JPS6058078A - 一般化されたＤＮＡクロ−ニングビヒクルＳＵＮＹ １−ＪａｐａｎとしてのＲ−２１８，バクテリオフア−ジＴ４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＹ、ユ１む月１πユ 分Ｊ４物学Ｃ１大腸菌（Ｆｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）を宿↑としく使うことは周知ｅある。この微生物
は、り「コ　ン化された遺伝子を経てインシー１リンの
商業内生Ｊｑに使われた最初の扉核微生物だったようＣ
ある。有用なポリペプチド又は蛋白質を暗号化りる員核
消伝子の宿主としての大腸菌は欠点がないわ１プではな
い。早くから広く知られるよう（なった一つの欠点は、
大腸菌による内向系の産休である。蛋白質生成物の調製
におい（内向系があるのは望ましくない。この問題解決
の！こめ広範囲の研究が行われた。宿主としての大腸菌
使用のもう一つの欠点は、この微生物がつくる１Ｄテア
　ピが、この微生物によっ（つくられる感受↑１蛋白質
生成物を破壊することである。このように蛋白質生成物
が破壊されるため、あるクローン化された與核眉伝了の
表現水準が低いという誤った結論を引出づことがある。

慨して、プロテア　ゼは微ｑ−物によつ（つくられる不
完全な、又は異常な蛋白質に作用づる。しかし、大腸菌
プロｊアーゼが有用な外来蛋白質、例えば人間のヘ−タ
・ゾレインターフェロンやジン１〜スタチンにも悪影響
を及ばづ。

従来の技術と９発明が解？しようとりるｔ冒°Ｑぐ、１
−Ｌル’　７’　−／　−”サイ［ン（Ｌ、Ｄ　Ｓｉｍ
ｏｎ）らによる発表のＵ大腸菌［クローン化されたハク
）−リＡノ？−ジ１４遺伝子による蛋白質の安定化Ｊ　
Ｐｒｏｃ不完全山白凹例えばピ」−一ロマイシンポリペ
ブチト、（２）パ常だが完全な蛋白質、例えばλｔＳＯ
蛋白質、及び（３）大腸菌内にクローン化された遺伝子
によ・）−（暗号化される不安定な真核蛋白質、例えば
成人の線紺芽細胞インターフェロン、を安定化さけるた
めの、クローン化されたＴ４　ｐｉｎＪ仏子の１史用を
明らかにしくいる。この公表文献に記述され（いるｂ払
は、大腸菌宿主に形質転換させた明白に１．ＩＪの２シ
ラスミドを使っている。−〕）の１シメミトは１４　ｐ
ｉｎＪ仏子を゛含有し、他力は望んＣいる蛋白質生成物
を暗号化する真核遺伝子を含有りる。この方法は指示さ
れた蛋白質を安定化１”ると菖われるが、大腸菌宿主中
に２種の貸なるプラスミドを使用ザるため、望ましい商
業内方）人ではない。絹換え手段による有用蛋白質の商
業生産にＩ３いＣ１このようなシラスミドの和合性は望
ん（゛い・るはと家憲ｅは寿いかもしれない。和合性″
がる。本発明す法は、二重キメラ型プラスミドを１史用
し、ここからの外来ＤＮＡ配列を１偶数系バクｉすＡ）
／−ジに組換え、次いｅこれを大腸菌宿主への感染に用
いることによって、プラスミドの不和合問題を回避しＣ
いる。本発明の安定化の面は土８記文献の方法の場合の
ようにＴＡ　ｐｉｎＪ伝ｆのクローニングに基づくもの
Ｃはない。　゛本発明の分野に関係する他の発表文献が
幾つかある。これら文献の完べきな引用は実施例のあと
の「参と文献」欄に見い出ける。

（１）レベル（Ｒｅｖｅｌ）及びショーシコポウラス（
ＧｅＯ（１０ｐＯＵＩＯＵｓ）、１９６９年。ＨＨＣ（
５−ヒト０キシメチルシトシン）によるフン７一シＤＮ
Ａ合成をｒｌ能とづ−るようなフ１−ジ及び細菌突然９
ｖ！株の開示 （２）スナイダ−（３ｎｙｄｅｒ）ら、　１９７６年。

ＩＩＨｃの代わりにシ１〜シンを１史う以外は（１）と
１司し。

（３）カブラン（Ｋａｐｌａｎ）及びニアリッｆ　（Ｎ
ｉｅｒｌｉｃｌ＋）１９１５年。ＩＩＨｃを含有りる１
４　［ＩＮＡにｂ：ｏＲＩ　ｈ’ｉ効率（４）シ１１ゾ
（Ｓｔｕ＋ｂ）及び４【２スナ（Ｃａｓｎａ）　、　１
９訓年ＤＮＡ断Ｊ、１をハクｊすＡノ１７　ジ１４へ抑
入りる方Ｖ、の抄録。

（５）　４　ｔ・ツノ及びシセ１．１９８２年。本明細
書に明らかにされたクローン化手順の発表。この発表文
献は参照により水明ｍｓに取入れられ（いる。

問題を解決でるための手段 クローン化された遺伝子を軽【大腸菌によつ（表現され
た有用な外来蛋白質が、大腸菌細胞内Ｃつくられるプロ
ｉアーゼに感受性がある場合に。

このΦ白ｖ１を長足化させるためのプ’３’ｔｌが明ら
かにされ、ＨＪ　６’＋　請求され（いる。特定的には
、水明細嵩Ｃ明らかにされるように、木方払は次の段階
からなる。

（１）ハクＩすＡノ１７　シＹ４のｒｌ１３１ｉ伝子の
部分と４１’ｆｑ＝された大腸＠１ラスミドのゲノムの
一部とからなる↓メジ型シラスミドを構築りる。

（２）キメラ型ノシスミドの１４配列へ外来ＤＮＡを住
体外で挿入しく一′Ｘ小キメラ型プラスミドを得る（３
）バク’ｙ　’、Ｊ　Ａノ１７　ジ■４とてφキメラ型
ダラスミドどの間で生体内組換えを行なう。

（４）二重↓メジ型シラスミドを宿したｌ／ＩＦ人腸菌
大腸染さＵる。

正味の効果は、大腸菌細胞から高水型の外来蛋白質を生
ずることである。

木明細店で用いられる省略体は次のとおりごある。１）
Ｏ＝塩基文り、ＣＡＰ−ツノタボライトＪ（玉子アクチ
ヘーター蛋白質、ＤＴｌ−ジチオスレイト　ル、［［８
ｒ−エチジウムブロンイト、ｇｌｃｌｌＨｃ−グル〕シ
ルー５−ヒドロキシメチルシトシン、ＩＩＨＣ−５−ヒ
ドロキシメチルシトシン、＋＋）４１Ｊ＝５−ヒドロ↓
ジメチルウラシル、ｋｂ−キ［ノヘース灼、Ｘｇａｌ＝
３−ＩＯし〜４−クロロー５−インドリル−β−カラク
トシ１〜。

１１はプラスミド担体状態を表わす。

木明細嵩で引用された発表文献は、実施例のあとの「参
考文献」欄に出（いる。

ハクテリオフ１−ジ１偶数系ＤＮＡと大腸菌プラスミド
のゲノムの一部とからなるキメラ型〕）スミドの構築は
、Ｃ７１［ＩＮＡとｓ’＊′ｖＰされた大腸菌ゾ２スミ
トのゲノムを用いて、本明細書で例示されＣいる。人）
麟菌内Ｕ−ＤＮＡを安定に増殖Ｃさるかぎり、りなわら
イれが大腸菌に対して致死的でないかぎり、他のハク戸
ノオフ？−ジＩ偶数系ＤＮＡを使用Ｃ゛きる。このＬ偶
数系ＤＮＡは１遺伝子の全体か、又はイの−、一部であ
る。

また、あとで述へる実施例はＩ４のｒｌｌ遺伝子への外
来ＤＮＡの挿入を明らかにしているが、このようなりＮ
Ａを任意の１偶数系バクテリＡノア／−ジのイの遺伝子
へ、又は１遺伝子の部分へクローン化Ｃきることが認識
されねばならない。史に、Ｉ４にはｒｌｌ遺伝子以外に
多くの遺伝子があり、本明細よＣ明らかにされた手順又
はこの技（４：ｊに周知の伯の手順によつＣ１外米ＤＮ
Ａをそれらの中へクローン化することがｅきる。

木りぺはクローン化媒体としてバタテリオファーシ１４
を用い（例示され（いる。他の１偶数系バ■４に対しＣ
明らかにされたものと実質的に同じ方法て”　ＤＨ，Ａ
クローン化媒体としＣ投合つかぎり１大腸菌宿）の感染
に使用できることを理解リベきＣある。

大腸菌がアンバー抑圧突然変異を含りする限り任意の大
腸菌を宿主微生物として使用Ｃきる。このような微生物
は周知であり、一般に入手できる。［−ル人学大腸菌培
養阜保ａ施設は、要求に応じＣ二次培養基を一般に提供
している。トの開示に使用されＣいる大腸菌１０７８株
並びに大腸菌Ｃ６００株は、１−ル人学培養基保存／Ｉ
ｌ！！設から無制限に人手−Ｃきる。

材料及び方法 （ａ）大腸菌菌株、ノ？−ジ系統及びノシスミドゾラス
ミトＤＮＡの形質転換と増殖用の受容菌としく大腸菌１
０７８（Ｃ６００ｒ−ＩＩ＋５ｕｐＥ４４　ｔｈｒ″″
１ｅｕ−Ｌｈｉ−）株を使用した。ＩＩＨｃ　ＤＮＡ　
（レベル及びジー１　シ］（Ｓｕ’、ｒｌｌｌｌ中文然
変異による遺伝子３０ム救出に晶′１容Ｃさる）を使用
した。遺伝子３０の救出実験には、１４系統Ｃ１０４Ｂ
（遺伝子３０−）を使用した。

５７ノスミトｐＯＰ２０３−１は、ＥｃｏＲ１部位に挿
入された大腸菌ツクドース域の２０３−ｂｐ　ｔｌａｅ
ｌｕ　ａ片（Ｏｖ５プロ［夕　突然変異を含有）を含有
ザるｐＨＢ９誘導１本ひある（ハックマンら、１９７６
年）。プラスミドｐＢＲ３２２（１１２３ｒ十）は１）
ＢＲ３２２のｌｌ１ｎｄｌ［部位に挿入された１４のｒ
ｌｌ遺伝子のシストロン間領域の８７３−ｂＤｉｉｆｉ
ｊｌｌを含有り−る（ブリブナウＰｒｉｂｎｏｗら、１
９８１年）（ｂ）酵素及びその他試薬 制限１−ントメクレアーゼＥｃｏＲＩ、　Ａｌｕｌ、　
Ｂｇｌｌ。

Ｉｆ　ｌ’＋ａ　ｌ　、　Ｂａ１ｍ旧（二１−イングラ
ンドφバイＡラゾ）。

１１ｉｎＮ（へｊメダ研究所）１及びｔｌｉｎｄｌｌと
１ａｑｌ　（べ一リン力　・７ンハイム）を売り主から
供給された１」様に従）Ｃ１山用したが、但し党争な反
応を達成りるために、Ｃ４ＤＮＡμ０当り４単位の１−
ａｑｌを３峙間使用した。）ｃｏＲＩ＊反応は２５■Ｈ
１ｒｉｓ、１Ｉｃｌ　（ｐＨ８５）、２　ｎ＋ＨＨｇＣ
ｌユ〈ポリスキーＰｏ１ｉｓｋｙら、１９７５年）の最
終濃度ぐ実施した。Ｓ１ヌクレアーゼ（へ−リンガ−φ
マンハイム）反応は、０．２　ｍＨ７ｎＳＯ４５０ＩＮ
酢酸−ｊ　ｌ−リウム（ｐＨ４５）、１００１１１８　
ＮａＣｌ　（１）０２１中で、ＦＣＯＲＩ　’ｒ切断さ
れたｐＯＰ２０３−Ｉ　ＤＮＡ　８μ０及び酵素８０単
位により、３７℃′ｃ３０分ｔｊなつｌこ。１４　ＤＮ
Ａリガーゼ（ＢＲＬ）は、５０　ｍＨトリスＩＩＣＩ（
ｐＨ７５）、１００　ｎ＋ＨＨｇＣｌ□、２０　ｍＭ　
ＤＩ−１及び１　ｎｉＨＡｌ’Ｐの最１’ｌ濃度で、Ｄ
ＮＡ　ｌμｇ当り１単位を４℃（・・模及応さゼた。Ｘ
ｇａ　ｌを２％までジメチルホルム１ミドに溶解し、寒
天プレート当り５０μｍを使用した。ＤＮＡポリメラ〜
ゼＩ（ベーリンカ−・ンンハイム）のフレＪつ断片をＤ
ＮＡ、ｃ／！ＩＩ当り１１４１７（’使用し、６．６ｍ
Ｈｔ−リスＩＩＣＩ（ｐＨ７，５）　、　６．６　ｍＨ
ＮａＣ１，６，６ｎ＋ＨＨｇＣｌ２．．６．６　＋＋＋
ＨＯＴＩ及び各ｄＮＴＰ　（１，１ｍＨの最終濃度で良
い３ｆｉい未Ｄ−みた１した。

（ｃｌゲル電気泳動 分析ノノカ目−スゲル（１％）は、１５０ｖ（／′）定
電Ｊ１で平均１６時間、最終濃度４０ｍ＋）ｌ）−リ）
、１１Ｃ１（ｐＨ７９）２０　ｍ）ｌ酢酸プトリウム、
１　ｍＨＥＤｒＡの緩鮨液中Ｃ・ｔ）な〕た。ゲルを１
μＱ／ｍｌ　ＥｔＢｒ＝　（’　１５分染色し、長波Ｕ
Ｖ光の透視によっＣ写貞撮影した、（ｄ）　ＤＮＡ調製
と形質転換 Ｃ３ＣＩ段階勾配によって濃縮精製された大腸菌ＨＲ１
４１Ａの感染体のｆ孫を２０のＡ、１Ｇ、まｅ希釈づる
ことによっ（、ＩＩＮｃ　１４　ＯＮＡを調製しＩこ。

０．１Ｈトリス１１ＣＩ（ｌＩｉ’、９）　ｉ’飽和し
た周ＩＪ　（１）　／　Ｔ、　／−ル’（：”　７　／
’　−シを２回抽出し、水相を１０　ｎ＋ＨトリスＩＩ
ＣＩ（ｐＨ７，９）０、Ｉ　ＨＮａＣ１，０，１ｓＨＥ
ＤＴＡに４℃で一１１′、ｆｉ析した。

１ノスミト及び）１１３　ＲＦ　１）ＮＡをカツッ（Ｋ
ａｔｚ）ら（１９７３年）のトリトン−Ｘ透明溶菌液手
順にょっで調製し、Ｃ５ＣＩ−ＥｔＢｒ浮力密度勾配で
分【プた。生部のノ゛レッゾを１５１様につくったが、
ＣｓＣｌ勾配を省略し・、ぞの代わりに１００　、ｃｚ
ｇ／ｍｌのゾ［］］ｊイＪ−ｔ；；Ｋ中で３７℃、３０
分培養し、続い（同量の）−１ノールＣ２回抽出し、ｆ
−タノール沈澱さけた。形質転換をＪ　−、Ｉン（Ｃｏ
ｈｅｎＪら（１９７２年）の既述のとおりに？うな・）
だ。［記のように、本方法は大腸菌細胞中（・外来蛋白
質を長足化さゼるのに有用Ｃ・ある。

大腸菌細胞内Ｃグロｊアーぜに感受性のある蛋白質は数
多く、Ｊ、く知られ（いる。例とじＣはソンンがある。

有用な外来蛋白質生産に対りる配列を１１８号化したそ
の他の遺伝子を、水明＄１１１Ｗｒ明らかにされた技術
に明白妥当な調整を加えた１ｃ用いいることにより、１
４へ挿入できる。このような調整は当業者に周知Ｃある
。明らかなように、このような挿入された遺伝子は、Ｔ
４感染細胞中Ｃ′積極的に認識される必須調節信号（プ
ロ［−り−及びリホンーム開始部泣）、丈６わち１４自
イ４がら誘導される信号を含んでいる。大きなりＮＡ挿
入物を１４へ移したい場合は、■４の適当な欠失突然変
箕系統が使われよう。１４のこのような欠失突然変周系
ｌＪｃは周知Ｃ゛あり、当業者に容易に人手〇きる。こ
のため、種々の大きさのＤＮＡ　Ｊ包子挿入物を収容り
るような相補的な欠失をもつ適当な１４系統／Ｊ＜　４
５１られれば、当業者は本開示により、有用な外来蛋白
質を暗号化した種々の遺伝子を１偶数系ハクｊすＡ−ノ
１−ジヘクローン化できる。最終の結果（Ｊ、宿主大腸
菌細胞による劣化のない有用外来蛋白質が表現されるこ
とＣある。木り法は、周知の手順Ｃ・ある。′）＜られ
た蛋白質が安定化されると、低水準の蛋白質を検出でき
るので、安定化によつにのようなｈ法の効力が高まる。

次の培養基は、合衆国イリノイ州ビオリア、合衆国ｇ３
務省、北部研究所（ＮＲＲｌ、、）の永久保存施設に預
託されＩこらのＣある。

大腸菌ＲＲ１［ｐＢＲ３２２（Ｈ２３ｒ”）］、　ＮＲ
Ｒｌ、　Ｂ１５４７５゜１９８３年　７月　７日預託。

大腸菌１０７８（ｐＮＣ７）、ＮＲＲｌ、　ａ−１５４
７ｙ。１９８３年７月７日に預託。

大腸菌１０７８（ｐＮｃ７１ａｃ２）、ＮＲＲＬ　Ｂ１
５４７８゜１９８３年７月　１日に預託。

大腸菌１０７８、ＮＲＲｌ、　Ｂ−１５４７６、１９８
３年７月７日に預託。

シラスミドｐＢＲ３２２は入手Ｃきる周知のプラスミド
Ｃある。これは大腸菌宿主ＡＴＣＣ３７０１７中に保持
されζいる。精製されたｐＢＲ３２２ＤＮＡ、　ｐＮＣ
７ＤＮＡ、及びｐＮｃ７１ａｃ２　ＤＮＡは周知の手順
、例えば透明溶菌液−等密爪勾配手順を使用して、大腸
菌宿主から得られる。

上の培養基預託物は、水明細書に既述された発明に関連
して呼出し番号が付されており、これを間示しＣいる特
許の授与と共に一般に入手Ｃきる。これらの預託物を入
手できるからと言っＵ、Ｉ！２Ｈ：］措置により本発明
に対しＣ授りされた特Ｘ′ｒ権を侵害しＣま（・本発明
を実施しＣよいといつ檜【すを与えるものではない。

以下は、本発明を実施りるための最適な態様をａめた手
順と、それによっＣつくられる住成物を例示した実施例
である。これらの実施例を限定的１、二考え（はならな
い。他に注意がな【Ｊれば、自分率はリペ（車量、冶Ｉ
Ｊ１．混合物の割合いは容即にＪ、る。

実施例１．プラスミドｐＮＣ７の構築と特性化ｐＢＲ３
２２（ｔ（２３ｒ＋）は、ｐＢＲ３２２の単一の１ｌｉ
ｎｄ１１部位に挿入ｃ（れりｒ４（ＨＩ１８７０）　（
７）ｒ１１遺伝了（７）８７３−ｂｐ７／ミノ末端０８
舅化域に及んＣいる。ｐＢｌ？３２２（リ１〜クリ−／
　５ｕｔｃｌｉｒｆｅ　１９７８年）と１１１１８７０
　（ゾリゾｌつＰｒｉｂｎｏｗら１９８１年）の配列が
知られており、ｆｆ／ｉハの制限酵素部イ☆及び大きさ
をキメラ型プラスミドのために予測できる。ｐＢＲ３２
２内のＨＨ８７０の方向は、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｃｌＪによる二重消化で容易に決定
できた。１１２３　ｒ十の最小のｔｌｉｎｅｌｌ断片は
、ＥｃｏＲ１部位をもつことがわかり、方向がプラスミ
ド内で”ｒｌｌＡから８へと反峙訓回りＣ為ることを示
しくいる。＋１１１８７０内ｒＩ４へクローン化しよう
とりるＤＮＡ　９片の挿入に都合のよい部位は、ｒｌｌ
Ｂ遺伝子ノ１ＩＯ−ｂｐニ位置ｔｌル１１ｉｎｃｌｌＣ
゛あり、ＨＨ８７０Ｔ−は唯一のＨｉｎｃ１１部位ｅあ
る。

ｐＢＲ３２２には追加の２１ｌｉｎｅｌｌ部位があり、
一つはアンピシリン耐性遺伝子内（３９０７９０７位置
の一つは６５２位置にある。ＨＨ８７０内に位置する１
ｌｉｎｅｌｌへの当該断片の挿入を容易にＶるため、５
ａｌｔによつＣ１められる６５２位置にある部イ☆を排
除しＩこ。

５ａｌｔで開裂後、５°１木鎖伸艮部に４個のデＡキシ
メクレＡチト三燐酸とＤＮＡポリメラーゼ１のクレノノ
ウ断ハをつり、ケｆる末端を蓮結し直り。こミドを単鎖
した。そのうらの一つｐＮＣ７を選び、残りの実験に使
用した。

プラスミドｐＮＣ７は長さが約３．６７　ｋｂ　’ｒあ
り、ノノンピシリン耐性を与える。ｐＮＣ７欠失の大き
さと終点を推定するために、ｐＮＣ７、ｐＢＲ３２２及
び親ブラメミトＨ２３ｒについＣ広範囲の制限分析を行
なった。

予想のように、ｐＢＲ３２２の６，５０位置（７）Ｓａ
ｌ’１部位と、６５２位置の１ｌｉｎｅｌｌ部位が失わ
れＣいた。長時ら１回りｈ向ｃ、　ｐＢＲ３２２の６３
１位置にある＋＋　ｉｎ　ｔ　ｒ部イ☆を含め全ての制
限部位は無傷のままぐあった。ｌ）割目り方向で、２１
８０１８０位置ａ１部位は明白に失われＩごが、２２１
０の部位は無傷であった。このように、欠失の時３１回
り終点は、２１９４±１３　ｂｐのイ装置にある。欠失
によっ−Ｃ生ずるＡｌｕｌとＩＩ　ｉ　ｎ　ｒ　Ｉの新
制限断片の大きさについＣの分析は、約＋５４６　ｂｐ
の欠失と一致しくいる。これは、欠失が５ａｌｔからｐ
　Ｂ　Ｉ？　、”ｓ　２２のほぼ２１９６１９６位置の
時計回り方向へ伸びＣいることを示唆し“（いる。

実施例２．プラスミドｐＮＣ７へのｌａｃ断ｇの挿入ク
ロ　ン化りるＤＮＡとしく選んだ。これは、そのメクレ
Ａｆ−ト配列が知られ（おり（メイゼルスＨａｉｚｅｌ
ｓ　、　１９７３年；ディグ’）ンＤｉｃｋｓｏｎら、
１９１５年：　／　ｔｙ　、ｊボ１りＦａｒａｂａｕｇ
ｈ、１９７８４．）　、人手しヤリく、選定に利点をし
っためである。２０３−ｂｐの断片は１ａｃｌＪｌ云ｆ
の末端から１７］トンを開始し、Ａベレ　ター、／ゾロ
Ｅ−ター域を通ツー（ＩａｃＺｌｉ伝子の第８−］トン
へ伸びζいる。これをＦｃｏＲＩ消化によ−）（／シメ
ミ１〜ｐＯＰ２０３−１から除いｊこ。４−ｂｐの５′
１木鎖伸艮部を除くために、この断片混合物を３１メク
レア−ぜＣ処理し、）Ｊ−ノール抽出し、はとんど線状
の分子を得るために１ｌｉｎｅｌｌで部分的に開裂され
ＣいたｐＮＣ７ブラスミドに鈍い切れ端を連結した。次
に連結混合物を使用し４１大腸菌１０７８を形質転換さ
せ、ノ７ンピシリン含有ゾレート上で形質転換体を選択
し、これによってｐＢＲ３２２ＤＮＡに残っ（いる１ｌ
ｉｎｅｌｌ部位へ挿入された断片を含有りるプラスミド
から選り分（〕た。ｌａｃ調節１ｆｉハをらつプラスミ
ドの含まれＩこ集落を確認しやＶいように、ル−トにＸ
ｇａｌも含めた。このプラスミドは高い］ビー数で存在
するのひ、プラスミド上に１ａｃＡペレーターがあれば
、染色イ木オベレ　タ　からのｌａｃリプレッサー全部
を滴定することができる。

その結果構成的につくられるβ−カラク１〜シトが色原
（Ａ基質を開裂し、明るい青色の集落をｆシト上に生じ
さゼる。

見込みのある集落を７ンビシリン−Ｘｇａ　Ｉ　ゾレト
から選び、いくつかの制限酵素反応をｔ）なうのレニ１
分な句のシーラスミドＤＮＡを甲ＮＩ　Ｌ　／こ。ノ゛
ノスミｌ；’ｐＮｃ７１ａｃ２はｒｃｏＲＩ　、　１Ｉ
ｉｎｄ［ｌ及びＢＱＩＩての制限分析によ７）Ｃ，ｐＮ
Ｃ７より約２００　ｂｐ大さいことがわか一〕だ。Ａｌ
ｕｌでの消化は、ｌａｃ断ｇｒ：あるこの挿入物と一致
していた。というのは、内部１ａｃ　Ａｌｕｌ断ハが存
Ｈしたからひあり、また隣接りるＩａｃ末端をもつｐＮ
ｃ７ｉ片は適当な大きさ−Ｃあった。ＩａｃＤＮＡの両
端近くを開裂りる旧ｎｕもＰ想された大きさの断片を生
じた。２０３−ｂｐ　ｌａｃ断）１内に非月称的に所り
りる１ｌｈａｌ制限酵素により、ゾシスミ１へのｒｌｌ
域内のＩａｃ断ハの方向を決定Ｃきた。Ａベレータ−／
プロモーター域がｒｌ１８運伝ｆのｈへ転写を進めるよ
うにこのｆｌｉｌｉ片が方向づけられているか、又は１
″ンスミト内のＩａｃｌから１ａｃＺへの反時計回りに
あることがわかった。

実施例３．１４へのｌａｃ断片の転移 ントソン（ＨａｔＬＳＯｎ）ら（１９７７年）は、■４
配列を含りする大腸菌プラスミドと１４ゲノムとの間の
絹換えが”１：体内ひ起ることを報告した。ｐＮｃ７１
ａｃ２のｒｌｌｌｊｌＩ！列十〇の組換えで・、プラス
ミドから“ノ？−シゲノムへのｌａｃ配列の転移が可能
となる。ｌａｃ断ハは全読取り枠中の翻訳終了コドンを
含んぐいる（−ｊ゛イクソンＤｉｃｋｓｏｎ、１９１５
年；）１ラボウ［ａｒａｂａｕｇｈ　、１９７８年）　
。Ｈｉｎｃｌｌ制限部位はｒｌｌＢＪ仏子の暗号化域内
にあるから、Ｉａｃ挿入によつで絹換えノアＦ−シはｒ
ｌｌＢ−になる。通常致死的表現型である１４の遺伝子
３０（ＤＮＡリガーぜ）の突然変異が、大腸菌のある菌
株ではｒｌｌ中の相補的な突然変異により抑圧できるこ
とが、既に示され（いる（ハ　カー　Ｂｅｒｉｌｅｒ及
びロジンス４−　にｏｚ　ｉ　ｎｓｋ　１１９６９年；
−１−ビス量アＰ　Ｆｂｉｓｕｚａｋｉ及びキレンペル
の機作は解明されＣいないが、Ｉａｃ挿入物を得た［４
）１−ジを選択する容易な手段がこれによつ（Ｈｕれｇ
。プラスミド（１０７８［ｐＮＣ７１ａｃ２］）を含有
するアンバー・勺ブレツ勺−大腸菌菌株をｒ１１＋３０
．。

の１４系統であるＣ１０４Ｂで感染させることによ−）
（転移と選択を一段階で行なった。感染のｆ係を大腸菌
ＢＢ株によって選択した。この菌株は、アンバー突然変
異を抑圧しないが、ｒｌｌ内の突然変異によ−）Ｃ項伝
子３０の突然変異を抑圧できる（カラム及びバーカーＢ
ａｒｋｅｒ　、１９７１年）。遍伝ｐ３０突然変安の救
出頻度（感染後の全ソＩ−ジのうら、非７ンハー抑圧菌
株で生育Ｃきたワラクシ−１ン）は１×１０　ないし４
Ｘ１０（第１表）の範囲にあり、これはプラスミド含有
野生型ｒｌｌ　ＤＮＡをら′〕糸系統感染中につくられ
る子孫の頻度に比へ、１０イ８から１８イ８おおきい。

第１表 シラスミド含有大腸菌菌株へのＣ１０４Ｂ　ｆし　ノイ
ングの効率 爪Ａれた一ｊうｌミドを運ぶ大腸菌１０７８株に１０の
乗数ＣＣ１０４Ｂを感染さ−けた。５分後、培養基を１
１７１］）！（スタインハ　グＳｔｅｉｎｂｅｒｇ及び
−１ド万一　Ｆｄｇａｒ、１９６２年）Ｃ希釈し、３０
分培養した。培養基を２時間後に溶菌させ、感染の子孫
をプレートに撒いた。プレー−ｊインクの効率は、全子
孫のうち、非アンバー抑圧菌株の大腸菌８８株にブレー
トＣきるものの富り、舎（大腸菌Ｂ、ｓｕｌ　上のブラ
ーり）Ｃある。

す １　２．４　３．５ｘ１０ ２　４．９　９．０ｘｌＯ−３ ３７，０１，ｌＸ１０−” ４　４．０　１１．０Ｘ１０ １ａｃ挿入物を含むファージは極めて家憲である。［１
された１個のゾン−りからの）／７　シストツクの調製
中に、ＣＩ？６３　（λ）上Ｃ−生育する能力によっＣ
確認される復帰突然変異体は約１×１０　の頻瓜Ｃ件し
た。これらの復帰突然変異体の四つによってつくられる
蛋白質をゲル電気泳動で分析すると野生型から区別でき
ない分子優のｒｌｌＢ蛋白質を示した。従っ（、復帰突
然変異体はｌａｃ挿入物のはげ正確な枠内欠失によつ（
什り”る。

実施例４．＋ａｃ断片は１４ゲノムの・部Ｃある。

ｒＩＩＢＨｉ　ｎＣＩ　１部位にお（ブる突然変異地図
作成か実際は２０３−ｂｌ）のＩａｃ　ＤＮＡ挿入のた
めであるという証拠は、制限分析によって提供された。

自生型の■４［）ＨＡ　１ｌＣＨ１４ＣＴ−完全１．装
置ＷＡ　１　ル。ＩＩ）ＩＣ［）ＮＡ　ｔ、ＬｔｌＤＰ
−グルコースビロホスホリラ−ぜと、１１）４ＣＤＮＡ
を破１Ｍ−１−る宿主ヌクレア−ピとを欠く大腸菌菌株
を感染さ已ることによつＣ得られる（レベル及びジョー
ショポウラス、１９６９年）。無修飾シ１〜シン含右１
４　ＤＮＡも得られるが、これには追加ノド　シ眉仏子
の突然変異が必要である（スノーイダ−ら、　’１９７
６年）。ＦｃｏＲＶ及びｒａｑ　ｌという２制限丁ント
ヌクレアーゼが、自生型１４　ＤＮＡへ働きかりること
がわかった。更に追加２Ｍ素すなわら［ｃＯＲＩ（ツノ
シラン及びニアリッヂ、１９７５年）及びＸｂａｌが、
ＩＩＨｃ　１４　ＤＮＡへ作用しうる。ＥｃｏＲｌによ
っＵＨＨＣＴ４　ＤＮＡの完全な消化を得るには、多量
の酵素と長時間の消化が必ＩＣ−ある。修飾された塩基
をも含有するバクテリＡノ？−シ５ＰＤＩ　ＤＮＡ　（
チミンがＨＨυで完全に置き代えられＣいる）に関する
ωｌ究は、ｔｅｏＲＩ条件トに１１；ツる同し消化パタ
ーンが、Ｅｃｏｌネ条件下にもっと少ない酵素で、より
短い時開に生ヂることを示しでいる（フレラグＣｒｅｇ
ｇ及びスチコワートＳｔｅｗａｒｔ　、　１９７８年）
　、　ＥＣ０ＲＩ＊条件下の８８０１４　ＤＮＡの消化
は、特異性を失わずにこの反応速度の同じにうな増加を
示した。

＋１）ｆｃ　１４　ＤＮＡを野生型及びｌａｃ挿入挿入
ノンがら一部、）　（−）だ。これらのＤＮＡをＥｃｏ
、　ＲＩ＊条件−トに消化さけると、野生型ＤＮＡの約
５．７１　ｋｂのバンドがｌａｃ倉右含有では５．６　
ｋｂへ転移しでいることを示している。ｒｌｌ　遺伝子
を含有スるＥｃｏＲＬ＊バンドが、ｋｂ狛の変化を覆い
隠すような他のバンドから比較的自由なｆ９置に移動り
るのは偶然である。ｒｌｌＪ仏ｆを含有するＥｃｏｔｔ
ｌ断片の大きさに対する最もよい４狂定稙は、かつ（約
４．４　ｋｂであった（セルザ＝−飾ＤＮＡを１阿るた
めに、ｒｌｌ遺イム了の隣接域に欠失を導入した。従っ
て、野生聖断ハの人ささは使用欠失の推定規模に基づく
ものＣあっ〕ご。

野生型及びＩａｃ挿入ノ１−シからの１）４ＣＤＮＡを
制限エンドメクレアーゼＴａｑ　Ｉでも消化させた。こ
の場合も、ｌａｃ含有ＤＮＡでハント規模の変化が明白
であった。野生型消化物からの月利は１５２０ｈｐでの
ハントの一部として移動するが、１４　ｒｌｌＢｌａｃ
２からの消化物中ひは１７３０　ｈｐのハン１〜の・部
としζ移動しζ−いる。これらの人きさｅｅｌ　Ｈりる
際のＨ）−基準がＩＩＨｃよりもシｌ−シンを含有しく
いノごため、これらの規模はやや大きめと思われる。ぞ
の規模は予想値と一致しでイる。１ａｃ２０３　ＤＮＡ
を１１１１８７０の独Ｍ（７）ｔｌｉｎｃｌｌ開裂部位
（ｂｐ　５４３と５４Ａの間）に挿入した。後名は右端
から約２０　ｂｌｌのところにただ−・つのｒａｑｌム
２識配列を１）＝ｉ（いる（／すＩ〕゛νら、１９７８
年）　。Ｈ１１８７０のダぐｈにある１Ｉｉｒ＋ｒ１ｍ
ａｇは約４００　ｂｌｂら（ゼルザ−ら、１９７８年）
　、　１．］Ｑｌで切断されない。このため、挿入によ
っ（変史さカス、し名相Ａ？１　スＴａｎ　ｌ肛詐ｔ、
−＋　ｚｌｓ　／ｙ　／　Ｊ−上、１つ八八１）１）を
倉イうりるはずである。使用のＩａｃ　ＤＮＡは１ａｑ
ｌＣの開裂部イ☆をしたないから（メイぜルス、１９７
３年：、゛イクソン、１９７５年；）１ラホウ、１９７
８年）、挿入の結果２０３　ｂｐ増加づると予想Ｃきる
。これらの］′）のハク１〜が確かにｒｌｌ及びＩａｃ
　ＤＮＡ　倉むことをＭ明りるために、別個のサザーン
（Ｓｏｕシｈｅｒｎ［１７！＋１Ｊ−）　１１種形成を
ｔｊない、ｒｌｌ　ＤＮＡのプローブとしＣプラスミド
ｐＮＣ７、Ｉａｃ　ｌｌｉ片の存在に対りるプローブと
してＨ１３ｍｐ２により、このゲルのレーンをΔブシＦ
）シた。ｐＮＣ７ブローブによる雑種形成のΔ１−ラジ
オグラムは、これらの二つのハントが、１１１１８７０
に相補的なりＮＡを含りする−・つのｂのＣあることを
承しくいる。同しゲルＣプローブとしＣＨ１３１Ｒｐ２
による和種形成のΔ−トラジΔグラムは、ｌａｃ断ハが
実際に物理的にｒｌｌ　Ｊ包子へ挿入されたことを小し
くいる。

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Ｈ，）及びレズニ］ノ・ダブリ−１つ・シ　（Ｒｅｚｎ
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エビスザキφクイ（Ｅｂｉｓｕｚａｋｉ、　Ｋ、）及び
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　：　ハクｙ　’Ｊオノ１　シ１４の遺伝的組換えにお
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Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３８巻（１９６９年）　７０１−７
０３Ｍ。

ノ１ラボウ・ピー・シ１イ（ｌａｒａｂａｕｇｈ、　Ｐ
、Ｊ　）：１ａｃｌ遺伝子の配列。ＮａｊＵｒ６２７４
巻（１９７８年）　７６５−７６９員。

カブラン・ディー・土イ（にａｐｌ；Ｉｎ、　Ｄ、Ａ、
）及び−ノアリップ−ｊ’イ−−−ビ　（Ｎｅｉｒｌｉ
ｃｈ、　Ｄ、Ｐ、）：制限■ントヌクレアーゼＥｃｏＲ
１による非グリロシル化ハク−ｊすΔノＩ−シ■４デＡ
＋シリホ核酸の開裂。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２５０　巻＜１９７５年）　
２３９５−２３＜１７白。

カラム１１　シ、’ｌイ・ｉイー（にａｒａｍ９．Ｉ　
Ｄ　）　：ボリメクレΔチト・リカーｌ１（３１仏了３
０）なしのノ？シ［４ｒ　ｌ　］突然変異体によるＤＮ
Ａ　ｌ製、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎＢｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
　Ｃｏｍｍｕｎ、　３７巻（４９６９年）　４１６−４
２２負。

カラム・シ１イ・ディー及びハ　カ　・ビー“遺伝ｆ３
０（デＡキシリボ核酸すカーゼ）及びｒｌｌｌｌ遺伝穴
いたハクテリＡ７？−シ１４突然変異体の性状。Ｊ　Ｖ
ｉｒｏｌ、　７巻（１９７１年）　２６０−２６６員。

／Ｊッツ・１ル（ＫａＬｚ、　Ｌ、）、キンゲスヘリ串
ディー　・ｙ　イー（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ、　Ｄ　１．
）及びヘリンスキー・１゛イー・アール（ｌｌｅｌｉｎ
ｓｋｉ、　Ｄ、Ｒ，）：環式７デノシン・燐酸による、
−１ラスミド・ｉ″Δ−ｔシリ小核酸複製の刺激と、シ
ラスミド・フ゛Ａキシリ小核酸−伽白買複合陣のカタ小
ノイ１〜抑制。Ｊ、　Ｂａｃｔ−ｅｒｉｏｌ、１１４巻
（１９７３年）　５７７−５９１　負。

メイビル７−エヌーＩム（Ｈａｉｚｅｌｓ、　Ｎ、Ｈ）
　：大腸菌（１ｖ５ブローし＝ター突然変異株から転写
されたラタトース・メッセンシ鵞・−・リホ核酸のメク
レＡｆト配列。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ、ａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７０巻＜１９７３年）　３５８５
−３５８９貞。

７トソン１１ｊイー（ＨａｔｔＳＯｎ、１）、ヴ１７ン
φハウトシー（Ｖａｎ　Ｈｏｕｗｅ、Ｇ、　）　、ポル
・エイ（Ｂｏ　Ｉ　Ｉ＠。

Ａ、）、ｔ？ルザー轡シー（Ｓｅｌｚｅｒ、　Ｇ、）及
び土ブ′スティンφノノール（ｌｐｓＬｅｉｎ、　Ｒ，
）　：　ハクｊすＡフッ！−シＩＡ　ＤＮＡのクローン
化された断片の遺伝的同定及び初期の１４運伝子を含有
（るいり′）かのクローンによる相補性。Ｍｏ１．　Ｇ
ｅｎ、、Ｇｅ、ｎｅｔ、　１５４巻（１９７７年）３１
９−３２６頁。

ポリスキー・ヒ−（Ｐｏｌｉｓｋｙ、　Ｂ　）　、グリ
ーン・ビー（Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｐ、）、カーフイン・ｊ
゛イ・イー（Ｇａｒｒｉｎ、　Ｄ、Ｅ、）、−？ツカー
シー・ヒ　・シ１イ（ＨｃＣａｒ［ｈｙ、　Ｂ、Ｊ、）
、グツトマン−、Ｉツノ−ｒム（Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｉ
ｌ、Ｈ，）及びボイ％ｔ−−１ツＪ−ダゾリ−２つ（Ｂ
ｏｙｅｒ、　ＩＩ　Ｗ　）　：　１ｃｏＲ１制限１ント
メクレノ！−ヒニよル基質認識の特巽性。Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、１ＩＳＡ　７２巻（１９
７５年＞　３３１０−３３１Ａ　負。

プリブノウ・ディー　（Ｐｒｉｂｎｏｗ、　Ｄ、）　、
シカートソン・ディー・シー（Ｓｉｇｕｒｄｓｏｎ、　
Ｄ　Ｃ）、１゛−ルトφ」−ル（Ｇｏｌｄ、　Ｌ、）、
シンカーφヒ−・１ス（Ｓｉｎｇｅｒ、　Ｂ　Ｓ、）、
ナポリ・シー（ＮａＩ）Ｏｌｉ、　Ｃ，）、ｆロシウス
・シコーイ（Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｊ、）　、ダル・エイ
・シ］−イ（Ｄｕｌｌ、　１．Ｊ、）及びノラー　・１
ツヂ・１ノ標識の位置。Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　
＋４８巻（１９８１年）３３７−３７６ＣＩ。

レヘル・−［ツ′ｆ−（Ｒｅｖｅｌ、　Ｈ，）及びショ
ーショポウーノス・シ　・ビー（Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌ
ｏｓ、　ＣＰ、　）　：ブロノＩ−シＰ１による非グル
コシル化１−偶数ハクテリＡ　−／　７−シの制限。Ｖ
ｉｒｏｌｏ３ｙ、３’ｌ　（１’１６’ｌ）　ｌ−１７
゜エルす−・シー（Ｓｅｌｚｅｒ、　Ｇ、）、ポル・二
［イ、クリッシト１ツチ（Ｋｒｉｓｃｈ、　Ｉｆ、）及
び１ニブスｊイン・ノ′　ル（ｌ　ｐｓＬｅｉｎ、　１
ｍ　）　：ハクｉすΔノ？−シ１４の１゛１１道１ムｆ
を含有りる組換えシラスミドの構築と竹状。Ｈｏ１ｅｃ
、　Ｇｅｎ、　ｃｅｎｅｔ、１５９巻（１９７８年）３
０１−３０９貞。

シｙｒブー　テ゛イー−−二ｒ−イ（Ｓｈｕｂ、　Ｄ、
Ａ、）及びＳｉセス−Ｊ　−Ｉｌ−ジＩイ（Ｃａｓｎａ
、　Ｎ　Ｊ、）　ニー膜化され／ｊＤＮ八クロへニング
・ベクターとしくのハクフリＡノ１７−シＩ４゜Ａｍｅ
ｒ、　Ｓｏｃ、　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ　年会議抄録（１
９８１年）１１３．１１４員。

リイ［ン・１ル−　ｊ゛イーＳｉｍｏｎ、　Ｉ　、　Ｄ
、　）ら：大腸菌にクローン化されたハクｊすＡノ？−
シ１４着仏ｆによる蛋白質の寛定化、、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａ’ｄＳｃｉ　ｌｌ５Ａ　８０巻（１９
８３年）　２０５９−２０６２貞−スナイダー・エル（
Ｓｎｙｄｅｒ、　１．）、ゴール１〜φエル（Ｇｏｌｄ
、Ｌ、）及、びツノツタ−φイー　（Ｋｕｔｔｅｒ、　
Ｅ　）　：遺伝子生産物がシトシン含有Ｔ４　ＤＮＡへ
の遅れた負の転写を防いでいるバクデリオファーシ１４
眉伝子。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７
３巻＜１９７６年）　３０９８−３１０２頁。

１ノザーン・イー−エム（ＳＯＵｌｌｅｒｎ、　ＬＭ　
）　：　／７’　ルミ気泳動によって弁頭されたＤＮＡ
断片の１４異的配列の検出。Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ
　９８巻＜　１９７５年＞　５０３−５１１頁。

スタインバーブ・シー・エム（Ｓ［ｃｉｎＩ）ｃｒｇ、
　ＣＨ）及び１トカー・アール−ニス山１ｇａｒ、　Ｒ
Ｓ　）　：ハクテリオファージの逓伝的組換えにつぃＣ
最近の１理論の批評的試験。ａａｎａ【１ｃｓａｙ巻（
１９６２（１）１８７−２０８頁。

リトク’）　７−　シー（Ｓｕｔｃｌｉｒｒｏ、　Ｇ、
　）　：　ＤＮＡ配列から導かれたｐＢＲ３２２制限地
図。４３６１メクレＡブ１へ対の長さまで・の正確なり
ＮＡＪ、ＱＩＩ、ｉ−／−ノＪ　−。ＮｕｃｌＡｃｉｄ
ｓ　Ｒｅｓ　５巻（１９７８年）　２７２１−２７２８
　、Ｌ’ｌ。

第１頁の続き ＠Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号０発　明
　者　ナンシー　ジエー　力　アメリカ合衆国スナ　オ
ルランド　アベ １２２０３　ニューヨーク州　アルバニーニュ−２５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クローン１ヒされた遺伝子を経由して大腸菌（ｒ　
   ｃｏｌｉ）によ７）で表現される有用な蛋白質が、大腸
   菌内Ｃつくられるプロテアーゼに感受性がある場合に、
   このような蛋白質を安定化さゼるための以トの段階から
   なるＩ）法。 ｆａ）　Ｔ　４ｎ’ｉｖｉ、系ハクテ’）　Ａ　７　ｐ
   　−シカラ（１）ＤＮＡ　ｆｌｉ片とイ断飾された大腸
   菌プラスミドのゲノムとからなる一１メジ型シラスミド
   を構築り°る。 （１））このキメラ型プラスミドの１偶数系ハクテリΔ
   ノ、７　シからのＤＮＡ断ハヘ外来ＤＮＡ丸生体外ノラ
   スミトとの間で生体内組換えを（うなう。 （１１）この二Φキメラ型プラスミドを宿した■偶数２
   、［偶数系バクテリオファージからのＤＮＡ断片を大腸
   菌内で長足に増殖させる、特許′［請求の範か、又は１
   道伝子の一部である。狛へ１１請求の範囲第２項による
   ６２人。 ４、遺伝子がハクテリΔ）１−ジＩ４のｒｌｌ　’４仏
   子群である、特許請求の範囲第３項による方法。 ５、Ｔ偶数系バタテリオフ？−ジがバクテリＡノ１−シ
   １４である特許請求の範囲第１項の方法。 ６、修飾された大腸菌ブラスミ１〜がｐＢＲ３２２（＋
   １２３ｒ十）　’ｒある、特許請求の範囲第１項による
   方法。 ７、外来ＤＮＡ挿入物が有用なボリベブヂ１−又は蛋白
   質を暗号化する貞核還伝了（−ある、Ｉｌｌ　Ｋ’を請
   求の範囲第１　ｉｆｉによる方法。 ８、大腸菌が大腸菌１０７８（Ｃ６００ｒ″″ｍ”５ｕ
   ｐｆ４４１ｈｒ−１ｅｕ”−ｔｈｉ−）株又は大腸菌（
   Ｃ６００５ｕｐＦ４４）株Ｃある特許請求の範囲第１項
   による方法。 ９、−：ｆｙスミトＩ）ＮＣ７’Ｃ’、（１）　’Ｉ　
   ７、−７．　ミｌ；’　ｐＲＲ３２２３２２の甲−・の
   旧ｎｄｌ１部１ｉへ挿入されたバクプリＡノ１　シｒ４
   （１１１＋８７０）のｒｌ　ＩＪ伝子の８７３−ｂｐ　
   Ｈｉｎｄ■断ハをａ右し、（２）長さが約３．６７　ｋ
   ｂであり、（３）アンピシリン耐性をうえるもの。 １０　グラスミドｐＮｃ７１ａｃ２　テあ）？、（１）
   ブ＝／スミトｐ８Ｒ３２２（ｌＩ２３ｒ”）ゲノムの一
   部を含有し、この部分がｐＢｌ？３２２の彫・の１Ｉｉ
   ｎｄｌｌＪ部位へ挿入されたハクｊす７１−　’、７　
   ／−ジｒ４（１１１＋８７０１のｒＨ遺伝子の８７３−
   ｂｐ　１ｌｉｎｄ　ｍ断ハを含有し、（２）アンピシリ
   ン耐性を５え、かつ（３）ｉｌ能的βカラクトシダ　ヒ
   ｊｉ仏了をもつ宿主細胞をβカラクトシドの構成的生産
   菌に覆るもの。