に横
たわっている電気泳動ゲルから移動して、ナイロン会バ
ッグ内に置かれている吸着ゲルにおいて集められる。溶
離が完了すると、その溶離ゲルはナロロン・バッグから
取除かれて、カラム上でこの吸着ゲルから溶離され、特
に従来でのマラカイトグリーン・ゲルが使用されるとき
には、概して、ｌ質量の過塩素酸ナトリウム溶液によっ
て溶離される。

最新の技術からして現在最も良いと思われるこの方法に
対する完全対策には、電気泳動ゲルの片当り約４０分の
時間が必要であり、そして繰返される吸着および溶離の
ために、ターゲット物質にかなりの損失がある。仮りに
バクテリアの損失が無視されるとしても、この溶離方法
では、少なくとも全体で約２５％のターゲット物質の損
失が予想され、かくして、初めに導入された電気泳動ゲ
ルにおける巨大分子の重量に関連して最善の場合で約７
５％の歩留りが期待できる。更に、臨時の吸着ゲルの費
用はかなりになる０例えば、マラカイトグリーン拳ゲル
、２５１の市販価格は、約聞３５（ＬＯＧである。

最近の技術からして、本発明の目的は、迅速で、損失が
なくそして特に電気泳動ゲルからの巨大分子の安価な溶
離が実施できる、電気的に帯電される巨大分子特に生物
学的巨大分子を電気的に溶離するための装置を提供する
にある。本発明のかかる目的からして、”溶離”又は”
電気的溶離”という用語は、電界の作用の下で、すなわ
ち特に、溶液の濃縮、脱塩又は異なる緩衝剤への転送作
用の下での液相からの巨大分子の”溶離”として理解さ
れたい。

この目的を達成するために、本発明は、特許請求の範囲
第１項の特徴項に与えられている特徴により、ターゲッ
ト巨大分子のためのトラップが２つの重合体薄膜によっ
て境界づけ又は形成されている。電気的溶離のための装
置を与える。こうした２つの薄膜のうち、その溶離チャ
ネルの縦軸に関連して外側のものは、電界の下では、小
さなイオン及び分子にとって、特に、緩衝剤及び水にと
って浸透可能であるが、溶離されるべき巨大分°　子に
とっては、不浸透性である。しかしながら、この意味に
おける内側のものは、すべてのイオン及び分子にとって
、すなわち特に、もしもその薄膜が電界内にあるとする
と、溶離されるべき巨大分子にとっても浸透性である。

しかしながら、電界がスイッチ−オフされると、それら
の薄膜は共に、如何なるサイズのイオン及び分子に対し
ても不浸透性となり、それらは事実上、耐水性となる。

電気的溶離媒体が作られてそして電界がスイッチ参オン
されると、巨大分子は、例えば初めに導入された片の電
気泳動ゲルから抽出されて、電界の方向において一般に
は正極に向って内側薄膜を通して移動し、そして外側薄
膜の内側において保有且つ収集、すなわち濃縮される。

一方、バッファ・イオンはその薄膜を通して電気泳動チ
ャンバへと移動する。

運転に際して、本発明による装置は、上述の周知の装置
の場合と同じ仕方において電気泳動チャンバ内に置かれ
る。その溶離プロセスが完了された後、電界の極性が、
好ましくはｌＯ〜１５秒間１反転されるので、その外側
薄膜の内面に集められ、時には部分的に吸収される巨大
分子は、その薄膜表面から取除かれてそしてトラップ空
間へと釈放される。

この装置の場合、電気泳動ゲルの片についての電気的溶
離には、５分以下の時間がかかる。溶離される巨大分子
の歩留りは、少なくとも９０％、事実上は１００％と見
做せる。この歩留りは、使用される内側薄膜がｆ１１水
且つ付加的に耐バクテリア性の薄膜であること、すなわ
ち、それは如何なるバクテリアでも溶離チャネル又は溶
離チャンバからそのトラップへと転送されるのが禁止さ
れることから得られる。もしもそのトラップが前置って
注意深く殺菌されるとすると、すべての周知の電気的溶
離プロセスでは広範囲に行われているバクテリア攻撃に
よる巨大分子の損失が、この方法において除かれる。

如上の要件に合う薄膜としては多くのものが種々な形態
において市販品として入手可能である。

好ましくは重合体薄膜が使用され、その構造は。

水及び、特にセルローズ、セルローズ誘導体、ポリアミ
ド、ポリイミド及びポリスリホンのようなバッファ溶液
によって湿らされる重合体に基づいている。一般に、セ
ルローズ・アセテートの薄膜は外側薄膜として使用され
、そして再生セルローズの薄膜は内側薄膜として使用さ
れるのが好ましい。かかる薄膜はこの出願人から入手可
能であり、例えば、外側薄膜は形式ＲＡＢメはＲＡＣそ
して内側薄膜はＲ２Ｈとして入手できる。しかしながら
、ここで使用可能なセルローズ薄膜としては多くのもの
があり、他の製造業者からも入手できる。内側薄膜は、
約≦０．２ル量の領域における平均的細孔サイズを、特
に、０．０５Ｂｍから０．２０ＩＬ。

ｍまでの範囲の細孔サイズを持つ必要があり、そして外
側薄膜は、約１０００以上の分子量を持つ巨大分子にと
って不浸透性でなければならない。しかしながら、かか
るデータは単なるガイド値であって、解決されるべき特
定の問題に従ってユーザによって変えられるものと理解
されたい。

本発明の実施例によると、特定の内側薄膜と特定の外側
薄膜とによって形成される巨大分子トラップは連続的に
開放している溶離チャネルの２つの端部領域上に与えら
れているので、分離せる溶離チャンバは各場合において
２つの相互に対向せる内側薄膜間に形成される。これは
１本発明による装置が動作される電気泳動チャンバにお
けるものから異なるバッファ領域が溶離チャンバにおい
て使用されるようにする。これは、巨大分子溶液を脱塩
させるか或いは緩衝剤を変えることを可能にする。

薄膜は、その装置の本体に交換可能に取付けられるのが
好ましい。特に、その互換性は薄膜を装置本体の上部か
らその本体内での対応せるガイド又はくぼみへと挿入す
るか又は押し込むことによって得られる。まず第１にそ
の内側に位置されている薄膜に対して、もしもその内側
薄膜が、膨張可能な羽料で作られているが乾燥状態及び
膨張されていない状態においてはその頂部におけるＵ形
状のスロット・ガイドへと正確に押し込まれるフレーム
によって包囲されるならば、それは好都合で手軽でしか
も１００％信頼性のあることが証明されている。溶離チ
ャン八が溶離媒体でもって満たされるか或はその装置が
水平の電気泳動チャンバ内へと置かれた後、その溶離媒
体はそのフレームの周囲を流れてそれを膨張させるので
、その内側薄膜は、フィルタのようにシールを作って、
そのチャネル壁へと締め付けられる。

フレームなしで使用できる外側薄膜は、軸線状外方にそ
のトラップを境界づけている分離壁に対して外側から支
持するのが好ましい。この固体の分離壁において、その
薄膜によって覆われている中央孔はイオン電流の通過の
ために与えられている。また、薄膜は、例えば圧縮ばね
又は緊張ねじ又は緊張ねじスリーブによって、その装置
のチャネルに関連して、軸線状内方に圧迫されているフ
レームによりその分離壁に対し且つその札止で締付けら
れる。外側薄膜とこの分離壁との間における密封すなわ
ちシールは、１つ又はそれ以上の密封リング又は密封縁
部により付加的に改善される。好ましいことに、ここで
は、円錐状外方に開口している連続チャネルが、気泡の
形成を回避するために、そのフレーム及び緊張ねじスリ
ーブに形成されている。

本発明による装置の本体すなわちポデーは無活性のプラ
スチック、例えば、ポリカーボネート又はアクリル・ガ
ラスから作られるのが好ましい。

プラスチックはオーＩ・クレープにとって適している。

以下、本発明は添刊図面に関連した例示的実施例を参照
して一層詳細に説りｊされよう。

第１図は、本発明による電気的溶離装置の例示的実施例
の平面図を示し、特に、かかる装置の本体ｌを示してい
る。第２図は、第１図の例示的実施例での軸線ＩＩ−Ｉ
Ｉに沿った断面であって、外側薄膜Ｍｌ及び内側薄膜Ｍ
２が図の左側に挿入されている。本体１は透ＩＪ１なポ
リカーボネートからなってい、る。薄膜Ｍｌは、電界の
下でさえ、ｌ、０００以上の分子量を持つ分子に対して
は不浸透性であるセルローズ・アセテート薄膜である。

内側薄膜Ｍ２は、０．２１Ｌｍの細孔サイズの簡単なセ
ルローズ薄膜である。薄膜Ｍ１とＭ２どの間で規定され
ている空間は溶離されるべき巨大分子に対するトラップ
２として作用する。軸線状外方に、トラップ２は本体ｌ
と一体に形成されている分離壁３によって境界づけられ
ている。図の左側で見られるように分１１１＆壁３には
、比較的大きなオリフィス４が与えられていて、トラッ
プ２と周囲環境との間での自由な連通を確保している。

特に、オリフィス４は、頂部が切り開かれていて且つ内
部ねじ６を持つ孔を通して本体１の一面に向けて軸線状
に開放しているくぼみ、すなわち前置チャンバ５へと開
口している。装置の運転に際して、この前置チャンバ５
は空気でもって満たされる。このために、外部ねじを持
つ緊張スリーブ７は、内部ねじ６へとねじ込まれた後、
そのシステムが外側すなわち前置チャンバ５に対して耐
水性となるように形成されなければならない、前置チャ
ンバ５の側壁９，１０上で案内され、回転しないように
固定される緊張フレーム８は緊張スリーブ７に対して軸
線状内方に押し込まれる。その周辺において、緊張フレ
ーム８は外径がオリフィス４の内径よりも幾らか大きい
密封用の切込み縁部な持っている。緊張スリーブ７が、
緊張フレーム８へと挿入される態様で、本体１へねじ込
まれると、緊張フレーム８は分１１１Ｂｔ３に向けて案
内される。これと同時に、上部から挿入された薄ｆｆ５
１Ｍ１とオリフィス４とは、緊張フレーム８と分離壁３
との間で締付けられて、緊密なシールを作り出す、密封
用の切込み縁部２１によって、薄膜Ｍｌ自体がここでは
ガスケットとして使用されている。

緊張フレーム８にあって、オリフィス４と整列されてい
るオリフィス１２は薄膜Ｍ１を通した電流の自由な流れ
を保証する。緊張フレームにおけるオリフィス１２と緊
張スリーブにおける隣接オリフィス２１とは、円筒状チ
ャネル（第２図）を形成するか、或は好ましいことは円
錐状外方（第５図）に広がり、かくして、薄膜Ｍｌの前
面における気泡の持続を阻ＩＦする。外部ねじな持つ緊
張スリーブ７は内側ねじ６へとねじ込まれ、そして前置
チャンバ５の側壁９．ｌＯ上に案内されて回転止めされ
た緊張フレーム８は、抜き差し自在にして軸線内方に挿
入されてそして緊張スリーブ上に押し込まれる。緊張ス
リーブ７をねじ込むことにより、緊張フレーム８は分離
壁３に向けて案内されるか或はその上に押し刊けられる
。これと同時に、上部から前置チャンバ５へと挿入可能
な外側薄膜Ｍｌはしっかりと締付けられそして緊張フレ
ーム８と分岐壁３との間で、オリフィス４を堅固にシー
ルしている。この締付けの堅固さは付加的な密封用リン
グｔｉによって改善される。緊張フレーム８にあって、
オリフィス４と整列されているオリフィス１２は薄膜Ｍ
１を通した電流の自由な流れを保証する。前置チャンバ
５は液体のない状態に保たれるので、前置チャンバ５に
向うトラップ２の堅固さは最善な仕方において監視され
、そして追跡電流路の形成が排除される。

軸線状内方に向って、トラップ２の境界は、頂部におい
て開口しそしてそこへと内側薄膜が上部から挿入される
Ｕ字状のスロット溝１３によって固定される。ここにお
いて、Ｕ字状のスロット溝１３は、側壁１４．１５にお
いて且つチャネル１７の床１６において形成される。薄
膜Ｍ２には、乾爆状態において、スロット溝１３へと正
確に嵌合挿入されるフレーム状縁部ゾーンが与えられて
いる。溶離媒体がチャネル１７へと導入されると、薄Ｆ
ＪＭ２のフレームは膨張するので、その薄膜は、気密状
にシールされたプレス嵌めの状態でスロット溝１３に保
有される。

２つの内側源１１２Ｍ２間で、連続チャネル１７の、溶
離チャンバ１８として作用する区間はこれらの薄ＩＩＩ
によって分岐される。一方、溶離チャン／＜１８は、薄
膜Ｍ１及びＭ２そしてオリフィス４及び１２を介して電
気泳動チャンへの外部電解液に電気的に接続されている
が、他方、それは、その電気泳動チャンバにおいて使用
されている電解液のものから実質的に異なっている成分
の電解液すなわち緩衝剤でもって溶離チャンバ１８を満
たすことの可能な範囲においてその周囲から水力学的に
且つ化学的に分岐されている。

運転に際して、溶離されべきものでしかも巨大分子を含
むゲル片は、電気的溶離装置の溶離チャンバ１８内に置
かれる。その後、２つのトラップ２と溶離チャンバ１８
とは、充填された媒体のレベル１９（第３図）が本体ｌ
のチャンバ１８の上縁２０（第２図）の直ぐ下にあるよ
うに、高度に希釈された緩衝剤又は蒸留水でもって満た
される。それから、その装置は、電気泳動チャンバにお
けるバッファ溶液のレベルがその溶離チャンバでのレベ
ル１９と少なくとも実質的に同じレベルにあるように十
分なバッファ溶液でもって満たされた水平の電気泳動チ
ャンバ内に置かれる。しかしながら、ここにおいて、そ
の電気泳動チャンバにおけるバッファ溶液の濃度は、一
般に、溶離媒体での緩衝剤すなわちパー、ファの濃度よ
りも１０倍ないし１００倍程度大きい。

更に、その電気的溶離装置は、電気泳動チャンバにおい
て発生される電界がチャネルｌＯに対して少なくとも実
質的に平行にあるようにその電気泳動チャンバ内に置か
れる。これは第３図において図式的に示されている。第
３図において、大きな丸で包囲されているマイナス記号
は負に帯電された巨大分子を表わし、一方、小さな丸で
包囲されているプラス記号及びマイナス記号はバッファ
・イオンを表わしている。電界の存在において、その極
性は第３図に示されているものを取るものと仮定されて
おり、そこでのイオンは短かい矢印によって第３図に示
されている方向に移動する。

すなわち、正のバッファ・イオンは負極に向けて移動し
、そして負のバッファ・イオン及び負に帯電された巨大
分子はその作用電界の正の極に向けて移動する。これと
同時に、負に帯電された粒子はすべて薄膜２を通してト
ラップ２へと通過する。しかしながら、負に帯電された
バッファ・イオンは電界の作用の下で外側薄膜Ｍ１を通
過してそして電気泳動チャンバのバッファへと転送され
るけれども、電気的に帯電された巨大分子は外側簿膜Ｍ
ｌの軸線状内方に向う面状に保有される。

この様にして、電気的に帯電された巨大分子はすべて、
薄膜Ｍｌ上で徐々に集められる。その溶離が完了されそ
してすべての電気的に帯電された巨大分子が溶離チャン
バ１８からトラップ２へと転送された後、電界の極性は
約１０秒ないし約１５秒にわたって反転されるので、外
側薄ｆｉＭｌ上に集められた巨大分子は釈放されそして
トラップ２へと移動し、そこからは、例えばマイクロピ
ペットによって上部から高濃度において容易に除外され
る。

各個々のトラップ２と溶離チャンバ１８との容積比は、
約ｉ　：　ｉｏｏである。しかしながら、トラップ２は
それが例えばピペットとアクセスできない程狭く作って
はならないので、その容積の減少は、溶離チャンバ１８
の床に関連してトラップ２の床すなわち底を上げること
によって第２図に示されている仕方において行われる。

代替として、そのトラップの容積は、第４図及び第５図
から明らかな方法によって、すなわち、トラップ２を円
形断面としそして下方では円錐状テーパとすることによ
って減少できる。

第４図及び第５図に示されている電気的溶離装置の例示
的実施例は、緊張フレーム８でのオリフィス１２とそし
て緊張スリーブ７の内部とによって規定されるチャネル
２１が連続して作られそして外方に開１−Ｉ　した平滑
な壁を持つ点において、第１図及び第２図に示されてい
る装置から異なっている。これは、チャネル２１におけ
る気泡の形成又は付着を防止し、かくして電流の状態を
変える。

更に、第５図に示されている緊張フレーム８には切込み
リング縁部２２が形成されていて、その縁部は分離壁３
の外側に対して薄膜Ｍ３を押し付けて、シールを作って
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、薄膜なしの電気的溶離装置の例示的実施例の
平面図を示し； 第２図は、第１図における線ＩＩ−ＩＩに沿って段面を
示している図であり： 第３図は、第１図及び第２図に例示されている装置の作
用モードの図式的表示を示しており；第４図は、本発明
による電気的溶離装置の別な例示的実施例を平面におい
て部分的に示している図であり；そして 第５図は、第４図に示されている装置の軸線区間を示し
て１１νる図である。 ｌ・・・本体　２・・・トラップ ３・・・分離壁　４・・・オリフィス ５φ・・前置チャンバ　６・・・内部ねじ７・・−ｇｉ
ミスリーブ８・・拳緊張フレーム９．１０−＠−側壁　
ｉｉφ・１１密封リング１２・φ・オリフィス １３・・・Ｕ字形スロット溝 １４．１５−・争側壁　１６・−・床

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）立方形又は板状本体からなり、そこには、少なくと
   も１つのチャネルが形成され、そのチャネルは前記本体
   の片側から反対側へと）！ｌＩ統し、両側で開口し、該
   本体の主平面において、すなわちそれに平行して少なく
   とも実質的に走行しそしてその頂部において少なくとも
   部分的に開口しており、更に、その２つの端部の少なく
   とも１つの領域においてしかもそのチャネルの縦軸を横
   切って、２つの境界面エレメントが前後に、与えられて
   いて、該エレメントは、それらの間で、巨大分子に対す
   るトラップとして作用するチャネル区間を規定していて
   、電気的に帯電された巨大分子を電気的に溶離するだめ
   の装置において、前記２つの境界面エレメントは重合体
   薄膜（Ｍｌ、Ｍ２）であり、その外側薄膜（Ｍｌ）は、
   電界の下において、水、小さなイオン及び分子にとって
   浸透性であるが、溶離されるべき巨大分子にとっては不
   浸透性であり、一方、電界の下にある内側薄膜（Ｍ２）
   はすべてのイオン及び分子にとって、すなわち、溶離さ
   れるべき巨大分子にとっても浸透性であり、能動的電界
   の下における両型合体薄膜（Ｍｌ、Ｍ２）は、以下なる
   イオン及び分子にとっても、特に、水及び緩衝剤にとっ
   ても不浸透性であることを特徴とする装置。 ２）薄膜トラップ（２）がチャネル（１７）の両端部領
   域に与えられているので、分離せる溶離チャンバ（１８
   ）が２つの相互に対向ぜる内側薄１１Ｋ　（Ｍ２）間に
   おける前記チャネル（１７）の中間に形成されているこ
   とを特徴とする特、ｎ請求の範囲第１項に記載の装置。 ３）前記重合体薄膜（Ｍｌ、Ｍ２）は木及び使用される
   バッファ溶液によって湿らされるものであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の装置。 ４）前記重合体薄膜（Ｍｌ、Ｍ２）は、木質的に、セル
   ローズ、セルローズ誘導体、ポリアミド、ポリイミド又
   はポリスルホンからなることを特徴とする特許請求の範
   囲第３項に記載の装置。 ５）前記外側薄＠　（Ｍｌ）はセルローズ・アセテート
   に基づく薄膜であり、前記内側薄Ｍ　（Ｍ２）は再生セ
   ルローズに基づく薄膜であることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項に記載の装置。 ６）前記薄−の少なくとも成るものは、交換可能に、開
   口（５）を通して又は案内スロット（１３）において本
   体（１）又はチャネル（１７）へと上部から押し込み挿
   入されることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第５
   項のうちのいずれかに記載の装置。 ７）溶離媒体において膨張できて、乾燥且つ膨張されて
   いない状態ではその薄膜平面でのすべてのチャネル壁（
   １４，１５，１８）に形成されているスロット溝（１３
   ）へと正確に嵌め込まれるフレームに取付けられている
   少なくとも１つの薄膜（Ｍ２）を含んでいることを特徴
   とする特許請求の範囲第６項に記載の装置。 ８）前記トラップ（２）は、本体（１）から形成されそ
   してオリフィス（４）又は孔を持つ不浸透性の分離壁（
   ３）によってその外側上で境界づけられており、その自
   由通路は、前記分Ｉ！壁（３）におけるオリフィス（０
   の前面において、前置って緊張されるか又は軸線状外方
   に圧迫されたフレーム（８）によって押圧されて、シー
   ルを作っている外側薄膜によってその外側から覆われる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６項のうち
   のいずれかに記載の装置。 ８）前記トラップ（２）は頂部において開口しそしてマ
   イクロ・リットル範囲における容積を持ち、一方、前記
   溶離チャンバ（１８）は、数ｌＯミリリットルの範囲に
   おける容積を持っていることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項〜第８項のうちのいずれかに記載の装置。 １０）前記フレーム（８）は、緊張スリーブ（７）、特
   にねじ付スリーブによって前記分離壁（３）に対して押
   圧されていて、そして円錐状外方に連続して開口してい
   るチャネル（２１）は、フレーム（８）およびスリーブ
   （７）において共に形成されていることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項〜第９項のうちのいずれかに記載の
   装置。 １１）生物学的巨大分子について電気泳動ゲルから電気
   的に溶離し、濃縮し且つ脱塩するか又はそれらを異なる
   緩衝剤へと転送し、そして正に帯電されたたんば〈質を
   濃縮し且つ分離するために特許請求の範囲＄１項〜第８
   項のうちのいずれかに記載の装置を使用すること。