JPS606618A - ５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−ｄ−グリセロ−ｄ−ガラクトノヌロサミン酸のシチジンモノホスフエ−ト含有医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、活性成分として５−アセトアミド−３，５
−−、’デオキシーＤ−グリセローＤ−ガラクトノヌロ
サミン酸のシチジンモノホスフェートを含有する、中枢
神経系（ＣＮＳ　）及び末梢神経系（ＰＮＳ　）　Ｋお
ける神経刺激の障害に関連する病理的状態の療法におい
て使用す＆Ｙｃめの医薬組成物に関する。

すでに知られているように、次の式（１１で示される５
−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−５−グリセロ−
Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸（５−ａｃｅｔａｍｉｄｅ
−３＋５−ｄＬｄｅｏｘｙ−５−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−
ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｇａｒｎｉｎｉｃ　ａｃｉ
ｄ　：　ＮＡＮＡ又はＮｅｕＡｃ）のシチジンモノホス
フェート（ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｍｏｎｏ−ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　：　ＣＭＰ　）　Ｃ式（１）の化合物をＣＭＰ
　−ＮＡＮＡ　。

又ｌｉＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略す〕は、５−アセトアミ
ド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト
ノヌロサミン酸〔通常、Ｎ−アセチル−ニューラミン酸
（Ｎ−ａＣｅｔｙｌ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉｄ
　）と称しＮＡＮＡと略す〕の生物学的活性形であシ、
そしてこの化合物は生物体中の種々の合成過程の生成物
である。

ＮＡＮＡは、膜に見出される分子（ガングリオキサイド
及び糖蛋白）の生理的活性部分であり、これは一般に、
細胞が機能するために必要とされるすべての情報を受領
しそして伝達することができるように構成されている（
例えば、Ｒ，Ｗ、　Ｔｅａｎｌｏｚ等、Ｔｈｅ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ
１ｄ　ａｔ　ｔｈｅＳｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ
ｅ１ｌ、　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅｓ　
ｏｆ８ｉａｌｌｃ　Ａｃｉ＋Ｌ　Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ等編、プレナムプルス、２０１〜２２７頁、１９７６
年参照のこと）。

次の反応式、　以下余白 に従って、生化学的方法によりＣＭＰ　−ＮＡＮＡ　’
を製造する方法も、例えば８．　Ｒｏｓｅｍａｎ＋　Ｐ
ｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　。

Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ　４８．４３７−４１　（
１９６２）　：　Ｎ。

５ｈａｒｏｎ、　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅｓ、　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｖ／ｅｇｌｅｙ。

出版、ロンドンーアムステルダム、１５０〜１５３百、
１９７９年においてよく知られている。

Ｂ、　Ｂｅｎｄｉａｌ（等、Ｃａｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　５９．１７１〜１８０　（１９８１）、及びＡ
、　Ｐｒｅ　ｔ　ｌ　等、Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ。

３Ｆ１．２８１〜２９６　（１９８０）から、ＣＭＰ−
ＮＡＮＡは酵素シアリルトランスフェラーゼの生理的基
質であり、この酵素は生物膜の前記のサブユニット、例
えばガングリオサイド及び糖蛋白への（Ｊ’ＩＰ−ＮＡ
ＮＡの導入に寄与することもすでに知られている。

前記の反応において示されるように、活性形ＮＡＮＡの
合成の間にＣＴＰ中の２１固の高反応性結合のエネルギ
ーが消費される。他方、Ｎ−アセチルニューラミン酸は
この活性形においてのみ膜に導入され得る〔例えば、Ａ
、Ａｒｃｅ等、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、す、６．５２〜５８　（１９６６）参
照〕。

膜中での成分の正常な代謝回転のほかに、膜の機能はＮ
ＡＮＡ残基の脱着の反復と関連していることは重要であ
る。実際に、ＮＡＮＡが膜表面に伺与する負電荷の変化
により膜のｍ８ｆｉ’？的活性が変化する（例えば、Ｒ
，Ｊｂｅｒｎａｃｋｉ等、ｉ’ｈｅ　Ｇｌｙｃｏｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅｓＶｏｌ、　ＰＪ　ｐａｒｔ　Ｂ、八り、
１．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　Ｅ、　＊アカデミツクプレス、
２５６〜２６１頁、　］　９８２　：　Ｓ、Ｎｇ　ｖｉ
、ＴｈｅＮａｔｕｒａｌ　０ｃｃｕｒｅｎｃｅ　ｏｆ　
５ｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄ、　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＲｏｌｅｓ　ｏｆ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄ、んＲｏ
ｓｅｎｂｅｒｇ等編、プレナムプレス、５９〜８６頁、
１９７６宅照）。

さらに、神経不調の治療のために、ガングリオサイドを
、天然分Ｋｔ曽から、例えばモノ−、ジー、トリー、及
びテトラ−Ｎ−アセチルニューラミン酸ガングリオサイ
ドを含有する哺乳ｑｈ物の神経組織からの抽出により得
られる混合物として使用することも提案きれている（イ
タリア特許出ＷＩ第２６３２３Ａ／７３号参照のこと）
。

しかしながら、この療法は次のような幾つかの欠点を有
する。

（ａ）　７！／ングリオサイドの混合物の組成をコント
ロールすることは困難であり、そして複雑な装置１りを
必要とする。

（ｂ）　ガングリオサイドのような生物重合体の化学的
安定性は低いので医薬としての商品寿命が限定され、こ
のために治療上の危険、例えば秤々のコントロールでき
ない副作用が生ずる。

（ｃ）ガングリオサイドは高分子邦・（約１５００）の
生物重合体であるので抗原性を有する（例えば、Ｊ、Ｔ
、ＲＩｅｋ　菊、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｉ
ｌｄ　Ｎｅｕｒｏｌ、　２２゜７１９〜７２４．１９８
０を参照のこと）。

今まで、ＣＭＰ−ＮＡＮＡは、中枢神経系（ＣＮＳ）及
び末梢神経系（ＰＮＳ）における神経刺激の障害に関連
する病理的状態の療法のための医薬組成物の形では使用
されていなかった。

今や、ＣＭＰ−ＮＡＮＡが、中枢神経系又は末梢神経系
の障害、例えばＣＮ８又はＰＮＳレベルでの神経伝達の
変調；末梢神経の外傷による又は毒による損傷；ハンチ
イントン・フレア（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’５Ｃａｒｅ
ａ　）　、老人性痴呆のごとき病的状態による記憶障害
；動脈硬化性又は心臓性の錯乱状態；眼球ｇ／部神経炎
；眼球運動の麻痺；三叉神経の神経痛；顔面神経又はベ
ル（Ｂｅｌｌ）神経の麻痺；ガルシン（Ｇａｒｃｉｎ）
症候群：グイラｙ−パレ（ＧｕｉｌｌａｎＢａｒｒｅ　
）症候群ニラジオライト（ｒａｄｉｏｌｉｔｅｓ　）　
：糖尿病性及びアルコール性多発性神経炎：＃科的麻痺
：運動性神経疾患；筋萎縮性側索硬化症：を髄病性筋萎
縮：１８行性球麻痺；激しい筋勿力症：筋ジストロフィ
ー：錯乱状態のような意識障害：脳しんとう；頭蓋外傷
、脳血管障害、及び血栓症の結果の治病のために非常に
価値があることが見出された。

さらに、ＣＭＰ−ＮＡＮＡが、シチジントリホスフェ−
）　（ＣＴＴ）とＮ−アセチルニュラミン酸（ＮＡＮＡ
　）との酵素ＣＭＰ−アシルニュラミネートシンサーゼ
［ＣＭＰ−ａｃｙｌｎｕｒａｍｉｎａｔｅ　５ｙｎｔｈ
ａｓｅ（ＥＣ２，７，７，４３））により触媒される縮
合に基礎を置く２つの方法により得られることが見出さ
れた。

第１の新規な方法（Ａ）においてｉ、ＣＴＰとＮＡＮＡ
と、の縮合が、神々の分離源からの、無細胞型の、溶解
した、又は適当な固体に固定された酵素ＣＭＰ−アシル
ニューラミネートシンサーゼ（ＥＣ２，７，７゜４３）
により触媒され、これは酵素の蛋白性構造と固体担体と
の化学結合を可能にするＢｒＣＮ、チオカルどン酸安定
剤及び／又はニトロイミダゾール安定剤の存在下で行わ
れる。

第２の新規な方法（Ｂ）においてけ、ＣＴＰとＮＡＮＡ
との縮合がＥ−”す（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＣＲＣｌ　４
８２がら分離された酵素ｃＭＰ−アシルニューラミネー
トシンサーゼ（ＥＣ２，７，７，４３）により触媒され
る。

第２の方法（Ｂ）は、場合によってはさらに、チオカル
ボン酸安定剤及び／又はニトロイミダゾール安建剤の存
在下で、そして／又は方法（〜の条件下で行うこともで
きる。

従って、この発明の対象の１っけ、中枢神経系及び末梢
神経系における神経刺激の障害に関連する病理的状態の
療法において使用するための、５−アセトアミド−３，
５−ジデオキシ−〇−グリセローＤ−ガラクトノヌロサ
ミン酸のシチジンモノホスフェートを含んでなる医薬組
成物である。

この発明の他の対象は、酵素ＣＭＰ−アシルニューラミ
ネートシンサーセ（ＥＣ２，７，７，４３）によｐ触媒
される、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）とＮ−ア
セチルニューラミンＰ！（ＮＡＮＡ）との縮合によるＣ
’ｌ’Ｐ−ＮＡＮＡの製造方法であって、（Ａ）該縮合
をチオカルボン酸安定剤及び／又はニトロイミダゾール
安定剤の存在下で行うことを特徴とする方法、及び（Ｂ
）該縮合をＥ、　ｗ　ＩＪ　ＣＲＣ１４８２株から分離
されたｉ禦ＣＭＰ−アシルニューラミネートシンサーゼ
（ＥＣ２，７，７，４３）により行うことを特徴とする
方法である。

この発明け、ガングリオシドの治療的使用に関する問題
のほとんどを回避すると共に、次のような利点を有する
。

（ａ）　ＮＡＮＡの活性形、すなわちＣＭＰ−ＮＡＮＡ
け、生物細胞代謝回転がこの分子の多Ｍ°の供給を必要
とする場合、例えば神経の再生の場合に、特にある種の
病理的状態にある生物にｉμ接供給される。

事実、ＮＡＮＡが導入されるガングリオサイド及び糖蛋
白質は、すべての細胞間認識現象、及び細胞と環境との
間のいわゆる社会的細胞挙動に関連する。

（ｂｌ　ＣＭＰ−ＮＡＮＡは化学的に良く特定された分
子であって、生体外での酵素的合成を介して最も高純度
において手入することができる。

（ｃ）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡの化学的純度及び生物的活性
レベルは、簡単な化学的試験及び生体外での酵素的方法
を用いて、決定し又は制御することができる（例えば、
Ｒ，Ｗ、Ｌｅｅｄｅｅｎ　＠、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
ａｎｄＡｎａｌｙ＠ｉｓ　ｏｆ　５ｉａｌｌｃ　Ａｃ１
ｄ、　ｉｎ　Ｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅｓｏｆ　
５ｉａｌｉｃ　Ａｃ１ｄ、　Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｙ等
綿、プレナムプレス、１〜４８頁、１９７６）。

（ｄ）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡが生体内でガングリオサイド
及び糖蛋白質に導入されることが明確に証明されている
（例えば、Ｔｈｅ　Ｇｌｙｅｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｔ　
Ｖｏｌ、　ＩＶ　ｐａｒｔＢ、　Ｍ、　Ｔ、　Ｈｏｒｏ
ｗｌ　ｔｚ　ｌｉ　ｍアカデミツクプレス、１９８２：
Ｅ、　Ｊ、Ｍｃ　Ｇｕｉｒｅ、　Ａｎａｂｏｌｉｃ　Ｒ
ｅａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇＳｉａｌｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ、　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｏｌｅ
ｓ　ｏｆ　５ｉａｌｉｃＡｃｉｄ、　Ａ、　Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｙ等編、プレナムプレス、１２３〜１５８頁、１
９７６を参照のこと）。

（ｅｌ　ＣＭＰ−ＮＡＮＡは、ガングリオシドに比べて
実質的に小形であり、全く抗原性を有しない。ガングリ
オシド又は関連高分子については抗原性が知られている
。

（ｆ）　ＣＭＰ−ＮＡＮＡは、内性分子（ｅｎｄｏｇｅ
ｎｏｕｓｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、ヒトに対する毒性
が非常に低い。３０匹ずつの２群及び対照の２群からな
る、体重２０±Ｉｇのアルピノラットについて発明者等
が得た結果は、腹腔内投与においては９００ｍｇ／ｋｇ
、経口投与において＆−１２４００ｒｖ／ｋｇのＬＤ５
ｏを示した。

ＣＴＰとＮＡＮＡの縮合による５−アセトアミド−３，
５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロサ
ミン酸のシチジンモノホスフェートを製造するための新
規な方法における好ましいＣＴＰ／ＮＡＮＡミリモル比
は３．０〜５．０　：　１．０　ミリモルである。好ま
しい−Ｉは８．５〜８，８である。好ましくは、３０℃
〜４０℃において１〜４時間反応を行うのが好ましい。

好ましい態様に従えば、チオカルボン酸及びニトロイミ
ダゾール安定剤を、ｍＭｏ１のＣＴＰ当たり、又は１！
の全容量当り０．５〜２．０　ｍＭ使用する。

チオカルぎン酸安定剤として非常に広範囲のチオカルが
ン酸又はメルカプトカル？ン酸を使用することができ、
例えば式　Ｈ８（ＣＨ２）ｎＣ００）１　（式中ｎは１
〜５の整数である）の酸、例えばメルカプト酢酸もしく
はβ−チオプロピオン酸、又はメチレン基−ＣＨ２−が
アルキル基により置換されている前記の式の酸、例えば
（＋）−β−チオ−α−メチルプロピオン酸、及び（＋
）−β−チオ−α−エチルプロピオン酸を使用すること
ができる。

ニトロ−イミダゾール安定剤として、例えば、次の式 （式中、ニトロ基は２−１４−１又は５−位にあり、そ
してＲは水素、又Ｊｒｉ置換されている場合があるアル
キル基、例えばヒドロキシエチルもしくはβ−エチルチ
オエチル基である） で表わされる非常に広範囲のニトロイミダゾール、及び
ニトロイミダゾール誘導体を使用することができる。典
型的な、有用なニトロイミダゾールは、２−ニトロ−イ
ミダゾール、２−メチル−５−二トロー１−ヒドロキシ
エチルイミダゾール、及び２−１ｆルー５−ニトロ−１
−β−エチルチオエチルイミダゾールである。

チオカルボン酸は抗酸化剤として機能する。これらは高
い親水性と緩衝性を有するため、アルキルチオールのご
とき類似の化合物よりも好ましい。

ニトロイミダゾールは静細菌活性を有するため特に好ま
しい。

好ましくは、反応生成物（１）はイオン交換クロマトグ
ラフィーによシそして／又はｐＨ８，２〜８．６の緩衝
液、例えばトリエチルアミン／炭酸水素ナトリウム、も
しくｔｊ：０．５〜１．５ｍＭアンセニア水の直線グラ
ジェント溶出を用い、０℃〜６℃で行うセファデックス
カラムクロマトグラフィーにより分１椎する。

この発明の方法においては、ＣＭＰ　−）ランスフェラ
ーゼとも称する酵素ＣＭＰ−アシルニューラミネートシ
ンサーゼ（ＥＣ２，７，７，４３）は、無細胞状態で、
溶解した状態でもしくＦｉ適当な固体担体に固定化して
、又はエシェリヒア・コリＣＲＣ−１４８２（７）細菌
細胞中に存在する状態で使用することができる。無細胞
酵素は、公知の分離方法に従って、例えばＦ、　Ａ、　
Ｔｒｏｙ等、Ｊ、Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４９（１
９７４）１５６　：　１．　Ｋ、ＶＩｊａｙ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５０　（１９７５）１６４
　ｅ　Ｊ、　Ｈａｖｅｒｋａｎｐ等、Ｈｏｐｐｅ−８ｅ
ｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３６０（１９７９）　
］　５９に記載されているようにして、ホモジナイズし
た動物組織、例えばカエル〔ラナ・エスクレンタ（Ｒａ
ｎａＥｓｃｕｌｅｎｔａ）］の肝臓、子ウシの脳、ブタ
、ヒツジ又はウシの下顎腺から、前記のチオカルボン酸
安定剤として使用するのと同じタイプのメルカプトカル
デン酸又はチオカルボン酸、例えばβ−チオゾロピオン
酸又は（＋）−β−チオ−α−エチルゾロピオン酸の存
在下で、全容量ＩＡ当り（）、５〜２．０ｍＭの濃度に
おいて、−■を７，１〜７．２に保持しながら、０〜４
℃の温度において、分＋ｑ＋ｔすることができ、他方固
定化酵素ＥＣ２，７，７，４３を使用する場合には、酵
素を例えば適当な固体担体、例えばセファロースに結合
せしめることによＶ同定化を行う。

好ましくけ、固定化け、ＰＨ３，５〜９０において、適
当な安定剤の存在下で行う。有用な安定剤は、例えばブ
ロモシアニド（ＣＮＩ（ｒ）、Ｍｔびに非常に広範囲の
チオカルボン酸安定剤、ニトロイミダゾール、及びニト
ロイミダゾール許を導体であり、ｃ’ｒｐ−ＮＡＮＡ　
縮合の添加剤として前記したものである。

ニトロイミダゾール及びそのｉ９４体は抗酸化安定剤と
して、及び殺菌剤として機能する。

沓ち゛、旦、スユｃ＊ｃ＋＋ｇ−ｚはけイツ邪虹１判尽
力。

ｆＩｌｃ閏ケ゛七゛ルＶヤフト・７エール・乙パオテク
ノロギ’・ｙｔ−ブオル佐ンクｃＴＭ’ＢＨ，ゲツ千ン
γ゛′ン（Ｂ又Ｖ）に、＠−）、ｂ番号ＩＪｏｚ’１ｏ
４−ＬＬ−’ｔ　１’？？斗４：ｚＱ２ｆ７ｓに濱］ら
１入ｋ。

以下余白 次に、この発明の説明のために例を記載する。

Ａ、製造方法 カエル〔２す・エスクレンタ（Ｒａｎａ　Ｅｓｃｕｌｅ
ｎｔａ）’Ｊの肝臓２００＃を、ウルトラトラクス（Ｕ
ｉｔｒａ　−Ｔｕｒｒａｘ）ホモジナイザー中で、９０
秒間、１ｍＭのβ−チオ−ノロピオン酸を含有する同容
量の８０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＭＣｔ緩衝液（ＰＨ７，２
）を用いて、水浴中で冷却しながら、ホモジナイズした
。このホモジネートを遠心分離（９００００ＸＧ、３０
分間）し、上清を集め、そしてさらに６０分間９０００
０ｘｃにて遠心分離した。第２の上清液（約２５０ｍ）
を、１ｍＭのβ−チオ−プロピオン酸を含有する８０ｙ
ｎＭのＴｒｉｍ／）ＩＣｔ緩衝液ＣＰＨ７，２）であら
かじめ平衡化したＤＥＡＥ−セフアゾ、クスＡ−５０力
２ムに適用した。１０００〜１２００　ＷＬｌの同じ緩
衝液で洗浄した後、同じ緩衝液中０〜１．５Ｍ塩化ナト
リウム直線グラジェントを用いた。２５００ｍ１の溶出
の後、酵素を含有するすべての分画が溶出した。これら
を集め（〜６００１ｎｌ）、窒素のもとて限外濾過し、
そして０．３〜０．６ユニツト／ｍＡ！（１ユニツトの
活性は１μモルの１７分を発生せしめる）の活性を有す
る最終容積（１２０ｍＱの液を得た。

酵素の２０１ｒＬｌのアリコート（約８０００ユニツト
の酵素を含有する）、ＣＴＰ（４〜５ｍモル）、Ｎ−ア
セチルニララミン酸（１ｍモル）を、２時間にわたって
少しずつ、Ｔｒｉ＠緩衝液、Ｍｇ＋、及びβ−チオープ
目ピオン酸の溶液（２’０Ｏｙｄ）に加えた。

あとの３化合物は、それぞれ０．４．０．０４、及び０
．００２　Ｍの濃度で存在せしめた。混合物を３６±０
．２℃で６時間インキユベートシ、次に水で８倍に稀釈
し、そしてダウエックス１×４．炭酸水素形、５０〜１
００メッシ、（０，６＃樹樹脂型モルの化合物■）のカ
ラムにゆっくりと通した・。まず１ｍＭ水酸化アンモニ
ウムで洗浄し、次に３〜４倍量の０．０２〜２．０Ｍ炭
酸水素トリエチルアンモニウム（ｐＨ７，８）を用いて
溶出した。化合物（１）を含有する分画（Ｅ、Ｌ、Ｋａ
ａｎ等、　Ｍｓｔｈｏｄ＠、ｉｎ　Ｅｎｙｍｏｌ。

８．２０８（１９６６）に従って定量〕を一緒にし、そ
して凍結乾燥した。純粋な化合物（１）は薄層クロマト
グラフ４　（０，１ｍｍセルロースシート（メルク）、
９６％エタノール／ＩＭ酢酸アンモニウム（７，２：２
．８））においてＲ１〜０．２であシ、そして白色〜淡
黄色粉末は一１０℃にて少なくとも１年間貯蔵すること
ができた。収率は、Ｎ−アセチルニューラミン酸に対し
て８５チであった。

合物（１）の製造 ウシの下顎腺の凍結物から調製した薄片（０，５に！？
）を１１の０．１５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，８）中で２
時間、ゆっくシ振とうした。４５０００ＸＧにて遠心分
離した後、上清を、８０ｍＭのＴｒ　ｉ　ｎ／ＭＣ１緩
衝液（−７，２）であらかじめ平衡化したＤＥＡＥセフ
ァデックスＡ−５０に適用した。力２ムを尚じ緩衝液で
洗浄した後、酵素を同じ緩衝層中θ〜１．５Ｍ塩化ナト
リウムの直線グラジェントにより溶出した。ＤＩｌ；Ａ
Ｅ分画を、蛋白質当た９３〜５ｇの燐酸カルシウムゲル
を用いて処理した。０℃〜６℃において０．５時間振と
うした後（他のすべての操作もこの温度範囲において行
う）、懸濁液を９５００８Ｇにて遠／ら分離し、沈澱を
洗浄しくＴｒｉｇ緩衝液ｐｉ−１７，２で２回、０．０
１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７，６で２回）、そして最後に、ｄ
（７，８の０．１Ｍ燐酸緩衝液によシ洗浄することによ
り酵素をゲルから溶碧した。

こうして得た酵素を用いて、例１に記載したようにして
化合物（１）を製造した。こうして得られた（収率７８
チ）粗化合物（１）を、炭酸水素型ダウエックス１×５
クロマトグラフイーの後、０．１ｒｎＭ水酸化アンモニ
ウムを用いてセファデックスＧ−１０又はＧ−２５上で
ゲル濾過することにより最終的に精製した。カラムサイ
ズは、０．３ミ１ノモルの化合物（１＞の試料に対して
３Ｘ１２０ｃ１ｎとし、流速を１０〜１５ｄ／時とした
。化合物（１）を含有する分画（収率６０チ）を−緒°
にし、凍結乾燥し、そして−１０℃にて貯蔵した。純粋
な化合物（１）は〔α）、＝−１１，５°（ｃ＝０．２
１水）であシ、そしてＥ、Ｌ、　Ｋｅａｎ等、　Ｂｉｏ
　１．　Ｃｈｓｍ、　２４１．５６４３（１９６６）に
従う酸加水分解／チオバルビッル酸測定によシ、９８％
以上の純度を有することが見出された。

例１に記載した方法によシ純粋な酵素を調製した。酵素
抽出物（５ＷＬｌ、５〜６ユニツ）／Ｗｌｌを含有）を
１００ｍＭ炭酸水素塩（ｐｉ（８，２）によシ１：２で
稀釈し、そしてシアノゲングロミドによシ活性化（Ａ、
Ｐ、　Ｃｏｒｆｉｅｌｄ等、　Ｂｉｏｅｈｅｍ　、　Ｊ
、　１７’Ｌ１（１９７９）に従ってコしたセファロー
ス４Ｂのスラリーと、０℃において混合した。４℃にて
１２時間振とうした後、ゲルを濾過し、水、２に塩化ナ
トリウム、及び水で洗浄した。ゲルを、０．６−の（±
）β−チオ−α−メチル−プロピオン酸及び殺菌剤とし
ての２ｍＭの２−二トロイミダゾールを含有する８０ｍ
ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＬ中で、θ℃〜６℃において貯蔵し
た。こうして゛得られた固定化酵素（１００ユニツト）
を用いて化合物（１）の触媒的製造を行った。このため
に、１．５〜２．０１の全容量中６ミリモルのＮ−アセ
チルニューラミン酸、１．５ミリモル０ＣＴＰ、　０．
１ミリモルのＴｒｉｍ、８０ミリモルのＭｇ＋イオン、
及び０．１ミリモルの（±）−β−チオ−α−メチル−
ゾロピオン酸をｐＨ８，２〜８．４．３６℃にて４時間
インキエペートした。このインキュベーションはバイオ
ゲン（Ｂｉｏｇｅｎ）連続培養装置（アメリカン・ステ
リリザー）において行い、−（は２％水酸化ナトリウム
を自動点加することによシ調整し、他方、Ｎ−アセチル
ニューラミン酸を最初の２時間に少量ずつ加えた。反応
が完了した後、ゲルを炉去し、水で洗浄した。−緒にし
た洗浄液を炭酸水素型のダウエックス１×８カラムに適
用した。０〜１．５Ｍ）リエチルアミン／Ｎａ　ＨＣＯ
ｓ緩衝液（ｐＨ８，４）の直線グラジェントを用いて流
速Ｑ、６ｍ１１分の速度で化合物（１）を溶出した（８
８％）。溶離液として１−アンモニア水を用いる第２の
セファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフイーによ
シ、純粋な化合物（１）を不純物ＣＭＰから分離し、凍
結乾燥し、そして−１０℃にて貯蔵した。収率５８チで
あった。

〔α）、＝−１１，８°（ｃ＝０．２．水）。試料を室
温にて１０分間ｐＨ１に保持することによシ、ＣＭＰ及
びＮ−アセチルニューラミン酸（１，０：　１．０モル
）が生じ、これらはそれぞれ０．０５及び０．５のＲｆ
値（溶剤系及び条件は例１に記載したのと同じ）を有し
ていた。

（１）の製造 培養物を反復して選択することによシ、最高のＣＭＰ　
−７シルニエーラミネートシンサーゼ活性ヲ有するＥ、
コリ　菌株を得た。培養菌は、全量１６当、９１５．ｐ
の大寒、６ｇの酵母エキス、２ｇのグリシン、４ｇのグ
ルコース、０．２９のβ−チオプロピオン酸、４Ｆの燐
酸水素ナトリウム、２１の燐酸二水素−ナトリウム、及
び０．２９のトリメチルペンジルアンモニウムヒドロキ
シドラ含有スル培地に増殖せしめた。すべての成分をあ
らかじめ２０〜５０−の水に溶解し、そして別々に殺菌
した。２４０　ｒｐｍのロータリーセーカー〔ニーーラ
ミンスウィッチ（ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｈ）　〕上
で小試験を行った０〔選択実験のために、細胞を抽出し
、そして化合物（１）のバルク製造に関する次の項に記
載する方法によって測定することによシ培養物試料（１
００ｍＡりを試験した。〕 増殖細胞を１０〜１５倍の新鮮な培地に移植し、これを
反復することによシ大規模製造のための移植を行った。

最終発酵は、無菌空気を連続的に通気しながら、２０〜
４０容量において、３６℃にて４時間行った。発泡を防
止し又は抑制するために、この段階で種々の消泡剤を使
用し、そして５チ水酸化ナトリウムを連続的に添加する
ことによυ−を８．２〜８．３に保持した。培養が定常
期に達したとき、０℃にて９０００ＸＧで遠心分離し、
そして細胞ペースト（約１００〜１５０／ＩＯＡ’の発
酵容器）を凍結した。このペーストにア七トン（約１．
５〜２）７１００ｇのペースト）を０℃において加え、
そして生成した沈澱をフィルター上に集め、アセトンで
洗浄し、そして乾燥した。乾燥粉末をエタノール／水（
４，０：　１．０４−）混合物中にスラリー化し、３〜
４時間攪拌し、９００００ＸＧにて遠心分離し、そして
同じ溶剤混合物（２×）で洗浄した。−緒にした抽出液
及び洗浄液から、例１に記載した方法と同様にして純粋
な化合物（１）を得た。

化合物（１）の収率は、イオン交換樹脂に吸着された合
計ヌクレオチドの１５〜２０％であった。

Ｂ、療法的用途 この研究は、一定の体重を有する繁殖適齢のラット・チ
ャールスリパー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）　１６
対を用いて行った。懐妊の３日目にこれらの動物を無作
為に４群に分けた。最初の２群には１０％のカゼインを
含有する半合成飼料を与えた。食餌療法を懐妊及び飼育
の全期間にわたって継続した。

生抜１４日月と２１１日目間に、第２群及び第４群の子
動物を２０ダ／ｋｇのＣＭＰ−ＮＡＮＡの（シグマ・チ
ミカル社）腹腔内投与によシ装置し、第１群及び第３群
を同量の生理的塩溶液で処置した。

２１１日目、各群からの２匹ずつの雄性子動物を穴の空
いた板に固定し１．そして２０分間開放域実験のもとに
おいた。探索活動に関する期間を観察しそして定量した
。実験の終点において、動物を脱血によシ殺し、これら
の動物の脳を取シ出し、そしてガングリオサイド［Ｇ、
　Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ等。

Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｉ、　Ａｃｔａ　２９６
　、１６０〜１７０（１９７３）の方法によシ抽出〕、
及び糖蛋白（Ｂ、　Ｂｅｒｒ＆等。

Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ
　、　Ｇａｌｅｏｔｔｉ等編。

Ｅ１ｓｅｖｉｅｒ＋　８１〜８７頁、（１９８２）：Ｆ
、伽ｏｄｅｏ　５ａｌｅ等、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、　２７　＋　４５５〜４５８頁、（１９８１）
）の含量について試験した。

いずれの場合にもＮＡＮＡの含量を測定した。

第１表は、正常蛋白飼料によシ飼育したラットの群及び
低蛋白飼料によシ飼育したラットの群において、ＣＭＰ
−ＮＡＮＡによる処置により、続開的有意性をもって、
探索活動、並びに脳ガングリオサイド及び糖蛋白中のＮ
ＡＮＡ含量が上昇したことが示された。

以下４°５白 第　１　表 正常蛋白飼料又は低蛋白飼料により飼育され、ＣＭＰ　
−ＮＡＮＡによシ装置された又は処置されなかった生後
２１１日目ラットにおけるガングリオサイド及び糖蛋白
の脳内含量、並びに探索活動。Ｍ２群の平均値を１ｏｏ
ｓとして各群の平均値をチで示す。

探索活動　脳ガングリオサイド　脳糖蛋白第１群 （カゼイン２０％）４７　７５　７９ ＊　ＣＭＰ−ＮＡＮＡ処置及び非処置の差、スチューデ
ントのｔ分析によシ統計的に有意（ｐ＜ｏ、ｏ　１〜０
．００１）？４．Ｌ°　ウーＦ？、：１例２．カイニン
酸によシ生じた障害後のラットの体重１８０〜２００ｇ
の雄性ラット、チャールスリパーＣＤを２０動物ずつか
ら成る４群に分けた。

第１群は対照群とし、第２群は生理的塩溶液で処置し、
第３群はカイニン酸で処置し、そして第４群はＣＭＰ−
ＮＡＮＡ　（２０〜／に９７日、腹腔内）及びカイニン
酸で処置した。

ＣＭＰ−ＮＡＮＡによる処置はカイニン酸による処置の
１週間前から始め、そして動物を殺すまで続けた。

動物をベンドパルビタール（６０ｍＶｋｇｔ−ｐ　）で
麻酔し、そして次に線状体に注射することにょシカイニ
／酸（１μｌの生理的溶液中２μｇ）で処置した。

対照ラットは同容量（１μｌ）の生理的溶液で処置した
。

７日後、ラットを殺し、線状体を取シ出した。

５サンプルを一緒にして１回ずづの測定を行った・。

ガイグリオサイドを抽出し、そして前記の方法により測
定（ＮＡＮＡ含量として）した。

第２表に結果を示す。ＣＭＰ−ＮＡＮＡによる処置によ
り、カイニン酸によシ生ずる線状体中のガングリオサイ
ドレベルの低下が抑制されることを示している。

ＮＡＮＡ含量として測定されそして表示された、ラット
線状体中のガングリオサイドのレベル。値は、各５サン
プルの平均につき、対照を１００チとしてチで表示しで
ある。

第１群：対　照　１００ 第２群：生理的溶液を投与　９６ 第３群：カイニン酸を投与　６６ び分布 ＣＭＰ−ＮＡＮＡ［９−’Ｈ）をＮＥＮ　にューイング
ランドニエークレア、６０７２ド２イアイヒ、***）か
ら入手した。

約１８時間絶食せしめたラットを、燐酸緩衝液に溶解し
たＣＭＰ−ＮＡＮＡで、２０　ｍ９７ｋｆｌ　ｉ　、ｍ
の投与量（比活性１０００　ｍＣＳ／ｆｎ９　）で処置
した。３０分、１時間、２時間及び４時間後、動物を殺
し、そしてこの動物から肝臓、じん臓及び脳を摘出し、
そして正確に重量を測定した。

前記の器官からの１００μＩのサンプル及び同様（７）
　血液ｔングルをツルエン（Ｓｏｌｕｅｎｅ）　３５０
　（／４ッカード）に溶解し、そしてシンチレーティン
グ液を加えて、液体シンチレーション装置によシ計赦し
た。

測定を、キャナル−キャナル比法によシ定景化した。第
３表にすべての測定の平均結果を示す。

放射能は血中では急速に減少し、そして器官においては
さらに徐々に減少した。脳は肝臓及びじん臓以下の放射
性レベルを有する。

〔５Ｈ〕　−ラベルＣＭＰ−ＮＡＮＡ　（２０ｒｔｂｙ
Ａｙｓ　０ｍ、）で処置した後のラットの器官の放射性
レベル。４実験の平均値を投与した量のチとして、そし
て１−又は１ｇの組織について示す。

血液　１２．２　５．７　３．２　１．９肝臓　３．９
　４．７　２．８　０．９じん臓　２．６　５．２　３
．３　１．６脳　６．２　７．８　４．９　２．４ ニユーロ（Ｎｅｕｒｏ）　−２ａ細胞（ＡＴＣＣ＋　ｏ
　ツクビレ、米国）を標準的条件（１０４〜１０’細胞
／１０〇−皿）において接種した。１２〜２４時間後に
ＣＭＰ−ＮＡＮＡを加えた。濃度は第４表に示す。出芽
の定量のためのインキエペーシロン時間を２４時間とし
た。次に３チのグルタルアルデヒドを含有する緩衝塩溶
液により細胞の固定を行った。神経細胞の増殖の定量的
測定をザイスＤ−７０８２ミクレオービデオマートによ
シ行った。

神経細胞の分化のパラメーターとし７て神経出芽を用い
た。ホルマリンに固定したサンプルを、コントラストを
良くするために染色した。ＣＭＰ−ＮＡＮＡの添加量と
細胞からの神経の出芽の数との間に密接な関係が観察さ
れた（第４表）。

ニューロ−２８−細胞におけるＣＭＰ−ＮＡＮＡ　肪発
出芽の投与量応答関係 ０　１００±１５ ５　１１０±１５ １０　１１７±２０ ２０　１３２±２５ ３０　１４５±３０ ５０　１７８±３５ 第４表から、３０μ帥ｌの濃度のＣＭＰ−ＮＡＮＡが、
培養細胞において、神経の出芽をもとの定常値の５０％
近く上昇せしめ、５０　ｐ９／ｍｌのＣＭＰ−ＮＡＮＡ
は神経の出芽を２倍近くに上昇せしめることが明らかで
ある。

ニューロ−２ａニエーリンｔ’？ｉ？ａ胞１ｆｔ　（Ａ
ＴＣＣ−ＣＣＬ−１３１）を、非必須アミノ酸、抗生物
質（５〜２０ｍ９％）及び炭酸水素塩（５０〜１００苧
１を加えた、ウシ胎児血清（イルビンサイエンティフィ
ック、イルビン、カリフォルニア）を含有する培地中で
増殖せしめた。細胞を、コーニングプラスチック組織培
養フラスコ上で増殖せしめた。

測定用細胞を、コーニングプラスチックベトリ皿上ＣＭ
Ｐ−ＮＡＮＡを含有する又は含有しない培地中に入れた
。試験管内神経成熟に対するＣＭＰ−ＮＡＮＡの機能を
試験するために、プレート時又はプレートしてから２４
〜４８時間後に培地中にＣＭＰ−ＮＡＮＡを導入した。

細胞プロセスの平均数及び長さを、処理群当たシ最低１
００細胞につき反復して測定し、神経成熟の半定量的指
数を得た（第５表）。

第５表の成熟指数（Ｉ　、Ｍ）ｕ　Ｉ　、Ｍ＝　Ｌ、Ｐ
ＸＮ、Ｐとして示され、ここで、 Ｌ、Ｐ、１０　＝約１０μへのプロセスの長さＮ、Ｐ　
＝プロセスの合計数 種々の濃度のＣＭＰ−ＮＡＮＡの効果を高解像カンマル
スキー光学計で評価した。

神経芽細胞腫細胞の形態に対するＣＭＰ−ＮＡＮＡの影
響 標準培地（ＳＭ）　１０±　２ ８Ｍ　＋　１　μｇ／ｍｌ　２０±　５ＳＭ＋　５４／
ｍ１４５−ｔ：　５ ＳＭ＋１０ｐ９／ｍｌ　、　６　Ｂ±１０５Ｍ＋２０ｔ
ｔｇＡｎｌ　９２±１０ 第５表から、２４７ｍ１濃度ノＣＭＰ−ＮＡＮＡは１．
Ｍ（前に定義した）を２倍にし、２０μＩ／−のＣＭＰ
−ＮＡＮＡは、標準培地について測定した場合に比べて
１０倍高い１．Ｍ値を導く。

例６．静脈投与用注射剤 活性成分　０．５ｍｇ 非発熱性マンニトール　５ｏ　即 燐酸二ナトリウム・１２Ｈ，０５ダ ｇ８酸−カリウム　ｌ　ｍ９ 注射用非発熱水　２．０ｍｆ 且１屑製方法 活性成分、マンニトール及び無機塩を注射用無菌水に溶
解した。最終ｐＨを６．５〜６．７とした。この溶液に
無菌窒素を通し、モしてポアーサイズ０．４５μのメン
ブランフィルタ−を通して濾過し、そして２ｍｌのガラ
スアンプルに充填した。

適当な凍結乾燥機中で、−５８℃〜−６０’ＣＱ凍Ｒｉ
　ｉ＃１度を保持し、そして最後に３５℃まで加熱する
ことによシ凍結乾燥を行った。

次に、こうして得たアンプルを無菌窒素のもとてシール
した。生成物を、物理化学的性質、残留湿度、ＣＭＰ−
ＮＡＮＡ含輩、再溶解性、無菌性、発熱物質の不存在、
及び非−毒性にょシコントロールした。

町蔦 活性成分　１．０ｍ９ 非発熱性マンニトール　５０　ｍｙ 燐酸二ナトリウム・１２Ｈ２ｏｏ、５Ｉｎ９燐酸−カリ
ウム　１〜 注射用非発熱水　２．　Ｑ　〃Ｉ１ 例６と同様にして製剤化する。

特許出願人 チェッレチーコンノ？／’エア　ディ　リセルヵチミカ
　ソチェタ　ペル　アツィオニ 特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 第１頁の続き 優先権主張　０１９８３年４月２０日■イタリア（ＩＴ
）■８３３７１／Ａ／８３ ０発　明　者　二ニオ・デコルテ イタリア国つデイネ・アイエロ ・デル・フリウリ・ビア・ゾル ツテイ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 で表わされる５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−
   Ｄ−グリセロ−Ｄ−がラクトノヌロサミン酸のシチジン
   モノホスフェートを活性物質として含有することを特徴
   とする中枢神経系及び末梢神経系における神経刺激の障
   害に関する病理的状態の療法において使用するための医
   薬組成物。 ２、注射可能な形である特許請求の範囲第１項記載の医
   薬組成物。 ３、凍結乾燥された形で活性物質を含有する特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の医薬組成物。 ４、　リポゾームとしての形で又は特異的な親脂性担体
   に導入された形で投与される特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載の医薬組成物。 ５、次の組成、すなわち、 活性成分　０．０２５〜０．５　ｗ／ｖ　％非発熱性マ
   ンニトール　１，０〜５．Ｏｗ／ｖ　％燐酸二ナトリウ
   ム・１２ＩＩ２００．１〜０５ｗ／ｖチ燐酸−カリウム
   　０．０２〜１．Ｏｗ／ｖチ非発熱性注射用水　全体が
   ２−になる量を含んで成ることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の医薬組成物
   。 ６、次の反応式 に従って、ＣＭＰ　−）ランスフェラーゼ（ＣＭＰ−ア
   シルニウラミネートシンサーゼ）　（ＥＣ２，７，７，
   ４３）を触媒として用いて、シチジントリホスフェート
   とＮ−アセチルニューラミン酸を縮合せしめることによ
   り５−アセトアミノ−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセ
   ロ−Ｄ−ガラクトノヌロサミン酸の７チジンモノホスフ
   エートを製造する方法にオイテ。 （Ａ）　該縮合をチオカルボン酸安定剤及び／又はニト
   ロイミダゾニル安定剤の存在下で行い、あるいは（Ｂ）
   該縮合をエセリヒア・已輩（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）　ＣＲＣ１４８２株から分離された酵素ＣＭＰ
   　−）ランスフェラーゼ（ＣＭＰ−アシルニューラミネ
   ートシンサーゼ）　（ＥＣ２，７，７，４３）により行
   うことを特徴とする方法。 ７、　シチジントリホスフェートとＮ−アセチルニュー
   ラミン酸を３．０〜５．０’：１．００モル比で用い、
   無細胞型、固定化型又は細胞結合型の酵素ＥＣ２，７，
   ７，４３の存在下で、チオカルボン酸の存在下でｐＨ８
   ，５〜８．８において前記の縮合を行うことを特徴とす
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記チオカルボン酸としてβ−チオプロピオン酸又
   は（→−β−チオーα−メチルプロピオン酸を使用する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項又は第７項記載
   の方法。 ９、　シチジントリホスフェートとＮ−７セチルニユー
   ラミン酸との縮合を３０℃〜４０℃の温度において行う
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６エｎ〜第８項のい
   ずれか１項に記載の方法。 １０　シチジントリホスフェートとＮ−アセチルニュー
   ラミン酸との縮合を１〜４時間行うことを特徴とする特
   許請求の範囲第６項〜第９項のいずれか１項に記載の方
   法。 り、ヒツジもしくはウシの下顎腺からの無細胞酵素を使
   用することを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方
   法。 １２、前記反応生成物をイオン交換クロマトグラフィー
   により分離することを特徴とする特許請求の範囲第６項
   記載の方法。 １３、前記反応生成物を、例えば０．１５Ｍ以下のトリ
   エチルアミン／炭酸水素ナトリウムを含有するｐＨＢ、
   　２〜８．６の緩衝液を用いて溶ｕ１するイオン交換ク
   ロマトグラフィーにより、そして／又は溶出液としてア
   ンモニア水を使用してθ℃〜６℃においてセファデック
   ス（商標）カラム上でイオン交換クロマトグラフィーを
   行うことにより、分離することを特徴とする特許請求の
   範囲第１２項記載の方法。 １４、使用する酵素ＥＣ２，７，７，４３を、全容ｊ會
   １ｐ当ＩＩ）　０．５〜２．０ｍＭのチオカルボン酸、
   例えばβ−チオーゾ買ピオン酸又は（→−β−チオーα
   −メチループロピオン酸の存在下で、０℃〜４℃におい
   て、ホモジナイズしたｍ（Ｉ物紹織から分離することを
   特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法。 １５、前記分離された酵素ＥＣ２，７，７，４３を、Ｂ
   ｒＣＮ、β−チオ−カルボン酸及び／又はニトロ−□イ
   ミダゾール誘導体の存在下で、ＰＨ８，５〜９．０にお
   いて適当な担体に固定化して使用することを特徴とする
   特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、前記固体担体としてセファロースを使用すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の方法。