JPS60501540A - 細胞外マトリクスの体移植片並びに該移植片の製造及び使用のための手段及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この明細書に記載される発明はナショナルインスティテユートオブヘルス（Ｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）の許可のもとに行わ れた。

関連する出願 この出願は１９８３年６月１０日に出願された米国特許出願第５０３，２０３号 の一部継続出願である。

発明の背景 多くの種類の体移植片（ｂｏｄｙ　ｉｍｐｌａｎｔ）、例えば血管代替物、皮膚 被膜及び被覆、並びにその他のものが医療的使用のために知られている。移植材 料は合成材料でもよく、又は移植される種と同一種もしくは異る種からの体組織 でもよい。体組織及び構造体が移植される場合、それらを供与体から新鮮な状態 で使用することができるが、多くの場合、後で使用するために移植組織を貯蔵す るだめの幾つかの手段を有することが好ましい。

へその緒が緩衝液中で貯蔵しそしてグルタルアルデヒドで固定した後に血管移植 片として使用するために示唆されている。牛の頚動脈が、後で移植するだめのコ ラーゲン性材料を形成するためにファイシン（ｆｉｃｉｎ）　で処理されている 。他の場合、移植されるべき架橋された体材料から脂質が抽出されている。

米国特許第４，３２３，３５８号は、まずグルタルアルデヒドで処理された体移 植材料のドデシル硫酸ナトリウム処理の使用を記載している。この処理は架橋後 にのみ行われ、そして移植後の鉱化作用（ｍｉｎｅｒａｌ　１−ｚａｔｉｏｎ　 ）を阻害する。これらの公知の方法はそれぞれがなんらかの利点を有するとして も、すべての受領のために適当な、全体として許容されるそして再現性のある血 管移植片をもたらさない。組織培養における補完物及び補助物としての生物マト リクスの使用が、米国特許第４，３５２，８８７号を含む多くのものに示唆され ている。コラーゲンを多く含有する材料を残しながら細胞膜、核酸、脂質及び細 胞質成分を除去するだめの洗剤処理を含む一連の段階による体構造物の処理後の 組織培養のために生物マトリクス繊維が使用される。科学的研究のために適当な 細胞外マトリクスを得るために、種々の洗剤段階による体構造全体の処理が示唆 されている。この主題についての報文には次のものが含まれる二に、ブレンデル 及びＥ、メーザン“血管基礎膜：洗剤の使用によシ分離された材料の調製及び性 質″セレブラルミクロパスクラーチュアー（Ｔｈｅ　Ｃｅｒｅｂｒａｌ　Ｍｉｃ ｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ　）　。

１９８Ｃ１，８９−１０３頁；　Ｅ、Ｃ，アールンン、Ｋ、ブレンデル、Ｊ、Ｊ 、ヘーレ及びＥ、メーザン゛′腎糸球体及び３ 細管からの分離された基礎膜並びに脳及び網膜ミクロベッセルの超構造的及び生 化学的分析″、ジャーナルオブウルトラストラクチュアーリザーチ（Ｊｏｕｒｎ ａｌｏｆ　Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、６２．２６− ５３（１９７８）；Ｒ，Ｃ，ドハメル、Ｅ、メーザン、Ｋ、ブレンデル、″ウシ 脳及び腎毛細血管基礎膜及び分別抽出物の電子顕微鏡的特徴付けパ、ビプリオテ カアナトミカ（Ｂｉｂｌｉｏ−ｔｈｅｃａ　Ａｎａｔｏｍｉ　ｃａ　）、Ａ　２ ０　、１３４−１３７頁；Ｅ、メーザン、Ｋ、ブレンデル、Ｊ、Ｊ、ヘーレ及び Ｅ、Ｃ，カールソン゛超構造的及び化学的に純粋な基礎膜の超音波を用いない分 離のだめの鋭敏な方法″、バイオロノーアンドチェミストリーオプベースメント メンブレン（Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｂａｓｅｍ ｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）　１９７８　。

１、７−３０頁；Ｅ、メーザン、Ｒ，Ｂ、ナーグル、Ｐ、ジョンソン、Ｃ，ワグ ナ−１Ｌホワイト及びに、ブレンデル、゛細胞不含の及び組織構造的に無傷の基 礎膜の構造的及び機能的性質″、フロンテアズオブマトｌ）クスパイオロジー（ Ｆｒｏｕｔｉｅｒｓ　ｏｆ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ　７　。

１０　］−−１，１，９頁（１９７９）；Ｅ、メーザン、Ｊ、Ｔ、へ、−し及び に、ブレンデル、“幾つかの組織から組織学的及び化学的に純粋な基礎膜を分離 するだめの簡単で鋭敏で非破壊的な方法”、ライフサイエンス（Ｌｉｆｅ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ）、Ｖｏｌ　１７．１７２１−１７３２（１９７５）；に、ブレン デル、Ｅ、メーザン及びＲ，Ｂ、ナーグル“細胞４　待人昭ＧＯ−５０１５４０ （３） 不含かん流腎臓：基礎膜透過性モデル”、バイオロジーアンドケミストリーオプ ベースメントメンブランス（Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏ ｆ　Ｂａｓｅｍｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、１７７−１９３頁（１９７８） ；Ｒ，クツタン、Ｒ，Ｄ、メバル、Ｒ，Ｃ，ドハメル、１．Ｇ、シベス、Ｅ、メ ーザン及びに、ブレンデル、“胞状細胞外マトリクス及び導入された基礎膜の調 製及び組成″゛、ラング（Ｌｕｎｇ）（１９８１）１５９：３３３−３４５；　 並びにＲ，Ｃ，ドハメル、Ｅ、メーｆン及びに、ブレンデル、ゞウシ腎基礎膜か らのポリペプチドの２集団の選択的可溶化″、エクスプアイリザーテ（Ｅｘｐ、 　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、）　（１９８３）　３６．２５７−’２６７゜従来技術は、 コラーゲンの含量が多くそして広範囲の機能を有する広範囲の特定の生体部位に おいて体修復及び適合性をもたらす細胞不含細胞外マドＩＪクスに形成するため に処理された体移植片の使用によシ得られる実質的な利点を認識してぃなかった 。

発明の概要 この発明の目的は、細胞膜、核酸、脂質、及び細胞質成分が除去された細胞外で トリクスの形で主成分としてコラーゲンを有する体由来全構造体を含んで成る無 菌の体移植片を提供することである。

この発明の目的は、生体由来の、体構造を置き控えそして修復することができ、 そして体に対して抗原的でない新規な体移植片を提供することである。

この発明の他の目的は、選択された体構造を修復しそして置き換えるために他の 体に移植することができるように体組織を処理するだめの改良された方法を提供 することである。

この発明の前記以外の目的は、体から採取された構造体から細胞外マトリクスを 形成するための改良された方法を提供すること、及び体中でこれらのマトリクス 材料を使用する方法を提供することである。

この発明の方法は、細胞外マトリクス形の構造体を得るために変性洗剤によ多処 理された体組織由来体移植片を形成することを広く含む。

細胞膜、核酸、脂質及び細胞質成分を除去しそして主成分としてコラーケ゛ンを 有する細胞外マトリクスを形成するために体組織を処理し、そして体移植片とし て使用するために適する体組織を製造するための好ましい方法においては、細胞 外マトリクスの変性を回避しながら細胞膜を除去し、しがし核膜を除去しないよ うに第１の非変性洗剤が使用される。

次に、第２の強力な変性洗剤を用いて核膜を溶解し、その後で、体移植片として 使用するために組織を無菌形に保持しながら両洗剤を除去する。好ましくは、第 １の洗剤はプロテアーゼ阻害剤と共に使用され、そして添加されたＤＮアーゼを 有していてもよく有していなくてもよい。すなわち、体組織の第１浸漬は細胞膜 を除去しそして脂質を破壊するが、細胞中に存在するプロテアーゼが存在するコ ラーゲンを消化し又は破壊することを許容しない。天然ＤＮアーゼ又は添加され たＤＮアーゼによってＤＮＡが部分的に可溶化されそして部分的に除去されても よい。

第２段階において、好ましくは第１の洗剤を洗浄除去した後に、変性洗剤を用い て残留蛋白質をほぐしそしてそれらを可溶、化し、そして又核膜を除去する。非 変性洗剤による第１浸漬の使用によ、９　ＤＮＡの部分的加水分解及び組織材料 からの部分的除去が可能となシ、その結果非常に粘稠なりＮＡが第２の洗剤の作 用を妨害することがない。非常に粘稠なりＮＡは第２の洗剤段階における完全な 除去に先立って変性される。

次の段階において、洗剤を好ましくは十分な洗浄によって除去する。この洗浄は 室温において数時間又は、数日間行うことができる。

第３段階において、形成された細胞外マトリクスをエチレンオキシド又は照射の ような公知の方法によシ殺菌し、そして次の使用のために無菌的に保持すること ができる。

この発明に従って処理された頚動脈管のごとき全構造体は、次の使用のために凍 結乾燥することができ、又は常用の条件下で液体基剤中に無菌的に保持７ することができる。ある場合には、組織構造体について知られているように、グ ルタルアルデヒド処理又は他の架橋処理を用いることができる。このような架橋 は幾つかの移植片において好ましいであろう。

体移植片が、これらが代替し又は修復しつつある組織と生物学的に関連する組織 構造（ｈｉｓｔｏａｒｃｈｉ　ｔｅｃｔｕｒｅ）を維持することができることが この発明の特徴である。体移植片は、強さ、レジリエンス、密度、不溶性及び透 過性のごとき物理的性質を維持する。生物学的に関連ある空間的配置を有する物 理的形状において、細胞外マトリクスの一次構造は、新細胞の制御された内側へ の増殖のために重要な幾つかのコラーゲン及び蛋白質と共に維持される。移植片 及び他の組織は、体に再移植された場合に再細胞充実のだめの適切な導管として 機能することができ、そして再細胞充実は生物学的に関連ある態様で生じ、移植 片及び他の組織の自然の物理的性質の多くを維持する移植片が得られる。組織移 植において使用する場合、移植片は、非常に小さい直径（１００マイクロメータ ー未満）におけるほか、流血と血栓形成性の強い相互作用を示さない。

この発明の体組織片は細胞不含細胞外マトリクスであり、このマトリクスは強さ 及び弾性に関する物理的性質を保持しているもとの組織のかなりの部分を含み、 そして主としてコラーゲンであるが、さらにグリコサミノグリカン、並びに基礎 膜複合体、ラミニン及びフィブロネクチンのごときコラーケ゛ンと密接に関連す る蛋白質も含む。骨以外の体組織、そして特に血管及び靭帯から形成されるこの 発明の無細胞細胞外マトリクスにおいて、エラスチンがコラーゲンと共に主たる 成分であるが、通常はコラーゲンよりは幾分少ない。これは組織のタイプによシ 変シ、そして靭帯のごとき幾つかの組織においてはコラーゲンよシエラヌチンが 多い。この明細書において使用する場合、細胞外マトリクスは、少なくとも１つ の洗剤によシ抽出されることによって形成された、この・ぐラグラフにおいて上 記したよう々材料をブタ、ウシ、イヌ、ウマ等のごとき動物及びヒトからの天然 の体組織を、この発明の体移植片を形成するだめの出発物質として使用すること ができる。

実際にはヒトのための移植片を取扱う場合には出発材料を得るだめの種は他の哨 乳動物であるが、出発材料用として、移植されるものと同一の種を使用する場合 に最小の抗原性がしばしば得られる。出発組織は、その材料が移植されようとし ている組織と同一であることが好ましい。例えば、他の体からのこの発明に従っ て処理された血管弁材料により血管弁を置き換えることができる。動脈及び静脈 を置き換えるために動脈及び静脈を使用することができる、等である。骨及び歯 を置き換えるために骨及び歯を使用することができ、そして皮膚を置き換えるた めに皮膚を使用することができる。しかしながら、多くの場合、例えば皮膚移植 の場合、種々の高強度組織材料、例えば火傷等の被覆のために皮膚移植片として 使用することができる上膜及び硬膜を使用することができる。

すべての場合に、体移植片は、剖検又は屠殺の際に得られる体組織から、防腐剤 、タンニン剤又は有害な酵素処理による前固定を用いないで形成される。

好ましくは、処理されるべき組織は新鮮な状態で得られ、そしてこの発明の方法 に従ってすぐに処理される。

基本的には、酵素、固定剤、蛋白質変性剤、架橋剤、殺菌剤等による処理によっ てあらかじめ変性されていない組織から細胞成分を除去するために洗剤を用いる 。組織を洗剤で処理した後、洗剤残渣を除去し、無菌的に維持することができる 殺菌された移植片を得るだめ、及びある場合には、移植片に改良された物理的性 質を加えるために、例えばある種の組織タイプにおいて増加した強さを得るため に架橋を行うために、追加の段階が行われる。

体移植は４つの一般的なタイプに属し、これには血管補填、例えば頚動脈管置換 、及び体における一般的静脈及び動脈置換、心臓弁及び・Ｑウチ、火傷の被覆及 びドレッシング、並びに歯及び骨移植が含まれる。好ましい体移植片には、ヒト における移植のだめの、体外移植されたヒトの動脈からの血管補填及びヒトのへ その緒：ヒトにおける移植のための、霊長類、イヌ及び他の動物からの動脈管及 び静脈管；ヒトにおける移植のだめの、体外移植されたヒト静脈管からの弁を伴 う静脈補填完全体、又はヒトにおける移植のだめの動物静脈管からの弁を伴う静 脈補填完全体が含まれる。心臓弁はヒトにおける移植のためにヒトの剖検又は供 与組織から得ることができ、又は入手源はヒトにおける移植のために屠殺場での 動物組織であってもよい。ヒト剖検供与組織からの上膜、上膜のう、硬膜、網、 腸間膜及び結膜を外科的再構成において使用することができる。ヒト剖検及び動 物組織からの骨片、軟骨及び靭帯を外科的再構成において使用することができる 。歯移植片を得、処理し、そしてヒト歯槽に再移植して補てつを得ることができ る。動物由来の皮膚又は消化管を火傷の被覆のために使用することができる。細 胞外マドｌ）クスに富む新たに体外移植された組織、例えば動脈管、静脈管、へ その緒、皮膚、骨、歯、軟骨、腸壁、靭帯等が使用のために好ましい。他の体移 植片がこの発明に従って形成され得る。使用されるもとの体組織及び構造体は、 要求される非免疫原性、非血栓形成性、及び指示される再細胞化のために好捷し い表面特性を有する材料を得るためにこの発明の洗剤によって処理することがで きるものである。筋肉組織は使用のために好ましくない。

好ましい洗剤処理法に従えば、摘出された生組織は好捷しくけ非変性洗剤、例え ばトリトンｘ−ｉｏ。

（ペンシルバニア、フィラデルフィアのロームアンドハース社の商標）の溶液、 例えば１％溶液（但し０１〜２０％溶液も許容される）に浸漬される。第１浸漬 洗剤の目的は脂質を破壊することによって細胞膜及び蛋白質を除去することであ る。透明々洗液が得られる捷で、溶液を好捷しくは少なくとも２回又は３回、そ して好ましくはさらに多数口取ｐ替える。この第１洗浄段階は好ましくは、室温 において、最初の３〜５時間の間浸漬洗剤を１時間ごとに取り替えながら行う。

温度は大きく変えることができ、１０時間〜数日間１℃〜４０℃とすることがで きる。

ＰＨは６と８の間に維持するのが好ましいが、４と９の間で変えることができる 。ある場合には、細胞外・　マトリクスの変性を防止するため、そして好ましく は天然に存在するプロテアーゼがコラーゲンを攻撃するのを防止するためにプロ テアーゼ阻害剤を用いる。ある場合には、天然のプロテアーゼ阻害物質が十分な 保護をもたらす。

プロテアーゼ阻害剤は、コラ−ゲナーゼ阻害剤、例えば１〜２５ミリモル濃度の エチレンノアミン四酢酸、スルヒドリルプロテアーゼ阻害剤、例えば１〜２５マ イクロモル濃度のＮＥＭ　、及びセリンプロテアーゼ阻害剤、例えば０２〜１マ イクロモル濃度のＰＭＳ　Ｆを含むことができる。温度は、洗剤のクラフト点よ シ高温、又は相分離が生じない温度に維持する。好ましくは、１０〜３０℃の温 度において１〜２４時間行う。

ある場合には、第１洗剤と共にＤＮアーゼを使いることかできる。こうすること によって、天然存在するＤＮアーゼ又は添加されたＤＮアーゼにより、存在する ＤＮＡが可溶化され、そして部分的に除去されることが可能となる。ＤＮアーゼ が添加されない゛場合でもＤＮＡが除去され、そして可溶化される。ＤＮアーゼ は、もし添加されれば、抜脱を通過しそして核に入ることができる。第１洗剤処 理段階後に残留するＤＮＡは非粘稠形であシ、この形は、第２洗剤段階中に、処 理された材料中に存在する蛋白質及び洗剤の拡散を制限するように機能しない。

第１洗剤段階の後、痕跡量の洗剤を除去するために水洗浄を行うのが好ましい。

使用する第２洗剤に対する可能性ある遮断作用を防止するのが好ましいが、ある 場合にはこれを省略することができる。

その臨界ミセル濃度より高い濃度において使用することができる変性洗剤への浸 漬を伴って第２洗剤段階が用いられる。このよう々浸漬は、１〜７日間又はさら に長期間にわたって用いることができ、はとんどの小体組織構造体、例えば長さ が１０〜１５αの動脈管については３日間が好ましい。

しばしば１　％に達する洗剤濃度をもって、４〜３０℃の温度を用いることがで きる。１０〜３０℃において３日間浸漬するのが好ましい。

第２洗剤段階は架橋されていない蛋白質をほぐし、そしてこの蛋白質を可溶化し 、これを抜脱と共に除去する。

次に、蒸留水を用いて第２変性洗剤を洗浄除去する。しばしば、すすぎ及び洗浄 のために塩溶液を用いて組織の生理的条件を体条件のもとに維持することができ る。好ましくはアルコール、例えば７０チエタノールを洗浄溶液として加えて、 殺菌剤として、そして痕跡の洗剤を除去する場合の助剤として機能させることが できる。

洗浄後、この発明に従って処理された体組織を７０係アルコール中に貯蔵し、凍 結乾燥し、グルタルアルデヒドで固定し、さらにエチレンオキシド、ガス殺菌又 はガンマ−線照射によシ殺菌することができ、これらはすべて体に再移植すべき 体組織の処理のだめに当業界において知られている。

第１及び第２洗剤段階において、使用される洗剤は多くてもよく、そして種々の 常用の添加剤、例えば殺菌剤を使用することができることを理解すべきである。

幾つかの場合には、第２洗剤段階のみを使用すればよく、これによって体組織か ら十分な物質が除去され、体移植片として使用するだめの細胞外マトリクスの形 で機能するようになる。他の場合には、第１洗剤段階のみを行えばよいが、但し 、第２段階において変性洗剤を使用するのが好ましい。ある場合には、非変性洗 剤と共に穏和な変性洗剤を１段階で使用することができ、例えばトリトンＸ−１ ０（ｉと組合わせてデオキシコレートを使用することができる。

非変性洗剤のために使用することができる多くの洗剤の内、他の、７１Ｊオキシ エチレンエーテルヲ使用することができ、トリトンＸ−１００はポリオキシエチ レンエーテルである１つの商標製品である。トリトンＸ、−１１４を使用するこ とができる。シェルケミカル社によシ製造されるオクチルフェノールオキシ１５ ドＮＰ−４０Ｑ使用することもでき、同様にトゥイーン系のポリオキシエチレン ソルビタンであル、例えハトウィーン２０１　トゥイーン４ｏ及ヒトウィーン６ ０を使用することができる。ウィルミントン、プラウエアのＩＣＩアメリカ社に より製造されるポリオキシエチレンエーテルＢｒ１ｊ　３５　も使用することが できる。一般に、第１段階においては、非変性の、細胞質膜又は細胞膜を破壊す るが被膜を破壊しない任意の洗剤を使用することができる。内生ヌクレアーゼ（ ＤＮアーゼ）の活性化又は外来性ヌクレアーゼの侵入を許容しながら第１段階を 通して被膜が物理的に無傷の状態に維持されることが重要である。被膜が溶解す る前に核ＤＮＡが加水分解されることを洗剤が許容しなければＤＮＡが放出され る。ＤＮＡは粘稠であ巾、そして蛋白質を捕捉することができ、そして次の抽出 段階を不可能にはしないにしても一層困難にする。

被膜及び核内容物を溶解することができる第２洗剤は好ましくはドデシル硫酸す ）　ＩＪウム、又は炭素原子数７〜２２のヌルホン化アルカンもしくはスルホン 化アルキルレン又は硫酸化高級脂肪族アルコールの水溶性塩の水溶液と共に形成 される洗剤である。

アルキル単位は直鎖でも分枝鎖でもよく、そして好ましくは、ラウリル硫酸、ミ リスチル硫酸、セチル１６　待人口Ｂ６０−５０１５４０　（６）硫酸、ステリ ル硫酸及びオレイル硫酸の水溶性塩を包含するアルキル硫酸塩が使用される。所 望にょシいずれかの洗剤段階において２種類又はそれより多くの洗剤の混合物を 使用することができる。適当な塩には、Ｃ７−２２アルキル硫酸もしくはスルボ ン酸、又はアルキラレンスルホン酸のナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩及 びアンモニウム塩、並びにアミン塩、例えばラウリル硫酸トリエチルアミンが含 まれる。洗剤の濃度は好ましくは０５〜１０％の範囲である。この出願において 使用される「変性洗剤」なる語には、蛋白質を変性しもしくはほぐし又は被膜を 溶解する洗剤が含まれる。好ましくは、これらの変性洗浄は陰イオン性洗剤であ る。変性洗剤として有用々他の洗剤には０５〜４係の濃度のデオキシコレートが 含まれる。低ＰＨにおける低い不溶性のため、デオキシコレート溶液は好ましく はｐＨＢに、しかし常に約ｐＨ７〜約ｐＨ９の範囲内に緩衝化されなければなら ない。

好ましくは制細菌剤が全期間を通して、又は少なくとも第１洗剤段階において使 用され、そして水と共に除去され得る。０．０１〜０．５％の濃度におけるナト リウムアットが好ましい。マーキーロクロム及び抗生物質を使用することもでき る。この方法に代えて、すべての溶液を熱によシ殺菌し、そして全エフ 程を無菌条件下で行うことができる。

細胞外マトリクスの蛋白質分解的損傷を最小にするために２つの方法が用いられ る。１つの方法においては、多量の溶液を使用し、そしてトリトン溶液又は第１ 洗剤を頻繁に取シ替えることによシ、放出されたプロテアーゼを急速に稀釈しそ して洗浄する。

第２の方法においては、１又は複数の７０ロチアーゼ阻害剤を第１洗剤と共に含 める。下に記載する阻害剤の添加によシ上に検討した幾つかのクラスのプロテア ーゼを阻害することができる。

（ａ）　セリン−依存性プロテアーゼは、活性化された有機ホスフェート及びチ オホスフェート、例えばフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ　Ｆ　） 又はノイソプロビルホヌホフロリデートによシ阻害される。

（ｂ）　スルヒドリル−依存性ン０ロテアーゼハ、ヌルヒドリル基の阻害剤、例 えばＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）　、グリシドール、エタクリン酸等によシ 阻害される。

（ｃ）　２価陽イオン依存性プロテアーゼは、キレート剤、例えばエチレンジア ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンクリコール−ビス（β−アミノ−エチルエー テル）　Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎ’−四酢酸により阻害される。

（ｄ）　酸性プロテアーゼは中性ＰＨにおいて阻害され８ る。

イヌ頚動脈管を処理する場合には０．２　ｍモルのＰＭＳＦのみで十分であるが 、処理される組織に一層活性なプロテアーゼが存在する場合には、多数の阻害剤 、例えばｐＨ６，５〜８．５の緩衝液中０．２ｍモ／ｌ／　ＰＭＳＦ　。

１〜２５ｍモ／ｌ／ＮＥＭ、１〜２５　ｍモルＥＰＴＡを用いるのが好ましい。

この発明の体組織構造体を前記のように洗剤で処理した後、これらを常法に従っ て体に移植することができる。すなわち、血管移植片を調製し人体中の頚動脈及 び他の動脈並びに静脈と取シ替えることができる。イヌの血管移植片及び他の管 状材料は長期間わたって利用できそして長期間にわたって好ましい特性をもたら す。

この発明の上記の及び他の目的、利点及び特徴は、この発明の細胞外マトリクス 体移植片を調製しそして使用する理論的及び実際的例の下記の記載から一輸精管 動脈管（ｓｐｅｒｍａｔｉｃ　ａｒｔｅｒｉｅｓ　）及び他の動脈を、剖検の際 に無菌技法を用いて摘出する。摘出後にすべての動脈を０ノ８チ塩溶液によシひ たし血液及び凝固物を除去する。次に２個の洗浄された血管を、１％　ト！Ｊ　 ｌ−ンＸ−１００溶液を２００　ｍｌ収容する無菌密閉パンに移す。この液及び その後のすべての溶液はオートク／−ブ殺菌する。トリトンＸ−１００溶液はさ らに００２％ナトリウムアジド、１７ｎｙｉジナトリウムエチレンジアミノテト ラアセテート（ＥＤＴＡ）及び１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含有 する。血管外部移植片をこの溶液中で、室温において回転シェーカー中で振とり することによシ攪拌する。溶液は１時間ごとに３時間にわたって取シ替える。こ の時点で、ｍ　液ｔ　０．５　ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有 する１φトリトンＸ−１０’Ｏ溶液と取シ替え、この液中で血管外部移植片を１ 時間攪拌する。

この処理の後、血管を０．０２％ナトリウムアットを含有する１％トリトンＸ− １００に移し、そして次の４日間にわたシ毎日抽出剤を取り替え々からインキュ ベートする。この期間の後、細胞外面管マトリクスを、殺菌した再蒸留水を多数 回取り替えながら十分に洗浄し、そして２４時間ずつ数回７０％エタノールに暴 露し、最後に７０係アルコール中に、移植のだめの調製まで貯蔵する。７０係エ タノール中での貯蔵は長期間にわたって可能である。移植の前に、血管移植片を ０９％塩溶液中でこれを数回取シ替えながら洗厚し、そして次に少量のヘパリン 化食塩溶液に浸漬する。移植は血管外科における標準的方法により行う。トリト ンＸ−１００に４日間暴露する代シに、トリトンＸ−１００に１日間暴露し、次 に１％ドデシル硫酸ナトリウムに３日間暴露することもできる。

これらの処理における相違は組織学的測的によっては明らかでないが、移植され た細胞性、血管性、細胞外マ）　ｌ）クヌの再細胞形成及びターンオーバーにお いて重要であろう。

例？ ヒトのへその緒を、分娩直後の胎盤から切９取った後凍結する。損傷された緒又 はその他年適当な緒は廃棄する。さらに処理することが適当であると認められる 緒を、無菌的に観察しながらへその緒の片方にカニー−レを付け、そして再循環 的組織をがん流することができ、同時にがん流液に組織をひだすことができる装 置に連結した。次に、１　％　トＩ）　）ンＸ−１００の無菌溶液を、カニー− レを付した緒を通して数時間ゆっくりとがん流する。第１のかん流液を廃棄した 後、ｐＨ７，５の燐酸緩衝化生理的塩溶液中０．０２％ナトリウムアット、１ｍ Ｍノナトリウムメチレンノアミノテトンアセテート、１ｍＭのＮ−エチルマレイ ミド、及び０５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有する１チドリト ンＸ−１００と取り替え、これを緒を通して２４時間循環せしめる。この溶液を 新鮮な同一の溶液と取り替え、さらに１日１ 間かん流を続ける。３日目に、がん流液を、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０． ０２％ナトリウムアットを含有しそして燐酸緩衝化塩溶液によ、９３２０　ミ１ ，１オヌモルに調整された溶液と取り替える。この溶液を、へその緒を通して毎 日取シ替えながら３日開かん流する。４回目の２４時間の終点において、へその 緒を、フィルターによシ無菌化した逆浸透水により、洗剤の存在（泡）が視覚的 に観察できなくなるまで洗浄する。この方法は非循環的かん流法によシ行う。次 に、へその緒をＰＨ７，５に燐酸緩衝化された生理的塩溶液にもどし、そして活 性炭フィルターを用いながら循環法によりがん流し、そして次に小粒子フィルタ ーによシ最後の痕跡の洗剤を除去する。

この操作に続いて、内側にステンレス鋼網心を入れて、０１〜０５バールの圧力 において、１％グルタルアルデヒド及び１％塩化ナトリウムを含有する溶液を用 いて引延し固定を行う。この引延し固定段階は室温において２４時間以内で行う 。固定の後、濾過された逆浸透水で洗浄し、そしてキャッピング、すなわち分離 されたヒトへその緒の細胞外マトリクスが水中アミノ酸又は蛋白質の溶液に暴露 され、その結果これらが露出したグルタルアルデヒド部位に結合し、表面の変性 と反応性部位のカバリングが同時に達成されるような方法を行う。このキャッピ ング浴から材料を洗浄浴に返し、そして次に最終貯蔵溶液中に入れる。外科手術 のだめの調製に際し、ヒトへその緒細胞外マトリクスを貯蔵溶液から取シ出し、 そして無菌塩水で洗浄しそしてひたし、そして次にへ・マリン化無菌塩水で洗浄 する。すべての操作は無菌条件下で行い、すべての装置はオートクレーブ殺菌し 、すべての溶液はオートクレーブ殺菌又はフィルター除菌する。

例３ 剖検に際してヒトの心臓弁を無菌技法を用いて注意深上摘出し、そして付着して いるすべての組織を除去する。次に、弁を、例１に示しだ溶液中に、同じ順序及 び同様の時間にわたって浮べる。機械的なみがき、及びブラシ処理によシ周囲に 存在する筋組織の残留物を除去する。次に弁を、洗浄されそして殺菌された適当 な貯蔵器中に浸漬する。すべての仕事をフィルター及びＵＶ殺菌された空気層流 を有す管状組織、例えば血管及び複合弁をこの方法により処理して対応する無細 胞マトリクス材料を得ることができるのみならず、膜状組織シート、例えば６膜 、網、腸間膜、結膜等、剖検の際にヒトから得たもの、屠殺場でウシ、ブタ、ヒ ツジ等から得たもの、又は実験室において大実験室動物から得たものを、実質上 同様にして処理することができる。筋組織が結合組織マ）　ＩＪクスに隣接して いる場合には、追加の機械的操作、例えば層の切断及び筋組−織残留物を除去す るだめの引っかきが必要となる。これらの操作は、洗剤抽出操作が完了する前、 操作中又はその後に行うことができる 一ノＩ 骨の小片、軟骨の薄片及び靭帯から、例１に記載したのと同じ方法によって細胞 を除去し、そして得られた細胞外骨、軟骨及び靭帯マ）　ＩＪクス材料を骨及び 軟骨のを往古構成の外科的融合において使用する。この発明の方法中に骨の無機 成分を無傷の状態に保持するため、使用する溶液をヒドロキシアパタイトで飽和 する２゜これはこの材料を負荷したカートリッジを通すことによシ行う。

例ど ヒトの歯の再移植はこの発明の方法の他の応用である。ここでは、抜き取った、 又は裂離した歯を例１において上記した方法と同様の溶液で逐次処理する。歯の 冠に小孔をあけ、そしてこの孔を通して歯根を介して、歯が入れられた外温から 洗剤液を吸い込む。囚の鉱物質を浪費しないために、ヒドロキシアパタイト又は フルオロアノｅタイトを抽出剤と接触するように置く。十分洗浄工程が抽出剤の すべての痕跡を除去する。最後に、再移植の前に殺菌を行う。

歯科室においてこの方法を行うことを可能にするだめにキットを開発することが できる。

男Ｊ− 屠殺場においてブタから皮膚を得る場合、４０℃を超える熱水を動物にかけない ことが重要である。

死後できるだけ早く全皮を得、そして実験室に運び、６インチ幅のストリップに 切断し、そして１％トリトンＸ−１００溶液を用いて機械的に洗浄する。次に、 かみそシによシ毛を除去し、そしてストリツプを１係ドデシル硫酸ナトリウム溶 液（ストリップの体積の約１０倍）に浸漬する。ドデシル硫酸ナトリウム溶液を 合計１４４時間にわたって４８時間ごとに取り替え、そして同時にストリップを 浴壁にとすシつけ、存在するかもしれ々い色素及び皮下脂肪組織の残存物と共に ケラチン層を除去する。この時点で皮膚のストリップは完全に白色であるが、物 理的強さ、寸゛法及び一般的外観に関し、そのもとの性質を保持している。こん どはストリップを皮膚切除器（デルマトーム）で割シ、そして約１０００μｍ厚 の上層をフィルターによシ無菌化した逆浸透水によシ十分に洗浄する。次に、ｖ ｃ浄したストリップを７０チエタノールに１４４時間浸漬し、そしてこのアルコ ールを４８時間ごとに取シ替える。この処理の終点において、ストリップを逆浸 透水により再度洗浄し、そして次に１％グルタルアルデヒドの浴に２４時間浸漬 する。この後、周到な無菌条件を用いて無菌ＲＯ水によシ過剰のグルタルアルデ ヒドを洗浄除去する。

次にこのストリップを引き延ばした平な状態で凍結乾燥し、そしてエチレンオキ シド殺菌したプラスチックバッグに詰める。この方法に代えて、ブタ皮膚の細胞 外マトリクスをグルタルアルデヒド段階の前に凍結乾燥し、そしてこの段階で凍 結乾燥し、次にエチレンオキシド殺菌しく〈４０℃）そして無菌プラスチックバ ッグに詰めることができる。

凍結乾燥したブタ皮膚細胞外マトリクスは、乾燥状態で冷暗所に保持された場合 、無限の商品寿命を有する。材料の再構成は抗生物質を含有する無菌塩溶液中に 浸漬することによって行われる。この材料は、広範囲の第３度の火傷の一時的被 覆のために使用することができる。

江別 屠殺された動物から新しく得られ、洗浄され、そして灸手方向に切り裂かれ、次 に粘膜組織のほとんどを除去するために内側がみがかれた小腸の片から火傷被覆 材を製造することができる。次に、これらの前洗浄された小腸ストリップを例７ に記載したのと同様にしてドデシル硫酸ナトリウム溶液に浸漬する。この洗剤暴 露期間の終点において、ストリップの両側を磨き付着している平滑筋層の残留物 を除去する。次に、得られた消化管細胞外マトリクス材料を例　に記載したよう にアルコールに浸漬し、そして無菌ＲＯ水によシ十分に洗浄する。この処理に続 いて、３０〜５０係のエタノールを含有する１％グルタルアルデヒド溶液に浸漬 する。この溶液は混合された固定無菌及び貯蔵溶液である。

再構成のために、消化管細胞外マトリクスストリップは食塩溶液に浸漬し、この 溶液を数回交換する。

最後に、ストリップを抗生物質食塩溶液に浸漬し、そして大範囲の第３度火傷に 湿適用する。

狗ｊ− 無細胞血管マトリクス（ＡＶＭ）を次のようにして製造する。

天然の頚動脈の給源として成ダレイハウンドを使用する。この動物にキシラジン （ｘｙｌａｚｉｎｅ）　（１，０ｍｇ／ｌ　ｂ）を前・投与し、そしてベントパ ルピトールナトリウム（１１０■／１ｂ）の静脈内投与により麻酔した。動物に 挿管し、そしてボリュームベンチレーター（）・−バードポンプ）上に置く。同 頚動、脈管を動員し、そして１つの中線切開によシ無菌的外科手法を用いて採取 した。外移植された頚動脈は分枝しておらず、２７ そして平均３〜４−の外直径及び１２〜１５ｃｍの長さを有した。どの動脈管を 食塩溶液で洗浄した後洗剤処理する。動脈管を１　％　）　リ）ンＸ−１，００ 、０，０２係ナトリウムアジド、新しく溶解した２ｍＭフェニルメチルスルホニ ルフルオリド（ＰＭＳ　Ｆ　）、５ｍＭのＭｇＣ４２中にて室温で１時間インキ ュベートした。動脈管を１時間ごとに３時間にわたシ新鮮な同一溶液に移した。

トリトン処理の後、動脈管を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）に７２時 間インキ−ベートし、毎日交換した。次に、得られたＡＶＭを、まず蒸留水中で 、次に７０％エタノール中で２４時間にわたシ十分に洗浄することによシ残留洗 剤のすべての痕跡を除去した。架橋すべきＡＶＭを蒸留水中で再水和し、さらに 処理した。洗剤処理、並びに水及びエタノール洗浄を、回転シェーカー上で滑動 することによシ行った。動脈管を、３００　ｍｌの溶液中で８〜１２０ツトで行 った。これらの動脈管を、第１表において「抽出・非架橋」と記載する。

上記の抽出されたイヌの頚動脈管の幾つかを、１−エチル−３−（３−ツメチル アミノプロピル）−カルホゝジイミドＨＣノの１％溶液中に２５℃にて６０分間 にわたって浸漬し、そして水で洗浄し、その後でこれらを５係グリシン溶液、又 は部分的にＮ−脱硫酸されたへ）９１Ｊンの５％溶液のいずれかに暴露する。

２８１１表Ｈａ　Ｇｏ−５０１５４０（９）これらの処理の後に、蒸留水、そし て次に塩溶液゛、次に水中で十分に洗浄した。この処理の後、化学的に変性され た無細胞血管マトリクス材料を、蒸留水及びへ・マリン化食塩溶液中で前移植洗 浄するまで、７０チエタノール中で貯蔵する。カルボジイミド処理された動脈管 を第１表において「抽出・架橋」と記載し、そしてグループ■は動脈管のへツク リン化され処理されたパッチである。

成ダレイハウンドを、ベントパルビタールナトリウムの静脈内注射により麻酔し 、次にＴ−６１静死剤により静死させた。

首の前側中線切開を行い、胸部から甲状動脈分岐までの右及び左の全頚動脈管の 両側切離を可能にした。頚動脈管を摘出し、そしてヘパリン化食塩水で十分に洗 浄した。

各外移植片を個々にへ・ｅ　ＩＪン化食塩溶液に入れ、そしてラベルを付した後 冷蔵した。すべての外移植片をできるだけ迅速に氷上に移し、さらに処理した。

使用した移植片の平均長さは１０〜１５ｃｒｎであり、これを後で約５ｃｒｎの 断片に切断した。

外科的移植 体重２０〜４０　ｋｇの成雄雑種犬に、手術に先立ち９ ３日間毎日３００　ｍ９のアスピリンを与え、そして予定された手術前２４時間 断食させ、前麻酔としてケタミンＨＣｆｆｌ（１００１１９）を筋肉内に投与し た。ベントパルビタールナトリウム（２０ｍｙ／ｋｇ体重）の静脈内注射によシ 麻酔を行った。静脈滴注ユニットを置き、手術中の液体置換として５φグルコー スを含む乳酸化リンゲル液を用いた。通常、番犬は手術中及び術後に５００〜１ ．０００　ｍｌを受理した。気管内チューブを入れ、そして人工呼吸器に連結し た。首部をそシ、そしてブラシ洗浄及びベタジン溶液の適用を５分間行うことに よって無菌手術の用意を行った。無菌ドレープを置き、そして他の器具をセット した。

標準的無菌技法を用いながら首に腹側中線切開を行い、右総動脈（ｒｉｇｈｔ　 ｃｏｍｍｏｎ　ｃａｒｏｔｉｄｌＲＣＣ）を露出した。

ＲＣＣの短い長さの切除に続き、２係リドカインＨＣノの局所適用を行った後、 ストラタムーコゞウルド（Ｓ　ｔｒａｔｈａｍ−Ｇｏｕｌｄ　）流れ検知子及び 流量計５Ｐ２２０４を用いて血流速定値を記録した。ＲＣＣの切除を甲状動脈分 岐におよそ１５〜２０ｃｍ近くまで拡大した。移植片が位置すべき領域の内側及 び外側に一時的動脈瘤クリップを適用した。次に、クリ、７″間においてＲＣＣ を鋭利な虹彩鋏できれいに切断し、そして動脈管をへ・クリン化食塩水で洗浄し た。

ディス手術用顕微鏡を用いて、移植片及び頚動脈端を手入れし、そして問直端対 端配置のだめに適合させた。移植片の長さは約５ｍであった。標準的微小血管技 法を用いて、９−、Ｏ単糸ナイロン上１３５ミクロン針を用いながら端対端吻合 を行った。各吻合のために１６中断縫合（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ　５ｕｔｕｒ ｅｓ　）を置いた。空気を除去するために逆流かん流技法を用い、そして宿主及 び移植片動脈管の最終回がん流を行った。２係リドカインＨＣノの局所適用に続 いて、移植片の再がん流の後他方の血流測定を記録した。比較のため再がん流径 の移植片の長さを測定した。吸収性ポリゲルコール酸縫合材料によシ閉じる前に バシトラシン溶液を傷の内又は周囲に自由に適用した。

犬は６００，０００ユニツトノペニシリンＧｆロカイル、術後５日間にわたる毎 日０．７５ｆのジヒドロストレプトマイシンサルフェート、術後５日間にわたる 毎日３００　ｍ９のアスピリン、及び術後３０日間にわたる毎日３００ｍｇのア スピリンを与えられた。

移植片の収得 最初の手術の３ケ月（９０日）目に、番犬を２４時間絶食させた後移植片を収得 した。

ケタミンＨＣＪ２前麻酔及びベントパルビタールナトリウム麻酔の後、古い中線 切開部を再切開し、ＲＣＣ及びＬＣＣの両側切離を可能にした。各頚動脈の短い 長さの切離を極近位領域において行い移植片の開放性を決定し、そしてリドカイ ンの局所適用の後ＲＣＣ（移植）及びＬＣＣ（対照）の血流測定を記録した。

移植片を傷つけないように十分に注意深く、移植片を含むＲＣＣの十分な長さを 切断して、卆ん流−固定方法を促進し、そしてがん流−固定中における細動脈及 び外膜管を通しての血の逆流に対する保険とする。

移植片の各端から３〜５ｃｒｎ残して、甲状分岐の近位でそれに隣接して宿主の 頚動脈に鉗子を適用する。

次に、胸部に極めて近くでＲＣＣを結紮する。結紮部の移植片側に動脈カテーテ ルを挿入し、そして他の結紮部と正しい位置に強く結びつける。カテーテルを、 ６０’ｃｃのシリンジを末端に有する３方止コツクと直接連結する。挿入した場 合、シリンジ及びカテーテルに洗浄媒体（へａ９　ＩＪン化食塩溶液）を満たす 。遠位鉗子が開放される場合、一定の平衡圧がシリンジに適用され、そしてライ ン内圧力計によｐ　３００　ｍｍＨｇのレベルにモニターされる。第１シリンジ が空になる場合、遠位鉗子が止コックと同時に閉じられ、内部圧がトラップされ る。第２洗浄シリンジを止コックに連結し、そして適用されたシリンジ圧をその 圧に維持しなから遠位鉗子及び正コックを再び開く。６０ｃｃシリンジによる４ 回の洗浄が行われるまでこれを反復する。第５シリンジはカルノフスキーの固定 剤を含有し、そして先行する４回の洗浄と全く同様にがん流される。但し、シリ ンジが空になるとき、遠位鉗子に加えて移植片に３〜５ｃｍ近位に他の鉗子が適 用される。固定剤がセグメント・中に加圧状態でトラップされ、そしてこのセグ メントの外側をカルタフスキー中に１５〜２０分間浸漬する間そのまま保持され る。固定剤の最終かん流の直後に犬を静死させる。

最初の固定期間の後、セグメントを無傷の−１までシリンジによシ取り出し、そ して１時間固定浴に入れ、この後切断し、又は冷固定剤中に貯蔵して後で切断す る。切断しそして後で電子顕微鏡観察する場合に適切な方向に保持するために近 位端又は遠位端を標識する。

移植片の切断 宿主の動脈端を伴う無傷の移植片を、カルフッスキー固定剤にひたしたガーゼに 横たえる。近位端から始めて、大きな止血鉗子にかたく固定された新しい両刃か みそシによシ、標本を近位吻合部から約］５□□□のところで切断（ｔｒａｎｓ ｓｅｃｔ　）する。この切断を、標本にそって５〜８憫間隔で続ける。各吻合部 が宿主及び移植片の両者の十分な領域を示すことを保証するように各切断が行わ れるように最初に注意深く計画する。各セクションの壁を長手方向に切断し、全 管腔表面を露出させる。露出された管腔をさらに２回長手方向に切断し、露出さ れた管腔表面の３個の同一の標本にする。これらの片を、小径の培養チーーブの 底に近位端が置かれるように置く。ゆるやかに詰められたガーゼ片を標本の土に 挿入しチーープ中でのその方向を保持する。チーーブを新鮮で透明ナカルノフヌ キー固定剤で満たし、そしてチーーブの底部から空気を除去する。次にチーーブ をラベルし、電子顕微鏡観察のために調製する寸で冷蔵庫に貯蔵する。

３５ ３６　１情昭ＧＧ−５（１１５４０θ１）例２は、この発明の洗剤処理血管移植 片を体移植片として使用した場合の成功を例示するものである。

しかしながら、処理されたすべてのイヌが生存したわけではないことに９注意す べきである。試験を反復する場合、幾つかのケースにおいて、そしである試行中 に、わずか６８ヂの移植片が開放状態に維持される。失敗した移植片の幾つかは 物理的徴候を示し、これは失敗が微小手術技法の使用によシ訂正し得る縫合過程 に関連する機械的問題に基くと信じられる。

移植片が頚動脈のために移植される場合、微小手術技法が好ましい。

例ソは変更された洗剤技法を用いて反復することができる。例え、は供与体頚動 脈管をブレイノ・ランド犬から外科的に取ｐ出し、塩溶液で洗浄し、そして凍結 することができる。第２段階において、動脈管を解凍し、そして３％トリトンＸ −１００，０２係ナトリウムアジド、新しく溶解した２　ｍＭ　ＰＭＳＦに３時 用インキュベートし、この新鮮な溶液をさらに３時用使用し、次に溶液の第３次 交換を行い、室温にて一夜暴露する。１％トリトンＸ−１００，０，０２チナト リウムアジド、２　ｍＭ　ＰＭＳＦ、　２０　ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ６，０）中で ３時間室温において牌臓ＤＮアーゼ（１０マイクログラム／　ｍｌ　）と共にイ ンキーベーする。次に４多デオキシコール酸中で室温にて一致インキーベートす る。次に材料を１条炭酸水素：トリウムで洗浄し、次に５０％エタノールで洗浄 １でデオキシコール酸を除去する。蒸留水中で水和フ。

行い、次に所望によシ表面又は架橋変形を行う。

架橋は、１％グルタルアルデヒドに中性ＰＨにて２４時間室温において暴露し、 次に移植片を蒸留ンにて数回洗浄することによシ行う。残留アルデヒは、２ｏｍ ｌの硼酸緩衝液（ｐＨ９）中２００７１１＆のナリウムボロハイドレートで、室 温にて１時間還元次に蒸留水で洗浄することによシブ口、りするこ。

ができる。変性され架橋された補填材は、外科的１用のために必要とされるまで ７０チェタノール中（貯蔵することができる。この方法に従って調製さンた移植 片はイヌにおける生物学的移植片として頚！脈代替物として有用であることが見 出される。

この発明の特定の例を記載したが、多くの変法１可能であろう。細胞不含マトリ クスの体移植片を−に移植する前に洗剤処理し、抗原性材料を除去しなお体構造 体として機能することができる前形成・れた材料を得ることが重要である。

１２〜１５ｃｎ１の長さの血管移植片が０５〜６００ロ径を有することが好まし く、又はよシ小さい径を有することが好ましく、０５〜４鰐の範囲かも好ましい 。このような管状構造は、体移植片とと　て使用された場合に置き代えられる管 の組織構造と一致する。これらは細胞の再増殖を可能にし、そしヒ　て非常に多 くの場合に高い開放性をもたらす。同様に、他の体移植片が、体に移植される前 に細胞不含マトリクスとして形成された場合、すでに記載したｋ　すべての体チ ューブ、心臓内膜及び層、皮膚等を含ド　む体の部分を修復するために非常に有 用である。哨ト　乳動物体に７１・、リクヌ構造を挿入するために標準的〜、移 植手術法を用いることができる。

と 吏 て 嘔 妨 が 本 さ 血 褒 し 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞膜、核酸、脂質及び細胞質成分が除去されている細胞外マ）　ＩＪクス の形で主成分としてコラーゲン及びエラスチンを有する体由来構造体を含んで成 る無菌体移植片。 ２　前記移植片が、該移植片が付加される体部分の組織構造と適合する大きさ寸 法にされている請求の範囲第１項記載の体移植片。 ３　前記移植片が、前記体構造体が体から取シ出される直後であって実質的な化 学架橋又はその変化に先立って洗剤によ逆処理される請求の範囲第１項記載の無 菌体移植片。 ４　前記洗剤が変性洗剤及び非変性洗剤を含んで成υことさらに含んで成る請求 の範囲第３項記載の無菌体移植片。 ５　細胞膜、核酸、脂質及び細胞質を除去しそして１つの主要成分としてコラー ク゛ンを有する細胞外マトリクスを形成するために体組織を処理し、そして゛核 体組織を体移植片として使用するために適当なものとする方法であって、前記組 織を体に移植するために適当な大きさ及び形状に維持しながら該組織を少なくと も１種類の洗剤で処理することを含んで成る方法。 ６　前記組織を非変性第１洗剤で処理して細胞質性細胞膜を除去するが核膜を除 去せず、この間に細胞外マトリクスの破壊を回避し、そして該組織を変性第２洗 剤で抽出する請求の範囲第５項記載の方法。 ７、　前記第２洗剤が変性洗剤であシ、そして前記第１洗剤とは別に第２段階に おいて適用される請求の範囲第５項記載の方法。 ８　前記第２洗剤が強陰イオン性洗剤でアシ、そして体移植片として使用するた めに前記組織を無菌形に維持しながら該洗剤を除去する請求の範囲第５項記載の 方法。 ９　前記陰イオン性洗剤が、炭素原子数７〜２２個を有する分枝鎖又は直鎖のス ルホン化アルカンもしくはスルホン化アルキラレン又は硫酸化高級脂肪族アルコ ールの水溶性塩である請求の範囲第８項記載の方法。 １０、　前記洗剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求の範囲第９項記載の方法 。 １１　体に移植する前に前記体組織を架橋することをさらに含んで成る請求の範 囲第８項記載の方法。 １２、前記第１洗剤がグロテアーゼ阻害剤と混合される請求の範囲第８項記載の 方法。 １３、前記第１洗剤がＤＮアーゼと混合される請求の範囲第８項記載の方法。 １４、前記体移植片が血管移植片である請求の範囲第８項記載の方法。 １５　前記体移植片が骨移植片である請求の範囲第８項記載の方法。 】６　前記体移植片が歯移植片である請求の範囲第８項記載の方法。 １７、前記体移植片が皮膚移植片である請求の範囲第８項記載の方法。 １８　体を修復するために生体に全構造体を移植する方法であって、該構造体が コラーゲンを多く含む細胞外マトリクスの形であって、核酸、脂質及び細胞質成 分が除去されておシ、その主成分としてコラーゲンが残されており、前記の除去 が少なくとも１種類の洗剤を使用することによって行われ、この方法が生体に前 記構造体を移植することを含んで成る方法。 １９　前記全構造体が血管移植片である請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０　前記全構造体が歯である請求の範囲第１８項記載の方法。 ２１、前記構造体が皮膚の領域である請求の範囲第１８項記載の方法。 ２２　体組織から体移植片を形成する方法において、該体組織を架橋又は該組織 の不所望の悪化に先立って変性洗剤で処理し、そして生体における移植に使用す るために適当な前記体移植片をそれから形成することを含んでなる改良。 ２３゜前記体組織を第１の非変性洗剤、及び第２の変性洗剤で処理することを言 んで成る請求の範囲第２２項記載の改良。 ２４　前記洗剤が順次使用され、そしてプロテアーゼ阻害剤が前記第１洗剤と共 に使用される請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、ＤＮアーゼが前記第１洗剤と混合される請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６　前記第２洗剤が強陰イオン性洗剤であシ、この洗剤が７〜２２個の炭素原 子を含む分枝鎖又は直鎖のヌルホン化アルカンもしくはスルホン化アルキラレン 又は硫酸化高級脂肪族アルコールの水溶性塩である請求の範囲第２３項記載の方 法。 ２７　洗剤で処理された体移植片の使用方法であって、体部分を修復し又は置換 するために生体に前記細胞外マトリクスを移植することを含んで成シ、ここで該 マトリクスが体と適合し、非抗原性であシ、そして再細胞形成が可能なように設 計されている方法。 ２８、細胞膜、核酸、脂質及び細胞質成分が除去されている細胞外マｌ−リクス の形で主成分としてコラーゲンを有する体由来の構造体を含んで成る無菌体移植 片。