JPS6096610A - Nicotinamide-adenine-dicucleotide phosphate-bound polymer - Google Patents

Abstract

PURPOSE:A polymer which allows a coenzyme to bind with a dehydrogenase in high binding yields, obtained by copolymerizing acrylamide with a nicotinamide- adenine-dinucletide phosphate derivative. CONSTITUTION:Acrylamide is radical-copolymerized with a polymerizable nicotinamide-adenine-dinucletide phosphate derivative of formula I and, optionally, an ionic group-containing polymerizable compound of formula II. In formula I , R<1> is H, or methyl, R<2> is a 5-10C carbon chain or a carbon chain interrupted by an amido or ether bond, this carbon chain may contain an oxygen-containing group, and M is an anion. In formula II, R<3> is H or methyl, R<4> is COOM, or -CONH-R<5> (wherein R<5> is a 1-5C carbon chain), or the like.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド
ホスフェ＝！・を結合した新規な高分子物質に関するも
のである。 酵素反応にあたって補酵素としてニコチンアミド−アデ
ニン−ジヌクレオチドフォスフェート（以下単にＮＡＤ
Ｐと略記する）を要求する酵素を用いる酸化還元反応を
工業的に実施するためには、高あるいはホローファイバ
ーを有する反応器中に入れて、連続使用するシステムが
効果的であることが知られている。しかし、これまでに
Ｎ　Ａ　＋Ｊ　Ｐをも一合した高分子物質の研刀１・開
発は、国内外において数少なく、これらのものは、デキ
ス１へラン〔１・ｕｒ。 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４９，５１１（１！４７４））
　、ポリエチレンイミン（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈａｍ
、、７２．：１０！］（１９７７））、セファロース［
Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｊ、ｏｐｌ＋ｙｓ、　、
−１６８，６６５（１９７ｒ）：］などの既製の高分子
にＮＡ叶を結合させた高分子物質である。これらの合成
法は、　ＮＡＩ）Ｐにあらかじめ末端に官能基を有する
適当な長さの右磯ノ、（を導入後、その官能基を用いて
当詠高勺子に糸、−合させるというものである。これら
の例では、ポリエチレンイミンとの結合時に高価なカル
ボジイミ１−を使用（［Ｅｕｒ。 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、７２，３０９（１９７７）：
ｌ　したり、比較的安価であるが、結合の切れやずい［
３ｒＣＮ法によりテキストランあるいはセファロースに
結合（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。 、４９，５１１（１９７４）、Ａｒｃｈ、ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、１６８，６６５（１９７５）コ
シているため、工業的見地からは、実用性のあるものと
は到底言い難い。また、ＢｒＣＮ法による場合は結合収
率は明記されていないが、相当低いものとＪｌｌｉ　ｍ
される。一方、ポリエチレンイミンへの結合の場合には
、比較的高い結合収率でＮＡ叶が高分子に結合されてい
るが、その補酵素活性をみると、もとのＮＡＤＰの場合
に比べて３６％にとどまるという低さである。従って、
ＮＡＤＰを結合した高分子について、安価な試薬を用い
て簡単に合成でき、その結合は強固であり、しかも高い
補酵素活性を有する高分子の満足なものは未だに得られ
ておらず、その開発が要望されていた。本発明者らは、
このような要望に応えるべく鋭意研究を重ねた結果、本
発明を完成するに到った。 即ち、本発明は、アクリルアミドと、一般式（式中、Ｒ
１は水素又はメチル基、Ｒ２は炭素数５〜１０個の炭素
鎖、又はその中間にアミド結合又はエーテル結合を有す
る炭素鎖であり、該炭素鎖には含酸素基が結合していて
もよく、旧ま陽イオンである） で表わされる重合性のニコチンアミ１−一アデニンージ
ヌクレオチドホスフエー１へ誘導体とをラジカル共重合
して得られる高分子物質が提供される。 また、本発明によ扛ば、アクリルアミドと、前記一般式
（１）で表わされる重合性のＮＡＤＰ誘導体と、一般式 ％式％（） （Ｒｓは炭素数１〜５個の炭素鎖又は中間にアミド結合
又はエーテル結合を有する炭素鎖であり、該炭素鎖には
含酸素基が結合していてもよく、Ｒ６及びＲ７は水素、
メチル基又はエチル基であり、同は酸イ］加塩を形成し
ていてもよい） で表わされるイオン性基を有する重合性化合物とをラジ
カル共重合して得られる高分子物質が提供される。 本発明の前記部分す物質を繰返し構造単位によりまとめ
て示すと次の通りである。 前記式中、Ｑと０１は正の整数であり、ｎ及び［）は０
又は正の整数であり、１り１〜Ｒ’及び旧よ前記と同じ
意味を有する。また、この式において、Ｑ、ｍ、ｎ及び
Ｐの比は高分子（１゛１中の各部分において不規則であ
るが、ｎ＋ｎとＩｌｌとＩＩの比は、通常、］０　：　
１　：　０から５００　：　１　：　１００までの範囲
であり、高分子物質の重量平均分子量は、通常、１０万
以下である。 前記一般式（Ｉ）及び（１１）において、Ｒ２は一般に
は炭素数５〜２５を有するものが好ましく用いられ、例
えば、以下に示すようなものの使用が好ましい。 ＨＣＨｚ　）　Ｑ− 一□Ｈ２）ｍ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ　−→ＣＨ２）
Ｏ−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｐ−ＣＯＮＨ−（ＣＨｚ）ｑ−
べＧ羽咋÷ｔ −The present invention provides nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphene =! This relates to a new polymeric substance that combines . Nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate (hereinafter simply NAD) is used as a coenzyme in the enzyme reaction.
In order to industrially carry out redox reactions using enzymes that require enzymes (abbreviated as P), it is known that a system in which they are placed in a reactor with high or hollow fibers and used continuously is effective. ing. However, to date, there have been only a few developments in Japan and abroad of polymeric materials that also combine N A + J P, and these materials have been used for Dex 1 [1 ur]. J.Biochem, 49,511(1!474))
, polyethyleneimine (Eur, J, Biocham
,,72. :10! ] (1977)), Sepharose [
Arch, Biochem, Bj, opl+ys, ,
-168,665(197r):] is a polymeric material in which NA leaves are bonded to ready-made polymers such as -168,665(197r):]. These synthetic methods involve introducing into NAI)P an appropriate length of strands that have a functional group at the end, and then using that functional group to attach the strand to the strand. In these examples, expensive carbodiimide 1- is used when conjugating with polyethyleneimine ([Eur. J, Biochem, 72, 309 (1977):
Although it is relatively inexpensive, it may cause breakage of the bond or damage [
Binding to Textran or Sepharose by the 3rCN method (Eur, J. Biochem., 49, 511 (1974), Arch, bioche
M, Biophys, 168, 665 (1975) Since it is stiff, it is hard to say that it is practical from an industrial standpoint. In addition, although the binding yield is not specified when using the BrCN method, it is said that it is quite low.
be done. On the other hand, in the case of binding to polyethyleneimine, NA leaf is bound to the polymer with a relatively high binding yield, but its coenzyme activity is 36% higher than that of the original NADP. It remains at a low level. Therefore,
Regarding polymers that bind NADP, a satisfactory polymer that can be easily synthesized using inexpensive reagents, has strong binding, and has high coenzyme activity has not yet been obtained, and development is in progress. It was requested. The inventors
As a result of extensive research in order to meet these demands, we have completed the present invention. That is, the present invention relates to acrylamide and the general formula (wherein R
1 is hydrogen or a methyl group, R2 is a carbon chain having 5 to 10 carbon atoms, or a carbon chain having an amide bond or an ether bond in the middle, and an oxygen-containing group may be bonded to the carbon chain. A polymeric substance obtained by radical copolymerization of a polymerizable nicotinamide 1-1 adenine dinucleotide phosphor 1 represented by (formerly a cation) with a derivative is provided. Further, according to the present invention, acrylamide, a polymerizable NADP derivative represented by the general formula (1), and the general formula % formula % () (Rs is a carbon chain having 1 to 5 carbon atoms or an intermediate It is a carbon chain having an amide bond or an ether bond, and an oxygen-containing group may be bonded to the carbon chain, and R6 and R7 are hydrogen,
A polymer substance obtained by radical copolymerization with a polymerizable compound having an ionic group represented by a methyl group or an ethyl group (which may form an acid salt) is provided. The above-mentioned substances of the present invention are summarized by repeating structural units as follows. In the above formula, Q and 01 are positive integers, and n and [) are 0
or is a positive integer, and has the same meaning as 1 to R' and the above. In addition, in this formula, the ratios of Q, m, n, and P are irregular in each part of the polymer (1゛1, but the ratios of n+n, Ill, and II are usually ]0:
It ranges from 1:0 to 500:1:100, and the weight average molecular weight of the polymeric substance is usually 100,000 or less. In the general formulas (I) and (11), R2 preferably has 5 to 25 carbon atoms, and for example, the following compounds are preferably used. HCHz) Q- 1□H2)m-CONH-(CH2)n -→CH2)
O-CONH(CH2)P-CONH-(CHz)q-
Be G Hakui ÷ t −

〔グルコース−６−リン酸デヒ１（ロゲナーゼにＺＪする活性の測定〕[Glucose-6-phosphate dehyde 1 (measurement of ZJ activity to logonase)]

１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
−塩酸緩衝液（１’ｌ＋７．２）中に、クルコース−６
−リン酸１．２ｍ）丁、硫酸マクネンウム７．８ｍＭ及
びＰＡ−Ｖ。 ＰＡ−Ｖ−ＶｌもしくはＩＩＡ−Ｖ−■を結合Ｎ　Ａ　
Ｄ　））濃度として０．３ｍＭからＯ、Ｏ：３７５ｍＭ
の濃度で含むＬ（性液（金星１．２４ｍ（１，）を調製
し、：）０℃に保温下、Ｑ、６４７１ｇ酵素蛋白質景の
ロ４コメストツク・メセンテロイテノ、グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ（***ベーリンガー社製）を
含む４μ０の酵素液を添加して反応を開始させた。反応
の進行は、：１０ｍｍにおけ４光度の増加を経時的にレ
コーダーに記録させることによって追跡した。このよう
にして、結合ＮＡＤＰの各濃度における初速度を測定し
、これから、各高分子の酵素反応における最大速度を算
出した。 同条件下で測定したＮＡ叶の最大速度を１００％とする
とＰＡ−Ｖ、　ＰＡ−Ｖ−Ｖｌ（７１最大速度はそれぞ
れ４７．４７％であった。 実施例６ 実施例５で示した基質液（］、、２４ｍＲ）を、３０°
Ｃに保温下、０．２９μｇｎ５素蛋白質量の酵母を起源
どするグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む
４μＱの酵素液を添加して反応を開始させた。反応の進
行は、３４０ｎｍにおける吸光度の増加によって追跡し
た。１）Ａ−Ｖの最大速度はもとのＮＡＤＰを１００％
とすると、１１６％を示した。 実施例７ ０．０９３Ｍ　＋−リエタノールアミン・塩酸塩−水酸
化す１−リウム緩街液（ＰＩ−１８，５）中に、Ｌ−グ
ルタミン酸６．７ｍＭ及びＰＡ−Ｖ、ＰＡ−Ｖ−ＶＩ又
はＰＡ−Ｖ−■を結合ＮＡＤＰの濃度として０．３〜０
．０１８８ｍＭの濃度で含ゞ♀孔性液（全量１．２４ｍ
　Ｑ、　）を調整し、１３μｇ酵素蛋白質量の酵母を起
源とするクルタフ−１−デヒ１−ロゲナーゼ（オリエン
タル酵１；ユ礼製）を含む４μＱの酵素液を添加して反
応付開始させた。反応の進行は。 ３４０ｎｎ＋における吸光度の増加により追跡した。ｌ
’八−ＶのＮＡＤＰの最大速度に苅する割合は１１７％
に達した。 実施例８ 実施例７で示したノ、（質＋１＊　（１、２４＋ｎ　Ｑ
　）を３０℃に保温下、４４μｇ酵素蛋白り′Ｌ量の牛
肝臓を起源とするグルツメ−１−デヒドロゲナーゼ（西
独ベーリンガー社製）を含む４μαの酵素液を添加して
反応を開始させた。反応の進行は：ｌ　４０　ｎ　ｍに
お（づる吸光度の増加により追跡した。１）Δ−■−■
のＮ　Ａ　Ｄ　ｌ’に苅する最大速度は１００％を示し
た。 特５′１庁長官殿 １、　事件の表示　昭和　５８　年特γＦ願第　２０４
２６９　９２、　発明の８拘−ニコチンアミドーアデニ
ンージヌクレＡヂド小スフ上−トを結合した高分子物質 ３、　補正をＪる者 ′″′Ｊ１′Ｊ１イ′１．１．１訂出願人住　所　東京
都千代田区霞か関１丁目３番１円氏　名　（１１４）　
工業技術院長　川　１）裕　部５、　補正命令の日イ」
　自　光 ６、　補正により増加づ゛る発明の数　な　し１、明細
書第３頁下から第３３行口の「ジヌクレオチドフォスフ
ェート」を「ジヌクレオチドホスフ１−１〜」に訂正し
まず。Cucrose-6 in 100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl buffer (1'l+7.2)
- Phosphoric acid 1.2mM), macanenium sulfate 7.8mM and PA-V. Combine PA-V-Vl or IIA-V-■ NA
D)) Concentration from 0.3mM to O, O: 375mM
L (sexual fluid (Venus 1.24 m(1,) was prepared and kept at 0℃, containing 6471 g of enzyme protein, glucose-6) at a concentration of
- The reaction was started by adding 4μ0 of an enzyme solution containing phosphate dehydrogenase (manufactured by Boehringer, West Germany). The progress of the reaction was followed by recording the increase in light intensity at :10 mm over time on a recorder. In this way, the initial velocity at each concentration of bound NADP was measured, and from this the maximum velocity in the enzymatic reaction of each polymer was calculated. When the maximum velocity of NA leaf measured under the same conditions is taken as 100%, the maximum velocity of PA-V and PA-V-Vl (71 was 47.47%, respectively. Example 6 Substrate solution shown in Example 5 (], 24mR), 30°
The reaction was initiated by adding 4 μQ of an enzyme solution containing yeast-derived glucose-6-phosphate dehydrogenase with a 0.29 μgn pentagonal protein amount to C while keeping it warm. The progress of the reaction was followed by the increase in absorbance at 340 nm. 1) The maximum speed of A-V is 100% of the original NADP
Therefore, it showed 116%. Example 7 6.7 mM of L-glutamic acid and PA-V, PA-V-VI or PA-V-■ as the concentration of bound NADP from 0.3 to 0.
．． Porous liquid containing ♀♀ at a concentration of 0.188mM (total volume 1.24mM)
Q, ) was adjusted and reaction was started by adding 4 μQ of an enzyme solution containing 13 μg of enzyme protein of Kurtaf-1-dehy-1-logenase (Oriental Koko 1; manufactured by Yurei) originating from yeast. . What is the progress of the reaction? Tracked by increase in absorbance at 340nn+. l
'8-V NADP maximum speed rate is 117%
reached. Example 8 As shown in Example 7, (quality + 1 * (1, 24 + n Q
) was kept at 30 DEG C., and a 4 .mu..alpha. enzyme solution containing 44 .mu.g of enzyme protein and Glutume-1-dehydrogenase (manufactured by Boehringer, West Germany) originating from bovine liver was added to initiate the reaction. The progress of the reaction was followed by the increase in absorbance at 40 nm.
The maximum speed of cutting to N A D l' was 100%. Commissioner of the Patent Act 5'1 Agency 1, Indication of the case 1981 Patent γF Application No. 204
269 92, Clause 8 of the Invention - Polymer Substance Combining Nicotinamide Adenine-Dinucleate Small Sulfate 3, Person Who Makes Amendment'''J1'J1I'1.1.1 Revised Applicant address: 1-3-1 Kasumikaseki, Chiyoda-ku, Tokyo Name (114)
Director of the Agency of Industrial Science and Technology Kawa 1) Hirobe 5, Date of amended order
Jiko 6. Number of inventions increasing due to amendments None 1. "Dinucleotide phosphate" at the beginning of line 33 from the bottom of page 3 of the specification was corrected to "dinucleotide phosphate 1-1~".

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）アクリルアミドと、一般式 （式中、Ｒ１は水素又はメチル基、Ｒ２は炭素数５〜１
０個の炭素鎖、又はその中間にナミド結合又はエーテル
結合を有する炭素鎖であり、該炭素鎖には含酸素基が結
合していてもよく、Ｎは陽イオンである） で表わされる重合性のニコチンアミド−アデニン（式中
、Ｒ１は水素又はメチル基、■（２は炭素数５〜１０個
の炭素鎖、又はその中間にアミド結合又はエーテル結合
を有する炭素鎖であり、該炭素鎖には含酸素基が結合し
ていてもよく、門は陽イオンで、ある） で表わされる重合性のニコチンアミ１−一アデニンージ
ヌクレオチドホスフエーＩ−誘心体と、一般式 （１ ％式％ （式中、Ｒ３は水素又はメチル基、Ｒ４は−ＣＯＯＭ　
（は炭素数１〜５個の炭素鎖又は中間にアミド結合又は
エーテル結合を有する炭素鎖であり、該炭素鎖には含酸
素基が結合してもよく、Ｒ６及びＲ７は水素、メチル基
又はエチル基であり、同−又は異っを形成していてもよ
い） で表わされるイオン性基を有する重合性化合物とをラジ
カル共重合して得られる高分子物質。(1) Acrylamide and the general formula (in the formula, R1 is hydrogen or a methyl group, R2 has 5 to 1 carbon atoms)
0 carbon chain, or a carbon chain having a namide bond or an ether bond in the middle, an oxygen-containing group may be bonded to the carbon chain, and N is a cation. nicotinamide-adenine (in the formula, R1 is hydrogen or a methyl group, may be bonded with an oxygen-containing group, and the gate is a cation, and is a polymerizable nicotinamide 1-1 adenine dinucleotide phosphor I-dicenter represented by the general formula (1% formula % (wherein R3 is hydrogen or a methyl group, R4 is -COOM
( is a carbon chain having 1 to 5 carbon atoms or a carbon chain having an amide bond or an ether bond in the middle; an oxygen-containing group may be bonded to the carbon chain; R6 and R7 are hydrogen, a methyl group, or A polymeric substance obtained by radical copolymerization with a polymerizable compound having an ionic group represented by: