JPS606630B2 - Method for producing 2-deoxy-D-glucose - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は２ーデオキシ−Ｄーグルコースの新規な製造
法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION This invention relates to a novel method for producing 2-deoxy-D-glucose.

この発明の目的物質である２ーデオキシ−Ｄ−グルコー
スは公知物質であり｛例えば「糖質化学便覧」（共立出
版株式会社、昭和４６年８月１５日発行）第２５頁参照
｝例えば生化学的研究用試薬として使用されている。2-Deoxy-D-glucose, which is the target substance of this invention, is a known substance {see, for example, "Carbohydrate Chemistry Handbook" (Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., published August 15, 1970), page 25}, for example, biochemical Used as a research reagent.

従来、この２ーデオキシーＤ−グルコースは植物からの
抽出あるいは合成法によって製造されるということが知
られているが、このような方法は２−デオキシ−Ｄ−グ
ルコースの生産にはかならずしも充分ではない。Conventionally, it has been known that 2-deoxy-D-glucose can be produced by extraction from plants or synthetic methods, but these methods are not always sufficient for producing 2-deoxy-D-glucose.

この発明者等は、このような点から鋭意研究の結果、ス
トレプトマィセス属に属する菌が２−デオキシーＤ−グ
ルコースを生産するという新知見を得、さらに研究を続
けた結果、この発明を完成した。As a result of intensive research from this point of view, the inventors obtained the new finding that bacteria belonging to the genus Streptomyces produce 2-deoxy-D-glucose, and as a result of further research, completed this invention. did.

この発明で使用される２ーデオキシ−Ｄーグルコース生
産菌のうち、この発明者等が高知県宿毛市の±穣から新
たに分離した菌株（Ｎｏ．４９４３と番号を付す）は次
のような菌学的性状を有する。Among the 2-deoxy-D-glucose-producing bacteria used in this invention, the strain (numbered No. 4943) newly isolated by the present inventors from Sukumo City, Kochi Prefecture, is based on the following mycological research. It has certain characteristics.

１ 形態学的性質 シュークロース・硝酸塩寒天、グリセリン・ァスパラギ
ン寒天、イースト・麦芽寒天、オートミール寒天および
スターチ・無機塩寒天の各平板培養基上で２５ｑｏ、１
４日間培養した後、顕微鏡下で観察した結果は次のとお
りである。1 Morphological Properties 25 qo, 1
After culturing for 4 days, the results of observation under a microscope are as follows.

‘１｝ 胞子形成菌糸の分枝法 単純分枝 ■ 胞子形成菌糸の形態 直〜曲状（Ｒｅｃｔ船ｘｉｂｉｌｅｓ）。'1} Branching method of spore-forming hyphae simple branching ■ Morphology of spore-forming hyphae Straight to curved (Rect vessels xibiles).

気菌糸は比較的枝分れが少なく、まつすぐに伸び、時に
は５の固以上の胞子が連鎖している。Aerial hyphae are relatively unbranched, elongate quickly, and sometimes contain five or more spores linked together.

（３’胞子の表面構造及び大きさ 平滑（Ｓｍｏｏｔｈ）、０．３〜０．９×１．２〜２．
０山｛４｝ 鞭毛胞子の有無認められない。(Smooth surface structure and size of 3' spore, 0.3-0.9 x 1.2-2.
Mountain 0 {4} The presence or absence of flagellated spores is not observed.

【５）胞子のうの有無 認められない。[5] Presence or absence of sporangia unacceptable.

｛６｝ 胞子柄の着生位置 気菌糸上 ｛７ー 栄養菌糸の分断 認められない。{6} Spore stalk epiphyte position on aerial mycelia {7- Division of vegetative hyphae unacceptable.

０ 各種培地における生育状態 下記各種培地における生育状態は、２５００、１０〜１
４日間培養後の観察である。0 Growth status in various media The growth status in the following various media is 2500, 10-1
This is an observation after 4 days of culture.

ｍ 生理学的性質 （１｝ 生育温度範囲〔ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔｓ）
寒天培地上〕１０〜３５００、最適生育温度２５００。m Physiological properties (1) Growth temperature range [Bennetts]
On agar medium] 10-3500, optimal growth temperature 2500.

■ ゼラチンの液化（グルコ−ス・ベプトン・ゼラチン
塔地上）液化しない。■ Liquefaction of gelatin (Glucose/Beptone/Gelatin tower above) Does not liquefy.

糊 スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地上
）加水分解する。Glue Hydrolyze starch (on starch/inorganic salt agar medium) Hydrolyze.

【４ー 脱脂牛乳の凝固およびべプトン化凝固しない、
弱くべプトン化する。[4- Skimmed milk does not coagulate and veptonize,
Beptonizes weakly.

｛５） メラニン様物質の生産（チロシン寒天、ベプト
ン・イースト・鉄寒天およびトリプトン・イースト・フ
ロス） 生産しない。{5) Production of melanin-like substances (tyrosine agar, beptone yeast iron agar and tryptone yeast floss) Not produced.

■ 各種炭素源の利用性 Ｌーアラビノース ＋ セ′レロ‐−ス Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−グルコース ＋ ガラクトース ＋ イノシトール マソノース 士 Ｄーマンニトール Ｌーラムノース ラフイノース 士 夕 シェークロース ＋ サリシン Ｄ−キシロース ＋ （十：よく利用する、士：利用性疑わし い、一：利用しない） Ｚ以上のような
菌学的性質を有する菌株について、パージエイズ・マニ
アル・オブ・デイタミナテイブ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ ｓＮねｎ雌ｌｏｆＤｅにｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版（１９７３年）
、ィー・ビー・シヤーリングおよびデＺ一・ゴツトリー
ブ（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄ．ＧｏｔＵ
ｉｅｂ）著のＩＳＰ（ｌｎｔｅｒｎａｔｉｏ岬ＩＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓＰｒｏｇｅｃｔ）報告｛インターナ
ショナル・ジャーナル・オブ・システマテイツク・バク
テリオロジー第１８巻第６９頁、（１９６８年）、同第
１９巻第３９１頁（１９６ｇ王）および同第２２巻第２
６５頁（１９７２王）｝ およびエス・エ・ワックスマ
ン（Ｓ・Ａ・Ｗａｋｓｍａｎ）著、ジ・アクチノミセテ
ス（ＴｈｅＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅにｓ）第２巻（１９６
１年）等の文献をもとに検索を行った。■ Utilization of various carbon sources L-arabinose + cellulose D-fructose + D-glucose + galactose + inositol masonose D-mannitol L-rhamnose sulfinose L-shakerose + salicin D-xylose + : Frequently used, Expert: Usability questionable, 1: Not used) For strains with mycological properties such as Z or higher, Purge's Manual of Determinative Bacteriology (B
ergey' sN nen female lofDe rminati
veBacteriology) 8th edition (1973)
, E.B. Shirling and D. Gottlieb
ISP (lnternatiomisaki IStr) written by ieb)
eptomycesProject) Report {International Journal of Systematic Bacteriology Vol. 18, p. 69, (1968), Vol. 19, p. 391 (196g) and Vol. 22, No. 2
65 pages (1972)} and S.A. Waksman, The Actinomycetes, Volume 2 (196).
The search was conducted based on literature such as 1st year).

その結果Ｎｏ．４９４３珠と比較的近縁する菌種として
下記の菌種が挙げられる。すなわち、ストレプトマイセ
ス・オステレオグリゼウス（Ｓｔｒｅｐ■ｍｙｃｅｓｏ
ｓｔｒｅｏｇｎｓｅｕｓ）、トレプトマイセス・ルシフ
エンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｅｃｉｆｅｎｓ
ｉｓ）およびストレプトマイセス・キサントシデイカス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｘａｎｔｈｏｃｊｄｉｃｕ
ｓ）。これらのうち、ストレプトマイセス・オステレオ
グリゼウスはラムノースを利用する点で、またストレプ
トマィセス・レシフェソシスは、気菌糸がループ（ｌｏ
ｏｐ）、フック（ｈｏｏｋ）を形成し、マソニトールを
利用する点で、それぞれＮｏ．４９４３珠と異なる。し
かし、ストレプトマィセス・キサントシディカスは該菌
がメラニン様物質の生産は不安定であるという点以外は
Ｎｏ．４９４３株と最も近似し、しかも原記載ではスト
レプトマィセス・キサントシディカスのメラニン様物質
の生産は陰性となっていることから、結局Ｎｏ．４９４
３株をストレプトマィセス・キサントシデイカスＮＯ．
４９４３と命名した。このストレプトマイセス・キサン
トシデイカスＮｏ．４９４３※ま工業技術院微生物工業
技術研究所に微生物受託番号第４１３５号として、寄託
されている。As a result, No. The following bacterial species are relatively closely related to 4943 beads. That is, Streptomyces osteoglyzeus
Streognseus), Streptomyces lucifensis
is) and Streptomyces xanthocjdicu
s). Among these, Streptomyces osteoreoglyzeus uses rhamnose, and Streptomyces recifesosis has a loop (loop) aerial hyphae.
op), No. 1 in terms of forming a hook and using masonitol. Different from 4943 beads. However, Streptomyces xanthosidedicus is No. 1 except for the fact that the production of melanin-like substances is unstable. It is most similar to strain No. 4943, and since the original description says that Streptomyces 494
3 strains were Streptomyces xanthosideicus NO.
It was named 4943. This Streptomyces xanthosideicus No. 4943* has been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as Microorganism Accession No. 4135.

ストレプトマィセス属に属する２ーデオキシ−Ｄ−グル
コース生産菌は、例えば紫外線、Ｘ線等の照射処理、Ｎ
ーメチルーＮ′ーニトローＮ−ニトロソグアニジン（Ｎ
ＴＧ）、５ーブロモウラシル、２ーァミノプリン等の薬
剤による処理、形質転換、形質導入、接合等の通常用い
られる菌株変異処理方法によって２ーデオキシ−Ｄ−グ
ルコースの生産能を高めることができる。2-deoxy-D-glucose-producing bacteria belonging to the genus Streptomyces can be treated with irradiation such as ultraviolet rays or X-rays,
-Methyl-N'nitro-N-nitrosoguanidine (N
The production ability of 2-deoxy-D-glucose can be increased by commonly used strain mutation treatment methods such as treatment with drugs such as TG), 5-bromouracil, and 2-aminopurine, transformation, transduction, and conjugation.

培養方法は原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが
、通常は液体培地による深部培養法が有利である。In principle, the culture method is similar to that of general microorganisms, but the deep culture method using a liquid medium is usually advantageous.

培養に用いられる培地としては、ストレブトマィセス属
に属する２ーデオキシ−○ーグルコース生産菌が利用す
る栄養源を含有する培地であればよい。すなわち、合成
培地、半合成培地あるいは天然０培地が用いられ、培地
の組成は、炭素源としては例えばグルコース、マンノー
ス、グリセリン、糠密、でん粉、液化でん粉等が用いら
れ、窒素源としては肉エキス、カゼイン加水分解物、ベ
プトン、グルテンミール、コーンミール、棉実粕、大タ
豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵母、りん酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、尿素等が用いられる。The medium used for culturing may be any medium containing a nutrient source utilized by 2-deoxy-○-glucose-producing bacteria belonging to the genus Strebtomyces. That is, a synthetic medium, a semi-synthetic medium, or a natural zero medium is used, and the composition of the medium includes, for example, glucose, mannose, glycerin, bran, starch, liquefied starch, etc. as a carbon source, and meat extract as a nitrogen source. , casein hydrolyzate, veptone, gluten meal, corn meal, cotton seed meal, soybean flour, corn steep liquor, dried yeast, ammonium phosphate, ammonium sulfate, urea, etc. are used.

また、例えばりん酸水素２ナトリウム、りん酸２水素カ
リウム、炭酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウ
ム、硫酸鋼、硫酸亜鉛、塩０化マンガン、塩化マグネシ
ウム等の金属のりん酸塩、炭酸塩、塩化物等の無機塩も
必要に応じて添加される。また、培養中発泡の著しい時
には、例えば大豆油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカ
ノール・テトラデカノール、ヘブタノール等の高級タア
ルコール類、シリコン化合物等の消泡剤を適宜添加すれ
ばよい。培養温度は３０００前後が適当である。In addition, metal phosphates and carbonates, such as disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium carbonate, ferrous sulfate, magnesium sulfate, steel sulfate, zinc sulfate, manganese chloride, magnesium chloride, Inorganic salts such as chlorides are also added as necessary. In addition, when foaming is significant during culturing, antifoaming agents such as vegetable oils such as soybean oil and linseed oil, higher alcohols such as octadecanol, tetradecanol, and hebutanol, and silicon compounds may be appropriately added. A suitable culture temperature is around 3,000.

培養容量の増大に従って適宜種培養を行なうと好結果が
得られることが多い。本培養の培養時間は５０〜１００
時０間位が適当であり、培地の濃厚化に従って、培養時
間をさらに延長してもよい。以上述べた培養条件は使用
生産菌株の特性に応じてそれぞれ最適の条件を選択して
適用される。Good results are often obtained by carrying out seed culture as appropriate as the culture volume increases. The culture time for main culture is 50 to 100
A time of about 0 hours is appropriate, and the culture time may be further extended as the medium becomes more concentrated. The culture conditions described above are applied by selecting optimal conditions depending on the characteristics of the production strain used.

このようにして培養物中に蓄積された２ーデオキシ−Ｄ
−グルコースは主に培養液中に含有されているので、遠
心分離またはろ過により培養物から菌株を除去した後、
ろ液から一般抗生物質の製造に用いられる常法の手段に
よって分離、採取、精製される。すなわち、減圧濃縮、
凍結乾燥「溶媒抽出、液***換、例えば陰イオン交換樹
脂、陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等による処
理、例えば活性炭、けし、酸、シリカゲル、アルミナ等
の吸着剤による処理、結晶化、再結晶等の手段を単独、
あるいは任意の順序に組合わせ、また反復して用いてろ
液から２−デオキシ−Ｄ−グルコースは分離、採取、精
製される。このようにして得られる２ーデオキシーＤ−
グルコースは、前記のように生化学的研究用試薬として
有用であり、また、この化合物は、スタヒロコッカス・
アウレウス、ェセリヒア・コリ等の病原菌に対し活性を
有するほか、ビールスに対しても活性を有する。2-deoxy-D thus accumulated in the culture.
- Since glucose is mainly contained in the culture medium, after removing the bacterial strain from the culture by centrifugation or filtration,
It is separated, collected, and purified from the filtrate using conventional methods used in the production of general antibiotics. That is, vacuum concentration,
Freeze drying, solvent extraction, liquid exchange, treatment with anion exchange resins, cation exchange resins, nonionic adsorption resins, etc., treatment with adsorbents such as activated carbon, poppy, acid, silica gel, alumina, crystallization, Using methods such as recrystallization alone,
Alternatively, 2-deoxy-D-glucose can be separated, collected, and purified from the filtrate by combining them in any order and using them repeatedly. 2-deoxy-D- thus obtained
Glucose is useful as a reagent for biochemical research as described above, and this compound also
In addition to being active against pathogenic bacteria such as E. aureus and E. coli, it is also active against viruses.

さらにまた、この２−デオキシ−Ｄ−グルコースは他の
抗ビールス剤（例えば３−デアザゥリジン）と併用効果
を有する旨の報告もある｛例えば、アンチミクロバイア
ル・ェ−ゼントアンドケモセラピー（ＡＮＴＩＭＩＣＲ
ＯＢＩＡＬＡＧＥＮＴＳＡＮＤＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰ
Ｙ）、３月号、１９７７年、第４７５〜４８１頁｝。次
にこの発明の実施例を示す。Furthermore, there are reports that this 2-deoxy-D-glucose has a combined effect with other antiviral agents (e.g. 3-deazauridine) {e.g. Antimicrobial Agent and Chemotherapy (ANTIMICR)
OBIALAGENTSANDCHEMOTHERAP
Y), March issue, 1977, pp. 475-481}. Next, examples of this invention will be shown.

実施例 １ グリセリン４％、ファーマメディア（商標、トレーダー
ズ・オイル・ミル社製）０．５％、月率芽０．５％、モ
ラティン（商標、鐘激化学工業株式会社製）０．２５％
、コーンスチープリカ−０．２５％、りん酸２水素カリ
ウム０．５％およびりん酸水素２ナトリウム（ＩＺｋ加
物）０．５％の組成の培地２０夕を３０〆客の発酵槽に
入れ、常法により滅菌した後、これにでん粉１％、ファ
ーマメディア１％およびモラティン１％の組成の培地で
培養したストレプトマィセス・キサントシディカスＮｏ
．４９４３の培養物１そを接種し、３０ｏＣで７雛寺間
培養する。Example 1 Glycerin 4%, Pharmamedia (trademark, manufactured by Traders Oil Mill Co., Ltd.) 0.5%, Monthly Bud 0.5%, Moratin (trademark, manufactured by Kaneki Kagaku Kogyo Co., Ltd.) 0.25%
, 20 hours of a medium with a composition of 0.25% corn steep liquor, 0.5% potassium dihydrogen phosphate, and 0.5% disodium hydrogen phosphate (IZk additive) were placed in a fermenter for 30 hours. Streptomyces
．． 4943 was inoculated and cultured for 7 chicks at 30oC.

培養終了後、培養物を炉過し、得られた炉液２０〆を和
光製薬株式会社製クロマト用炭素３０そを充てんしたカ
ラムに通す。有効成分を５０％メタノールで熔出し、溶
出液を減圧下で濃縮し、得られた濃縮液２そをＤＥＡＥ
セフアデツクス（ＯＨサイクル）に吸着させる。有効成
分を水で溶出し、濃縮して得られた濃縮液１０の‘をセ
ルロースカラム（５００地）に吸着させる。有効成分を
ブタノール：水（９０：１０）の漉液で溶出する。活性
区分を濃縮乾固すると白色粉末１夕が得られる。この粉
末をエタノールから再結晶すると無色針状結晶９００の
９が得られる。この結晶の赤外線吸収スペクトルは第１
図の通りであり、２ーデオキシ−Ｄ−グルコースの標品
のそれと一致した。After the cultivation is completed, the culture is filtered, and the resulting furnace solution is passed through a column filled with carbon 30 for chromatography manufactured by Wako Pharmaceutical Co., Ltd. The active ingredient was dissolved with 50% methanol, the eluate was concentrated under reduced pressure, and the resulting concentrate 2 was added to DEAE.
Adsorb to Cephadex (OH cycle). The active ingredient is eluted with water and the resulting concentrated solution 10' is adsorbed onto a cellulose column (500 ml). The active ingredient is eluted with a butanol:water (90:10) strain. The active fraction is concentrated to dryness to give a white powder. When this powder is recrystallized from ethanol, 9 of 900 colorless needle crystals are obtained. The infrared absorption spectrum of this crystal is the first
The results were as shown in the figure, and were consistent with those of the standard 2-deoxy-D-glucose.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図はこの発明で得られる２−デオキシーＤ−グルコ
ースの赤外線吸収スペクトルを示す。FIG. 1 shows the infrared absorption spectrum of 2-deoxy-D-glucose obtained by the present invention.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １ ストレプトマイセス属に属する２−デオキシ−Ｄ−
グルコース生産菌を培地に培養し、得られた培養物から
２−デオキシ−Ｄ−グルコースを分離、採取することを
特徴とする２−デオキシ−Ｄ−グルコースの製造法。1 2-deoxy-D- belonging to the genus Streptomyces
A method for producing 2-deoxy-D-glucose, which comprises culturing glucose-producing bacteria in a medium, and separating and collecting 2-deoxy-D-glucose from the resulting culture.