JPS6058078A - 一般化されたDNAクロ−ニングビヒクルSUNY 1−JapanとしてのR−218,バクテリオフア−ジT4 - Google Patents
一般化されたDNAクロ−ニングビヒクルSUNY 1−JapanとしてのR−218,バクテリオフア−ジT4Info
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- JPS6058078A JPS6058078A JP59159453A JP15945384A JPS6058078A JP S6058078 A JPS6058078 A JP S6058078A JP 59159453 A JP59159453 A JP 59159453A JP 15945384 A JP15945384 A JP 15945384A JP S6058078 A JPS6058078 A JP S6058078A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
MY、ユ1む月1πユ
分J4物学C1大腸菌(Fscherichia co
li)を宿↑としく使うことは周知eある。この微生物
は、り「コ ン化された遺伝子を経てインシー1リンの
商業内生Jqに使われた最初の扉核微生物だったようC
ある。有用なポリペプチド又は蛋白質を暗号化りる員核
消伝子の宿主としての大腸菌は欠点がないわ1プではな
い。早くから広く知られるよう(なった一つの欠点は、
大腸菌による内向系の産休である。蛋白質生成物の調製
におい(内向系があるのは望ましくない。この問題解決
の!こめ広範囲の研究が行われた。宿主としての大腸菌
使用のもう一つの欠点は、この微生物がつくる1Dテア
ピが、この微生物によっ(つくられる感受↑1蛋白質
生成物を破壊することである。このように蛋白質生成物
が破壊されるため、あるクローン化された與核眉伝了の
表現水準が低いという誤った結論を引出づことがある。
li)を宿↑としく使うことは周知eある。この微生物
は、り「コ ン化された遺伝子を経てインシー1リンの
商業内生Jqに使われた最初の扉核微生物だったようC
ある。有用なポリペプチド又は蛋白質を暗号化りる員核
消伝子の宿主としての大腸菌は欠点がないわ1プではな
い。早くから広く知られるよう(なった一つの欠点は、
大腸菌による内向系の産休である。蛋白質生成物の調製
におい(内向系があるのは望ましくない。この問題解決
の!こめ広範囲の研究が行われた。宿主としての大腸菌
使用のもう一つの欠点は、この微生物がつくる1Dテア
ピが、この微生物によっ(つくられる感受↑1蛋白質
生成物を破壊することである。このように蛋白質生成物
が破壊されるため、あるクローン化された與核眉伝了の
表現水準が低いという誤った結論を引出づことがある。
慨して、プロテア ゼは微q−物によつ(つくられる不
完全な、又は異常な蛋白質に作用づる。しかし、大腸菌
プロjアーゼが有用な外来蛋白質、例えば人間のヘ−タ
・ゾレインターフェロンやジン1〜スタチンにも悪影響
を及ばづ。
完全な、又は異常な蛋白質に作用づる。しかし、大腸菌
プロjアーゼが有用な外来蛋白質、例えば人間のヘ−タ
・ゾレインターフェロンやジン1〜スタチンにも悪影響
を及ばづ。
従来の技術と9発明が解?しようとりるt冒°Qぐ、1
−Lル’ 7’ −/ −”サイ[ン(L、D Sim
on)らによる発表のU大腸菌[クローン化されたハク
)−リAノ?−ジ14遺伝子による蛋白質の安定化J
Proc不完全山白凹例えばピ」−一ロマイシンポリペ
ブチト、(2)パ常だが完全な蛋白質、例えばλtSO
蛋白質、及び(3)大腸菌内にクローン化された遺伝子
によ・)−(暗号化される不安定な真核蛋白質、例えば
成人の線紺芽細胞インターフェロン、を安定化さけるた
めの、クローン化されたT4 pinJ仏子の1史用を
明らかにしくいる。この公表文献に記述され(いるb払
は、大腸菌宿主に形質転換させた明白に1.IJの2シ
ラスミドを使っている。−〕)の1シメミトは14 p
inJ仏子を゛含有し、他力は望んCいる蛋白質生成物
を暗号化する真核遺伝子を含有りる。この方法は指示さ
れた蛋白質を安定化1”ると菖われるが、大腸菌宿主中
に2種の貸なるプラスミドを使用ザるため、望ましい商
業内方)人ではない。絹換え手段による有用蛋白質の商
業生産にI3いC1このようなシラスミドの和合性は望
ん(゛い・るはと家憲eは寿いかもしれない。和合性″
がる。本発明す法は、二重キメラ型プラスミドを1史用
し、ここからの外来DNA配列を1偶数系バクiすA)
/−ジに組換え、次いeこれを大腸菌宿主への感染に用
いることによって、プラスミドの不和合問題を回避しC
いる。本発明の安定化の面は土8記文献の方法の場合の
ようにTA pinJ伝fのクローニングに基づくもの
Cはない。 ゛本発明の分野に関係する他の発表文献が
幾つかある。これら文献の完べきな引用は実施例のあと
の「参と文献」欄に見い出ける。
−Lル’ 7’ −/ −”サイ[ン(L、D Sim
on)らによる発表のU大腸菌[クローン化されたハク
)−リAノ?−ジ14遺伝子による蛋白質の安定化J
Proc不完全山白凹例えばピ」−一ロマイシンポリペ
ブチト、(2)パ常だが完全な蛋白質、例えばλtSO
蛋白質、及び(3)大腸菌内にクローン化された遺伝子
によ・)−(暗号化される不安定な真核蛋白質、例えば
成人の線紺芽細胞インターフェロン、を安定化さけるた
めの、クローン化されたT4 pinJ仏子の1史用を
明らかにしくいる。この公表文献に記述され(いるb払
は、大腸菌宿主に形質転換させた明白に1.IJの2シ
ラスミドを使っている。−〕)の1シメミトは14 p
inJ仏子を゛含有し、他力は望んCいる蛋白質生成物
を暗号化する真核遺伝子を含有りる。この方法は指示さ
れた蛋白質を安定化1”ると菖われるが、大腸菌宿主中
に2種の貸なるプラスミドを使用ザるため、望ましい商
業内方)人ではない。絹換え手段による有用蛋白質の商
業生産にI3いC1このようなシラスミドの和合性は望
ん(゛い・るはと家憲eは寿いかもしれない。和合性″
がる。本発明す法は、二重キメラ型プラスミドを1史用
し、ここからの外来DNA配列を1偶数系バクiすA)
/−ジに組換え、次いeこれを大腸菌宿主への感染に用
いることによって、プラスミドの不和合問題を回避しC
いる。本発明の安定化の面は土8記文献の方法の場合の
ようにTA pinJ伝fのクローニングに基づくもの
Cはない。 ゛本発明の分野に関係する他の発表文献が
幾つかある。これら文献の完べきな引用は実施例のあと
の「参と文献」欄に見い出ける。
(1)レベル(Revel)及びショーシコポウラス(
GeO(10pOUIOUs)、1969年。HHC(
5−ヒト0キシメチルシトシン)によるフン7一シDN
A合成をrl能とづ−るようなフ1−ジ及び細菌突然9
v!株の開示 (2)スナイダ−(3nyder)ら、 1976年。
GeO(10pOUIOUs)、1969年。HHC(
5−ヒト0キシメチルシトシン)によるフン7一シDN
A合成をrl能とづ−るようなフ1−ジ及び細菌突然9
v!株の開示 (2)スナイダ−(3nyder)ら、 1976年。
IIHcの代わりにシ1〜シンを1史う以外は(1)と
1司し。
1司し。
(3)カブラン(Kaplan)及びニアリッf (N
ierlicl+)1915年。IIHcを含有りる1
4 [INAにb:oRI h’i効率(4)シ11ゾ
(Stu+b)及び4【2スナ(Casna) 、 1
9訓年DNA断J、1をハクjすAノ17 ジ14へ抑
入りる方V、の抄録。
ierlicl+)1915年。IIHcを含有りる1
4 [INAにb:oRI h’i効率(4)シ11ゾ
(Stu+b)及び4【2スナ(Casna) 、 1
9訓年DNA断J、1をハクjすAノ17 ジ14へ抑
入りる方V、の抄録。
(5) 4 t・ツノ及びシセ1.1982年。本明細
書に明らかにされたクローン化手順の発表。この発表文
献は参照により水明msに取入れられ(いる。
書に明らかにされたクローン化手順の発表。この発表文
献は参照により水明msに取入れられ(いる。
問題を解決でるための手段
クローン化された遺伝子を軽【大腸菌によつ(表現され
た有用な外来蛋白質が、大腸菌細胞内Cつくられるプロ
iアーゼに感受性がある場合に。
た有用な外来蛋白質が、大腸菌細胞内Cつくられるプロ
iアーゼに感受性がある場合に。
このΦ白v1を長足化させるためのプ’3’tlが明ら
かにされ、HJ 6’+ 請求され(いる。特定的には
、水明細嵩C明らかにされるように、木方払は次の段階
からなる。
かにされ、HJ 6’+ 請求され(いる。特定的には
、水明細嵩C明らかにされるように、木方払は次の段階
からなる。
(1)ハクIすAノ17 シY4のrl131i伝子の
部分と41’fq=された大腸@1ラスミドのゲノムの
一部とからなる↓メジ型シラスミドを構築りる。
部分と41’fq=された大腸@1ラスミドのゲノムの
一部とからなる↓メジ型シラスミドを構築りる。
(2)キメラ型ノシスミドの14配列へ外来DNAを住
体外で挿入しく一′X小キメラ型プラスミドを得る(3
)バク’y ’、J Aノ17 ジ■4とてφキメラ型
ダラスミドどの間で生体内組換えを行なう。
体外で挿入しく一′X小キメラ型プラスミドを得る(3
)バク’y ’、J Aノ17 ジ■4とてφキメラ型
ダラスミドどの間で生体内組換えを行なう。
(4)二重↓メジ型シラスミドを宿したl/IF人腸菌
大腸染さUる。
大腸染さUる。
正味の効果は、大腸菌細胞から高水型の外来蛋白質を生
ずることである。
ずることである。
木明細店で用いられる省略体は次のとおりごある。1)
O=塩基文り、CAP−ツノタボライトJ(玉子アクチ
ヘーター蛋白質、DTl−ジチオスレイト ル、[[8
r−エチジウムブロンイト、glcllHc−グル〕シ
ルー5−ヒドロキシメチルシトシン、IIHC−5−ヒ
ドロキシメチルシトシン、++)41J=5−ヒドロ↓
ジメチルウラシル、kb−キ[ノヘース灼、Xgal=
3−IOし〜4−クロロー5−インドリル−β−カラク
トシ1〜。
O=塩基文り、CAP−ツノタボライトJ(玉子アクチ
ヘーター蛋白質、DTl−ジチオスレイト ル、[[8
r−エチジウムブロンイト、glcllHc−グル〕シ
ルー5−ヒドロキシメチルシトシン、IIHC−5−ヒ
ドロキシメチルシトシン、++)41J=5−ヒドロ↓
ジメチルウラシル、kb−キ[ノヘース灼、Xgal=
3−IOし〜4−クロロー5−インドリル−β−カラク
トシ1〜。
11はプラスミド担体状態を表わす。
木明細嵩で引用された発表文献は、実施例のあとの「参
考文献」欄に出(いる。
考文献」欄に出(いる。
ハクテリオフ1−ジ1偶数系DNAと大腸菌プラスミド
のゲノムの一部とからなるキメラ型〕)スミドの構築は
、C71[INAとs’*′vPされた大腸菌ゾ2スミ
トのゲノムを用いて、本明細書で例示されCいる。人)
麟菌内U−DNAを安定に増殖Cさるかぎり、りなわら
イれが大腸菌に対して致死的でないかぎり、他のハク戸
ノオフ?−ジI偶数系DNAを使用C゛きる。このL偶
数系DNAは1遺伝子の全体か、又はイの−、一部であ
る。
のゲノムの一部とからなるキメラ型〕)スミドの構築は
、C71[INAとs’*′vPされた大腸菌ゾ2スミ
トのゲノムを用いて、本明細書で例示されCいる。人)
麟菌内U−DNAを安定に増殖Cさるかぎり、りなわら
イれが大腸菌に対して致死的でないかぎり、他のハク戸
ノオフ?−ジI偶数系DNAを使用C゛きる。このL偶
数系DNAは1遺伝子の全体か、又はイの−、一部であ
る。
また、あとで述へる実施例はI4のrll遺伝子への外
来DNAの挿入を明らかにしているが、このようなりN
Aを任意の1偶数系バクテリAノア/−ジのイの遺伝子
へ、又は1遺伝子の部分へクローン化Cきることが認識
されねばならない。史に、I4にはrll遺伝子以外に
多くの遺伝子があり、本明細よC明らかにされた手順又
はこの技(4:jに周知の伯の手順によつC1外米DN
Aをそれらの中へクローン化することがeきる。
来DNAの挿入を明らかにしているが、このようなりN
Aを任意の1偶数系バクテリAノア/−ジのイの遺伝子
へ、又は1遺伝子の部分へクローン化Cきることが認識
されねばならない。史に、I4にはrll遺伝子以外に
多くの遺伝子があり、本明細よC明らかにされた手順又
はこの技(4:jに周知の伯の手順によつC1外米DN
Aをそれらの中へクローン化することがeきる。
木りぺはクローン化媒体としてバタテリオファーシ14
を用い(例示され(いる。他の1偶数系バ■4に対しC
明らかにされたものと実質的に同じ方法て” DH,A
クローン化媒体としC投合つかぎり1大腸菌宿)の感染
に使用できることを理解リベきCある。
を用い(例示され(いる。他の1偶数系バ■4に対しC
明らかにされたものと実質的に同じ方法て” DH,A
クローン化媒体としC投合つかぎり1大腸菌宿)の感染
に使用できることを理解リベきCある。
大腸菌がアンバー抑圧突然変異を含りする限り任意の大
腸菌を宿主微生物として使用Cきる。このような微生物
は周知であり、一般に入手できる。[−ル人学大腸菌培
養阜保a施設は、要求に応じC二次培養基を一般に提供
している。トの開示に使用されCいる大腸菌1078株
並びに大腸菌C600株は、1−ル人学培養基保存/I
l!!設から無制限に人手−Cきる。
腸菌を宿主微生物として使用Cきる。このような微生物
は周知であり、一般に入手できる。[−ル人学大腸菌培
養阜保a施設は、要求に応じC二次培養基を一般に提供
している。トの開示に使用されCいる大腸菌1078株
並びに大腸菌C600株は、1−ル人学培養基保存/I
l!!設から無制限に人手−Cきる。
材料及び方法
(a)大腸菌菌株、ノ?−ジ系統及びノシスミドゾラス
ミトDNAの形質転換と増殖用の受容菌としく大腸菌1
078(C600r−II+5upE44 thr″″
1eu−Lhi−)株を使用した。IIHc DNA
(レベル及びジー1 シ](Su’、rllll中文然
変異による遺伝子30ム救出に晶′1容Cさる)を使用
した。遺伝子30の救出実験には、14系統C104B
(遺伝子30−)を使用した。
ミトDNAの形質転換と増殖用の受容菌としく大腸菌1
078(C600r−II+5upE44 thr″″
1eu−Lhi−)株を使用した。IIHc DNA
(レベル及びジー1 シ](Su’、rllll中文然
変異による遺伝子30ム救出に晶′1容Cさる)を使用
した。遺伝子30の救出実験には、14系統C104B
(遺伝子30−)を使用した。
57ノスミトpOP203−1は、EcoR1部位に挿
入された大腸菌ツクドース域の203−bp tlae
lu a片(Ov5プロ[夕 突然変異を含有)を含有
ザるpHB9誘導1本ひある(ハックマンら、1976
年)。プラスミドpBR322(1123r十)は1)
BR322のll1ndl[部位に挿入された14のr
ll遺伝子のシストロン間領域の873−bDiifi
jllを含有り−る(ブリブナウPribnowら、1
981年)(b)酵素及びその他試薬 制限1−ントメクレアーゼEcoRI、 Alul、
Bgll。
入された大腸菌ツクドース域の203−bp tlae
lu a片(Ov5プロ[夕 突然変異を含有)を含有
ザるpHB9誘導1本ひある(ハックマンら、1976
年)。プラスミドpBR322(1123r十)は1)
BR322のll1ndl[部位に挿入された14のr
ll遺伝子のシストロン間領域の873−bDiifi
jllを含有り−る(ブリブナウPribnowら、1
981年)(b)酵素及びその他試薬 制限1−ントメクレアーゼEcoRI、 Alul、
Bgll。
If l’+a l 、 Ba1m旧(二1−イングラ
ンドφバイAラゾ)。
ンドφバイAラゾ)。
11inN(へjメダ研究所)1及びtlindllと
1aql (べ一リン力 ・7ンハイム)を売り主から
供給された1」様に従)C1山用したが、但し党争な反
応を達成りるために、C4DNAμ0当り4単位の1−
aqlを3峙間使用した。)coRI*反応は25■H
1ris、1Icl (pH85)、2 n+HHgC
lユ〈ポリスキーPo1iskyら、1975年)の最
終濃度ぐ実施した。S1ヌクレアーゼ(へ−リンガ−φ
マンハイム)反応は、0.2 mH7nSO450IN
酢酸−j l−リウム(pH45)、1001118
NaCl (1)021中で、FCORI ’r切断さ
れたpOP203−I DNA 8μ0及び酵素80単
位により、37℃′c30分tjなつlこ。14 DN
Aリガーゼ(BRL)は、50 mHトリスIICI(
pH75)、100 n+HHgCl□、20 mM
DI−1及び1 niHAl’Pの最1’l濃度で、D
NA lμg当り1単位を4℃(・・模及応さゼた。X
ga lを2%までジメチルホルム1ミドに溶解し、寒
天プレート当り50μmを使用した。DNAポリメラ〜
ゼI(ベーリンカ−・ンンハイム)のフレJつ断片をD
NA、c/!II当り11417(’使用し、6.6m
Ht−リスIICI(pH7,5) 、 6.6 mH
NaC1,6,6n+HHgCl2..6.6 +++
HOTI及び各dNTP (1,1mHの最終濃度で良
い3fiい未D−みた1した。
1aql (べ一リン力 ・7ンハイム)を売り主から
供給された1」様に従)C1山用したが、但し党争な反
応を達成りるために、C4DNAμ0当り4単位の1−
aqlを3峙間使用した。)coRI*反応は25■H
1ris、1Icl (pH85)、2 n+HHgC
lユ〈ポリスキーPo1iskyら、1975年)の最
終濃度ぐ実施した。S1ヌクレアーゼ(へ−リンガ−φ
マンハイム)反応は、0.2 mH7nSO450IN
酢酸−j l−リウム(pH45)、1001118
NaCl (1)021中で、FCORI ’r切断さ
れたpOP203−I DNA 8μ0及び酵素80単
位により、37℃′c30分tjなつlこ。14 DN
Aリガーゼ(BRL)は、50 mHトリスIICI(
pH75)、100 n+HHgCl□、20 mM
DI−1及び1 niHAl’Pの最1’l濃度で、D
NA lμg当り1単位を4℃(・・模及応さゼた。X
ga lを2%までジメチルホルム1ミドに溶解し、寒
天プレート当り50μmを使用した。DNAポリメラ〜
ゼI(ベーリンカ−・ンンハイム)のフレJつ断片をD
NA、c/!II当り11417(’使用し、6.6m
Ht−リスIICI(pH7,5) 、 6.6 mH
NaC1,6,6n+HHgCl2..6.6 +++
HOTI及び各dNTP (1,1mHの最終濃度で良
い3fiい未D−みた1した。
(clゲル電気泳動
分析ノノカ目−スゲル(1%)は、150v(/′)定
電J1で平均16時間、最終濃度40m+)l)−リ)
、11C1(pH79)20 m)l酢酸プトリウム、
1 mHEDrAの緩鮨液中C・t)な〕た。ゲルを1
μQ/ml EtBr= (’ 15分染色し、長波U
V光の透視によっC写貞撮影した、(d) DNA調製
と形質転換 C3CI段階勾配によって濃縮精製された大腸菌HR1
41Aの感染体のf孫を20のA、1G、まe希釈づる
ことによっ(、IINc 14 ONAを調製しIこ。
電J1で平均16時間、最終濃度40m+)l)−リ)
、11C1(pH79)20 m)l酢酸プトリウム、
1 mHEDrAの緩鮨液中C・t)な〕た。ゲルを1
μQ/ml EtBr= (’ 15分染色し、長波U
V光の透視によっC写貞撮影した、(d) DNA調製
と形質転換 C3CI段階勾配によって濃縮精製された大腸菌HR1
41Aの感染体のf孫を20のA、1G、まe希釈づる
ことによっ(、IINc 14 ONAを調製しIこ。
0.1Hトリス11CI(lIi’、9) i’飽和し
た周IJ (1) / T、 /−ル’(:” 7 /
’ −シを2回抽出し、水相を10 n+HトリスII
CI(pH7,9)0、I HNaC1,0,1sHE
DTAに4℃で一11′、fi析した。
た周IJ (1) / T、 /−ル’(:” 7 /
’ −シを2回抽出し、水相を10 n+HトリスII
CI(pH7,9)0、I HNaC1,0,1sHE
DTAに4℃で一11′、fi析した。
1ノスミト及び)113 RF 1)NAをカツッ(K
atz)ら(1973年)のトリトン−X透明溶菌液手
順にょっで調製し、C5CI−EtBr浮力密度勾配で
分【プた。生部のノ゛レッゾを151様につくったが、
CsCl勾配を省略し・、ぞの代わりに100 、cz
g/mlのゾ[]]jイJ−t;;K中で37℃、30
分培養し、続い(同量の)−1ノールC2回抽出し、f
−タノール沈澱さけた。形質転換をJ −、Iン(Co
henJら(1972年)の既述のとおりに?うな・)
だ。[記のように、本方法は大腸菌細胞中(・外来蛋白
質を長足化さゼるのに有用C・ある。
atz)ら(1973年)のトリトン−X透明溶菌液手
順にょっで調製し、C5CI−EtBr浮力密度勾配で
分【プた。生部のノ゛レッゾを151様につくったが、
CsCl勾配を省略し・、ぞの代わりに100 、cz
g/mlのゾ[]]jイJ−t;;K中で37℃、30
分培養し、続い(同量の)−1ノールC2回抽出し、f
−タノール沈澱さけた。形質転換をJ −、Iン(Co
henJら(1972年)の既述のとおりに?うな・)
だ。[記のように、本方法は大腸菌細胞中(・外来蛋白
質を長足化さゼるのに有用C・ある。
大腸菌細胞内Cグロjアーぜに感受性のある蛋白質は数
多く、J、く知られ(いる。例とじCはソンンがある。
多く、J、く知られ(いる。例とじCはソンンがある。
有用な外来蛋白質生産に対りる配列を118号化したそ
の他の遺伝子を、水明$111Wr明らかにされた技術
に明白妥当な調整を加えた1c用いいることにより、1
4へ挿入できる。このような調整は当業者に周知Cある
。明らかなように、このような挿入された遺伝子は、T
4感染細胞中C′積極的に認識される必須調節信号(プ
ロ[−り−及びリホンーム開始部泣)、丈6わち14自
イ4がら誘導される信号を含んでいる。大きなりNA挿
入物を14へ移したい場合は、■4の適当な欠失突然変
箕系統が使われよう。14のこのような欠失突然変周系
lJcは周知C゛あり、当業者に容易に人手〇きる。こ
のため、種々の大きさのDNA J包子挿入物を収容り
るような相補的な欠失をもつ適当な14系統/J< 4
51られれば、当業者は本開示により、有用な外来蛋白
質を暗号化した種々の遺伝子を1偶数系ハクjすA−ノ
1−ジヘクローン化できる。最終の結果(J、宿主大腸
菌細胞による劣化のない有用外来蛋白質が表現されるこ
とCある。木り法は、周知の手順C・ある。′)<られ
た蛋白質が安定化されると、低水準の蛋白質を検出でき
るので、安定化によつにのようなh法の効力が高まる。
の他の遺伝子を、水明$111Wr明らかにされた技術
に明白妥当な調整を加えた1c用いいることにより、1
4へ挿入できる。このような調整は当業者に周知Cある
。明らかなように、このような挿入された遺伝子は、T
4感染細胞中C′積極的に認識される必須調節信号(プ
ロ[−り−及びリホンーム開始部泣)、丈6わち14自
イ4がら誘導される信号を含んでいる。大きなりNA挿
入物を14へ移したい場合は、■4の適当な欠失突然変
箕系統が使われよう。14のこのような欠失突然変周系
lJcは周知C゛あり、当業者に容易に人手〇きる。こ
のため、種々の大きさのDNA J包子挿入物を収容り
るような相補的な欠失をもつ適当な14系統/J< 4
51られれば、当業者は本開示により、有用な外来蛋白
質を暗号化した種々の遺伝子を1偶数系ハクjすA−ノ
1−ジヘクローン化できる。最終の結果(J、宿主大腸
菌細胞による劣化のない有用外来蛋白質が表現されるこ
とCある。木り法は、周知の手順C・ある。′)<られ
た蛋白質が安定化されると、低水準の蛋白質を検出でき
るので、安定化によつにのようなh法の効力が高まる。
次の培養基は、合衆国イリノイ州ビオリア、合衆国g3
務省、北部研究所(NRRl、、)の永久保存施設に預
託されIこらのCある。
務省、北部研究所(NRRl、、)の永久保存施設に預
託されIこらのCある。
大腸菌RR1[pBR322(H23r”)]、 NR
Rl、 B15475゜1983年 7月 7日預託。
Rl、 B15475゜1983年 7月 7日預託。
大腸菌1078(pNC7)、NRRl、 a−154
7y。1983年7月7日に預託。
7y。1983年7月7日に預託。
大腸菌1078(pNc71ac2)、NRRL B1
5478゜1983年7月 1日に預託。
5478゜1983年7月 1日に預託。
大腸菌1078、NRRl、 B−15476、198
3年7月7日に預託。
3年7月7日に預託。
シラスミドpBR322は入手Cきる周知のプラスミド
Cある。これは大腸菌宿主ATCC37017中に保持
されζいる。精製されたpBR322DNA、 pNC
7DNA、及びpNc71ac2 DNAは周知の手順
、例えば透明溶菌液−等密爪勾配手順を使用して、大腸
菌宿主から得られる。
Cある。これは大腸菌宿主ATCC37017中に保持
されζいる。精製されたpBR322DNA、 pNC
7DNA、及びpNc71ac2 DNAは周知の手順
、例えば透明溶菌液−等密爪勾配手順を使用して、大腸
菌宿主から得られる。
上の培養基預託物は、水明細書に既述された発明に関連
して呼出し番号が付されており、これを間示しCいる特
許の授与と共に一般に入手Cきる。これらの預託物を入
手できるからと言っU、I!2H:]措置により本発明
に対しC授りされた特X′r権を侵害しCま(・本発明
を実施しCよいといつ檜【すを与えるものではない。
して呼出し番号が付されており、これを間示しCいる特
許の授与と共に一般に入手Cきる。これらの預託物を入
手できるからと言っU、I!2H:]措置により本発明
に対しC授りされた特X′r権を侵害しCま(・本発明
を実施しCよいといつ檜【すを与えるものではない。
以下は、本発明を実施りるための最適な態様をaめた手
順と、それによっCつくられる住成物を例示した実施例
である。これらの実施例を限定的1、二考え(はならな
い。他に注意がな【Jれば、自分率はリペ(車量、冶I
J1.混合物の割合いは容即にJ、る。
順と、それによっCつくられる住成物を例示した実施例
である。これらの実施例を限定的1、二考え(はならな
い。他に注意がな【Jれば、自分率はリペ(車量、冶I
J1.混合物の割合いは容即にJ、る。
実施例1.プラスミドpNC7の構築と特性化pBR3
22(t(23r+)は、pBR322の単一の1li
nd11部位に挿入c(れりr4(HI1870) (
7)r11遺伝了(7)873−bp7/ミノ末端08
舅化域に及んCいる。pBl?322(リ1〜クリ−/
5utclirfe 1978年)と1111870
(ゾリゾlつPribnowら1981年)の配列が
知られており、ff/iハの制限酵素部イ☆及び大きさ
をキメラ型プラスミドのために予測できる。pBR32
2内のHH870の方向は、制限エンドヌクレアーゼE
coRI及びHinclJによる二重消化で容易に決定
できた。1123 r十の最小のtlinell断片は
、EcoR1部位をもつことがわかり、方向がプラスミ
ド内で”rllAから8へと反峙訓回りC為ることを示
しくいる。+111870内rI4へクローン化しよう
とりるDNA 9片の挿入に都合のよい部位は、rll
B遺伝子ノ1IO−bpニ位置tlル11incllC
゛あり、HH870T−は唯一のHinc11部位eあ
る。
22(t(23r+)は、pBR322の単一の1li
nd11部位に挿入c(れりr4(HI1870) (
7)r11遺伝了(7)873−bp7/ミノ末端08
舅化域に及んCいる。pBl?322(リ1〜クリ−/
5utclirfe 1978年)と1111870
(ゾリゾlつPribnowら1981年)の配列が
知られており、ff/iハの制限酵素部イ☆及び大きさ
をキメラ型プラスミドのために予測できる。pBR32
2内のHH870の方向は、制限エンドヌクレアーゼE
coRI及びHinclJによる二重消化で容易に決定
できた。1123 r十の最小のtlinell断片は
、EcoR1部位をもつことがわかり、方向がプラスミ
ド内で”rllAから8へと反峙訓回りC為ることを示
しくいる。+111870内rI4へクローン化しよう
とりるDNA 9片の挿入に都合のよい部位は、rll
B遺伝子ノ1IO−bpニ位置tlル11incllC
゛あり、HH870T−は唯一のHinc11部位eあ
る。
pBR322には追加の21linell部位があり、
一つはアンピシリン耐性遺伝子内(3907907位置
の一つは652位置にある。HH870内に位置する1
linellへの当該断片の挿入を容易にVるため、5
altによつC1められる652位置にある部イ☆を排
除しIこ。
一つはアンピシリン耐性遺伝子内(3907907位置
の一つは652位置にある。HH870内に位置する1
linellへの当該断片の挿入を容易にVるため、5
altによつC1められる652位置にある部イ☆を排
除しIこ。
5altで開裂後、5°1木鎖伸艮部に4個のデAキシ
メクレAチト三燐酸とDNAポリメラーゼ1のクレノノ
ウ断ハをつり、ケfる末端を蓮結し直り。こミドを単鎖
した。そのうらの一つpNC7を選び、残りの実験に使
用した。
メクレAチト三燐酸とDNAポリメラーゼ1のクレノノ
ウ断ハをつり、ケfる末端を蓮結し直り。こミドを単鎖
した。そのうらの一つpNC7を選び、残りの実験に使
用した。
プラスミドpNC7は長さが約3.67 kb ’rあ
り、ノノンピシリン耐性を与える。pNC7欠失の大き
さと終点を推定するために、pNC7、pBR322及
び親ブラメミトH23rについC広範囲の制限分析を行
なった。
り、ノノンピシリン耐性を与える。pNC7欠失の大き
さと終点を推定するために、pNC7、pBR322及
び親ブラメミトH23rについC広範囲の制限分析を行
なった。
予想のように、pBR322の6,50位置(7)Sa
l’1部位と、652位置の1linell部位が失わ
れCいた。長時ら1回りh向c、 pBR322の63
1位置にある++ in t r部イ☆を含め全ての制
限部位は無傷のままぐあった。l)割目り方向で、21
80180位置a1部位は明白に失われIごが、221
0の部位は無傷であった。このように、欠失の時31回
り終点は、2194±13 bpのイ装置にある。欠失
によっ−C生ずるAlulとII i n r Iの新
制限断片の大きさについCの分析は、約+546 bp
の欠失と一致しくいる。これは、欠失が5altからp
B I? 、”s 22のほぼ2196196位置の
時計回り方向へ伸びCいることを示唆し“(いる。
l’1部位と、652位置の1linell部位が失わ
れCいた。長時ら1回りh向c、 pBR322の63
1位置にある++ in t r部イ☆を含め全ての制
限部位は無傷のままぐあった。l)割目り方向で、21
80180位置a1部位は明白に失われIごが、221
0の部位は無傷であった。このように、欠失の時31回
り終点は、2194±13 bpのイ装置にある。欠失
によっ−C生ずるAlulとII i n r Iの新
制限断片の大きさについCの分析は、約+546 bp
の欠失と一致しくいる。これは、欠失が5altからp
B I? 、”s 22のほぼ2196196位置の
時計回り方向へ伸びCいることを示唆し“(いる。
実施例2.プラスミドpNC7へのlac断gの挿入ク
ロ ン化りるDNAとしく選んだ。これは、そのメクレ
Af−ト配列が知られ(おり(メイゼルスHaizel
s 、 1973年;ディグ’)ンDicksonら、
1915年: / ty 、jボ1りFarabaug
h、19784.) 、人手しヤリく、選定に利点をし
っためである。203−bpの断片は1aclJl云f
の末端から17]トンを開始し、Aベレ ター、/ゾロ
E−ター域を通ツー(IacZli伝子の第8−]トン
へ伸びζいる。これをFcoRI消化によ−)(/シメ
ミ1〜pOP203−1から除いjこ。4−bpの5′
1木鎖伸艮部を除くために、この断片混合物を31メク
レア−ぜC処理し、)J−ノール抽出し、はとんど線状
の分子を得るために1linellで部分的に開裂され
CいたpNC7ブラスミドに鈍い切れ端を連結した。次
に連結混合物を使用し41大腸菌1078を形質転換さ
せ、ノ7ンピシリン含有ゾレート上で形質転換体を選択
し、これによってpBR322DNAに残っ(いる1l
inell部位へ挿入された断片を含有りるプラスミド
から選り分(〕た。lac調節1fiハをらつプラスミ
ドの含まれIこ集落を確認しやVいように、ル−トにX
galも含めた。このプラスミドは高い]ビー数で存在
するのひ、プラスミド上に1acAペレーターがあれば
、染色イ木オベレ タ からのlacリプレッサー全部
を滴定することができる。
ロ ン化りるDNAとしく選んだ。これは、そのメクレ
Af−ト配列が知られ(おり(メイゼルスHaizel
s 、 1973年;ディグ’)ンDicksonら、
1915年: / ty 、jボ1りFarabaug
h、19784.) 、人手しヤリく、選定に利点をし
っためである。203−bpの断片は1aclJl云f
の末端から17]トンを開始し、Aベレ ター、/ゾロ
E−ター域を通ツー(IacZli伝子の第8−]トン
へ伸びζいる。これをFcoRI消化によ−)(/シメ
ミ1〜pOP203−1から除いjこ。4−bpの5′
1木鎖伸艮部を除くために、この断片混合物を31メク
レア−ぜC処理し、)J−ノール抽出し、はとんど線状
の分子を得るために1linellで部分的に開裂され
CいたpNC7ブラスミドに鈍い切れ端を連結した。次
に連結混合物を使用し41大腸菌1078を形質転換さ
せ、ノ7ンピシリン含有ゾレート上で形質転換体を選択
し、これによってpBR322DNAに残っ(いる1l
inell部位へ挿入された断片を含有りるプラスミド
から選り分(〕た。lac調節1fiハをらつプラスミ
ドの含まれIこ集落を確認しやVいように、ル−トにX
galも含めた。このプラスミドは高い]ビー数で存在
するのひ、プラスミド上に1acAペレーターがあれば
、染色イ木オベレ タ からのlacリプレッサー全部
を滴定することができる。
その結果構成的につくられるβ−カラク1〜シトが色原
(A基質を開裂し、明るい青色の集落をfシト上に生じ
さゼる。
(A基質を開裂し、明るい青色の集落をfシト上に生じ
さゼる。
見込みのある集落を7ンビシリン−Xga I ゾレト
から選び、いくつかの制限酵素反応をt)なうのレニ1
分な句のシーラスミドDNAを甲NI L /こ。ノ゛
ノスミl;’pNc71ac2はrcoRI 、 1I
ind[l及びBQIIての制限分析によ7)C,pN
C7より約200 bp大さいことがわか一〕だ。Al
ulでの消化は、lac断gr:あるこの挿入物と一致
していた。というのは、内部1ac Alul断ハが存
Hしたからひあり、また隣接りるIac末端をもつpN
c7i片は適当な大きさ−Cあった。IacDNAの両
端近くを開裂りる旧nuもP想された大きさの断片を生
じた。203−bp lac断)1内に非月称的に所り
りる1lhal制限酵素により、ゾシスミ1へのrll
域内のIac断ハの方向を決定Cきた。Aベレータ−/
プロモーター域がrl18運伝fのhへ転写を進めるよ
うにこのflili片が方向づけられているか、又は1
″ンスミト内のIaclから1acZへの反時計回りに
あることがわかった。
から選び、いくつかの制限酵素反応をt)なうのレニ1
分な句のシーラスミドDNAを甲NI L /こ。ノ゛
ノスミl;’pNc71ac2はrcoRI 、 1I
ind[l及びBQIIての制限分析によ7)C,pN
C7より約200 bp大さいことがわか一〕だ。Al
ulでの消化は、lac断gr:あるこの挿入物と一致
していた。というのは、内部1ac Alul断ハが存
Hしたからひあり、また隣接りるIac末端をもつpN
c7i片は適当な大きさ−Cあった。IacDNAの両
端近くを開裂りる旧nuもP想された大きさの断片を生
じた。203−bp lac断)1内に非月称的に所り
りる1lhal制限酵素により、ゾシスミ1へのrll
域内のIac断ハの方向を決定Cきた。Aベレータ−/
プロモーター域がrl18運伝fのhへ転写を進めるよ
うにこのflili片が方向づけられているか、又は1
″ンスミト内のIaclから1acZへの反時計回りに
あることがわかった。
実施例3.14へのlac断片の転移
ントソン(HatLSOn)ら(1977年)は、■4
配列を含りする大腸菌プラスミドと14ゲノムとの間の
絹換えが”1:体内ひ起ることを報告した。pNc71
ac2のrllljlI!列十〇の組換えで・、プラス
ミドから“ノ?−シゲノムへのlac配列の転移が可能
となる。lac断ハは全読取り枠中の翻訳終了コドンを
含んぐいる(−j゛イクソンDickson、1915
年;)1ラボウ[arabaugh 、1978年)
。Hincll制限部位はrllBJ仏子の暗号化域内
にあるから、Iac挿入によつで絹換えノアF−シはr
llB−になる。通常致死的表現型である14の遺伝子
30(DNAリガーぜ)の突然変異が、大腸菌のある菌
株ではrll中の相補的な突然変異により抑圧できるこ
とが、既に示され(いる(ハ カー Beriler及
びロジンス4− にoz i nsk 11969年;
−1−ビス量アP Fbisuzaki及びキレンペル
の機作は解明されCいないが、Iac挿入物を得た[4
)1−ジを選択する容易な手段がこれによつ(Huれg
。プラスミド(1078[pNC71ac2])を含有
するアンバー・勺ブレツ勺−大腸菌菌株をr11+30
.。
配列を含りする大腸菌プラスミドと14ゲノムとの間の
絹換えが”1:体内ひ起ることを報告した。pNc71
ac2のrllljlI!列十〇の組換えで・、プラス
ミドから“ノ?−シゲノムへのlac配列の転移が可能
となる。lac断ハは全読取り枠中の翻訳終了コドンを
含んぐいる(−j゛イクソンDickson、1915
年;)1ラボウ[arabaugh 、1978年)
。Hincll制限部位はrllBJ仏子の暗号化域内
にあるから、Iac挿入によつで絹換えノアF−シはr
llB−になる。通常致死的表現型である14の遺伝子
30(DNAリガーぜ)の突然変異が、大腸菌のある菌
株ではrll中の相補的な突然変異により抑圧できるこ
とが、既に示され(いる(ハ カー Beriler及
びロジンス4− にoz i nsk 11969年;
−1−ビス量アP Fbisuzaki及びキレンペル
の機作は解明されCいないが、Iac挿入物を得た[4
)1−ジを選択する容易な手段がこれによつ(Huれg
。プラスミド(1078[pNC71ac2])を含有
するアンバー・勺ブレツ勺−大腸菌菌株をr11+30
.。
の14系統であるC104Bで感染させることによ−)
(転移と選択を一段階で行なった。感染のf係を大腸菌
BB株によって選択した。この菌株は、アンバー突然変
異を抑圧しないが、rll内の突然変異によ−)C項伝
子30の突然変異を抑圧できる(カラム及びバーカーB
arker 、1971年)。遍伝p30突然変安の救
出頻度(感染後の全ソI−ジのうら、非7ンハー抑圧菌
株で生育Cきたワラクシ−1ン)は1×10 ないし4
X10(第1表)の範囲にあり、これはプラスミド含有
野生型rll DNAをら′〕糸系統感染中につくられ
る子孫の頻度に比へ、10イ8から18イ8おおきい。
(転移と選択を一段階で行なった。感染のf係を大腸菌
BB株によって選択した。この菌株は、アンバー突然変
異を抑圧しないが、rll内の突然変異によ−)C項伝
子30の突然変異を抑圧できる(カラム及びバーカーB
arker 、1971年)。遍伝p30突然変安の救
出頻度(感染後の全ソI−ジのうら、非7ンハー抑圧菌
株で生育Cきたワラクシ−1ン)は1×10 ないし4
X10(第1表)の範囲にあり、これはプラスミド含有
野生型rll DNAをら′〕糸系統感染中につくられ
る子孫の頻度に比へ、10イ8から18イ8おおきい。
第1表
シラスミド含有大腸菌菌株へのC104B fし ノイ
ングの効率 爪Aれた一jうlミドを運ぶ大腸菌1078株に10の
乗数CC104Bを感染さ−けた。5分後、培養基を1
171])!(スタインハ グSteinberg及び
−1ド万一 Fdgar、1962年)C希釈し、30
分培養した。培養基を2時間後に溶菌させ、感染の子孫
をプレートに撒いた。プレー−jインクの効率は、全子
孫のうち、非アンバー抑圧菌株の大腸菌88株にブレー
トCきるものの富り、舎(大腸菌B、sul 上のブラ
ーり)Cある。
ングの効率 爪Aれた一jうlミドを運ぶ大腸菌1078株に10の
乗数CC104Bを感染さ−けた。5分後、培養基を1
171])!(スタインハ グSteinberg及び
−1ド万一 Fdgar、1962年)C希釈し、30
分培養した。培養基を2時間後に溶菌させ、感染の子孫
をプレートに撒いた。プレー−jインクの効率は、全子
孫のうち、非アンバー抑圧菌株の大腸菌88株にブレー
トCきるものの富り、舎(大腸菌B、sul 上のブラ
ーり)Cある。
す
1 2.4 3.5x10
2 4.9 9.0xlO−3
37,01,lX10−”
4 4.0 11.0X10
1ac挿入物を含むファージは極めて家憲である。[1
された1個のゾン−りからの)/7 シストツクの調製
中に、CI?63 (λ)上C−生育する能力によっC
確認される復帰突然変異体は約1×10 の頻瓜C件し
た。これらの復帰突然変異体の四つによってつくられる
蛋白質をゲル電気泳動で分析すると野生型から区別でき
ない分子優のrllB蛋白質を示した。従っ(、復帰突
然変異体はlac挿入物のはげ正確な枠内欠失によつ(
什り”る。
された1個のゾン−りからの)/7 シストツクの調製
中に、CI?63 (λ)上C−生育する能力によっC
確認される復帰突然変異体は約1×10 の頻瓜C件し
た。これらの復帰突然変異体の四つによってつくられる
蛋白質をゲル電気泳動で分析すると野生型から区別でき
ない分子優のrllB蛋白質を示した。従っ(、復帰突
然変異体はlac挿入物のはげ正確な枠内欠失によつ(
什り”る。
実施例4.+ac断片は14ゲノムの・部Cある。
rIIBHi nCI 1部位にお(ブる突然変異地図
作成か実際は203−bl)のIac DNA挿入のた
めであるという証拠は、制限分析によって提供された。
作成か実際は203−bl)のIac DNA挿入のた
めであるという証拠は、制限分析によって提供された。
自生型の■4[)HA 1lCH14CT−完全1.装
置WA 1 ル。II)IC[)NA t、LtlDP
−グルコースビロホスホリラ−ぜと、11)4CDNA
を破1M−1−る宿主ヌクレア−ピとを欠く大腸菌菌株
を感染さ已ることによつC得られる(レベル及びジョー
ショポウラス、1969年)。無修飾シ1〜シン含右1
4 DNAも得られるが、これには追加ノド シ眉仏子
の突然変異が必要である(スノーイダ−ら、 ’197
6年)。FcoRV及びraq lという2制限丁ント
ヌクレアーゼが、自生型14 DNAへ働きかりること
がわかった。更に追加2M素すなわら[cORI(ツノ
シラン及びニアリッヂ、1975年)及びXbalが、
IIHc 14 DNAへ作用しうる。EcoRlによ
っUHHCT4 DNAの完全な消化を得るには、多量
の酵素と長時間の消化が必IC−ある。修飾された塩基
をも含有するバクテリAノ?−シ5PDI DNA (
チミンがHHυで完全に置き代えられCいる)に関する
ωl究は、teoRI条件トに11;ツる同し消化パタ
ーンが、Ecolネ条件下にもっと少ない酵素で、より
短い時開に生ヂることを示しでいる(フレラグCreg
g及びスチコワートStewart 、 1978年)
、 EC0RI*条件下の88014 DNAの消化
は、特異性を失わずにこの反応速度の同じにうな増加を
示した。
置WA 1 ル。II)IC[)NA t、LtlDP
−グルコースビロホスホリラ−ぜと、11)4CDNA
を破1M−1−る宿主ヌクレア−ピとを欠く大腸菌菌株
を感染さ已ることによつC得られる(レベル及びジョー
ショポウラス、1969年)。無修飾シ1〜シン含右1
4 DNAも得られるが、これには追加ノド シ眉仏子
の突然変異が必要である(スノーイダ−ら、 ’197
6年)。FcoRV及びraq lという2制限丁ント
ヌクレアーゼが、自生型14 DNAへ働きかりること
がわかった。更に追加2M素すなわら[cORI(ツノ
シラン及びニアリッヂ、1975年)及びXbalが、
IIHc 14 DNAへ作用しうる。EcoRlによ
っUHHCT4 DNAの完全な消化を得るには、多量
の酵素と長時間の消化が必IC−ある。修飾された塩基
をも含有するバクテリAノ?−シ5PDI DNA (
チミンがHHυで完全に置き代えられCいる)に関する
ωl究は、teoRI条件トに11;ツる同し消化パタ
ーンが、Ecolネ条件下にもっと少ない酵素で、より
短い時開に生ヂることを示しでいる(フレラグCreg
g及びスチコワートStewart 、 1978年)
、 EC0RI*条件下の88014 DNAの消化
は、特異性を失わずにこの反応速度の同じにうな増加を
示した。
+1)fc 14 DNAを野生型及びlac挿入挿入
ノンがら一部、) (−)だ。これらのDNAをEco
、 RI*条件−トに消化さけると、野生型DNAの約
5.71 kbのバンドがlac倉右含有では5.6
kbへ転移しでいることを示している。rll 遺伝子
を含有スるEcoRL*バンドが、kb狛の変化を覆い
隠すような他のバンドから比較的自由なf9置に移動り
るのは偶然である。rllJ仏fを含有するEcott
l断片の大きさに対する最もよい4狂定稙は、かつ(約
4.4 kbであった(セルザ=−飾DNAを1阿るた
めに、rll遺イム了の隣接域に欠失を導入した。従っ
て、野生聖断ハの人ささは使用欠失の推定規模に基づく
ものCあっ〕ご。
ノンがら一部、) (−)だ。これらのDNAをEco
、 RI*条件−トに消化さけると、野生型DNAの約
5.71 kbのバンドがlac倉右含有では5.6
kbへ転移しでいることを示している。rll 遺伝子
を含有スるEcoRL*バンドが、kb狛の変化を覆い
隠すような他のバンドから比較的自由なf9置に移動り
るのは偶然である。rllJ仏fを含有するEcott
l断片の大きさに対する最もよい4狂定稙は、かつ(約
4.4 kbであった(セルザ=−飾DNAを1阿るた
めに、rll遺イム了の隣接域に欠失を導入した。従っ
て、野生聖断ハの人ささは使用欠失の推定規模に基づく
ものCあっ〕ご。
野生型及びIac挿入ノ1−シからの1)4CDNAを
制限エンドメクレアーゼTaq Iでも消化させた。こ
の場合も、lac含有DNAでハント規模の変化が明白
であった。野生型消化物からの月利は1520hpでの
ハントの一部として移動するが、14 rllBlac
2からの消化物中ひは1730 hpのハン1〜の・部
としζ移動しζ−いる。これらの人きさeel Hりる
際のH)−基準がIIHcよりもシl−シンを含有しく
いノごため、これらの規模はやや大きめと思われる。ぞ
の規模は予想値と一致しでイる。1ac203 DNA
を1111870の独M(7)tlincll開裂部位
(bp 543と54Aの間)に挿入した。後名は右端
から約20 bllのところにただ−・つのraqlム
2識配列を1)=i(いる(/すI〕゛νら、1978
年) 。H11870のダぐhにある1Iir+r1m
agは約400 blbら(ゼルザ−ら、1978年)
、 1.]Qlで切断されない。このため、挿入によ
っ(変史さカス、し名相A?1 スTan l肛詐t、
−+ zls /y / J−上、1つ八八1)1)を
倉イうりるはずである。使用のIac DNAは1aq
lCの開裂部イ☆をしたないから(メイぜルス、197
3年:、゛イクソン、1975年;)1ラホウ、197
8年)、挿入の結果203 bp増加づると予想Cきる
。これらの]′)のハク1〜が確かにrll及びIac
DNA 倉むことをM明りるために、別個のサザーン
(Souシhern[17!+1J−) 11種形成を
tjない、rll DNAのプローブとしCプラスミド
pNC7、Iac lli片の存在に対りるプローブと
してH13mp2により、このゲルのレーンをΔブシF
)シた。pNC7ブローブによる雑種形成のΔ1−ラジ
オグラムは、これらの二つのハントが、1111870
に相補的なりNAを含りする−・つのbのCあることを
承しくいる。同しゲルCプローブとしCH131Rp2
による和種形成のΔ−トラジΔグラムは、lac断ハが
実際に物理的にrll J包子へ挿入されたことを小し
くいる。
制限エンドメクレアーゼTaq Iでも消化させた。こ
の場合も、lac含有DNAでハント規模の変化が明白
であった。野生型消化物からの月利は1520hpでの
ハントの一部として移動するが、14 rllBlac
2からの消化物中ひは1730 hpのハン1〜の・部
としζ移動しζ−いる。これらの人きさeel Hりる
際のH)−基準がIIHcよりもシl−シンを含有しく
いノごため、これらの規模はやや大きめと思われる。ぞ
の規模は予想値と一致しでイる。1ac203 DNA
を1111870の独M(7)tlincll開裂部位
(bp 543と54Aの間)に挿入した。後名は右端
から約20 bllのところにただ−・つのraqlム
2識配列を1)=i(いる(/すI〕゛νら、1978
年) 。H11870のダぐhにある1Iir+r1m
agは約400 blbら(ゼルザ−ら、1978年)
、 1.]Qlで切断されない。このため、挿入によ
っ(変史さカス、し名相A?1 スTan l肛詐t、
−+ zls /y / J−上、1つ八八1)1)を
倉イうりるはずである。使用のIac DNAは1aq
lCの開裂部イ☆をしたないから(メイぜルス、197
3年:、゛イクソン、1975年;)1ラホウ、197
8年)、挿入の結果203 bp増加づると予想Cきる
。これらの]′)のハク1〜が確かにrll及びIac
DNA 倉むことをM明りるために、別個のサザーン
(Souシhern[17!+1J−) 11種形成を
tjない、rll DNAのプローブとしCプラスミド
pNC7、Iac lli片の存在に対りるプローブと
してH13mp2により、このゲルのレーンをΔブシF
)シた。pNC7ブローブによる雑種形成のΔ1−ラジ
オグラムは、これらの二つのハントが、1111870
に相補的なりNAを含りする−・つのbのCあることを
承しくいる。同しゲルCプローブとしCH131Rp2
による和種形成のΔ−トラジΔグラムは、lac断ハが
実際に物理的にrll J包子へ挿入されたことを小し
くいる。
参考文献
ハックマン・クイ(BackIIan、 K、 ) 、
ブタシコネ−[l> (Ptashne、 H,)及び
ギルバート・ダブリ−コーラ(Gilbert、 W
) : ハクjすAフ?−シλ(7)clJUSA 7
3巻(1976年) 487−560員。
ブタシコネ−[l> (Ptashne、 H,)及び
ギルバート・ダブリ−コーラ(Gilbert、 W
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バーネット−Xル(Barnett、 1.、 ) 、
ゾレナ ・ニス(Brenner、 S、 ) 、クリ
ック祷[)Φ十ツチ争シー(Crick、 r HC,
) 、シ=lルンン・ノア ル・シー (Shulma
n、 R,G、 )及びワツツ・1〜ヒシeノ7−ル・
シ1イ(Watrs−1obin、 R,J、) :ハ
タテリAノiノ−シ[4のrl IBシストロンの最初
の部分の)1イズ−・ジットその他の突然変異体。Pj
Jj 1rans RoyalSoc London、
5eries B 252(1967年) 487−
56<1貞へ”/”f −・−[ス(Benzer、
s、) : ’fi伝r微細構迄のトボグラノイ。Pr
oc、 Natl、 Acad Sci ll5A45
巻(19419年) 1607−1620負。
ゾレナ ・ニス(Brenner、 S、 ) 、クリ
ック祷[)Φ十ツチ争シー(Crick、 r HC,
) 、シ=lルンン・ノア ル・シー (Shulma
n、 R,G、 )及びワツツ・1〜ヒシeノ7−ル・
シ1イ(Watrs−1obin、 R,J、) :ハ
タテリAノiノ−シ[4のrl IBシストロンの最初
の部分の)1イズ−・ジットその他の突然変異体。Pj
Jj 1rans RoyalSoc London、
5eries B 252(1967年) 487−
56<1貞へ”/”f −・−[ス(Benzer、
s、) : ’fi伝r微細構迄のトボグラノイ。Pr
oc、 Natl、 Acad Sci ll5A45
巻(19419年) 1607−1620負。
ヘンブー・ニス及びチャンゾ・1ス・ビ(Champe
、 s、 p、 ) : J(i暗号の)−シレンスか
らUンスへの変化。Proc、 Na口 Acad、
Sci ll5A A8(1000年> 111411
21負。
、 s、 p、 ) : J(i暗号の)−シレンスか
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Sci ll5A A8(1000年> 111411
21負。
バーカー・エッチ(Berger、 If、)及びコシ
ンスキー、−−二r、イ・ダブリ−1つ(Kozins
ki、 A W ) : rllA及びrllB突然変
異によるr4Dリカ−ビ突然変巽の抑11 U Pro
c Natl Acad Sci、USA 64巻 (
1969年)897−90/l 白。
ンスキー、−−二r、イ・ダブリ−1つ(Kozins
ki、 A W ) : rllA及びrllB突然変
異によるr4Dリカ−ビ突然変巽の抑11 U Pro
c Natl Acad Sci、USA 64巻 (
1969年)897−90/l 白。
1−I7メノ・土メ・シ]−イ(Casna、 N、、
1.)及びシrr I−Yイ ・Jイ(Shub、 D
、A、)ニー膜化されたf)NAり目−ニング・ヒヒク
ルとしくのハクテリAノ、7−シI4゜Gene 18
巻(1982年) 297−30734゜」−1−ン−
J: 、7− ’Lメ(Cohen、 S、N、 )
、ヂpン−Tイ◆シーや”)イ(Chang、 A、C
,Y、)及びス−・Pr0CNat1. Acad、
Sci、 IIs/I 69巻(1972年)2110
−211/l貞。
1.)及びシrr I−Yイ ・Jイ(Shub、 D
、A、)ニー膜化されたf)NAり目−ニング・ヒヒク
ルとしくのハクテリAノ、7−シI4゜Gene 18
巻(1982年) 297−30734゜」−1−ン−
J: 、7− ’Lメ(Cohen、 S、N、 )
、ヂpン−Tイ◆シーや”)イ(Chang、 A、C
,Y、)及びス−・Pr0CNat1. Acad、
Sci、 IIs/I 69巻(1972年)2110
−211/l貞。
フレラグ・シ1イ・[ムrcreoo、 J、H,)及
びスf、「ノ ト拳シー・7−ル(Stewart、
C,R,−) :枯f、゛1菌ノ17 シ5POIから
のDNAのFcolllによる開裂V+rology
85巻(1978年) 601−605It。
びスf、「ノ ト拳シー・7−ル(Stewart、
C,R,−) :枯f、゛1菌ノ17 シ5POIから
のDNAのFcolllによる開裂V+rology
85巻(1978年) 601−605It。
1’イクソン・7 ル・シ (DickSon、RC)
。
。
1イヘルソン壷シIイ(Abelson、 J、) 、
ハーンズ・ダゾソーノウ・土ム(Barnes、 W、
H,)及びレズニ]ノ・ダブリ−1つ・シ (Rezn
ikoH,W、S、) : M伝的調節−Iac調節域
。5cience 187(1975年)27−35
頁。
ハーンズ・ダゾソーノウ・土ム(Barnes、 W、
H,)及びレズニ]ノ・ダブリ−1つ・シ (Rezn
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頁。
エビスザキφクイ(Ebisuzaki、 K、)及び
キvrンヘルφ二[ル(Campbell、 L、 )
: ハクy ’Jオノ1 シ14の遺伝的組換えにお
(プるリカーぜの役割。
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(プるリカーぜの役割。
Virology 38巻(1969年) 701−7
03M。
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ノ1ラボウ・ピー・シ1イ(larabaugh、 P
、J ):1acl遺伝子の配列。NajUr6274
巻(1978年) 765−769員。
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カブラン・ディー・土イ(にapl;In、 D、A、
)及び−ノアリップ−j’イ−−−ビ (Neirli
ch、 D、P、):制限■ントヌクレアーゼEcoR
1による非グリロシル化ハク−jすΔノI−シ■4デA
+シリホ核酸の開裂。
)及び−ノアリップ−j’イ−−−ビ (Neirli
ch、 D、P、):制限■ントヌクレアーゼEcoR
1による非グリロシル化ハク−jすΔノI−シ■4デA
+シリホ核酸の開裂。
J Biol Chem、250 巻<1975年)
2395−23<17白。
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カラム11 シ、’lイ・iイー(にaram9.I
D ) :ボリメクレΔチト・リカーl1(31仏了3
0)なしのノ?シ[4r l ]突然変異体によるDN
A l製、Bioche+nBiophys、Res、
Commun、 37巻(4969年) 416−4
22負。
D ) :ボリメクレΔチト・リカーl1(31仏了3
0)なしのノ?シ[4r l ]突然変異体によるDN
A l製、Bioche+nBiophys、Res、
Commun、 37巻(4969年) 416−4
22負。
カラム・シ1イ・ディー及びハ カ ・ビー“遺伝f3
0(デAキシリボ核酸すカーゼ)及びrllll遺伝穴
いたハクテリA7?−シ14突然変異体の性状。J V
irol、 7巻(1971年) 260−266員。
0(デAキシリボ核酸すカーゼ)及びrllll遺伝穴
いたハクテリA7?−シ14突然変異体の性状。J V
irol、 7巻(1971年) 260−266員。
/Jッツ・1ル(KaLz、 L、)、キンゲスヘリ串
ディー ・y イー(Kingsbury、 D 1.
)及びヘリンスキー・1゛イー・アール(llelin
ski、 D、R,):環式7デノシン・燐酸による、
−1ラスミド・i″Δ−tシリ小核酸複製の刺激と、シ
ラスミド・フ゛Aキシリ小核酸−伽白買複合陣のカタ小
ノイ1〜抑制。J、 Bact−eriol、114巻
(1973年) 577−591 負。
ディー ・y イー(Kingsbury、 D 1.
)及びヘリンスキー・1゛イー・アール(llelin
ski、 D、R,):環式7デノシン・燐酸による、
−1ラスミド・i″Δ−tシリ小核酸複製の刺激と、シ
ラスミド・フ゛Aキシリ小核酸−伽白買複合陣のカタ小
ノイ1〜抑制。J、 Bact−eriol、114巻
(1973年) 577−591 負。
メイビル7−エヌーIム(Haizels、 N、H)
:大腸菌(1v5ブローし=ター突然変異株から転写
されたラタトース・メッセンシ鵞・−・リホ核酸のメク
レAfト配列。Proc、 Natl、 Ac、ad、
Sci、 USA 70巻<1973年) 3585
−3589貞。
:大腸菌(1v5ブローし=ター突然変異株から転写
されたラタトース・メッセンシ鵞・−・リホ核酸のメク
レAfト配列。Proc、 Natl、 Ac、ad、
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7トソン11jイー(HattSOn、1)、ヴ17ン
φハウトシー(Van Houwe、G、 ) 、ポル
・エイ(Bo I I@。
φハウトシー(Van Houwe、G、 ) 、ポル
・エイ(Bo I I@。
A、)、t?ルザー轡シー(Selzer、 G、)及
び土ブ′スティンφノノール(lpsLein、 R,
) : ハクjすAフッ!−シIA DNAのクローン
化された断片の遺伝的同定及び初期の14運伝子を含有
(るいり′)かのクローンによる相補性。Mo1. G
en、、Ge、net、 154巻(1977年)31
9−326頁。
び土ブ′スティンφノノール(lpsLein、 R,
) : ハクjすAフッ!−シIA DNAのクローン
化された断片の遺伝的同定及び初期の14運伝子を含有
(るいり′)かのクローンによる相補性。Mo1. G
en、、Ge、net、 154巻(1977年)31
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ポリスキー・ヒ−(Polisky、 B ) 、グリ
ーン・ビー(Greene、 P、)、カーフイン・j
゛イ・イー(Garrin、 D、E、)、−?ツカー
シー・ヒ ・シ1イ(HcCar[hy、 B、J、)
、グツトマン−、Iツノ−rム(Goodman、 I
l、H,)及びボイ%t−−1ツJ−ダゾリ−2つ(B
oyer、 II W ) : 1coR1制限1ント
メクレノ!−ヒニよル基質認識の特巽性。Proc、
Natl、 AcadSci、1ISA 72巻(19
75年> 3310−331A 負。
ーン・ビー(Greene、 P、)、カーフイン・j
゛イ・イー(Garrin、 D、E、)、−?ツカー
シー・ヒ ・シ1イ(HcCar[hy、 B、J、)
、グツトマン−、Iツノ−rム(Goodman、 I
l、H,)及びボイ%t−−1ツJ−ダゾリ−2つ(B
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メクレノ!−ヒニよル基質認識の特巽性。Proc、
Natl、 AcadSci、1ISA 72巻(19
75年> 3310−331A 負。
プリブノウ・ディー (Pribnow、 D、) 、
シカートソン・ディー・シー(Sigurdson、
D C)、1゛−ルトφ」−ル(Gold、 L、)、
シンカーφヒ−・1ス(Singer、 B S、)、
ナポリ・シー(NaI)Oli、 C,)、fロシウス
・シコーイ(Brosius、 J、) 、ダル・エイ
・シ]−イ(Dull、 1.J、)及びノラー ・1
ツヂ・1ノ標識の位置。J、 Mo1. Biol、
+48巻(1981年)337−376CI。
シカートソン・ディー・シー(Sigurdson、
D C)、1゛−ルトφ」−ル(Gold、 L、)、
シンカーφヒ−・1ス(Singer、 B S、)、
ナポリ・シー(NaI)Oli、 C,)、fロシウス
・シコーイ(Brosius、 J、) 、ダル・エイ
・シ]−イ(Dull、 1.J、)及びノラー ・1
ツヂ・1ノ標識の位置。J、 Mo1. Biol、
+48巻(1981年)337−376CI。
レヘル・−[ツ′f−(Revel、 H,)及びショ
ーショポウーノス・シ ・ビー(Georgopoul
os、 CP、 ) :ブロノI−シP1による非グル
コシル化1−偶数ハクテリA −/ 7−シの制限。V
irolo3y、3’l (1’16’l) l−17
゜エルす−・シー(Selzer、 G、)、ポル・二
[イ、クリッシト1ツチ(Krisch、 If、)及
び1ニブスjイン・ノ′ ル(l psLein、 1
m ) :ハクiすΔノ?−シ14の1゛11道1ムf
を含有りる組換えシラスミドの構築と竹状。Ho1ec
、 Gen、 cenet、159巻(1978年)3
01−309貞。
ーショポウーノス・シ ・ビー(Georgopoul
os、 CP、 ) :ブロノI−シP1による非グル
コシル化1−偶数ハクテリA −/ 7−シの制限。V
irolo3y、3’l (1’16’l) l−17
゜エルす−・シー(Selzer、 G、)、ポル・二
[イ、クリッシト1ツチ(Krisch、 If、)及
び1ニブスjイン・ノ′ ル(l psLein、 1
m ) :ハクiすΔノ?−シ14の1゛11道1ムf
を含有りる組換えシラスミドの構築と竹状。Ho1ec
、 Gen、 cenet、159巻(1978年)3
01−309貞。
シyrブー テ゛イー−−二r−イ(Shub、 D、
A、)及びSiセス−J −Il−ジIイ(Casna
、 N J、) ニー膜化され/jDN八クロへニング
・ベクターとしくのハクフリAノ17−シI4゜Ame
r、 Soc、 Hicrobiol 年会議抄録(1
981年)113.114員。
A、)及びSiセス−J −Il−ジIイ(Casna
、 N J、) ニー膜化され/jDN八クロへニング
・ベクターとしくのハクフリAノ17−シI4゜Ame
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981年)113.114員。
リイ[ン・1ル− j゛イーSimon、 I 、 D
、 )ら:大腸菌にクローン化されたハクjすAノ?−
シ14着仏fによる蛋白質の寛定化、、Proc、 N
atl、 Aca’dSci ll5A 80巻(19
83年) 2059−2062貞−スナイダー・エル(
Snyder、 1.)、ゴール1〜φエル(Gold
、L、)及、びツノツタ−φイー (Kutter、
E ) :遺伝子生産物がシトシン含有T4 DNAへ
の遅れた負の転写を防いでいるバクデリオファーシ14
眉伝子。
、 )ら:大腸菌にクローン化されたハクjすAノ?−
シ14着仏fによる蛋白質の寛定化、、Proc、 N
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Snyder、 1.)、ゴール1〜φエル(Gold
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E ) :遺伝子生産物がシトシン含有T4 DNAへ
の遅れた負の転写を防いでいるバクデリオファーシ14
眉伝子。
Proc、Natl、 Acad Sci、USA 7
3巻<1976年) 3098−3102頁。
3巻<1976年) 3098−3102頁。
1ノザーン・イー−エム(SOUllern、 LM
) : /7’ ルミ気泳動によって弁頭されたDNA
断片の14異的配列の検出。J、 Hot、 Biol
98巻< 1975年> 503−511頁。
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断片の14異的配列の検出。J、 Hot、 Biol
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スタインバーブ・シー・エム(S[cinI)crg、
CH)及び1トカー・アール−ニス山1gar、 R
S ) :ハクテリオファージの逓伝的組換えにつぃC
最近の1理論の批評的試験。aana【1csay巻(
1962(1)187−208頁。
CH)及び1トカー・アール−ニス山1gar、 R
S ) :ハクテリオファージの逓伝的組換えにつぃC
最近の1理論の批評的試験。aana【1csay巻(
1962(1)187−208頁。
リトク’) 7− シー(Sutclirro、 G、
) : DNA配列から導かれたpBR322制限地
図。4361メクレAブ1へ対の長さまで・の正確なり
NAJ、QII、i−/−ノJ −。NuclAcid
s Res 5巻(1978年) 2721−2728
、L’l。
) : DNA配列から導かれたpBR322制限地
図。4361メクレAブ1へ対の長さまで・の正確なり
NAJ、QII、i−/−ノJ −。NuclAcid
s Res 5巻(1978年) 2721−2728
、L’l。
第1頁の続き
@Int、CI、’ 識別記号 庁内整理番号0発 明
者 ナンシー ジエー 力 アメリカ合衆国スナ オ
ルランド アベ 12203 ニューヨーク州 アルバニーニュ−25
者 ナンシー ジエー 力 アメリカ合衆国スナ オ
ルランド アベ 12203 ニューヨーク州 アルバニーニュ−25
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、クローン1ヒされた遺伝子を経由して大腸菌(r
coli)によ7)で表現される有用な蛋白質が、大腸
菌内Cつくられるプロテアーゼに感受性がある場合に、
このような蛋白質を安定化さゼるための以トの段階から
なるI)法。 fa) T 4n’ivi、系ハクテ’) A 7 p
−シカラ(1)DNA fli片とイ断飾された大腸
菌プラスミドのゲノムとからなる一1メジ型シラスミド
を構築り°る。 (1))このキメラ型プラスミドの1偶数系ハクテリΔ
ノ、7 シからのDNA断ハヘ外来DNA丸生体外ノラ
スミトとの間で生体内組換えを(うなう。 (11)この二Φキメラ型プラスミドを宿した■偶数2
、[偶数系バクテリオファージからのDNA断片を大腸
菌内で長足に増殖させる、特許′[請求の範か、又は1
道伝子の一部である。狛へ11請求の範囲第2項による
62人。 4、遺伝子がハクテリΔ)1−ジI4のrll ’4仏
子群である、特許請求の範囲第3項による方法。 5、T偶数系バタテリオフ?−ジがバクテリAノ1−シ
14である特許請求の範囲第1項の方法。 6、修飾された大腸菌ブラスミ1〜がpBR322(+
123r十) ’rある、特許請求の範囲第1項による
方法。 7、外来DNA挿入物が有用なボリベブヂ1−又は蛋白
質を暗号化する貞核還伝了(−ある、Ill K’を請
求の範囲第1 ifiによる方法。 8、大腸菌が大腸菌1078(C600r″″m”5u
pf441hr−1eu”−thi−)株又は大腸菌(
C6005upF44)株Cある特許請求の範囲第1項
による方法。 9、−:fyスミトI)NC7’C’、(1) ’I
7、−7. ミl;’ pRR322322の甲−・の
旧ndl1部1iへ挿入されたバクプリAノ1 シr4
(111+870)のrl IJ伝子の873−bp
Hind■断ハをa右し、(2)長さが約3.67 k
bであり、(3)アンピシリン耐性をうえるもの。 10 グラスミドpNc71ac2 テあ)?、(1)
ブ=/スミトp8R322(lI23r”)ゲノムの一
部を含有し、この部分がpBl?322の彫・の1Ii
ndllJ部位へ挿入されたハクjす71− ’、7
/−ジr4(111+8701のrH遺伝子の873−
bp 1lind m断ハを含有し、(2)アンピシリ
ン耐性を5え、かつ(3)il能的βカラクトシダ ヒ
ji仏了をもつ宿主細胞をβカラクトシドの構成的生産
菌に覆るもの。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US51892683A | 1983-08-01 | 1983-08-01 | |
US518926 | 1983-08-01 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6058078A true JPS6058078A (ja) | 1985-04-04 |
Family
ID=24066061
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59159453A Pending JPS6058078A (ja) | 1983-08-01 | 1984-07-31 | 一般化されたDNAクロ−ニングビヒクルSUNY 1−JapanとしてのR−218,バクテリオフア−ジT4 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0133044B1 (ja) |
JP (1) | JPS6058078A (ja) |
DE (1) | DE3483549D1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2988951B2 (ja) * | 1990-02-09 | 1999-12-13 | ヤマサ醤油株式会社 | 大腸菌における異種蛋白質の製造法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1207253A (en) * | 1981-08-17 | 1986-07-08 | Lee D. Simon | T4 dna fragment as a stabilizer for proteins expressed by cloned dna |
-
1984
- 1984-07-30 EP EP84305169A patent/EP0133044B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-30 DE DE8484305169T patent/DE3483549D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-31 JP JP59159453A patent/JPS6058078A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0133044B1 (en) | 1990-11-07 |
DE3483549D1 (de) | 1990-12-13 |
EP0133044A1 (en) | 1985-02-13 |
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