JPS6095344A - トランスアミナ−ゼ活性の測定方法 - Google Patents
トランスアミナ−ゼ活性の測定方法Info
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- JPS6095344A JPS6095344A JP58202508A JP20250883A JPS6095344A JP S6095344 A JPS6095344 A JP S6095344A JP 58202508 A JP58202508 A JP 58202508A JP 20250883 A JP20250883 A JP 20250883A JP S6095344 A JPS6095344 A JP S6095344A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gpt
- measuring
- enzyme
- activity
- electrode
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/52—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving transaminase
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生体試料中のグルタミン酸オキザロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ（ＧＯＴと略記することがある）および
グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴと
略記することがある）の活性を測定する方法に関するも
のである。
ンスアミナーゼ（ＧＯＴと略記することがある）および
グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴと
略記することがある）の活性を測定する方法に関するも
のである。
本発明を用いれば、同一反応セル内で同一試料中のＧＯ
ＴおよびＧＰＴを同時に測定することができる為、試料
の測定を迅速に、精度よく行うことができる。
ＴおよびＧＰＴを同時に測定することができる為、試料
の測定を迅速に、精度よく行うことができる。
トランスアミナーゼは、アミノ酸のアミノ基転移を触媒
する酵素で、その内ＧＯＴは心筋、肝、骨格筋、腎に多
量に含まれ、ＧＰＴは肝、腎に多量に含まれている。従
ってＧＯＴ、ＧＰＴの測定は急性ウィルス性肝炎、慢性
肝炎、肝硬変、肝腫瘍、急性アルコール性肝炎等の肝疾
患、胆のう、胆管炎、胆石症等の肝外閉塞性黄痘、心筋
硬塞、進行性筋ジストロフィー、感染性疾患等の診断に
有用な役割を果しておシ、ＧＯＴ、ＧＰＴを簡便に精度
よく迅速に測定することは臨床的に意義が太きい。
する酵素で、その内ＧＯＴは心筋、肝、骨格筋、腎に多
量に含まれ、ＧＰＴは肝、腎に多量に含まれている。従
ってＧＯＴ、ＧＰＴの測定は急性ウィルス性肝炎、慢性
肝炎、肝硬変、肝腫瘍、急性アルコール性肝炎等の肝疾
患、胆のう、胆管炎、胆石症等の肝外閉塞性黄痘、心筋
硬塞、進行性筋ジストロフィー、感染性疾患等の診断に
有用な役割を果しておシ、ＧＯＴ、ＧＰＴを簡便に精度
よく迅速に測定することは臨床的に意義が太きい。
従来、ＧＯＴの測定方法としては基質のアスパラギン酸
とα−ケトグルタル酸に試料を加え、生成したオキザロ
酢酸を、リンゴ酸脱水素酵素と補酵素Ｎ Ａ Ｄ Ｈの
存在下で共役させ、このときのＮＡＤＨの３４０ｍｍの
吸光度の減少を初速変法で測定するカルメン法と、上記
の様に生成したオキザロ酢酸を２，４−ジニトロフェニ
ルヒドラジンと反応させヒドラゾンを生成させ、これを
アルカリ性にしてキノイドを作り発色させるライトマン
−フランケル法がある。しかし、カルメン法では使用す
る試薬が不安定で、また恒温セルを付属させた特殊な分
光光度計が必要である等の問題がある。
とα−ケトグルタル酸に試料を加え、生成したオキザロ
酢酸を、リンゴ酸脱水素酵素と補酵素Ｎ Ａ Ｄ Ｈの
存在下で共役させ、このときのＮＡＤＨの３４０ｍｍの
吸光度の減少を初速変法で測定するカルメン法と、上記
の様に生成したオキザロ酢酸を２，４−ジニトロフェニ
ルヒドラジンと反応させヒドラゾンを生成させ、これを
アルカリ性にしてキノイドを作り発色させるライトマン
−フランケル法がある。しかし、カルメン法では使用す
る試薬が不安定で、また恒温セルを付属させた特殊な分
光光度計が必要である等の問題がある。
一方、ライトマン−フランケル法では基質のα−ケトグ
ルタル酸も発色して生成物の発色を妨害するために基質
量を極度に減じる必要があシ、検量線が変曲することや
測定可能範囲が狭い等の欠点がある。
ルタル酸も発色して生成物の発色を妨害するために基質
量を極度に減じる必要があシ、検量線が変曲することや
測定可能範囲が狭い等の欠点がある。
またＧＰＴの測定方法には、基質のアラニンとα−ケト
グルタル酸に試料を加え、生成したピルビン酸を乳酸脱
水素酵素−と前記ＮＡＤＨの存在下で共役させ該ＮＡＤ
Ｈの減少を測定するカルメン・法と、上記の様に生成し
たピルビン酸に２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを
作用させて発色させるライトマン−フランケル法がある
。しかしこれらの方法にも上記ＧＯＴの測定方法と同様
の欠点がある。
グルタル酸に試料を加え、生成したピルビン酸を乳酸脱
水素酵素−と前記ＮＡＤＨの存在下で共役させ該ＮＡＤ
Ｈの減少を測定するカルメン・法と、上記の様に生成し
たピルビン酸に２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを
作用させて発色させるライトマン−フランケル法がある
。しかしこれらの方法にも上記ＧＯＴの測定方法と同様
の欠点がある。
これらの欠点を解決する目的で最近、ピルビン酸オキシ
ダーゼ（ＰＯＰと略記することがある）を利用してＧＰ
ＴＸＧＯＴを分析する方法が開発されている。たとえば
ＧＰＴの測定方法としては、基質のアラニンとα−ケト
グルタル酸に試料を加えピルビン酸を生成する反応と、
生成したピルビン酸をＰＯＰと所要基質の存在下に酸化
するピルビン酸酸化反応とを共役させ、ピルビン酸酸化
反応を伴う過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比色定
量するものがある。
ダーゼ（ＰＯＰと略記することがある）を利用してＧＰ
ＴＸＧＯＴを分析する方法が開発されている。たとえば
ＧＰＴの測定方法としては、基質のアラニンとα−ケト
グルタル酸に試料を加えピルビン酸を生成する反応と、
生成したピルビン酸をＰＯＰと所要基質の存在下に酸化
するピルビン酸酸化反応とを共役させ、ピルビン酸酸化
反応を伴う過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比色定
量するものがある。
またＧＯＴの測定方法としては、基質のアスパラギン酸
とα−ケトグルタル酸に試料を加えオキザロ酢酸を生成
する反応と、生成したオキザロ酢酸をオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼ（ＯＡＣと略記することがある）の存在
下にピルビン酸を生成する反応とを共役させピルビン酸
を生成させる。
とα−ケトグルタル酸に試料を加えオキザロ酢酸を生成
する反応と、生成したオキザロ酢酸をオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼ（ＯＡＣと略記することがある）の存在
下にピルビン酸を生成する反応とを共役させピルビン酸
を生成させる。
次にこの生成したピルビン酸をＰＯＰと所要基質の存在
下にピルビン酸酸化反応を行わせ、ピルビン酸酸化反応
に伴う過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比色定量す
る。しかしながら上記ＰＯＰを利用する測定法は、高価
な酵素の使い捨て、測定時間が長いこと、ＰＯＰ自身が
溶液中では不安定であるため測定時の再現性が悪い等の
問題点がある。
下にピルビン酸酸化反応を行わせ、ピルビン酸酸化反応
に伴う過酸化水素の発生量を発色剤を用いて比色定量す
る。しかしながら上記ＰＯＰを利用する測定法は、高価
な酵素の使い捨て、測定時間が長いこと、ＰＯＰ自身が
溶液中では不安定であるため測定時の再現性が悪い等の
問題点がある。
そこでＰＯＰを固定化し、これを酸化電位測定用電極に
装着した酵素電極を使用してＧ Ｐ Ｔ。
装着した酵素電極を使用してＧ Ｐ Ｔ。
ＧＯＴを測定しようとする研究も盛んに行なわれている
。（特開昭５５−１１１７０６号、同５６−１２４３９
６号各公報、Ａｎａｌｙｔｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａＡｅ
ｔａ、１１８（１９８０）６５−７１等参照）しかし、
これら上記の固定化法および測定方法では、固定化ＰＯ
Ｐの活性ならびに安定性は十分とけいえず、またＰＯＰ
のみの固定化ではＧＯＴ測定特定時ＡＣ酵素を添加しな
ければならない欠点があり、さらに同一セル内で試料の
交換をせずに同−試料中のＧＯＴおよびＧＰＴ活性を同
時に測定することは極めて困難である。従ってＧＯＴお
よびＧＰＴ測定用の高活性で安定性の優れる固定化酵素
を用いさらに、同−試料中のＧ ＯＴおよびＧＰＴ活性
を短時間に測定する方法の提供が切望されていた。
。（特開昭５５−１１１７０６号、同５６−１２４３９
６号各公報、Ａｎａｌｙｔｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａＡｅ
ｔａ、１１８（１９８０）６５−７１等参照）しかし、
これら上記の固定化法および測定方法では、固定化ＰＯ
Ｐの活性ならびに安定性は十分とけいえず、またＰＯＰ
のみの固定化ではＧＯＴ測定特定時ＡＣ酵素を添加しな
ければならない欠点があり、さらに同一セル内で試料の
交換をせずに同−試料中のＧＯＴおよびＧＰＴ活性を同
時に測定することは極めて困難である。従ってＧＯＴお
よびＧＰＴ測定用の高活性で安定性の優れる固定化酵素
を用いさらに、同−試料中のＧ ＯＴおよびＧＰＴ活性
を短時間に測定する方法の提供が切望されていた。
本発明者らは、この要望に応えるべく鋭意検討を行った
結果、ＰＯＰ及びＯＡＣの酵素活性及びその安定性に優
れ、基質拡散性がよく、洗浄しやすい固定化酵素膜を酸
化電位測定用の電極に装着して酵素電極として利用し、
さらに同一セル内に二本の酵素電極を配置させることに
より、従来の測定方法の欠点を解消し、生体試料中の微
敞のＧＯＴおよびＧＰＴを簡便な方法で、迅速に精度良
く、定量範囲も広くかつ同時に測定し得ることを見出し
本発明を完成した。
結果、ＰＯＰ及びＯＡＣの酵素活性及びその安定性に優
れ、基質拡散性がよく、洗浄しやすい固定化酵素膜を酸
化電位測定用の電極に装着して酵素電極として利用し、
さらに同一セル内に二本の酵素電極を配置させることに
より、従来の測定方法の欠点を解消し、生体試料中の微
敞のＧＯＴおよびＧＰＴを簡便な方法で、迅速に精度良
く、定量範囲も広くかつ同時に測定し得ることを見出し
本発明を完成した。
即ち、本発明は、ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）を
担体上に固定化した固定化酵素膜を装着した酵素電極（
ト）及びピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）とオキザロ
酢酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＣ）とを担体上に固定化
した固定化複合酵素膜を装着した酵素電極（Ｂ）を有す
るセルに、試料液、グルタミン酸オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ（ＧＯＴ）測定用基質溶液及びグルタミン酸
ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ ）測定用基質
溶液を供給し、該酵素電極囚の出力によりＧＰＴ活性を
測定すると同時に該酵素電極（功の出力によりＧＰＴ活
性及びＧＯＴ活性の合計活性を測定することを特徴とす
るトランスアミナーゼ活性の測定方法を提供するもので
ある。
担体上に固定化した固定化酵素膜を装着した酵素電極（
ト）及びピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）とオキザロ
酢酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＣ）とを担体上に固定化
した固定化複合酵素膜を装着した酵素電極（Ｂ）を有す
るセルに、試料液、グルタミン酸オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ（ＧＯＴ）測定用基質溶液及びグルタミン酸
ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ ）測定用基質
溶液を供給し、該酵素電極囚の出力によりＧＰＴ活性を
測定すると同時に該酵素電極（功の出力によりＧＰＴ活
性及びＧＯＴ活性の合計活性を測定することを特徴とす
るトランスアミナーゼ活性の測定方法を提供するもので
ある。
本発明に用いられる固定化酵素膜は、多孔性高分子膜担
体を用いて製造できる。多孔性高分子担体としては、公
知の塩化ビニル樹脂担体、アセチルセルロース、ポリカ
ーボネート、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン
、テフロン等を用いることができる。この中でも塩化ビ
ニル樹脂担体が特に好ましく用いられ、該担体は、特開
昭５５−３９７１９号公報記載のものを用いることがで
きる。
体を用いて製造できる。多孔性高分子担体としては、公
知の塩化ビニル樹脂担体、アセチルセルロース、ポリカ
ーボネート、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン
、テフロン等を用いることができる。この中でも塩化ビ
ニル樹脂担体が特に好ましく用いられ、該担体は、特開
昭５５−３９７１９号公報記載のものを用いることがで
きる。
特に好ましくは、塩化ビニル樹脂担体は以下の様にして
製造される。
製造される。
先ず塩化ビニＪ樹脂をジメチルホルムアミドなどの溶媒
（イ）に溶解し、これを所望の担体形状に形成した後溶
媒（Ｂ）への浸漬処理を行なう。
（イ）に溶解し、これを所望の担体形状に形成した後溶
媒（Ｂ）への浸漬処理を行なう。
本発明の上記塩化ビニル樹脂（ＰＶＲ）としては、ポリ
塩化ビニル（ＰｖＣ）、塩化ビニル共重合体、これらと
他の樹脂とのブレンド物があり、塩化ビニル共重合体と
しては、例えば、塩化ビニルと酢酸ビニル、塩化ビニリ
デン、エチレン、アクリル酸、アクリロニトリルなどと
の二元または三元以上の共重合体がある。
塩化ビニル（ＰｖＣ）、塩化ビニル共重合体、これらと
他の樹脂とのブレンド物があり、塩化ビニル共重合体と
しては、例えば、塩化ビニルと酢酸ビニル、塩化ビニリ
デン、エチレン、アクリル酸、アクリロニトリルなどと
の二元または三元以上の共重合体がある。
溶媒（４）は、ＰｖＲを溶解できる溶剤であって、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＲ）、ジメチルアセトアミド（
ＤＭＡ ）、ｎ−メチルピロリドン（ｎ−ＭＰ ）、ヘ
キサメチルホスフォアミド（ＨＭＰＡ）、テトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ ）、アセトンとベンゼンの混合溶媒な
どがおる。ＰＶＲ溶液の濃度としては１〜３０重滑％の
ものが用いられる。酵素等の固定膜が優れた吸着活性を
発揮して機能するためにはＰＶＲの重合度が約１０００
において６〜１２重量％が好ましい。
チルホルムアミド（ＤＭＲ）、ジメチルアセトアミド（
ＤＭＡ ）、ｎ−メチルピロリドン（ｎ−ＭＰ ）、ヘ
キサメチルホスフォアミド（ＨＭＰＡ）、テトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ ）、アセトンとベンゼンの混合溶媒な
どがおる。ＰＶＲ溶液の濃度としては１〜３０重滑％の
ものが用いられる。酵素等の固定膜が優れた吸着活性を
発揮して機能するためにはＰＶＲの重合度が約１０００
において６〜１２重量％が好ましい。
次に、かくして得たＰＶＲ溶液を所望の担体形状に形成
した後、ＰｖＲの貧溶媒であり且つ溶媒（ト）の良溶媒
となる溶媒（Ｂ）と接触させて担体層を形成する。この
際、溶媒（功との接触はＰＶＲ溶液層が白化する前に行
なうことが好ましい。ここで白化する前とは、ＰｖＲと
溶媒（４）の溶液が目視できる白濁を生じて不透明とな
るまでの期間である。
した後、ＰｖＲの貧溶媒であり且つ溶媒（ト）の良溶媒
となる溶媒（Ｂ）と接触させて担体層を形成する。この
際、溶媒（功との接触はＰＶＲ溶液層が白化する前に行
なうことが好ましい。ここで白化する前とは、ＰｖＲと
溶媒（４）の溶液が目視できる白濁を生じて不透明とな
るまでの期間である。
溶媒（旬としては水、アルコール系溶媒、エーテル系溶
媒などがある。
媒などがある。
アルコール系溶媒としては、メチルアルコール、エチル
アルコール、ｎ−７”ロビルアルコール、ｔｓｏ−７’
ロビルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、５ｅｃ−７
’チルアルコール、ｔｅｒｔ−７’チルアル”−ルｆ！
、トＦ）−価アルコール類、エチレンクリコール、ジエ
チレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類
、エチレンクリコールモノメチルエーテル、エチレング
リコールモノエチルエーテルなどのグリコールモノエー
テル類などが用いられる。浸漬する溶媒としてはこれら
アルコール系溶媒単独またはアルコール系溶媒を５０重
殴％以上含有して塩化ビニル樹脂不溶の混合溶媒であっ
てもよい。
アルコール、ｎ−７”ロビルアルコール、ｔｓｏ−７’
ロビルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、５ｅｃ−７
’チルアルコール、ｔｅｒｔ−７’チルアル”−ルｆ！
、トＦ）−価アルコール類、エチレンクリコール、ジエ
チレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類
、エチレンクリコールモノメチルエーテル、エチレング
リコールモノエチルエーテルなどのグリコールモノエー
テル類などが用いられる。浸漬する溶媒としてはこれら
アルコール系溶媒単独またはアルコール系溶媒を５０重
殴％以上含有して塩化ビニル樹脂不溶の混合溶媒であっ
てもよい。
殊ニ、メチルアルコールへ エチルアルコールを用いた
場合には、固定化酵素活性の大きい固定化物が得られ好
ましい。
場合には、固定化酵素活性の大きい固定化物が得られ好
ましい。
なお、ＰｖＲと溶媒（４）の溶液には、担体の膨潤の度
合の調整すなわち担体の含水率の調節、孔径の調整等の
ために、ポリエチレングリコール等のＰＶＲに対し非溶
媒性の化合物を添加することができる。
合の調整すなわち担体の含水率の調節、孔径の調整等の
ために、ポリエチレングリコール等のＰＶＲに対し非溶
媒性の化合物を添加することができる。
担体形状としては膜状、管状、試験管状、ビーズ状等種
々の形状をとることができる。酵素電極等の用途には特
に膜状が好ましい。膜状担体はＰＶＲ溶液を流延し、そ
の後溶媒（Ｂ）に浸漬して形成する。
々の形状をとることができる。酵素電極等の用途には特
に膜状が好ましい。膜状担体はＰＶＲ溶液を流延し、そ
の後溶媒（Ｂ）に浸漬して形成する。
この際、担体の強度を向上させる為不織布等の補強材を
用いてもよい。
用いてもよい。
なお担体の形成後、担体を水中に浸漬して溶媒Φ）を水
と置換することが好ましい。
と置換することが好ましい。
次に上記多孔性高分子担体を酵素ＰＯＰと共に補酵素フ
ラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤと略記すること
がある）、補酵素チアミンピロホスフェ−）（ＴＰＰと
略記することがある）およびＭｇ２＋イオン及び／又は
Ｍｎ２＋ イオンを含む溶液に浸漬して本発明の固定化
酵素を得る。
ラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤと略記すること
がある）、補酵素チアミンピロホスフェ−）（ＴＰＰと
略記することがある）およびＭｇ２＋イオン及び／又は
Ｍｎ２＋ イオンを含む溶液に浸漬して本発明の固定化
酵素を得る。
この場合、上記酵素を含む溶液は、ＰＯＰの濃度が１０
０〜１０００■７ｄｌ、好ましくは２００〜８００■／
ｔｔｅであり、かつ該溶液のｐＨが６〜８．５、好ま
しくは６．５〜７．０の範囲にある緩衝溶液である。
０〜１０００■７ｄｌ、好ましくは２００〜８００■／
ｔｔｅであり、かつ該溶液のｐＨが６〜８．５、好ま
しくは６．５〜７．０の範囲にある緩衝溶液である。
一方、複合酵素膜の調製は次のようにして行なう。
前記多孔性高分子担体を酵素ＰＯＰ及びＯＡＣを含有す
る溶液と接触させる。この時好ましくはこれらの酵素と
共に補酵素ＦＡＤ、補酵素ＴＰＰおよびＭｇ２＋イオン
及び／又はＭｎ”＋イオンを含む溶液に浸漬して本発明
に用いられる固定化複合酵素を得る。
る溶液と接触させる。この時好ましくはこれらの酵素と
共に補酵素ＦＡＤ、補酵素ＴＰＰおよびＭｇ２＋イオン
及び／又はＭｎ”＋イオンを含む溶液に浸漬して本発明
に用いられる固定化複合酵素を得る。
この場合、上記酵素を含む溶液は、ＰＯＰと０ＡＣの合
計の濃度は１００〜１０００岬／ｄ７！、好ましくは２
００〜８００１１ｉ／ｄｔであシ、ｐｏｐとＯＡＣとの
重量組成比がｓ ｏ ／ ｓ ｏ〜９９／１、好ましく
は７０／３０〜９８／２、特に好ましくは８５／１５〜
９７／３の間にあり、かつ該溶液のｐＨが６〜８．５、
好ましくは６．５〜７．０の範囲にある緩衝溶液である
。
計の濃度は１００〜１０００岬／ｄ７！、好ましくは２
００〜８００１１ｉ／ｄｔであシ、ｐｏｐとＯＡＣとの
重量組成比がｓ ｏ ／ ｓ ｏ〜９９／１、好ましく
は７０／３０〜９８／２、特に好ましくは８５／１５〜
９７／３の間にあり、かつ該溶液のｐＨが６〜８．５、
好ましくは６．５〜７．０の範囲にある緩衝溶液である
。
本発明に使用する上記緩衝溶液は、Ｇｏｏｄ ら（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ５．４６７ （１９６６）
）による公知の緩衝剤を用いることができる。たとえば
Ｎ置換型双極性アミノ酸としては、Ｎ−（２−アセトア
ミド）−２−アミノエタンスルホンｆｉ、Ｎ−（２−ア
セトアミド）イミノジ酢ｔｆｌ、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホンＬ Ｎ、
Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）クリシン、Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）ピペラジンＮ／ ２−エタンスル
ホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３
−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、ヒペラジン
ーＮ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンス
ルホン酸、Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）メチル−２
−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−１７ス（ヒドロキシエ
チル）メチルグリシン等がある。また脂肪族アミンとし
ては、２，２−ビス（ヒドロキシメチル） −２，２？
２“−ニトリロトリエタノール、１．３−ビス〔トリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミン〕プロパン、グリシ
ンアミド等がある。またトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン等を用いることができる。
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ５．４６７ （１９６６）
）による公知の緩衝剤を用いることができる。たとえば
Ｎ置換型双極性アミノ酸としては、Ｎ−（２−アセトア
ミド）−２−アミノエタンスルホンｆｉ、Ｎ−（２−ア
セトアミド）イミノジ酢ｔｆｌ、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホンＬ Ｎ、
Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）クリシン、Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）ピペラジンＮ／ ２−エタンスル
ホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３
−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、ヒペラジン
ーＮ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンス
ルホン酸、Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）メチル−２
−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−１７ス（ヒドロキシエ
チル）メチルグリシン等がある。また脂肪族アミンとし
ては、２，２−ビス（ヒドロキシメチル） −２，２？
２“−ニトリロトリエタノール、１．３−ビス〔トリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミン〕プロパン、グリシ
ンアミド等がある。またトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン等を用いることができる。
また、Ｍｇ イオンおよびＭｎ イオンはＭｇＣｌ２お
よびＭｎＣｔｚの形態で使用することが好ましい。
よびＭｎＣｔｚの形態で使用することが好ましい。
本発明に用いられる固定化酵素は、昭和５７年１２月１
日出願の特許の明細書に記載した常温硬化性ブロックト
イソシアネート化合物の水溶液に接触させて該化合物で
被覆することもできる。
日出願の特許の明細書に記載した常温硬化性ブロックト
イソシアネート化合物の水溶液に接触させて該化合物で
被覆することもできる。
上記の様にして得られた固定化酵素膜を公知の多孔性の
高分子膜、例えばアセチルセルロース膜、ポリカーボネ
ート膜、ナイロン膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン
膜、テフロン膜等と貼り合せ、固定化酵素膜が試料液に
接する様に公知の例えば過酸化水素電極等に装着した酵
素電極を製作し、使用する。
高分子膜、例えばアセチルセルロース膜、ポリカーボネ
ート膜、ナイロン膜、ポリプロピレン膜、ポリエチレン
膜、テフロン膜等と貼り合せ、固定化酵素膜が試料液に
接する様に公知の例えば過酸化水素電極等に装着した酵
素電極を製作し、使用する。
第１図は、この酵素電極を用いた本発明の一例を示すト
ランスアミナーゼ活性分析装置の系統図である。
ランスアミナーゼ活性分析装置の系統図である。
以下、第１図を用いて本発明のトランスアミナーゼ活性
の測定方法を用いるＧＯＴおよびＧＰＴ測定方法を説明
する。
の測定方法を用いるＧＯＴおよびＧＰＴ測定方法を説明
する。
第１図に於て、測定セル２にＧＰＴ測定用基質溶液（ア
ラニン、α−ケトグルタル酸、ＦＡＤ。
ラニン、α−ケトグルタル酸、ＦＡＤ。
Ｔ Ｐ Ｐ 、 ＫＨ２ＰＯ４、Ｍｇ２＋及び／又はＭ
ｎ２＋イオン等を含む）１４およびＧＯＴ測定用基質溶
液（アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸、ＦＡＤ。
ｎ２＋イオン等を含む）１４およびＧＯＴ測定用基質溶
液（アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸、ＦＡＤ。
Ｔ Ｐ Ｐ 、ＫＨ２ＰＯ４、Ｍｇ２＋及び／又はＭｎ
２＋イオン等を含む）１５を各々ポンプ１０．１１にて
注入する。次に試料を注射器１により測定セル２に注入
する。セル２中にてアラニン、α−ケトグルタル酸及び
生体試料中のＧＰＴとの反応により生成したピルビン酸
は上述の固定化酵素膜３中のビルピン酸オキシダーゼと
反応する。この際、発生する過酸化水素量又は減少する
酸素量を過酸化水素電極又は酸素電極５にて検出し記録
計８またはデジタルマルチメータ９により読み取る。
２＋イオン等を含む）１５を各々ポンプ１０．１１にて
注入する。次に試料を注射器１により測定セル２に注入
する。セル２中にてアラニン、α−ケトグルタル酸及び
生体試料中のＧＰＴとの反応により生成したピルビン酸
は上述の固定化酵素膜３中のビルピン酸オキシダーゼと
反応する。この際、発生する過酸化水素量又は減少する
酸素量を過酸化水素電極又は酸素電極５にて検出し記録
計８またはデジタルマルチメータ９により読み取る。
一方、上記の反応は固定化複合酵素膜４中でも同時に進
行しており、さらに加えて、アスパラギン酸、α−ケト
グルタル酸及び生体試料中のＧＯＴとの反応によシ生成
したオキザロ酢酸は上述の固定化複合酵素膜４中のオキ
ザロ酢酸デカルボキシラーゼによりピルビン酸となり、
次いで固定化複合酵素膜４中のピルビン酸オキシダーゼ
と反応することにより、前記同様、発生する過酸化水素
量又は減少する酸素量を過酸化水素電極又は酸素電極６
にて検出し記録計８まだはデジタルマルチメータ９によ
り読み取る。従って、電極６上ではＧＰＴおよびＧＯＴ
の二成分反応による出力を測定し、前記の電極５にて得
られたＧＰＴ反応による出力を補正することにより、Ｇ
ＯＴ反応による出力をめることができる。測定終了後、
ポンプ１３によりセル内の液は廃棄される。
行しており、さらに加えて、アスパラギン酸、α−ケト
グルタル酸及び生体試料中のＧＯＴとの反応によシ生成
したオキザロ酢酸は上述の固定化複合酵素膜４中のオキ
ザロ酢酸デカルボキシラーゼによりピルビン酸となり、
次いで固定化複合酵素膜４中のピルビン酸オキシダーゼ
と反応することにより、前記同様、発生する過酸化水素
量又は減少する酸素量を過酸化水素電極又は酸素電極６
にて検出し記録計８まだはデジタルマルチメータ９によ
り読み取る。従って、電極６上ではＧＰＴおよびＧＯＴ
の二成分反応による出力を測定し、前記の電極５にて得
られたＧＰＴ反応による出力を補正することにより、Ｇ
ＯＴ反応による出力をめることができる。測定終了後、
ポンプ１３によりセル内の液は廃棄される。
この様にして既知のＧＯＴ活性値およびＧＰＴ活性値を
有する試料を用いて測定すると、第２図に示す上記二種
の酵素電極（４）及びの）それぞれの出力の反応曲線が
得られ、ＧＯＴ活性値およびＧＰＴ活性値と電流値変化
速度との間には第３図に示す良好な直線関係が認められ
た。
有する試料を用いて測定すると、第２図に示す上記二種
の酵素電極（４）及びの）それぞれの出力の反応曲線が
得られ、ＧＯＴ活性値およびＧＰＴ活性値と電流値変化
速度との間には第３図に示す良好な直線関係が認められ
た。
以上詳述した通り、本発明のトランスアミナーゼ活性の
測定方法を用いることによって、生体試料中の微量のＧ
ＯＴおよびＧＰＴを簡便な方法で、迅速に精度良く、定
量範囲も広くかつ同時に測定することができる。
測定方法を用いることによって、生体試料中の微量のＧ
ＯＴおよびＧＰＴを簡便な方法で、迅速に精度良く、定
量範囲も広くかつ同時に測定することができる。
第１図は、本発明の測定方法を用いるトランスアミナー
ゼ活性分析装置の系統図の一例である。 第２図は、本発明の測定方法を用いて得られた酵素電極
（４）および（Ｂ）の出力特性図の一例である。 第３図は、本発明の測定方法を用いて測定して得たＧＯ
Ｔ活性値およびＧＰＴ活性値と電流値変化速度との相関
図である。 １・・・試料注入器、２・・・反応及び検出セル、３・
・・固定化酵素膜、４・・・固定化複合酵素膜、５．６
・・・酸素電極または過酸化水素電極、７・・・増幅器
、８・・・レコーダー、９・・・デジタルマルチメータ
、工０．１１．１２．１３・・・ポンプ、１４．１５・
・・基質溶液槽、１６・・・廃液槽。 特許出願人 三菱油化株式会社 代理人 弁理士 古 川 秀 利 代理人 弁理士 長 谷 正 久 第１図 第２図 時間（ｍｉｎ） 第３図
ゼ活性分析装置の系統図の一例である。 第２図は、本発明の測定方法を用いて得られた酵素電極
（４）および（Ｂ）の出力特性図の一例である。 第３図は、本発明の測定方法を用いて測定して得たＧＯ
Ｔ活性値およびＧＰＴ活性値と電流値変化速度との相関
図である。 １・・・試料注入器、２・・・反応及び検出セル、３・
・・固定化酵素膜、４・・・固定化複合酵素膜、５．６
・・・酸素電極または過酸化水素電極、７・・・増幅器
、８・・・レコーダー、９・・・デジタルマルチメータ
、工０．１１．１２．１３・・・ポンプ、１４．１５・
・・基質溶液槽、１６・・・廃液槽。 特許出願人 三菱油化株式会社 代理人 弁理士 古 川 秀 利 代理人 弁理士 長 谷 正 久 第１図 第２図 時間（ｍｉｎ） 第３図
Claims (1)
- （１） ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）を担体上に
固定化した固定化酵素膜を装着した酵素電極（４）及び
ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）とオキザロ酢酸デカ
ルボキシラーゼ（ＯＡＣ）とを担体上に固定化した固定
化複合酵素膜を装着した酵素電極の）を有するセルに、
試料液、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（ＧＯＴ ）測定用基質溶液及びグルタミン酸ピルビン
酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）測定用基質溶液を供給
し、該酵素電極囚の出力によｆｉＧＰＴ活性を測定する
と同時に該酵素電極（Ｂ）の出力によりＧＰＴ活性及び
ＧＯＴ活性の合計活性を測定することを特徴とするトラ
ンスアミナーゼ活性の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58202508A JPS6095344A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | トランスアミナ−ゼ活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58202508A JPS6095344A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | トランスアミナ−ゼ活性の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6095344A true JPS6095344A (ja) | 1985-05-28 |
Family
ID=16458641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58202508A Pending JPS6095344A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | トランスアミナ−ゼ活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6095344A (ja) |
-
1983
- 1983-10-31 JP JP58202508A patent/JPS6095344A/ja active Pending
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