JPS60501290A - 酵母細胞に新しく導入した遺伝子の発現改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母細胞に新しく導入した遺伝子の発現改良本発明は酵母細胞に新知に導入した 遺伝子の発現における改良に関する。

特に本発明は、酵母ＲＮＡ　、］′？ＩＪメラーゼＩ［による伝Ｆを開始させる ことができ、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉ、５ｉａｅ　） のＧＡＰＤＨ遺伝子の１つのレギユロン領ψの少なくとも一部分を含むＤＮＡ　 ｉｊｉ＋′列に関する。

（ＤＮＡ　＝デオキシリポ核酸、　ＲＮＡ−リボ杉酸、　ＧＡＰＤＨ＝グリセリ ンアルデビ￥−３−リン酸脱水素酵素。

ｍＲＮＡ−メンセンジャーＲＮＡ　）。

本発明はさらに、酵母面Ａボリメラ！ゼ１【にょる転写の停止とそのｍＲＮＡの ポリアデニル什ヲ行なうこと力゛でき、サツカロミセス・セレビシェ（二ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨ遺伝子の１つに属する停止／ポリアデニル化領 域の少なくとも一部分を含むＤＮＡ配列の使用に関する。

本発明は又、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨ遺伝子の１つの少なくとも上記Ｌ／　Ｊ ｆ　ユロン領域と、サツカロミセス・セレビシェのＧＡＰＤＨ遺伝子とは異なる １つ又は２つ以上の構造遺伝子を含む大きい方のｒＤＮＡ配列に関し、この構造 遺伝子にコードされた目的の蛋白質全酵母が生産できる様に酵母を形質転侠させ るために、ＤＮＡ配列ｔ　ｗ　１１＜え２ ＤＮＡプラヌミド又は酵母染色体に挿入することができる。

′　最後に本発明は蛋白質の生成される多件下で上記の大きいｒＤＮＡ配列を含 む酵母を培養し、そして酵母培養液からその蛋白質を単離することにより蛋白質 を製造する方法ならびにその方法により得た蛋白質に関するっ 発明の背景 組換えＤＮＡ　（−ｒＤＮＡ　）技術の進歩により、高等生物体（たとえばピト 、動物及び植物・）から特異的遺伝子父はその一部分を単離又は合成し、これら の遺伝子父性遺伝子断片を細菌や酵母などの微生物に移入させることが可能にな った。形質転換された微生物が祥裂するように、移入された遺伝子は複製及び増 殖される。

その結果、形質転換された微生物は、移入された遺伝子又は遺伝子断片がコード しているどのような蛋白質（酵素、ホルモン、抗原、抗体、又はこれらの一部） をも作る能力？与えられることになる。この微生物はこの能力を子孫（（伝えて いくため　ｌ＜笑止この移入が記載された能力を有する新規の微生物株を作るこ とになる。

この技術が実用上の目的に応用できることの背景にある基本的な事実は、全ての 生物（微生物からビトまで）のＤＮＡは化学的に類（ｊＪ、　しており、同じ４ 個のヌク３　符表昭ＧＯ−５０１２９０（３） レオチドで構成されているということである。たとえば哺乳動物の新生児の胃細 胞のプレ７０ロキモ７ノを特定しているアミノ酸配列をコードする同じヌクレオ チド配列は微生物に移入されたとき、同じアミノ酸配列をコードしているものと して認識される。

組換えＤＮＡ技術の基本的構成要素（１辺下のものである： １）目的の蛋白質をコードしている遺伝子っ１１）新規遺伝子は遺伝子の安定な 複製と高度の発現を確保するために挿入しなければならないベクター（シラスミ １′）０ １１１）新規遺伝子を有するベクターを導入できる、適切東宿主微生物。

合成すべき蛋白質の性質、この理由の工業的応用おメひ技術的に可能な発酵及び 絹製操作を考慮して、プラスミνベクターと宿主生物を選ばなければならない。

多くの場合、毒性物質の産生の疑いのない宿主生物、すなわちＧＲＡＳ（一般的 に安全と考えられる）リストに記載されている微生物を選ぶことがきわめて重要 である。しかし、組換えＤＮＡ又は発酵技術の応用に必要な全ての要件を満たす これらのＧＲＡＳ　微生物はほんのわずかしかない。これらの好ましい基準に基 つく選択によると、現在のところいくつかの種の酵母、著名なものとしてはサツ カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙ ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）　ｓデバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ　）、 ハンゼニュラ（Ｈａ、ｎ５ｅｎｕｌａ　）、カンジダ（Ｃａ、ｎｄｊ、ｄａ　） 、トルロデンス（Ｔｏｒｕ’１ｏｐｓｉｓ）、及びロー　１ｓ’　トルーラ（Ｒ ｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ−）が、遺伝子操作されたＤＮＡ、分子の非常に有望な宿 主生物と卯なされているっ 本発明においては、酵母内で安定１【維持されうるシラスミドベクターであり、 そして最も重要なことでるるが、新しく導入した遺伝子を高度に発現させる適当 なレギユロンを含有するフ０ラスミドベクターの作成て、組換えＤＮＡの技術、 分子的、生物学的及び化学的技術全使用している。

今日、酵母サツカロミセス・セレビシェＮｐなシラスミドベクターがいくつが知 られている〔／−、ピー、ホレンバーグ（Ｃ，Ｐ、　Ｈ１二ｉｌｅｎ−Ｏｅｒｇ ＋カレントトヒソクス　イン　マイクロバイオロジーアンド　イムノロシー（Ｃ ｕｒｒｅｎｔ　ＴｏりｌＣＳ　’ｉｒ、　’Ｍ］　ｃｒｏｂ。

ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、　）第９６巻、１１９−１４４貞（１９８２年）、 及びエイ・ヒネン（Ａ　−１（ｉｎｎｅｎ）とビー・メイハソク（Ｂ、Ｍｅｙｈ ａｃｋ　）、カレントトビソクス・イン　マイクロバイオロシ゛−アンド　イム ノロシー（Ｃｕ、ｒｒｅｎｔ’　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｊｃｒｏｂ、　ａｎｄ 　Ｉｍｍｕｎ’ｏ１．、　）第９６巻、１０１−１１７頁（１９８２年）〕ｏこ れらのベクターは、宿主ｖ５ｍ　ｌ１ｆｑ内でベクターおよび担・人されたｉ蓑 伝子を維持するのに特定な種の酵母つ染色体ＤＮＡから単離された自律複製配列 （ＡＲ８）　Ｋ依存するプラスミドの複製活性に依存する。史に、これらの酵母 ベクターは、形質転換体を選択できるマーカーを含有する。このようなマーカー の例としてはｌｅｕ　２　ｊｆｊＨ伝子〔エイ・ヒネン（Ａ、　Ｈｉｎｎｅｎ’ ）　ラ、　ｙＰロン−ディング・す／ヨナル・アカデミ　サイエンス　ニーニス エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、第７５巻 。

１９２９−１９３３貞（１９７８年）〕、ｔｒｐ　１遺伝子〔ジー・ストルール （Ｋ、　５ｔｒｕｈ、Ｌ　）ら、ゾ０ン−デインダ・す／ヨナル・アカデミ・サ イエンス　ニーニスエイ（Ｐｒａｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ”）、第７６巻、１０３５−１０３９迭〔（１９７９年）〕、ラクターゼα 伝子〔アール・シー　ディックノン（Ｒ，ｃ。

Ｄｉｃｋｓｏｎ　）、ジー　７　（Ｇｅｎｅ　）、第１０巻、６４７−３５６０ （１９８０年）〕、オヨびアル抗生物＋　Ｊｔに７１する耐性を宿主細胞に与え る遺伝子がある。

サツカロミセス・セレビ人工（Ｓ、　ｃｅｒａｖ１ｓｉａｅ’）　Ｉ／Ｃおける ＡＲ−配列又はクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　 １ａｃｔ１ｓ　）又はクルイベロミセス・フラジリス（Ｋ、　ｆｒａｇｉｌｘｓ 　）における（Ｋ）ＡＲ配列は。

これらの酵母を用いるイ８頼てきる発酵フ０ロセスの開発には必ずしも充分では ない。従ってｒＤＮＡ含有酵ｔひの工業的応用に（ｄ１新しい宿主細胞の染色体 に外来構造６ 遺伝子を組込むことが非常に重要である。

経済的な面からみると、酵母細胞内の挿入遺伝子の安定性だけでなく、この遺伝 子が蛋白質として発現する効率も重要である。これらの知ｙに基づき、新しく挿 入された遺伝子を高度に発現させるだめの主要な経路は下記のようなものである ニ ー遺伝子の高度転写用ＩＷを行ない得るフ０ロモータ（ＲＮＡ開始）部位の下流 への構造遺伝子の組込み。

プロモーター活性が誘導可能（すなわち温度の変化や、生育培地中のインヂユー ザーの有無によりスイッチを入れたり切ったりできる）であるものが理想的であ る。酵母中で１動く強力な７０ロモーターは、解糖系の酵素をコードする遺伝子 の転写に関係するものである。マイドラ（Ｍａｉｔｒａ　）とロボ（Ｌｏｂｏ　 ）の実験〔ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミスト　リ　−　（Ｊ、　Ｂ ｉ、ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、第　２４６　巻、４８９−４９９頁（１９７１ 年）〕は、これらのプロモーターのうちのいくつかはきわめて誘導能が高いこと をさらに示している。しかしながら、これらの７０ロモーターの単離に関する重 大な問題は、ＤＮＡ断片に対し調節活性と充分なプロモーター活性を与えるヌク レオチド配列について、現在までのところほとんど分っていないということであ る。

一構造遺伝子の下流へのＲＮＡ　（ＩＪボ核酸）停止シグナルの組込みっこのよ うな停止シグナルが存在するため、構造遺伝子の転写は隣接するオＫＯンの転写 を妨害せず、さら（／ｃ転写効率はより高いようであり〔ケー・ニス・ずし・ノ ド　アンＶ　エフ　／ヤーマｙ　（Ｋ、　Ｓ、　Ｚａｒｅｔ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｓ ｈｅｒｍａｎ　）、セル（Ｃｅｌｌ：）第２８巻、５６ろ一５７６頁（１９８２ 年）〕、メソセンジャーのボリアぞニル化は正しく起こり、より安定性の高いｍ ＲＮＡ　（メツセンツヤ−ＲＮＡ　）　泪カ得られやすい。しかしながら、現在 までのところ、酵母の転写停止に必要なヌクレオチド配列（で関する正確なぞ− タは得られていない。

一蛋白質合成開始に最適のＲＮＡ分子中のＡＵＧコドンを取り囲むヌクレオチド 配列の存在。公表ぞ一タ〔エム　コずツク（Ｍ、　Ｋｏｚａｋ　）　、ヌクレ′ イソクア／ノズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅ＋ｃ　Ａｃｊ、ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第９ 巻、５２Ｚ３−５２５２頁（１９８１年）〕によれば、−６位と＋４位、ＮＸＸ ＡＵＧＮはきわめて保存性が高く（−６にＡ又はＣそして＋４にＧ）、この事実 はりホソームによる翻訳開始点としてのＡＵＧコドンの認識におけるこれらのヌ クレオチドの役割を示唆している。効率的な酵母のゾロモーターは一６位にヌク レオチげとしてＡ又ＵＣを有すると予測されるが、＋４位のヌクレオチドはコー ディング配列の−Ｍ’を形成しており、従ってプロモーターの下流に挿入される 遺伝子の性質に依存する。これは全ての場合にこの条件ｔｉ足することは国難で あることを示唆している。

一宿主シ州胞内のベクターのコピー数。多くの場合膜コピー数は高ｍＲＮＡ濃度 になり、従って遺伝子がより多り発現される。サツカロミセス・セレビシエ（Ｓ 、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）では２ミクロンＤＮＡ複製開始点を有するベクタ ーのコピー数ば５０にも逮するっこれはたとえばベクター又は自律的複製配列′ ！ｉｌ−有するベクターのコピー数〔ケイ・ストルール（Ｋ。

５ｔｒｕｈｌ　）　ラ、　−１０シーデイング・す７ヨナル・アカデミ・サイエ ンス　ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ、ｔｌ、。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、第７６巻、１０３５−１０５９頁（１９７ ９年）、及びエイ・クエイ・キンダズマｙ　（Ａ、　Ｊ、　Ｋｌｎｇｓｍａｎ　 ）ら、ゾーン（”（）ｅｎｅ　）　、第７巻、１４１−１５２頁（１９７９年） 〕よりも相当多い。しかし、サツカロミセス（５ａｃｃｈａ、ｒｏ＋ｐｙｃｓｓ 　）以外の酵母では、２ミクロンＤＮＡは発見されておらず、この複製開始点は きわめて少数の酵母でのみ機能することを示唆している。これ１でに得られた実 験データでは、２ミクロン複製開始点はン・７サノカロミセスボンベ（Ｓｃｈｌ ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　）では機能する〔ディー・ビー チ　アンド　ビー・ナース（Ｄ、　Ｂｅａ、ｃｈ　ａｎ’ｄ　Ｐ、　Ｎｕｒｓｅ 　）、ネイチャー（Ｎａｔ；ｕｒｅ　）、第２９０巻、１４０−１４２３ａ（１ ９８１年）〕が、タルイベロミセスラクテイスダス（Ｇ、　Ｄａ−ｓ　）とシー ・ピー・ボレンバーグ（ｃ、　ｐ−Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　）、カレント・ジエ ネテインク（Ｃｕｒｒ。

Ｇｅｎｅｔ、　）第５巻、１２３−１２８Ｍ’（１９８２年）〕ッ従ってサソカ ロミセ／Ｃ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）又はンデサノカロミセス（Ｓｃｈ ｌｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　ＤＩ外の属に属する酵母の形質転換は 、多くの場合形質転換すべき生物から単離されたＡＲ８のような仙のＤＮＡ複製 開始点の入手、又は酵母のケ゛ノｌ、中への外来遺伝子の組込みに依存する。

一使用する宿主生物に最適の遺伝子のコーンの使用。

サツカロミセス・セレビシエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉ、ａｅ　）で得られた結 果は、あるｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ　）の豊富さと蛋白質遺伝子中の各コドンの存 在の間には高い相関があることを示している。従ってたとえば世ノヵロミセス・ セレビシエ（Ｓ、　ＣｅｒｅＶＩＳ］、ａｅ　）での牛フ０レフロキモ７ノ遺伝 子又ハ植物フ’ｌ／フ０ロノー７チン遺伝子の最適な発現には、この−凹、富な 酵耽のｔＲＮＡと相関するコ「ン群を有する両遺伝子の化学合成が必要である。

″″″遺伝子の梱訳に影響を与える別の因子は、いわゆるシグナル配列をコー関 しているＤＮＡ配列の存在である。これらのシグナル配列は多くの場合膜を通し ての蛋白質の共翻訳的分泌にしばしば関係する、疎水性Ｎ−末端蛋白伸長部分で あるっ本明細ｆでは、酵母の７０レゾロノーマチン遺伝子の発現で得ら′ｎだ力 ｆしい分ゞ−タか示されて（・）るが、このぞ−タ（住／ダナル蛋白質を＝？− ドし７ているＤＮ　Ａ配列が遺伝子から除かれると、遺伝子の発現は数オーダー ρ少することを示し、ている。

馬、在のところ組損えＤＮＡ分ｊ′−の宿主となり得ることが知ら）上でいる酵 母の数はサツカロミセス・セレビ／・れる。　。

発明の要約 従って商業レベルでの組押えＤＮＡ技術が適用できる分野への拡張を１１目１し にオる／こめ、他の代謝上の性質や（ｊｉ＋、の栄養要求性を４１する別の酵＠ ：ｃｈ＋するニーズが任（ｉ；　しているわしかＬ７竹し、い酵母を使用するに は、新たに挿入いれたＤＮ　Ａの適切な発現系と共に、）耳しい宿主中のベクタ ー分子の安定な複製を値保するための適切なりＮＡ　ａ裂開始点が必要である。

本発明は、サツカロミセス−セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｓｖｘｓｉａｅ　）に限 定されず１仙の酵母でも機能できる発現系を供する。これを実現するために、サ ッカ「Ｉミセス　セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅ−ｖ＋５１ａｅ　）　（１）グリ セリンアルデヒド−６−リン酸脱水素酵素（ｏＡＰ丁ＩＨ）のＲＮＡ開始／調節 及びＲ１，ＩＡ停止／ボリア−？′；ル化／グゾルを単離した（、Ｉ）ＡＩ’Ｄ Ｈ＠　伝子のＲＮＡ開始部位はサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｓｖ ｔニー；ｉａｅ　）　’Ｉｃ　：にける非乞責ｒ（す＜’；ａ／−）０ロモータ ーであるという事実〔エム　シ゛エイ　ホランＶ　（Ｍ、　Ｊ、　Ｈｏ１１．ａ 、ｎｄ　）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｘｓｔｒ−ｙ　）第１７巻 、４９００−４９０７貞（１９７８年）〕に加えて、ＧＡＰＤＨは多くの異なる 生物中の代謝上の重要な酵素であり、その発現を調節するヌクレオチド配列に関 して進化中（Ｃ何らかの保存があったことを示唆していることが認識されてから 、本発明の）０ロモーターを単離して応用した。これを基礎にしてさらに実験を 行なった。そ（７て（１）単離し放射性標識したＧＡＰＤＨレギユロン領域断片 は種々の酵母のコロニーとハイブリダイズした１　（Ｈ）サツカロミセス　セレ ビシェ（且　ＣｅｒｅＶｌｓｌａｅ　）のＧＡＰＤＨしｆ−’−０７はクルイベ ロミセス・ラクテイス（Ｋ、　］、ａｃｔｉｓ　）中で外来値伝子を効率よく発 現した、そして（：：ｉ）約８５０ヌクレオチドの太きし・３レギユロン領域は 、約２８０ヌクレオチドの小きいレギユロン領域〔十ラッド　シ゛エイ　ピー　 （Ｈｏ１ｌａｎｄ　：ｒ、　ｐ、　）とホラノド　’Ｌ　ム・’７’　：ｒ−イ （Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｍ、’　Ｊ、　）、’）　ヤ−ｆ　ｉｖ　・、：ｔ　ｆ　・ バイオｏ　’）カル　ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、第２ ５５巻、２５９６−２６０５亘（１９８０年）］よりも効果的であった。これら の新しい知見により不発明者らは、単離されたレギユロンはいくつかの・９ｊＪ の酵母で外来ＤＮＡの発現に有用であろうという自（８を得た。

不発明は、基本的に図２に示されたＤＮＡ配列より成２ す５蛋白質合成開始のだめのヌクレオチド＞’ｉ１′：１列Ｖｉｉｔ　ノド■作 を容易にするために少なくともひとつの制限酵素切断部位を含む様に任意にレギ ユロン領域を変更することを特徴とする、酵母のＲＮＡポリメラーゼＩＩによる 転写を開始させ得るＤＮＡ配列で、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒ ｅｖｈｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨ遺伝子の１つのレギユロン領域の少なくとも一 部分を含むＤＮＡ配列をイｉｊする。

レギユロンを改変をせた例の１つを第４項と図７Ａ及び図８に本すが、ここでば Ｓａｃ　Ｉ部位の導入を示しである。図２には１つの特異的ＤＮＡ配列のみ記載 しであるが、１つ又は２つり上のヌクレオチドの置換えであろうと、又は１つ又 は２つ以−ヒのヌクレオチド配列力［１又は欠失であろうと、このＤＮＡ配列の 改変（この改変は図２に示したＶギュロン遺伝子の性質を・損わない）ｉｆ本発 １１Ｊ４の範囲内にある。

本発明はさらに、基本的に図６に示しだＤＮＡ配列より成ることを特徴とする、 酵母のＲＮＡボリノラーゼＩＩによる転写の停止とｎ＋ＲＮＡのポリアデニル化 がｌ：ｌ］能す］’ＢＪ　Ａ配列で、−リーソカロミス　セレビシェ（とＱｅｒ ｅ−ＶＩＳｌａｅ　）のＧＡＰＤＨ遺伝イのひとつに！−６するイ亭止／ポリア デニル化領域の少なくとも一部分を官有するＤＮＡ配列乏洪する。

このよりなりＮ、Ａ配列の存在が酵母：こおける溝！？ｉ遺伝Ｊ’の発」Ｉｌｌ 、（、二１）ｆ−まし、いことか明らかになってき７乞。このようなりＮＡＡ配 列存在は、酵母の・用胞のケゞツム中へｒＤＮＡを導入するの（で特ｆｃ有効で あるっ本発明は又、組換上ＤＮＡ　ｆラヌミ団又は酵母染色体中Ｇて挿入され得 るＤＮＡヤ列て、 （ａ）　基本的に図２に示しをＤＮＡ配列であり、及び（ｂ）　サツカロミセス 　セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨ遺伝子とは異なる １つ又は２つ以上の構造遺伝子、及び（Ｃ）から（ｆ）のうち少なくとも２つ。

（ｃ）　酵母ＲＮＡポリメラーゼ１１による転写の停止とｍＲＮＡのボ゛リアデ ニル化を実行させることが可能な１つ又は２つけ上の特異的なりＮＡ配列、及び ／又は（ｄ）１つ又は２つ以」二の選択マーカー、及び／又は包体への安定な挿 入をｔｔＪ面にする１つ又は２つＬ′−Ｊ上ノヌクレオチド配列、又Ｉ′ｊ、’ 　＋Ｍ７　ｉｉｄ　ｉｆ　−ＦＦｋ　’ｒｃ　、ｋ　ｌｊ　ルＤＮＡ　ｆｐ製を 調節する１つ又は２つ以−トのＤＩ＝ｌＡ配列、及ｏ・／又は （ｆ）　蛋白質の移動を助ける６０月下のアミノ酸残基より成るシグナルポ′り 架プチドをコー１しており、構畠遺伝了の１−流でかつ同じｙＰｆ読ル−ツ・（ ηに母性しているＤＮＡ配列、 より成るＤＮＡ配列を供するっ 牛Ｉｒに（ｂ）の構ユ告遺伝ｒ−＋□丁１ノーフチン又（ｒＪキ七ンン、又は、 ｊｃ　Ｉ’（らの種々の対）フ：上伝−「型又（・■改変ξす（このようなりＮ Ａ配列はこれらの遺伝子の発現を増加させるため、ソーマチンの甘味性やキモシ ンの凝乳能、又はノー７チン様蛋白質又はキモノン様蛋白質の前駆体を損わない ）をコードしている０ （ｃ）の特異的ＤＮＡ１ｊｉ’列としては基本的にチャート２に示したＤＮＡ　 ｆｆｉ”、列が、他の停止／ポリアデニル化領域よりも酵母に対して一層適応性 があるようなので、こちらを使う方が好ましい。

シグナルボリペノチドをコードしている（ｆ）のＤＮＡ配列ハ以下のものをコー ドしているＤＮＡ配列より成る群から選ぶことができる： （ａ）サツカロミセス・セレビシェ（ジｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）インベルター ゼを移動させるシグナルペゾチド、すなわちＭｅｔ　−Ｌｅｕ　・Ｌｅｕ　・Ｇ ｌｕ　−Ａｌａ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　’　Ｌｅｕ　・Ｌｅｕ　−Ａ ｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　・Ａｌａ−Ａ］、ａ　・ＬＹＳ　’　Ｉｌｅ　＋　 Ｓｅｒ　＋　Ａｌａ　。

（ｂ）　サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）酸性ホ スファターゼを移動させるシグナルポリペプチｒ１すなわちＭｅ’ｔ−Ｐｈｅ　 −Ｌｙｓ　・Ｓｅｒ　−Ｖａｌ　。

Ｖａｌ、　−Ｔｙｒ　・Ｓｅｒ　・工１ｅ　−Ｌｅｕ　・Ａｌａ−Ａｌａ　・Ｓ ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ａｓｎ　・　Ａｌａ　。

（Ｃ）　ノー７チン様蛋白質の未成熟型のシグナルｇ　＋Ｊベゾチｒ１すなわち Ｍｅｔ−Ａｌａ　Ａｌａ　−Ｔｈｒ・Ｔｈｒ　・ＣｙＳ・Ｆｈａ　・　Ｐｈｅ　 −Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　・　Ｐｒｏ　・　Ｐｈｅ　・Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ 　−Ｌｅｕ　、Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　・　Ｌｅｕ　・　Ｓｅｒ　・Ａｒｇ　・　Ａ ｌａ　。

（ｄ）　キモシン様蛋白質の未成熟型のノグナルボリペフ０チトゝ、すなわちＭ ｅｔ　＋　Ａｒｇ　＋　Ｃｙｓ　’　Ｌｅｕ　ｖａｌ　ＨＶａｌ　・　Ｌｅｕ　 −Ｌｅｕ　−Ａｌａ　ｖａｌ　・　Ｐｈｅ　−Ａｌａ　Ｌｅｕ・Ｓｅｒ　−’　 Ｇｌｎ−ＧＬｙ’　、および（ｅｌ　２つのコンセンサス　シグナルポリペゾチ ド、すなわちＭｅｔ　−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ　・Ａｈａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ・ Ｐｈｅ　−１１ｅ　−Ａｉａ　・Ｐｈｅ　−Ｖａｌ　・Ｉ］、ｅ　・Ｖａｌ　− Ｌｅｕ工ｌｅ　ｖａｌ　−Ａｓｎ−ＡｌａおよびＭｅｔ　・Ｓｅｒ　・ＴＪＹＳ 　・ＰｈｅＶａｌ・工１ｅ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−１１ｅ　・Ｖａｌ　−Ａｌ ａ・Ａｌａ−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ｐｈｅ　・Ｉｌａ　−Ａｌａ−Ａｓｎ　Ａｌ ａＯ発現条件をできるだけよくするため、コドンを酵母によって好ましいコドン にす−るために（ｂ）の構造遺伝子及び／又は（ｆ）のンダナルボリペゾチドを コードしているＤＮＡ配列を改変することが重重れる。ジエイ・ピー・ホランｌ −１’　（Ｊ、　Ｐ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　）とエム・ジェイ・ボランド（Ｍ、　 、ｒ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　）　〔ジャーナル・オグ・バイオロジカル　ケミスト リー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　）’第２５５へ２５９６−２６０５頁（１ ９８０年）〕の教示に従うと、好ましいコドンは以下のものである：ａｃｃ又は ＧＣＴ　アラニン　ＴＴＧ　ロイシンＡＧＡ　アルギニン　ＡＡＧ　リジン ＡＡＣアスパラギン　ＡＴＧ　メチオニンＧＡＣ又ハＧＡＴ　アスパラギンＩＩ Ｊ　ＴＴｃ　フェニルアラニンＴＧＴ　システィン　ＣＣＡ　フ０ロリン６ ＣＡＡ　グルタミン　ＴＣＣ又はＴＣＴ　セリンＧＡＡ　グルタミン酸ＡＣＣ！ 又はＡＣＴ　７レオニンＧＧＴ　グリシン　ＴＧＧ　）リプトファンＯＡＯヒス チジン　ＴＡＣチロシン ＡＴＣ又はＡＴＴ　インロイ７ン　ＧＴＣ又はＧＴＴ　バリン−０上記のＤＮＡ 配列はそれ自体が目的ではない。これらはプラスミドの形で又は酵母のｒツムへ の取込みによって、サツカロミセス（ＳａＣＣｈａｒＯｍ　ＣｅＳ　）、クルイ ベロミセス（ＫｌｕｙＶｅｒＯｍｙＣｅＳ　）、デバリオミセス（Ｄｅ’ｂａｒ ’ｙＯｍＹＣｅＳ　）、ハンゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　）、又はローげト ルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　）　ヘのこれらのｒＤＮＡ配列の導入によっ て、これらのＤ′ＮＡ１列を含有する酵母を調製する方法に使用される。

本発明はさらに、シラスミドの形又は酵母のｒツムへ取込まれた形でこのような ｒＤＮＡ配列を含有する酵母を供し、このような酵母を培養して蛋白を製造する 方法へのこれらのＤＮＡ配列の使用を供する〔ここで酵母に取込まれているｒＤ ＮＡ配列は、蛋白省又はその前駆体（この前駆体は分解中に関連する蛋白を生成 する）をコードしている構造遺伝子を含有する）０最後に本発明はこの新規の方 法により産生される蛋白質を供する。

ＧＡＰＤＨ７°ｒｊモ一ター／ｇＪ、１節領域がプレプロソーマチンやプレゾロ キモシン又は種々の成熟生成物のいくつかをコーｒしている構造遺伝子と結合し ているいくつかの構成物が作られており、酵母（（おけるノー７チン様蛋白質の 合成が証明されている。好適な構成物はプレゾロソーマチン又はゾレンーマチン をコーＶしている構造遺伝子を含有していた。この遺伝子の発現収率を増加させ るために、本来のコドンを高度に発現される遺伝子に多量に存在するコげンで置 換可能である。

さらにプレプロキモノンのシグナル配列をコー１しているＤＮＡ配列は、酵母て より***される産物のシグナル配列〔たとえばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）の産生ずるノブナル配列インベルターゼ及び酸性ホス ファターゼ〕をコーＩＳ＞シているＩ）ＮＡ配列で置きかえ得る。

本発明（つＤＮＡ配列は、サツカロミセス（５ａｃｃｈａｒｏ〜ｍｙｃｅｓ　） 属や衾ルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）　、Ｆ７に属する酵母 におけるＤＮＡ複製を調節するヌクレオチを挿入した場合は、サツカロミセス（ ５ａｃｃｈ、ａ−ｒｏ−−ｍｙｃｅｓ　）については下記の組合せが好ましい＝ ２ミクロｙ　ＤＮＡの複製開始点とシラ、スミドｐＭＰ　８１　上ノ１ｅｕ２遺 伝子との組合せ〔／−・ビー・ホレンバーグ（Ｃ，Ｐ、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ 　）、カレント・トビシラス　イン・マイクロバイオロシイ　アンド　イムノロ ソイ（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　ａ、ｎｄ　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、）第９６巻、１１９−１４４頁（１９８２年）〕、および２ ミクロン［）ＮＡの複製開始点とゲラスミ１Ｙ町７上の（Ｎａｔｕｒｅ　）第２ ８２巻、ろ９−４６頁（１９７９年）〕。タルイベロミセス（Ｋ、ｌｕｙｖｓｒ ｏｍｙｃｅｓ　）の好適な複製開始点はＫＡＲ８−２配列とシラスミドＴ）ＥＫ ２−７トのｔｒｐ　１遺伝Ｔとの組合せである〔ヨーロソ７ＮＱ特許出願Ｎ００ ０９６４ろ０（Ａ１　）の２１頁と２５頁、及びチャート１に記載〕。もしこの ＤＩ、ＩＡ配列を酵母のケ゛ツムに挿入しなければならない場合は、このＤＮＡ 配列（１外来の構造遺伝子の上流（でチャート１のレギユロン領域を含有する以 外に、構造遺伝子の下流にチャート２の停止領域を含有することが好せしい。こ の組合せは酵ｆ５ケ゛ツムのＧＡ　ＰＩ）Ｈ遺伝子の位置に同種組換えによって 挿入きれる（図１９参照）。もう１つの方法はレヤユロン領域−構造遺伝子−停 止領域の組合せを、酵母ケ゛ツム由来のクローン化ＤＮＡ配列中へ挿入する二と である〔ター・ストルール（Ｋ、　５ｔｒｕｈｌ　）、ネイチャー　（Ｎａｔｕ 、ｒｅ　）第３０５巻、３９１−３９７頁（１９８３（Ｍｅｔｈｏｃｌｓ　ｉｎ 　Ｅｎｄ〕、ｙｍｏｌｏｇＹ　）第１’０１巻、２０２−２１１貞（１９８３年 ）ｌ。

本発明をよりよく理腑するのに必要な般も重要な用語を」ごＪトに尾すする。

オペロンとは（ａ）ポリペプチド発現のための特′ＡヒのＤＮＡ配列（構造遺伝 子）、（ｏ）構造遺伝子の上流な二あり、主にプロモーター調節自己列より成る ３１ＡＩ節領域すなわちレギユロン（上記の発現をＨ（ｇｌ節してＡる）、（ｃ ）リセ・ノゞ−ムと結合する又は相ｑ作用するｎＮＡＮＡ配列ポリペプチドに特 徴的なアミノ酸配列をコードしでいるＤＮＡ配列である。

プロモーターとは転写の開始のためにＲＮＡボリノラーゼが結合するレギユロン 内のＤＮＡ配列である。

末端とはオペロン内のＤＮＡ配列であり、特にｍＲ，ＮＡのポリアデニル化に関 係する特別なりＮＡ配列と、　ＲＮＡ−ボ゛リメラーザによるＤＮＡの転写の停 止に関係する特別なりＮＡ配列より成る。

チドへの正しい翻訳が起きるようなフレームへの６個１組のヌクレオチド＋（コ トゝン）のブルーフ０化。

ろ過程。これは少なくとも転写と翻訳を含む多くの過程の組合せである。

ダー＾Ｃ列とも呼ｔｉすれる）とは、生体膜又は生体膜中の特別なりセフ０ター 蛋白質にケｆｆＬ高い親和性を有する、及び／又はフ０しくフＯｏ　）蛋白質の 輸送／移動に関与するフ０しくプロ）蛋白質の一部を意味する。これらの給送／ 移動違和には、プレ（）０口）蛋白質の蛋白の成熟ユリへの分解がしけしばとも なう。

Ｚ（立遺伝型２つ遺伝子産物の１つ又は２つ以−ヒの天然シて存在するいくつか の型っ により得られる遺伝ｆ産物の２つ又はそれ以上の天然に存在する摩の１つ。

）０レブ″ロソーマチンの成熟型とはプロンーマテン、プレソーマチノ（＝６個 のアミノ酸より成るカルゼキン末端配列のない）０レプロノーマチン）そしてソ ーマチン（ｒ；ｐ−ｐＡ５４３３０及びＥＰ−ＰＡ　５４ろ６１）を意味する。

プレン００キモンンの成熟型（！：はプロキモンン、７ユードモモ／ン及びキモ ７ン（ｇｐ−ｐＡ７７１０９　）を意いるという条件で、ｍＲＮＡ配列と同一の ヌクレオチド（）配列ケイｊするＤＮＡデ拘○ 以上のものを含η′する微生物クローニング用ピークルー（ａ）　サツカロミセ ス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉ−ｓｉａｅ　）のグリセリンアルデヒド− ６−リン酸脱−／ｋ　！酵素（０ＡＰＤＨ）オＫｏンの種々の型のレキ゛ユａノ 及び末端（本明細書中に言ｅ載された）０ラスミド中の添え字０１．０２で示し である）、（ｂ）　デレフ０ロソーマチン、デレフ０ロキモシン及びそノｔらの 種々の成熟型をコードしている構造遺伝子、（Ｃ）　特別の／グナル配列を有す るプレゾロソーマチン又はフ０レプロキモンンの成熟型をコードしている上記構 造遺伝子の種々のハイプリノド型、及び（ｄ）種々の化学合成したＴ）ＩＪＡ虻 列−はいくつかのステツプから生産されるが、その中で最も重要なものは： １、　サツカロミセス・セレビシエ（、ｓ、’　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ　）のＣ ）ＡＰＤＨオペロンを含有するクローンの単離。

２Ｇ八ＰＤＨプロモ一ター／請而頭域の単離と、ノーマチン前ｊへ３体をコード しているフ０ラヌミドへの導入。

６　キモノン前駆体をコードしているプラスミドへのＧＡ　Ｐ　ＤＪ（プロモー ター／　ｇｌ、ｇＪ節領領域導入。

４　合成りＮＡ　Ｍ片（図７配１図８）の導入による、プレゾロソーマチンをコ ードするプラスミドにおける、本来のＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域の再悔 成。

５　合成りＮＡ断片の導入による、（プレ）（７０口）（／コード）キモノンヶ コードするフ０ラスミ１にち・ける、本来の０ＡＰＤＨプロ七−ター／調節領域 の再溝１ｊ１７　Ｃ１６、ＤＮＡ合成。

２２ ７、　０ＡＰＤＨプロモーター／　ｇｌＡＩ節領域の構造的特徴。

＋３．　ＧＡＰＤＨ転写停止／＋′１′？リアテニル化領域の断片をＭ　１５　 ＲＦファーソの中心転写停止シグナルと一緒に、／ニー−キモシンをコーｖして いる遺伝子の下流への挿入。

９２ミクロンＤＮＡ複製開始点と酵母１ｅｕ　２遺伝子の、ノーマチン前駆体と キモシン前駆体をコー２するデラスミ１への挿入。

１Ｑ、　ＧＡＰＤＨ転写停止／ポリアデニル化領域のｐＵＲＹフ０ラスミｒへの 導入。

１１　酵母における遺伝子発現に広く適用可北な大腸菌・コ’Ｊ　（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ　）−酵母の／ヤトルベクターの作糺１２、ザソカロミセス・セレビ／工（ 、Ｓ、’　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨｋコードしている遺伝子のプ ロモーター／調節領域に支配されているプｌ／プロソーマチンをコードしている 遺伝子のクルイベロミセス・ラクテイス（Ｋ。

１ａｃｔｌｓ　）での発現０ １３、　０ＡＰＤＨｆ　ｏモーター／調節領域に支配されている構造遺伝子の、 酵母染色体への組込み０１４　構造遺伝子の化学合成と合成キメラ遺伝子の作製 。

以下の詳細な読切によシ本発明を例示する。

グリセリンアルデヒド６−リン敞脱水３Ｆ［素（ＧＡＰＤＨ）オペロンを含有す るクローンの単離。

′°　特表昭ＧＯ−５０１２９０（８）（Ｍ、、Ｃａｒｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｂｅ ｔｓｔｅｉｎ　＊　セ　ル　（Ｃｅｌ］、　）　第　２８巻、１４５−１５４頁 （１９８２缶）に言１ポ”ｉの方法と類似の方法を用いて、・・イデリノＶ大腸 菌（二。

二ｌｉ　）　−酵ｔ　７’ラスミ￥ｐＦｌ’ｌＣエム・シエ／ぐ１）工（Ｍ、　 Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ　）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ　）第１１巻、１１−１０頁（ １９８０年）〕中で酵母サン力ロミセス゛セレビ７工（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ　）のＤＮＡ　７°−ルを調製した。精製した酵母ＤＮＡを制限エンドヌク レアーゼＳａｕ　５　Ａで部分的に加水分解し、得られた１）ＮＡ断片（平均の 長さ約５　ｋｂ　ｆ　ｐＦｌｌの脱リン酸化Ｂａ、ｍ　ＨＩ部位でＴ　４　ＤＮ Ａ　ＩＪガーゼを用いて結合させた。この結合した物質を用い−てＣａＣＪ、２ 処理した大腸菌（ル立）を形質転換はせた後約３０．０００のア、ンビシリン耐 惟クローンが得られた。５　′ＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＣＴＴ　３　′の 配列を有する化学合りｖしだ、３２Ｐで標識したオリゴマーを用いて、コロニー 　／・イブリダイゼーーンヨン法Ｃ７−ルーイー・テイヤー（Ｒ，Ｅ、　Ｔａｙ ｅｒ　）、アナリテイカル・バイオケミストリイ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、）第９８巻、６０−６．３頁（１９７９年）〕によりこれらのクローンをスク リーニングした。

ソエイ　ピー・ホラｙ　ｔ’　（Ｊ、Ｐ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　）とエムソエイ・ ホランド（Ｍ、　Ｊ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　）の発表したデータ〔ジャーナル・オ グ・バイオロジカル　ケミスト１ノイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、第 １５５巻、２５９６−２６０５頁（１９８０年）〕によると、この第１ノーゝマ ４ −ＩはＧＡＰＤＨ遺伝子のアミノ酸３０６−３１０（最後のアミン酸にぶらさが っている塩基はオリゴマーから得られた）をコードしているＤＮＡ配列と相補的 である。

アール　ビー・ウオーク（Ｒ，Ｂ、　Ｗａｌｌａｅｓ）ら、ニュクレイノクアン ノｈ”　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）第９巻、８７９−８ ９４頁（１９８１年）に記載のハイブリダイゼーション条件を用いて、６個の形 質転換体を同定できた。このうちの１つにデラスミｙｐ−ｐＨ−６３が隠れてい た。このプラスミドはプロモーター／調節領域と転写末端／ポリアデニル化領域 を有していた。

約９ｋｂの長さのｐＦｌ　１−３３の挿入部分を制限酵素分析（図１）と部分的 ヌクレオチド配列解析（図２と図３）で特徴づけを行なった。

〔注〕　特に明記していなければ、酵素のインキュベーションは全て販売元の指 示する条件で行なった。酵素はアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）　、イーリ ンガー（Ｂｏｅｈｒｉ、ｎｇｅｒ　）、ピーアールエル（ＢＲＬ　）　、又はバ イオラグズ（ＢｉｏＬａｂｓ　）から人手した。

２、ＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域の単離とそのンーマチン前駆体をコード するシラヌミＶへの導入（図４）ノラスミ）−”ｐＦｌｌ−３３の挿入部分の制 限酵素解析とヌクレオチド配列のデータに基づき、　、　ＧＡＰＤＨ遺伝子のＲ ＮＡ転写開始領域を８００ヌクレオチドから成るＤｄｅＴ、断片として単離した 。このゾロモーターＬ所片を同定するためデラスミｒｐｐ７１！１−３４をｓａ ｄ　Ｔで消化し、得られた３つのＤＮＡ断片を、化学合成したオリゴマーを用い てサデンハイデリダイゼーンヨン試験を行なった〔イー・エム・すずン（Ｅ、　 Ｍ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　）　％ジャーナルーオグ・バイオロシイ（Ｊ、　Ｍｏ １．　Ｂｉａｓ、、　）第９８巻、５０３−５１７頁（１９７５年）〕。〕ハイ グリダイゼーンヨで陽性の４．３　ｋｂの長さの制限断片を調製スケールで０． ７％アガロ−スケゞルから電気溶出し、次にＤｄ＋３　Ｉで切断した。こうして 得られたＤｄｅ■断片のうち最も大きいもののみがｐｖｕ　Ｈの認識部位（ＧＡ ＰＨプロモーター領域内の切断部位）を有していた（図１）。最も大きいＤｄｅ 　Ｔ断片を単離し、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）　ＤＮＡポリメラーゼ、４種の ｄＮＴＰと共にインキュベートし〔エイ・アール・デービス（Ａ、　Ｒ。

Ｄａｖｉｓ　）ら、ンｙ−ン（ａｅｎｅ　）第１０巻、２０５−２１８頁（１９ ８０年）〕、グランド末端ＤＮＡ分子を作った。

反応混合液ラフエノール／クロロホルム（５０１５０Ｖ／−Ｖ）で抽出し、水層 部分をセファデックス（５ｅｐｈａ〜ｄｅｘ　）　Ｇ　５０のカラムに通し、ボ イｒ容積部分に存在する物質をエタノール沈澱゛させ、Ｔ４ＤＮＡりが−ゼでイ ンキュベートしてこのＤＮＡ断片に３２ｐ−標識Ｆｉｃ。

ＲＩ　リッカー５’　ＧＧＡＡＴＴｃｃ３’を結合させた。フレノウ（Ｋｌｅｎ ｏｗ　）　ＤＮＡ　Ｉリメラーゼ反応とその後のＢｃ。

ＲＩＩＪ７カーの結合のため１、本来のＤｄｅ　Ｅ部位がデロ２６ モーター断片の末端（Ｃ再構成された。りが−ゼを不活付化するため反応混合液 を２６５パＣで１０分加熱し、次に塩化ナトリウノ、を力０え（最終濃度５０ミ リモル／ｌ）、全混合液１ＥｃｏＲ４と共にインキュベートした。フェノール／ クロロホルムで抽出してインキュベーションを停止させ、ＤＩ、ＩＡ、をエタノ ールで２回沈雉させ、再浮遊させ適渦なベクター分子に結合させた。Ｄｄｅ　Ｔ プロモーター断片にはＥｃｏＲＴ部Ｍが結合しているため、容易にｐＵＲ５２８ 、Ｔ）ＵＲ５２３そしてｌ：ｌＵＲ５２２のＥＶ　Ｆｔ　１　部位へ導入さ７″ １（ＥＰ　−ＰＡ　５４３３０７）びＥＰ　−ＰＡ　５４３ろ１）、ノーマチン 前駆体をコードする構造遺伝子に酵母プロモーターが隣接しているプラスミドが できる。このプラスミドｌｄ　、ｐＵ＝Ｒ５２ｔ：　、　ｐＵＲ５２３及び１） ＵＲ５２２をＥＣＯ，ＲＩで切断し、脚状化したシラスミド分子を（子牛の腸の ）アルカリホスファターゼで処理し、て自己結合を防ぎ、これらの各ベクターそ １〜で精製したＤｄｅ　Ｔプロモーター断片ｆ：Ｔ　４　ＤＮＡりが−ゼと共に インキュベートしてイ１（だ。種りの結合ミックスをＣａ、Ｃｆ２で処理した大 腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　ＨＢ　１０１株で形質転換させて数個のアンピシリ ン耐性コロニーを得たＯこのコロニーからいくつかのシラヌミ−ＤＮＡヲ単離し 〔エイチ・シー・パー’／ｇイム（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　）とジエイ　ド リイ（Ｊ、　Ｄｏｌｙ　）　、ニュクレイノク　アノンズ　リザーチ（Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第７巻、１５１３−１５２３頁（１９７９年） 〕、挿入部分の配向を調べるためＰｖｕ　ＩＴとインキュベートした。

シラスミＶの命名法において、正しい方向（すなわち（）ＡＰＤＨプロモーター の転写が下流にある構造遺伝ｒの方向に起きる）にあるＥｃｏ　ＲＩ　（ＤＣ， １ｅ　Ｔ　）を含有するシラスミドは、フ０ラスミ１のもとのコードに−０１を 追加して示しである（たとえば１）ＵＲ５２８ｉ”ｔ　ｐｌＪＨ５２８−０１と なる。図４参照）。

ＥＣ０ＲＩ７’ロモ一ター断片を含有するプラスミドの操作全容易にするため、 ２つのＥＣｏＲＩ部位のうちの１つをこわした。シラスミ）”ＤＮＡ（たとえ１ ｊｐＵＲ５２８−０１）２μｇをＥｃｏＲＩ　で消化し、次に粘性末端を除くた め０．０５モル／ｌの酢酸す）　ＩＪウム（Ｐｌｌ−５，０）、０．０５　モル ／　１１　ノＦＡ化ｆ　ト、’）　ウム＆ＵＤ、ＤＯ１モル／ｌの塩化亜鉛の存 在下で最終液ｉ　２００　ｐＨにして５単位のヤエナリ（Ｍｕｎｇ　ｂｓａｎ　 ）ヌクレアーゼ〔ピー・エル・バイオケミカルズｊ−Ｊ（Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏ− ＣｈｅｌｎｌＣａｌＳ工ｎＣ，）より入手〕と共に室温で６０分間インキュベー トした。このヌクレアー毛゛はＳＤＳを加えて最終ａ度を０．１％にし〔ディー ・コヮルスギー（Ｄ、　Ｋｏｗａｌｓｋｉ　）ら、パイオヶミストリイ（Ｂｉｏ −ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１５巻、’４４５７−４４６３頁（１９７６年）〕 、２倍量のエタノールを加えてＤＮＡを沈４　、せた（この場合０．１倍量の３ モル／ｌの酢酸ナトリウムの添加は省略した）。線状化したＤＮＡ分子ｉ　Ｔ　 ４　ＤＮＡりが−ゼと共にインキユベー７ヨンシテ再８ 結合させ、ＣａＣ，Ｍ２で処理した大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）細胞の形質転換 のために使用した。アンピシリン耐性コロニーから単離しプこプラスミドＤＮＡ 　ｆ：ＥＣＯＲＩとＭ］、ｕ　１で切ｉ％して、ノーマチン遺伝子の隣りに単一 のＥｃ。

ＲＩ部位があるか否かを調べたつ ＧＡＰＤＨフ０ロモーター断片は含有するが、下流の構造遺伝子のＡＴＧ開始コ Ｖンに隣接するただ１つのＥｃ。

ＲＩ認識部位を有するシラスミドは一０２型のシラスミｖとした（たとえば：ｐ ＵＲ５２８−０１［ｐｕＲ５２８−０２となる。図４参照）。

ろ　キモシン前駆体全コードするフ０ラスミドへのＧＡＰＤＨゾロモーター／調 節領域の導入キモノン前駆体をコードする構造遺伝子の隣（ＣＧＡＰＩ）Ｈフ０ ０モーター／調節領域を有するシラスミ１を１゛′ｒ成するため、ＥＣＯＲＩと Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化したプラスミドＴ）ＵＲ５２８−０２（２を参照）を種 々の構造遺伝子が挿入されているベクター分子として使用した。全テ＋７）（ｙ ’し）（プロ）（シュート）キモシンをコードしているプラスミド（ＥＰ　−Ｐ Ａ　７７１０９に記載されている様にそれぞれＴＩＩＵＲ１５２４、ＴＯＵＲ１ ５２３及びｐＵＲ１５２１）は構造遺伝子内にＥＣＯＲＩ部位を有しているとい う問題を解決するため、部分的Ｅｃｏ　ＲＩ消化と共に）（４，１１ｄ　ｌｆｔ 消化全行な′りたＤその捷１の単離し／こ遺伝子を含督する！Ｎ’、ｌ　ｉ’ｆ ｆ　ｌ断片を１％アがロースケ゛ルから抽出し、ベクターと共にＴ　４　ＤＮＡ 結合ミックスに加えたッｏＵＲ５２８−０２をＨｉｎｄ　ｎｌとＥｃｍ　Ｒ■で 消化し、得られた断片をホスファターゼで処理し、最も大きい断片を０．７％ア がロースケゞルがら抽出することによりこのベクターを調製した。Ｃａ−Ｃｊ！ ２で処理した大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）細胞を結合ミックスで形質転換させア ンピシリン耐性コロニーを選択してから、（）０し）（プロ）（シューｒ）キモ シンをコードしている構造遺伝子の隣の適切な方向にＧＡＰＤＨプロモーター／ 調節領域を含有するシラスミげが得ら′ｈだ、９同様にしてフ０ラスミドｐＵＲ １５２２はシラスミドＩＩＩＵＲ１ｂ　２２−０２に変換できる。

ＧＡＰＤＨ−ｆロモーター断片とプレプロキモシン、フ０ロキモ／ノ、／ニー１ キモ／ン及ヒキモンンをコードンている遺伝子を含有するシラスミドはそれぞれ 、ｐＵＲｌ　５　２　４　−　０　２　、ｐＵＲ１５２３−０２、ｐＵＲ１５２ １−０２及びｐＵＲ１５２２−０２と呼ぶ。

４　合成りＮＡ断片の導入（でよる、ゾＩ／ゾＤンーマチンをコ−１♂する）０ ラスミドでの木床のＧＡＰＤＨ−７°Ｏモ一ター／調節領域の再構成（［ン（７ Ａ１図８）図２て示したスフレ第１ド配列（で示した様に、Ｅｃ。

Ｒ工（Ｄｄｅ　７　）　ＧＡＰＤＨ７０ｏ−Ｅ−ター断片は本来のＧＡ、ＰＤＨ フ０ロモーター／　Ｊ−，１節領域の−８４４から−６９のヌクレオチドｔｉし ている。このフｏ　、モーター断片に含寸れていないのは、　ＧＡＰＤＨをコー Ｖしている遺伝子のＡＴＯ開始コドノに先行する３８飼のヌクレオチド３０ である。この（３８）ヌクレオチドばＰｕ　ＣＡ　ＣＡ　ＣＡ酢列を有し、これ は数種の酵母の遺伝子に見出される。

翻訳開始部位の約２０　ｂｐ上流にあるこのＰｕＣＡＣＡＣＡ配列〔エム　シエ イ・ドブノン（Ｍ、　Ｊ、　ＤＯｂＳＯｎ　）ら、ニュクレイノク　アンノＶ　 リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　）、第１０巻、２６２５−２６ ３７頁（１９８２年）〕は、蛋白開始に最適の配列を与える〔エム　コヂソク（ Ｍ、　Ｋｏｚａ、ｋ　）　、　ニュクレイノク　アシノズ　リサーチ（ＮｕＣｌ ｅｌＣＡＣｌｄＳ　Ｒｅｓ、　）第９巻、５２３３−５２５２頁（１’９８１年 ）〕。をらに図６に示した様に、この６８個のヌクレオチＶは、　ＧＡＰＤＨ遺 伝子の発現制御に関与するかもしれない小さなループ構造を形成できる。

上記の理論に基き、Ｄｄｅｌプロモーター断片と下流にある構造遺伝子のＡＴＧ コドンの間にこの６８個のヌクレオチドを導入することは、７０ロモーター活性 及び翻訳開始を改良するのに必要であると考えられた。

図７Ａに要約した様に、この欠けているＤＮＡ断片は部分的にＮ複する２つのオ リコマ−の化学合成により得た。この２つのオリゴヌクレオチドの重複部分には Ｓａ、ｃｉ部位が存在するが、これは９下の２つの理由により導入した＝（１） ＡＴＧコドンのすぐ上流のヌクレオチド配列の操作〔ポＩ）　Ａが末端についた 酵母の発現ベクター（１１を参照）の作成を含む〕を可能にするため：　（ｉＤ 　３’−突出末端（これは４種のｄＮＴＰの存在下でＴ　４　ＤＮＡポリメラー ゼと共にインキュベ−１・することにより除去できる）を生ろ出す酵素の切１所 部イ☆をｌうえること。精製した２つのオリコゝマーの等Ｎ　ｔ　！：ｌｌ　’ 　末端でリン酸化し、ハイブリダイズ〔ジエイ　ジエイロノン（Ｊ、　Ｊ、　Ｒ ｏｓｓｉ　）ら、１９８２年）、ジャーツール・オプ・バイオロジカル　ケミス トリイ（Ｊ、Ｂｉｏｌｃｈｅｍ、　）第２５７巻、９２２６−９２２９頁〕させ 、２本鎖ＤＮＡ合成用の条件丁〔エイ　アール　デービス（Ａ、　Ｒ，Ｄａｖｉ ｓ　）ら、シーン（Ｇｅｎｅ　）第１０巻、２０５−２１８頁（１９８０年）〕 で、クフレノウ　Ｋｌｅｎｏｗ　）　ＤＮＡポリメラーゼと４種のｄＮＴＰと共 にインキュベートして２本鎖ＤＮＡ分子に変換した。１６％アクリルアミドクゞ ル中で電気泳動させた後オートラシ゛オグラフイーを行なう解析により、最初の １不鎖オリゴヌクレオチドの８０％以」二ば２本鎖（で変換されていることが証 明された。反応混合液をセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　５０カラ ｌ、に通しボイド容積中の物質をエタノール沈澱はせてＤＮＡを単離した。次に このＤＮＡ　ｉ　、］？リヌクレオチドゞキナーゼでインキュベートしてリン酸 化し、ＤｄｅＩで消化した。この消化で切断除去されたヌクレオチドを除くため 、反応混合液をエタノールで２回沈澱させた。

図８に示した様に、こうして得られる合成りＮＡ断片’ｊｉｂ、ＡＴＧ開始コド ンに先行するＥｃｏ　ＲＩ部位全ヤエナリ（Ｍｕｎｇ　ｂｅａ−ｎ　）ヌクレア ーゼ消化（２を参照）によ２ り除去したベタ１ター分子中のＢｇｌｎ　−Ｄｄｅ　Ｉ　ＧＡＰＤＨ７０ロモ一 ター調節断片と共に同時に結合させることによりクローニングを行なった。この Ｂｇｌ　ｉｌ　−Ｄｄｅ　Ｉゾロモーター／調節断片は、プラスミドｒ＋ＵＲ５ ２８−０２をＤｄｅ　ＩとＢｇｌ　ＩＩで消化して得た。得られた制限断片を２ チアがロースケ゛ルで電気泳動し、ケ゛ルがら断片を単離することばより、精製 された７９３ヌクレオチドの長さのプロモーター／調節断片が得られた。シラス ミｌｊ　ｐＵＲ５２８−０２ではＡＴＧコドンに先行するヌクレオチド配列は５ ’　−ＧＡＡＴＴＣ！ＡＴＧ−３’　（ＥＰ　−ＰＡ５４３３０とＥＰ　−ＰＡ 　５４３３１　）であり、これはエム　コずツク（Ｍ、　Ｋｏｚａｋ　）の与え る好ましいヌクレオチド配列〔ニュクレイソク　アンノ′ズ　リサーチ（Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第９巻、５２３３−５７５２頁（１９８１ 年〕〕とは異なる。我々の目的は本来のＧＡＰＤＨｆロモーター／調節／蛋白開 始領域をできるだけ正確に再構成することなので、合成りＮＡ　ｉ断片をプラン ト末・端に結合させるためＥｃｏ　Ｒ工部位を除去した。

Ｅｃｏ　ＲＩ部位の除去はＥｃｏ　ＲＩ切断ｐＵＲ５２８−０２ＤＮＡのヤエナ リヌクレアーゼ消化シてより行なった（２を参照）。

次にこのプラスミドＤＮＡ　ｆ　Ｂｇｇ　ＩＩで消化しホヌファターゼでインキ ュベートした。２つのＤＮＡＮＡ断片０．７矛アがロースケゞルで電気泳動して 分離した後、最も大きい断片をベクター（ここでＤｄｅ　Ｔ処理した合成りＮＡ 断片と共Ｋ　Ｂｇ、１２　Ｔｌ　−Ｄｄｅ　Ｉ　７°ロモ一ター断片が結合して いる）として用いた。Ｓａｃ　（認識部位を含む合成りＮＡ断片と共にＤｄｅ　 Ｉプロモーター／調節断片の導入されたシラスミドを−０６を付けて示す（たと えばｐＵＲ５２８−０２はｐＵＲ５２８−０３になる）っ構造遺伝子としてプレ プロソーマチンの成熟型の１つ（すなわちプレソーマチン、デロンーマチン及び ソーマチン）を有するプラスミドで同様の結果が得られ、そｈぞれプラスミドｐ ｕＲ５２２−０３、ｐＵＲ５２３−Ｄ５及ＵｐＵＲ５２０−０６とｌる。

本来のＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域をできるだけ正確に再構成するため、 シラスミドｐＵＲ５２８−０３からＳａｃ　丁部位を除いた（図９）０こ″れは まずシラスミｒを５ａ−ｃ　Ｉで消化した突出した６′末端を有する線状シラス ミド分子を作って行なった。次に４種のｄ、ＮＴＰの存在下でＴ　４　ＤＮＡポ リメラーゼの６′−エキノヌクレアーゼ活性を用いて、これらの末端をグランド 末端とした〔ティー・マニアティス（Ｔ、　’Ｍａ、ｎ１ａｔｉ、ｓ　）ら、モ レキュラー　クローニング（Ｍｏ−１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１，ｏｎｉｎｇ）；コー ルド　スプリング　・・−７く−　ラ肋うトリー（Ｃ！ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈ，ａ、ｒｂ６ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　１１７−１２０頁（１９８２年 ）〕ｏＴ４ＤＮＡりが−ゼを用いてこの線状シラスミ１′−′ヲ環状化したつ 合Ｋ　ＤＮＡ　ｖ９ｒ片中に存在したＳａｃ　１部位が除かれているプラスミド は一０４型ノラスミドとした（たとえばｐＵＩ（５２８−０３’（ｉ　ｐＵＲｂ 　２８−０４と変イヒする。図９参照）０ プレゾロソーマチンの成熟型の１つ（すなわちプレソーマチン、プロソーマチン 及びソーマチン）の構造遺伝子を含有するプラスミｙを用いて同様の結果が得ら れ、とハらはそれぞれたとえばフ０ラスミドｐＵＲ５２２−０４、Ｉ）ＵＦ（５ ２３−０４及び＋１）ＵＲ５２０−０４となる。

５　合成りＮＡ断片の導入による、（プレ）（ゾ０）（シュード）キモシンをコ ーＶするプラスミげにおける本来のＧＡＰＤＨ−ｆ　ｏモーター／調節領域の再 溝成（図る、−０３型のＧＡＩ）ＤＨプロモーター／ＪＪ節領領域４を参照）を 含有するシラスミドを作るため、合成りＮＡ断片と共に種々の構造遺伝子の挿入 されたベクター分イとして、５ａｌＣＩとＨｉ、ｎｄ　ｌ’ｌＴで消化したシラ スミドｐＵＲ５２８−０３を使用できる（図１０　）□　Ｓａｌ　ｒＶｃよるイ ンキュベーションに、キモシン遺伝子中の追加のＥｃｏＲｒ部位の切断金防ぐた め部分的Ｅｃｏ　ＲＩ消化を組合ぎて、（プレ）（プロ）（／ニード）キモシン をコーＶする遺伝子はそれぞれシラスミドｐｕＲ１５２４，１）ＵＲ１５２３， 丁）ＵＲ１５２１及びｐＵＲ１５２２（ＥＰＰＡ　７７１０９　）より重臣し得 る（ろを蚕が）Ｏこうして得られるＤＮＡ断片を次にヤエナリヌクレアーゼ（２ を参照）でインキュベートした後Ｈｉ　１１ｄ　ＨＴで消化できる。こわれてい ない単離された遺伝子を含む制限断片ば１係アガロ−スケゞルの電９ｆ泳動で精 製し、次にケ９ルから抽出し得る。本構成て使用されるこのＤＩ、ＩＡ　！！ｆ ｉ片を図７Ｂに示す。

このベクター分子は、シラスミドｐＵＲ５２８−０３をＳａｃ　ｌとＨｊ、ｎｄ 　ＩＩＩで消化した後、制限断片全ホスファターゼ処理し、最大の断片を０．７ ％アがロースケゝルから単離することにより調製できる。ベクター分子。

合成りＮＡ断片（Ｓａｃ　Ｉ処理）及びＤＮＡ断片［（７’し）（プロ）（シュ ード）キモシンをコードするヌクレオチド配列を有する〕は、Ｔ　４　ＤＮＡリ ガーゼと共にインキュベートし、Ｃ，３，ＣＪ、２処理した太腸南（二五二）細 胞中で形質転換される。アンビアリン耐性コロニーから得られたプラスミドＤＮ Ａは種々の制限酵素で試験することができる。

新しく得られたプラスミドの名Ａｆｉのつけ方は（プレ）（プロ）ソーマチンを コードしているシラスミドと同じである（　ｐＵＲｖ　５２４−０３　、ｐＵＲ １５２３−０３、ｐＵＲ１５２１−０３及びｐＵＲ１５２２−０３）（、５ｏｃ １部位の除去も又記載しである（４全参照）。Ｓａ、ｃ　１部位を除去すること Ｋより、プラスミド１）ＵＲ１５２４−０４、ＩＩＩＵＲ１５２３−０４、ｐＵ Ｒ１５２１−０４及びｐＵＲ１５２２−０４がそれぞれ得られる（図１０を参照 ）。

６ ６、ＤＮＡ合成 目的のオリゴヌクレオチｓＢポスポトリエステル法表ダイマーのライブラリーを 用いてポリスチレン支持体上で合５レジた〔シイ−・エイ　ファンヂルマレル（ Ｇ、　Ａ、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍａｒｅｌ　）ら、レクル・トラグ・キム・ベイ ズ−バス（Ｒｅｃｌ、　Ｔｒａｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ｐａｙｓ−Ｂａｓ　）第１０ １巻、２３４−２４１頁（１’　９８２年）〕。クロロメチル化ポリスチレン（ １，３４ミリモル／ｇ）＋２−（４−ピドロキンルフェニル）エタノールテ官能 基化し〔スースンワング（Ｓｕ　−Ｓｕｎ　Ｗａｎｇ）、ジャーナル・オグ・ア メリカン・ケミカル・ソザイアティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　８ｏｃ、　） 第９５巻、１３２５−１３３３頁（１９７３年）〕、次に２′及び６′酢酸塩と レビュリン基の重合物として保護した○′リン酸化ウリジンと結合すせり〔シー ・エイ　ファンヂルマレル（Ｇ、Ａ。

ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍａｒｅｌ　）ら、上記参照、と類似）リ　こうして１６０μ モル／ｇの官能基性を有する支持体が得られた。ネックか２つぁる２０７＋ｊの す／形フラスコ（１つのネックは焼結させたガラスファイバーカバいっている） 中で合成サイクルを実施した。こうすることにより官能基化きせたポリスチレン （６０・ｎｌｔ＋下記）段階から成る合成反応中フラスコ内にとどまらせること ができた（図８参照）。

」）フ０ロピオン限／ビリジ゛ン（１：　５　Ｖ／、　）中の抱水ヒドラジ゛ン で５分間処理して「レビュリン」法ヲ除云。

２）２Ｘ２ｍ／のピリジンで洗浄っ ３）５′位をレビュリンエステルとして保護されたソヌクレオチｒ陰イオンの必 要量（６０μモル）の４倍モル量鍋剰の添加。これをピリジンと共（・て２回蒸 発させ、ＭＳＮＴ　（２４０ｐモル）を加える前に０．５ｍｌ’ｔて減少させる 〔／イー・ビー・リーズ（Ｃ，Ｂ、　Ｒｅｅｓ　）ら、テトラヒ）＋ｌ　ｏン　 レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）２７２７−２７３０頁 （１９７８年）〕９この混合液を６０分間振盪した（ただし最ｆ（ｔ）のサイク ルは９０分間行なった）。

４）２Ｘ２１１１／のピリジンで洗浄。

５）　無水酢Ｗ　（０，２ｍｌ　）とピリジ／中のジ′メチルアミノピリジン（ １，５ｍｒ　、　０．０５　Ｍ　）を加えて、未反応のヒドロギシル暴を５分間 反応させる。

６）２×２ｍｌのピリジンで洗浄。

目的とする配列が得られる丑で、適当なダイマーを用いてこのザイクル全繰返し た。２−クロロフェニールホヌフエート保護基は、無水アセ１ニトリル中の０． ３モル／ｌのｊ、１，４．４−テトラメチルグアニジウム２−ピリクンアルドキ ンメート〔ノー・ビー・リーｔ”　（Ｃ，、Ｂ、’ＲｅｅＳｅ　）ら、上記参照 〕で２４時間処理して除去した。支持体を濾過し洗浄した後、塩基保護基（ｄＡ −ベンゾイル、ｄｃ＝＝アニソゞイル、ｄＧ−シフエルアセチル）ヲ濃アンモニ ア水で５ｏ”ｃ、６ｏ時間処理して切析した。この条件では支持体に結合したウ リ３８ ジンから［１的の配列も切断される〔アール　フレア（ＲＣｒｅａ　）とティー 　・ホーン（Ｔ、　Ｈｏｒｎ　）、ヌクレイツク　ア／ノズ　リサーチ（Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）−第８巻、２ろろ１−２３４８頁（１９８ ０年）〕。支持体からの水層を濾過し蒸発させることにより粗混合液が得られ、 これをセファぞシラス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ５０のンヨートカラム（４０ 確）で０．０５　Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウムを溶出液として用いて精製 した。閲吸収物質を含む最初の５画分を集め蒸発させることにより、調製用デフ レ電気泳動に適した濃縮物を得た。

７、ＧＡＰＤＨフ０ロモーター／調節領域の構造的特徴（図２、図６） ＲＮＡポリメラーゼｌｒに認識される真核生物７０口モーター構造中ｉ−ｖ　Ｒ ＮＡ開始部位を配置で１力るのに、　ＴＡＴＡ又はＴＡＴＡＡＡ配列は重要な役 割を果たすと考えらｈる。

〔／イー・プレスブーツノ直Ｃ，Ｂｒｅａｔｈ丁＋ａｃｂ　）とピーンヤンボン （Ｐ、　Ｃｈａｍｂｏｎ　）　、アヌ・レプ　パイオチム（Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第５０巻、３４９−３８４頁（１９８１年）〕。酵母 については転写開始のヌクレオチドの長さはいろいろある［７０ヌクレオチド１ で：エム・ソエイーｒデノｙ　（Ｍ、　Ｊ、　Ｄｏｂｓｏｎ　）ら、ヌクレイノ クア／ノズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｊ、ｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　）第１０巻、 ２６２５−２’６５７頁（１９８２年）〕が、通常上記の配列に２５から３０ヌ クレオチ１１表昭ＧＯ−５０１２９０（１２） ドろ′がイ寸いたものである。ＧＡＰＤＨフ００モーター／お円節領域に関する 本研究の間に得らオＬ／こヌク１／オチド配列によると、この構造はプロモータ ー断ハの末端のあたりに位置するさらに２十ノド（ＴＡＴＡ　Ｉ！−、ＴＡＴＡ ＡＡ　）の配列が含捷れている。１３０位あたりに存肴する、５’　ＴＡＴＡＴ ＡＡ　３　’配列の塊けＧＡＰＤＨをコートゞする遺伝子の転写に関係がある可 能性か非常（で高い。−６０８と一７７０位あたりの他の２つのＴＡＴＡとＴＡ ＴＡＡＡ酊列けＧＡＰＤＨ発現の調節に関与している可能性がある［−［−計； 参照：ビー・ター・マリトラ（Ｐ、　Ｋ、　Ｍａｒｉｔｒａ、　）とゼット　ロ ｒｙｅ　（Ｚ、　ＬｏｂＯ）　ｌ　ジャーナル・オグ・バイオロジカル・ケミス リイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、第２４６巻、４８９−４９９頁（’ Ｉ　９７１　＊）ＯｏこれらのＲＮＡ開始シグナルに加えて、ＧＡＰＤＨプロモ ーター／調節、断片は、転写停止に関係があると考えられる種々のヌクレオチド 配列を有する。ケイ　ニス・す８レット（Ｋ、　Ｓ、　Ｚａ−ｒｅｔ　）とエフ ・／−ヤーマン（Ｆ、Ｓｈｅｒｍａｎ　）〔セル（Ｃｅ１ｌ　）第２８巻、５６ ５−５７５頁（１９８２年）〕は、試験した大部分の酵母の遺伝子の６′ＩＩ］ １１佃配列中に、ＴＡＧ−Ｎ−ＴＡＧＴ−Ｎ’−ＴＴＴ又はＴＡＣ）−Ｎ″−Ｔ ＡＴＧＴ−Ｎ”　−ＴＴＴ　（ここでＮ　、　Ｎ’、Ｎ”及びＮ２２はグルー７ ０間の種々の距離を示す）　、−、ＧＡＰＤＨプロモーター／調節断片中−６２ ５位近辺（ＴＡＴ−Ｎ、−ＴＡＧＴ−Ｎ、、−ＴＴＴ　）、−，５７４位近辺（ ＴＡＣ−Ｎ工、−ＴＡＧＴ−Ｎ工、−ＴＴＡ　）、−１９２位近辺（ＴＡＣ−Ｎ 、−ＴＡＴＧＴ−ＮニーＴＴＴ　）、そして−１ｓｏｉ近辺０ （ＴＡＴ−Ｎ、７−ＴＡＧＴ−Ｎ２３−ＴＴＴ　）に同じ又は同様の配列が任存 する。図６ではこれらの停止シグナルを斜線で示しである。ＧＡＰＤＨ−ｉ°Ｏ モーター／調節断片上の最大のオープン翻訳解読フレームは一４５０位から一３ ６７位才で伸びており、６８個のアミン１収の長さのベゾチドをコードしている 。−６０８位近辺のＴＡＴＡボックスはオーツ０ン解読フ１／−ムに先行してい るため、この推定上のペゾチドは転写コピーからこのＴＡＴＡ配列の下流に向か って翻訳が開始されるのであろう０％に興味深いことはこのペゾチドのＡＴＧ開 始コドンば、−４４８から−４６６に伸びるヌクレオチドと−４１９から−４０ ７に伸びるヌクレオチドの塩基対合のとき生成する二次構造の一部を成している 表し０うことである。これらの特徴は酵母のｌｅｕ　２遺伝子の状況〔エイアン ド１／アゾイス（Ａ、　ＡｎｄｒｅａａｉＳ　）ら、セルＣＣｅ１第３１巻、３ １９ｉ２５頁（１９８２年）〕を思わせ、これはＧＡＰＤＨｆ：コードする遺伝 子のＡＴＧコ１ノに先行する小ざい幹／ルーゾ構造の存在と一緒になって、ＧＡ ＰＤＨｆｆ：コードする遺伝子の発現の調節に関与しているかもしれない。

８、・／ニーＰキモシンをコードする遺伝子の下流へ、ファージＭ　１３　ＲＦ の中ノし・転写停止シグナルと共にＧＡＰＤＩ（転写停ｄ：、　／　ｆ：’ｊア デニル化領領域断片の挿入（図１２）。

ＧＡＰＤＨ転写停止Ｊ：／ボリアぞニル化領域の断片を単離するため、プラスミ ドｐＦｌ　−３３を制°根酵素ＡｆｌＨで切断した。この酵素による切断により ２つの断片が得られ、小さい方の断片の長をは１６０７ヌクレオヂ団であり、１ １位から１５１７位−までのＧＡＰＤＨ停珪／ポリアデニル化領域をカバーして いる（図１２）。この断片を単離り、ヤエナリヌクレアーゼとインキュベートし てプラント末端を作り（２を参照）、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢａｍ　 ＨＩリンカ−（５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ　３　’　）を結合させた。単離した Ａｆｌ［Ｉ断片には中間（６９０位近辺）Ｋ天然に存在するＢａｍＨＩ部位があ るため、この結合ミックスｋ　Ｂａｍ　ＨＩで消化すると２つの断片が得られる （ＡとＢ：図１２）。この断片のうち大きい方の長さは６７７タクレオチ）パで あり、ＴＡＡ翻訳停止コドンのすぐ下流（（存在するヌクレオチド配列を有する 。ｐＢＲ３２２のＢａ、ｍ　Ｈ１部位中の精製した断片へをザブクローン化する 試ツメは、形質転換体がほとんど得られなかったことと形質転換体は断片Ａと共 に断片Ｂを種々の方向に含有しでいたためうまくいかなかった。（図１２に示し たプラスミド２９４−１７を参照）。

断片Ａの不安定性を克服するため、バクチリオファ’；”　Ｍ　１３　ＲＦの中 心転写停止シグナル〔エル　エぞンス（Ｌ、　Ｅｄｅｎｓ　）ら、ヌクレイツク 　アンノズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｄ、　）第２巻、１ ８１１−１８２０頁（１９７５年）〕を使用した。Ｍ１３ＲＦをＴａｑ　ｉで消 化し、得られた断片をヤエナリヌクレアーヤゞでインキュベートしてプラント末 端にした。次にＴ　４　ＤＮＡりが一ゼで断片に旧ｎｄ　ｍ　ＩＪンカー（５’ 　ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴ３’　）を結合させた後Ｈ１ｒｒｄ’ＴＨで消化した。

２倍量のエタノールを加えてこの反応混合物からＤＮＡ　’ｉ沈殿させた。この 沈澱物を再浮遊し、４チアクリルアミＰ）ｆルの電気泳動で種々の制限断片を分 離した。このケ゛ルから、中心転写停止／グナルを含む４４１ヌクレオチドの長 さの断片を単離１７た○精製した断片をＳａｕ　５　Ａで切断した後、１５０９ から１７１７のヌクレオチドを含む断片〔ピ′−エム・’、’−７’７７　ウエ ーゼンビーク（Ｐ、　Ｍ、　Ｇ、　ｖａ、ｎＷｅｚｅｎｂｅｅｋ　）ら、ジー７ 　（Ｇｅｒ＋６　）第１・１倦、１２９−１４８頁（１９８０年）〕ヲ、Ｈｉｎ ｄｌｌｌとＢａｍ　ＨＩで消化したｐＢＲ３２’）でクローン化した（図１２） 。

（）０し）（ソロ）（シュート）キモノンをコートスる遺伝子の６７−非翻訳領 域をＧＡＰＤ）Ｊをニア−’ｌｊする遺伝子の６′−非翻訳領域により置換えた シラスミドを作るため、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）のアデニンメチラーヤ゛欠 損株からシラスミドＴ）ＵＲ１５２１−０２を単離し、制限エンドヌクレアーゼ Ｂｃｌ　Ｉで切断した０この酵素は（非メチル化）配列５′ＴＧＡＴＣＡ３′を 認識し、（プレ）（ゾ０）（７ユード）キモノンをコーＶする遺伝子をその翻訳 停止］ニコドンＴＧＡで切断する。断片ＡとＭ１３転写停止・／グナルかクロー ン化できる適切なベクター分子を作るため、　Ｂｃｌ　ｉで切断したシラスミＶ を寸すＳａｇ　Ｉでインキュベートし、次にアルカリホスファターゼでインキュ ベートシた。こうしてできた２つの制限断片のうち大きい方を０．７％アがロー スケゞルから栄離した。断片Ａの単離のため、プラスミド２９４−１７をＨｉｎ ｄ　ｍで消ｆヒし、Ｂａ、ｍＨＩで部分的にり１断した。

Ｈｐａ−（部位を含有する１０２０ヌクレオチドの長さのＨｉｎｄ　ｍ　−Ｂａ ｍ　ＨＩ断片を１％アガロ−スケゞルから１気溶出させて得た。この断片、ベク ター及び４８５ヌクレオチドの長さ）Ｈｉｎｄ　ｌＴｒ　−Ｓａ＃　’Ｔ断片（ Ｍ１３１Ｂ写停止シグナルを含有するｐＢＲ３２２より得た）をＴ　４　ＤＮＡ りが−セゞと共シてインキュベートしｒ　Ｃａ、Ｃ夕、処理したイー　コリ（旦 、竺粘）細胞中で形質転押させた。こうして最後にフ０ラスミＫ　ｐＵＲ１ｂ　 ２１−１７が得られた。同様の結果がプラスミドＩＤＵＲ１５２４−０２、ｐＵ Ｒ１５２３−０２及びｐＵＲ１５２２−０２について得られ、それぞれプラスミ ドｐＵＲ１５２４−１２、ｐＵＲ１５２３−１２及びｐＩＪＲ１５２２−１２と なるＯ 断片ＡとＭ１３転写停ｄ−シグナルを耕だに挿入しプこ構造遺伝子の下流に有す るシラスミ１の命名法は、添え字−口Ｘを一１Ｘで置換えた。

９　ノーマチン前駆体とキモシラ前駆体をコードするフ０ラスミド中への、２ミ クロンＤＮＡＶＮ製開始点と酵母のｌｅｕ　２遺伝子の導入（図１６２図１４） 。

４ 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ、ｉ　）−酵母シャトルベクターｐＭＰ８１〔図１６：ジ ー　ピー・ホレンパーグ（ｃ、　ｐ。

Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　）、カレント・トピックス　イン・マイクロバイオロジ イ　アンＶ　イムノロシイ（Ｃｕ、ｒｒｅｎｔＴｏｐｊ、ｃｓ　ｊ、ｎ　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、　ａｎｄ工ｍｍｕｎｏ１．　）、第９６巻、１１９−１４４頁（ １９８２年）〕は、プラスミミドＣＲ１〔／−コベイ（Ｃ，Ｃｏｖｅｙ　）ら、 エムジージー　（ＭＧＧ　）　、第１４５巻、１５５−１５８頁（１９７６年） 〕と、ｌｅｕ　２遺伝子と酵母２ミクロンＤＮへ〇Ｇ開始点を有するｐＪＤＢ　 ７１９の二重Ｅｃｏ　ＲＩ断片〔ジエイ・ディー・ベノグス（Ｊ、　Ｄ、　Ｂｅ ｇｇｓ　）、ネ゛イチャー（Ｎａ、ｔｕｌＴ’ｅ　）　、第２７５巻、１０４− １０９巻（１９７８年）〕より成る。］、ｅｕ２遺伝子と酵母２ミクロンＤＮＡ 複製開始点はＨｉｎｄ　ｌ’、ＩＴとＳａｌ　Ｉで消化することによりｐＭＰ　 ８１より切出すことができる。こうして得られる４、４ｋｂの長さの制限断片を ノーマチン前駆体をコードする遺伝子を含廟する種々のＩ）ＢＲ３２２誘導体に 、サツカロミセス　セレビ／工（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨ フ０（］モーター領域の種々の型と共に導入した。

同様の方法を用いて４．４　ｋｂの制限祈片全、キモシン前駆体分コードする遺 伝子を含有する種々のｐＢＲ３２２誘導体に、サツカロミセス・セレビ／工（東 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨプロモーター領域と共に導入した０ ２ミクＯ−／　ＤＮＡ　Ｍ’Ｊ開始点とＨｌｎｄ　ＩＩＴ　−ｓａｄ　Ｉ　断片 を含有する１ｅｕ２遺伝子の種々の７０ラスミドへの導入は大腸菌（Ｆｉ、　ｃ ｏｌｉ　）シラスミドをＨｉｎｄｍとＳａｌ　（で切断しく図１４参照）、次に 得られる断片をホスファターゼで処理して行なった。断片を１％アブロースゲル で電気泳動して分離した後、最も大きい断片をｔ竹離し、ｐＭＰ　８１より得た 精製したＨｉｎｄ　ｍ　−Ｓａｇ　ｌと混合し、Ｔ　４　ＤＮＡりが−ゼで結合 し、ＣａＣＪ−２処理し７だ大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）細胞に形質転換させた 。

停止断片Ａを含有する、ンユードキモシンｆコー）Ｓするプラスミド（ｐＵＲ１ ５２１−１２：図１２参殿）に、４．４　ｋｂの長さのＨｉｎｄ、　ｍ　−５ａ ｌＩ断片を同様に挿入した。この目的のために７０ラスミドＪ）ＵＲ１５２１− １２は（Ｍ１６転写山領域を除くため゛）　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩと５ａｌＩで消化 し、次に２ミクロン複製開始点とｐＭＰ８１ｐ・らの断片を含有するｌｅｕ　２ 遺伝子を挿入することができた。このフ０ラスミド構成は大腸菌（凡、ＣＯ］− １）中で安定であった。

アンヒフリン耐性形質転換体のいくつかについてプラス−ミドＤＮＡを単離し、 制限酵素解析を行なった。正しい挿入部分を有するプラスミド￥Ｃ５Ｃｊ！　− ａ　化エチジウム密度勾配遠ノし・分離で精製し、ジェイ　ディー・ペソグズ（ Ｊ、　Ｄ、　Ｂｅｇｇｓ　）、ネイチャー（Ｎａ、ｔｕｒｅ　）第２７５巻、１ ０４−１０９頁（１９７８年）の方法に従い、サツカロミセス　セレビシェ（ｓ 、　ｃｅｒｅｖｉｓｊ、ａｅ）ＡＨ２２ｋ形質転換させる〔エイ・ヒネン（Ａ、 Ｈｉｎｎｅｎ）４６ ら、フ０ロン−ディング・す／ヨナル・アカデミイ・ザイエンス　ニーニスエイ （Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　）第７５巻、１９２９−１９３３頁（１９７８年）〕のに使用した。こ うして文字コードがｐＵＫＹであるが数字コードが同じプラスミドが得られた（ ）０ラスミＫ　ｐＵＲ５２８−０３をＩＩ）ＵＲＹ　５２８−０３　Ｋ変換した 図１４を参照）。同様にしてシラスミ）ｌ’　Ｉ）ＵＲ５２２−０２、Ｔ）ＵＲ ５２３−０２、ｐＵＲｉ　５２４−０２及びｐＵＲ１５２１−０２けそれぞれ対 応する１）ＵＲＹプラスミドに変換したつ 新たに作成したプラスミｌＪｉ有する酵母形質転換体が入手できるようになった ため、遺伝子発現Ｋ　７４するフ０ラスミｒの変動の影響を追跡することができ た。この「１的のだめソーマチンの酵素結合免疫吸着法［Ｅｌｌｓａ　：エイｆ ラー（Ａ、　Ｖｏｌ、ｌｅｒ　）ら、ビ）−Ｌ／チ／ワールドヘルス　オーガン （Ｂｕｌｌ、　Ｖｌｏｒｌｄ、　ＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎ、　）第５６巻、５５ −６５頁（１９７６年）〕を開発し、酵母抽出物中に存在するノーマチン様屏白 質の定量に使用した。これらの実験で得らハ、た結果は、ｐＵＲＹ５２８　（／ ＋　４を参照）に−０２又は−０６型のＧＡＰＤＨフ００モーター全導入すると タウマチン合成は２オーダー（１００倍）よりも大きく増加することがわかった 。しかしジエイ　ビー　ホランド（、：ｒ、　ｐ。

Ｈｏ１ｔａｎ、ｉ　）とエム・ジエイ・ホランド（Ｍ、　Ｊ。

Ｈｏ１ｌａｎｄ　）の記載した２８０ヌクレオチドの長さのプ特表昭ＧＯ−５０ １２９０θ４） ロモーター断片〔ジャーナル・オグ　バイオロジイク−ミ　ス　ト　リ　イ　（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、第　２５５　巻、２５９６−２６０５頁（１９ ８０年）〕を導入すると、タウマチン合成はわずか１オーダー（約１０倍）しか 増加せず、これはＧＡＰＤＨの機仲にその−ｈ流の配列が重要な役割を果たすこ とを示１−でおり、こｈ　！、Ｚ＋ホラントゝ（Ｈｏ１ｌａｎｄ　）とホランド （Ｈｏ１ｌａｎｄ　）が得／ζ結論〔ンヤーナル・オプ・バイオロシ゛カル・ク ミヌトリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２５４巻、９８３９−　４５ 頁（１９７９年〕参照〕とは反対である。、別の実験で７０レフ００ノーマチ７ ′とプロソーマチンをニーＶする遺伝子の発現全比較し、た。プロソーマチンを コードする遺伝子の発現はほとんど無視できる秤であったが、こ′ＦＬはシグナ ル配列が遺伝子発現りて与える影響、を明瞭に示Ｉ〜でいた、Ｊ分勺・・段階の １要性は図２０に示した結果がさらに支持している。この実験はプレプロノーマ チンをコードするシラスミｒを暗、し持つ酵母細胞は、植物より単離したノーマ チ７１［分子と実質的に同じ分子窟のノーマチン様蛋白質ヲ作ることができるこ とを証明している−１ これは酵母が植物のンダナル配列シト止確に分角年することが可能であることを 示している。酵母の合成したソーマチンのアミノ末端のアミノ酸配列（ｔＣつい て最近得られたデータ（はこれを明確に示している。

結論として、得られた結果は／グナル配列が蛋白合８ 成の刺激か又１．−；ｉ酵母１（丸・ける蛋白の安定性の増加に重要な役割を果 たしていることを強く示唆している。プロソーマチンとソーマチン（寸分子量の 差が小さい（約６係）ためこれらが酵母により作られているか否かは不明である が、フ０レデロノーマチノとの差（約１０％）は図２０に示した様に容易に検出 できるっ１０ｐ引符シラスミドへのＧＡＰＤＨ転写停止／ポリアデニル化領域の 導入。

ＧＡＰＤＨ転写停止／ポリアデニル化領域のｐＵＲＹシラスミＩＳへの導入を可 能にする方法の１つは、図１２に軍さバだＡｆｌｌＩ断片の種々の部分の挿入の ためこれらのプラスミドのユニークなり１ｎｄｌＨ制限部佇を用いることである 。たとえば転写停止断片Ａ　（１２′ｊ１２　ｆ参照）は以下の様に挿入きれる 。プラスミドｐＵＲＹ　５２８−０６のＨｉｎｄ　ｉｌｌによる切：新とその後 、；５ヤエナリヌクレアーゼによる消化（２を参照）により、組状ｆヒしまたブ ラント末端プラスミド分子（図１４全参照）が得ら′）ｌる。このＤＮＡ　”； ｇ）　Ｔ　４　ＤＮＡりが一ゼと適切なりａｔｈ）ＩＩ　リンカ−とインキュベ ートすることによりこのＤ　ＮＡにＩｋｍ　ＨＩ部イ☆がＪプえらねる（８を参 照）。Ｂａｒｐ＋ＨＩで切断し、再結合させたＤＮＡを犬、陽画（Ｅ、　Ｃｏ１ １　）中へ形質転換させて、Ｈｉｒｅｄ　ＩＩＴ部位がＢａｍＨｌ　部付に置き 換えられｉコＴ）ＵＲＹ　５２８−０３プラスミドが回収てきる。

この新しく街られたＢａ、ｍ　ＨＩ　部位に転写停止トン片Ａか挿入−Ｃきるっ ２ミクロンＤＮＡにばＨｐａ　１部位かもう１つ存在するため、このフ０ラスミ ド不二Ｈｐａｉで＋ｆｉ　ｆｔすることにより１折片Ａが正しい配向で挿入さｔ しでいるか否かがわかる。

リンカ−を変えて同じ方向で、異なる末端断片が７０ラスミド分子の種々の部位 に導入できる９、１１、酵母（Ｃおける外来遺伝子の発現にＴ）、り適用できる 大腸菌（Ｅ、　ｃｏ］、ｔ　）−酵母ツヤトルベクターのイ′「成。

□酵母発現ベクターとして一般に使用するのに山川な、５及び？で記載した大腸 菌（μμ見吉）−酵Ｕひツヤトルベクターの誘導体が調製さ九る５、これらの誘 導体では、化学合成したＤＮＡ断片を・含むＧＡＰＤＨフ０Ｏモーター／Ａ節領 域がＤＮＡ開始のために使用［ＩＩ能であり、転写停止ば２ミクＤ　７　ＤＮＡ の「有能な−Ｊ　、（＋：、　Ａｂｌｅ　”）オペロンの転写停止ト／、′１′ ？リアデニル化領域（！（よりｊｉＪ能である。これらの発現ベクターへの外来 遺伝ｒの挿入は、プロモーター中のＳａ、ｃ　１部−☆と１−イ１能な−ｊオペ ロン中のＨｉｎｄ　ｒｆ１部１ヶのポモポリマー（ボ゛す（ｌＡ）″／イリング 法を、挿入すべきヌクレオチド配列のポリｃ、ｉ　Ｔティリング法と組合わせる ことに」：り可能である。

ベクター分子の調製のために、プラスミドｐＵＲＹ５２８〜口３をＨｊ−ｎｄ　 Ｉ［丁で切断した後、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）　ＤＮＡポリメラーゼ及び４ （φのｄＮＴＰと共にインギュベ−１−して、プラント末ｉ４ｉタイイする線状 化したＤＮＡ分Ｆを作ることかできる（図１５）。次にこのＤＮＡ分子をＳａｃ 　Ｔで切断し、得ら、ｌ′ｌ−る２つの断片のうち大きいｈ　ｋ　Ｏｊ　％アが ロースゲルから単離し、ジー・デンゾ（Ｇ、　Ｄｅｎｇ　）とアール　ウー（、 Ｒ，Ｗｕ　）の記載した条件〔ヌクレイツク　アンノズ　リサーチ（ＮｕＣ１ｅ ｌＣ’　ＡＣｌｄｅ　Ｒｅｓ、　）第９巻、４１７３−４１８８頁（１９８１Ｅ ）Ｅ下で、ターミナルトランスフェラーゼとｄＡＴＰと共にインキュベ−１・で きる。インキュベーション時間は、５ａｃｌの切断でできた６′末端にイてｊく テイルの長さが約２０１ＡＴＰ残基になるものでなければならない。

ボ゛ＩＪ　ｄＡが末端に付いた発現ベクターへの外来遺伝子の勇人は、この遺伝 子を含むＤＮＡと１“セラ［・の制限酵素を、目的の遺伝子がその翻訳開始コド ンの上流にできるだけ近く、翻訳停止Ｊ−コドンの下随にできるだけ近いところ で切断できる様にインキシーベートすることにより可能である。、７０ロモータ ー領域の前に転写停止ノブナルがあるため、本来のプロモーターが、得られるＤ ＮＡ断片の中に（ｄないことが重要である。精製後、切断したＤＮＡ断片にボＩ Ｊ　ｄＴのテイルが付けられる。

もし挿入すべき遺伝子がｍＲＮＡ分子の逆転写によって得られる場合は、ｓｌヌ クレアーゼ゛処理した２本鎖ＤＮＡ分子にポリｄＴのテイル全直接付けることが できる。全ての場合においてインキュベー・ノヨン時間Ｕ、約２０ヌクレオチＶ の長さのポリｔｉＴのテイルを持つものが作られるようにしなければならない。

挿入すべきＤＮＡとボ１ＪｄＡの付いたベクター分子は次に６０℃で１０分間イ ンキュベートして・・イデリダイズされ、その後ハイブリ〃゛イゼー／ヨン混合 液をゆっくり室温にもどす。次にこのＭ合液はＣａ、Ｃ／−２処理した大腸菌（ Ｅ、　ｃｏｌｉ　）細胞中に形質転換される。アンビンリン耐性形質転換体より 単離されたシラスミ）Ｆ　ＤＮＡ　！ｄ次（ｌζ酵母細胞の形質転換に使用し得 る。

１２　グリセリンアルデヒド−ろ−リン酸脱水素酵素のプロモーター／　調節領 域をコードするサノ力ロミセスセレヒン：ｆ−（Ｓ、　ＣｅｒｅＶＩＳｌａｅ　 ）の遺伝子に支配されるプレゾロノーフチンをコードする遺伝子のクルイベロ２ −７ば１．：？ｋｂのＫＡＲ８−’）　ｐＲ片を含有するフ０シｙ、　６ドＹＩ ３ｐ　７　［ｒイー　ティー　ステインチコウム（１）Ｔ、　Ｓｔｉｎｃｈｃｏ ｍｂ　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　第２８２巻、３９−４３頁（１９ ７９年）〕より成る。酵母ｔｒｐ　１遺伝子が存在するためシラスミドｐＥＫ　 ２−７はクルイベロミセス・ラクテイス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）ｓＤ１１中で 維持できる（　ｌａｃ　４　、　ｔｒｐ　１；　Ｆ−０７パ特許出願Ｎ０００９ ６９１０　；　Ａ　１の１８及び１９頁参ＧＡＰＤＨをコードする遺伝子のプロ モーター／調節領域が機能できることを証明するため、プラスミドＴ）ＵＲ５２ ８−０３（図５）にに／４Ｒ８−２とｔｒｐ　１遺伝子を付けた。ｐＥＫをＢｇ ｌ　ＩＴ　２−７で消化した後、できた断片のうち最も小さいものの０，７％ア がロースデルからの単離によりＫＡＲ８−２とｔｒｐ　１遺伝子を切出した。

この精製断片を次にＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪが一ゼとインキュベートしてｐＵＲ５ ２８−０３の脱リン酸化したＢｇ４　ｆＩ切断部位に挿入した。この結合ミック スをＣａ（Ｊ２処理した大腸ｍ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）中で形質転換させてフ０ ラスミド１）ＵＲＫ　５２８−０３を得た（図１６）ｏヨーロッパ特許出！！！ ４Ｎ０００９６９１０　；　Ａ　１に記載された方法によりこのシラスミドをク ルイベロミセス・ラクティス（、シ〜１ａｃｔｉｓ　）　Ｓ　Ｄ　１１細胞中に 導入して作った形質転換体は、プレン０ｒ＋ンーマチンを合成することが証明さ れた（図１７）。

上記の方法と同様の方法によりシラスミドｐＵＲＹ５２８−０３にＫＡＲ８−２ と酵母ｔｒｐ、　１遺伝子を付け、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ、　１ａ ｃｔｉｓ　）　５Ｄｉｌ細胞中に導入した（図１６）０同し検出法を用いてｐＵ ＲＫ　５２８−０３を持つクルイベロミセス　ラフティｙ、　（Ｋ、　１ａｃｔ ｊ、ｓ　）細胞はプレプロソーマチン産生量することが証明できた（図１７）。

しかしＴ）ＵＲＫ　５２８−６３を持つ細胞は１）ＵＲＫ　５２８−０３を持つ 細胞よりプレプロソーマチン産生量が少し多かった。シー・ケゝルパウＫ　（Ｃ ，Ｇｅｒｂａ＋ａｄ　）ら〔ソー７（Ｇｅｎｅ　）第５巻、２３３：２５３（１ ９７９年）〕が酵母のｕｒａ　３遺伝子テ、この遺伝子を２ミクロンＤＮＡのＦ 有能１Ｊコード領域内に挿入して同様の現象を観察しているため、ｐＵＲＫ　５ ２８−３３によるプレゾロノーマチノの発現上昇は、「有能な」オペロンの転写 停止／′ポリアデニル化領領域の効率的な転写停止に帰因する可能性が高い。こ の結果は、ＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域に転写される構造遺伝子の下流に 効率的な転写停止／ポリアデニル化領域が存在することが、遺伝子発現の最適化 に重要な因子であることを示している。

１３、　ＧＡＰＤＨ７’　ｏモーター／調節領域に支配される構造遺伝子の酵母 染色体への組込み（図１８１図１９）。

ＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域に支配される！！ｌ：住又は同種構造遺伝子 をコードするＤＮＡ配列、及び随時ＧＡＰＤＨ停止／ポリアデニル化領域の酵母 のケゞツムへの組込みは、アール　ジェイ・ローススタイン（Ｒ，：ｒ。

Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　）の方法〔メリンス・イン・エンサゞイモロジー（Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）第１０１巻、２ｏ２−２１１頁（１ ９８３年〕〕及びケイ・ストルール（Ｋ、　５ｔｒｕｈｌ　）の方法〔ネイチャ ー（Ｎａｔｕｒｅ　）第６０５巻、５９１−５９７頁（１９８３）］に基づき実 施できる。これらの技術を応用する基草は（１）適切なマーカー遺伝子、　（Ｉ ｉ）　酵母ケ゛ツム上に存在するＤＮＡ配列と同種のクローン化したＤＮＡ配列 及びＱｌｌ）その１寸の同種又は異種の蛋白をコードするＤＮＡ配列が入手でき ることである。

マーカー遺伝子（たとえばｌｅｕ　２．　ｔｒｐ　１．　ｈｉｓ３）と蛋白をコ ードするＤＮＡ配列（たとえばノーマチン前駆体又はキモ’／　：／　ｆ４ｊＴ 駆体をニーｒする配列）を入手することにより、　ＧＡＰＤＨプロモーターと末 端配列（図１９参照）との間の同種組換え（図１９参照）、又はマーカー遺伝子 間の同種組換えにより、蛋白をコードするＤＮＡ配列を酵母のｒツム中へ組込む ことができる〕この方法では種々の組込み部位が与えられ、外来蛋白をニーＶす るＤＮＡ配列が「野性型」マーカー遺伝子に組込まれ、この遺伝子の機能を破壊 する。

１４　構造遺伝子の化学合成。合成キメラ遺伝子の作成。

フ０レゾ１コノーマチンとプレゾロキモシンの種々の構造遺伝子（２ミクロンＤ ＮＡベクター上忙６　’）　Ｉ　ＧＡ−ＰＤＨゾＯモーター／調節領域とＧＡＰ ＤＨ停止領域の支配を受けている）のサツカロミセス・セレビシェ（３，（Ｈ６ μ二ｖｉｓｉａｅ　）中での発現実験の結果、発現収率はこれらの頃日の発酵生 産に魅力的と考えられるものではなかった。ＫＡＲ８−ベクター上の７０レプロ ソーマチン及びゾーレデロキモシン遺伝ｆの発現も経済的実現性の低いものであ った。

発現実験に観察されるもう１つの問題は、プレプロソーマシンはサツカロミセス ・セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅ−ｖｉｓｊａｅ　）及びクルイベロミセス・ラクテ イス（Ｋ、ｌａ、ｃ−畢）中で正しく分ｈ・↓された（図１７）（分解中にＣ− 末端の６個のアミノ酸も除去されたか否かは、ばつきりしない）が、７°レゾロ キモンンではこのようなτ［しい分解は認められなかったことである。

従って発現収率を上げるため、サッカ【］ミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅ ｖｌｓｌａｅ　）の好適なコドン中でプレゾロキモシンとプレプロソーマシンを 作る〔クエイ・ピー・ホランド（Ｊ、　Ｐ、　Ｈａｌ１代！］Ｌ１）とエム・ソ エイ・ホラン）−”　（Ｍ、　Ｊ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　）　：ジャーナル・オデ ・バイオロジカル・ケミスｉ・レイ（、Ｔ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２ ５５巻、２５９６−２６０５頁（１９８０年）〕ことが好ましい。これらの遺伝 子は４と６に記載した方法により合成し得る。好ましいコドンの使用によるキモ シンとソーマチンのヌクレオチド配列は図２１と図２２に示す。

４と６に記載の通り、部分的に沖゛複する配列全方す作って合成するっこの方法 では両遺伝子の種々のｈｋ熟型も同時に得られる（チャート４と５参照）。さら ＋／ｃこのアプローチでは配列の途中を変化させることも可能である。これを使 ってプレ７０ロキモシンのリーダー配列（ヌクレオチＦ’−１７４から−１２７ 、図２１）を種々の他のリーダー配列で置換することができる。

典型的な２つのリーダー配列は酸性ホスファターゼ゛の配列〔有馬　啓ら、ヌク レイツク　ア／ソズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃｘｄｓ　Ｒｅｓ、　）第 １１巻、１６５７−１６７２頁（１９８３年）〕とインベルターゼの配列６ 〔アール・タウ／ノブ（Ｒ，Ｔａｕｓｓｊ、ｇ　）とエム・カールソン（Ｍ、　 Ｃａｒｌｓｏｎ　）、ヌクレイツク　アンノズリザーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第１１巻、１９４３−１９５４頁（１９８３年）〕である 。酵母の好捷しいコドンを有するこの２つのリーダー配列をコードするヌクレオ チド配列の例を図２６に示す。一方図２４には２つの酸性ホスファターゼ／ゾロ キモシン　キメラ遺伝子とインベルターゼ／ゾロキモノン　キメラ遺伝Ｆを図示 する。プレゾロキモシンは酵母細胞（でより正しく分解されたので、ゾロキモプ ンとプレプロソーマシン遺伝子のリーダー配列のキメラ遺伝子を役割した（図１ ８）Ｏ酵母のリーダー配列の性質に関する物理化学的性質と、リーダー配列とシ グナル認識蛋白との相−９作用〔ピー・ウオルター（Ｐ、　Ｖ／ａｌｔｅｒ　） とシー・グローベル（Ｇ、　Ｂｌｏｂｓｌ　）、７’　ｏ　／−−ｒ”イノグ　 ナシ’＋　ナル・７　カーＦ’　ミ４　やサイエンス・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ、ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、第７７巻、７１１２− ７１１６頁（１９８０年）〕を考慮して、フ０ロキモシン遺伝子とキメラ遺伝子 （図２４）を作るのに使用できる２つのコンセンサスリーダー配列（図２５）を 設計した。

図の凡例 図１　酵母グリセリンアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素オペロンを含有するプ ラスミドｐＦｌ　１−６６の領域の制限エンドヌクレアーゼ切断地図。

図２ｐＦ１１−６３にクローン化したグリセリンアルデヒド−３−リン酸脱水素 酵素オペロンのプロモーター／調節領域のヌクレオチド配列。ＴＡＴＡとＴＡＴ Ａｆｉ、Ａ配列には実線の下線を引いて示し、である。

推定上の転写停止シグナルには点線の下線を引いて示しである。カッコで囲った ヌクレオチド配列は倒置した繰返し部分（１ｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔｓ　 ）を示す。６８個のアミノ酸の長さのベゾチドをコードするヌクレオチド配列は 四角く囲っである。

図３　ｐＦｔｉ　−３３にクローン化したグリセリンアル号ヒトー３−リン酸脱 水素酵素オペロンの転写停止／ポリアデニル化領域のヌクレオチド配列。。

ＡＡＴＡＡ−配列は実線の下線で示しである。推定−にの転写停止シグナルには 点線の下線を引いである。

図４　Ｅｃｏ　ＲＩ（Ｄｄｅ　Ｉ　）　０ＡＰＩ）Ｈプロモーター／調節領域断 片の、プレプロソーマシンをコードするプラスミドへの挿入の模式図と、得られ るシラスミドからのＥｃｏ　ＲＩ切断部位の除去。

図５　Ｅｃｏ　ＲＩ　（Ｄｄｅ　Ｉ　）　ＧＡＰＤＨプロモーター／調節断片を 含有する、（プレ）（プロ）（シュード）キモシンをコードするプラスミド作成 の模式図。

図６　幹とループ構造になり得ろ可能性のある部分を含有する０ＡＰＤＩ−（プ ロモーター／調節領域の構造の模式図。推定上の転写停止シグナルを斜線で示す 。

断片トの６８個のアミノ酸の長さのペプチドをコードする配列の位置はＡＴＧと ＴＡＡコドンで示しである。

図７ａ　プレゾロソーマチンをコードするヌクレオチド配列の−に流に本来の０ ＡＰＤＨ／調節領域を再構成するのに使用される合成Ｉ）ＮＡ断片の調製に関与 する種々の段階 図７ｂ（フレ）（プロ）（シュード）キモシンをコード１′るヌクレオチド配列 の一］二流に本来のＧＡＰＤＨプ「１モ一ター／調節領域を再構成するのに使用 する合成りＮＡ断片。

図８　プレプロソーマチンをコードするプラスミドへの合成Ｉ）ＮＡ断片の導入 の模式図。

図９　再構成したＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域からのＳａｃ　Ｉ部位の除 去の模式図。

図１０（フレ）（プロ）（シュード）キモシンをコードするプラスミドへの合成 りＮＡ断片の挿入の模式図１１　ポリスチレン支持体−トのＤＮＡ断片合成の全 体図。

図１２ｐＦＪ１−３３から得たＡｎ　ｆｌ　−Ｂａｍ　ＨＩ転写停止／ポリアゾ チル化断片の模式図と、シュードキモシンをコード１−るヌクレオチド配列の下 流へのＭ１６中心転写停止シグナルと組合せてのその挿入。

図１６　プラスミドｐＭｐ　８１の模式図。

図１４ｐＭｐ８１のＨｉｎｄ　ＩＩＪと５ａｌＩによる消化により得た２ミクロ ンＤＮＡ複製開始点と１ｅｕ２遺伝子の、プレゾロソーマチンをコードするプラ スミドへの導入の模式図。

図１５　酵母におけろ外来遺伝子の発現に広く適用できる大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ　）−酵母シャトルベクターの模式図。

図１６ｐＥｋ２−７のＢｇｌｌＩによる消化により得られたＫＡＲ８−２とｔｒ ｐ　１遺伝子の、プレゾロソーマチンをコードするプラスミドへの導入の模式図 。

図１７７０ラスミドｐＥｋ　２−７　（ａ　）、プラスミドｐＵＲＫ５２８−０ ３（ｂ）及びノラ／（ミド１）Ｕｌ（Ｋ、　５２８−３３（Ｃ）を含有するクル イベロミセス・ラクラは、−３５８−システィンを含有する最小培地中でろ時間 増殖させた。遠心分離して細胞を集め、１ｍ（４の２．０モル／ｌンルビト−ル 、０．０２５モル／ｌＮａ、ＰＯ４ｐｔ（７，５、１ミ　リ　モ　＃　／　（３ ＥＤＴＡ　、　１　ミ　リ　モル／　ｌ！　ＭｇＣｌ２．２．５％β−メルカプ トエタノール、１ｍ９／ｍｌｒイモラーゼ６０．０　［１０に再浮遊し、３０℃ で６０分間インキュベートした。次にスフェロプラスト（５ｐｈｅｒｏｐｌａｓ ｔ　）を遠心分離し、２　７　０　ｐｌＪ　Ｈ２ｏ　、４　ｐｌＪ　１　０　０ 　ミ　リ　モル／ｌ！　ＰＭＳＦ　。

Ｆ３　ｐｌＪ　２５０ミリモ＃／　７１　ＥＤＴＡ　、　４０　ｐ１９％ＮａＣ １そして８０μｌ　５　Ｘ　ＰＢＳＴＤＳ　（５Ｑミリモル／１ＮａＰＯ４ｐＨ ７，２、５％　ト　リ　ト　ン　Ｘ　１　０　０　、　２．５　％デオキシコレ ート、　２．５％ＳＤＳ　）を加えて溶解させた。ソーマチン様蛋白質の免疫沈 降と沈澱した蛋白の分析はエル・エデンズ（Ｌ、　Ｅｄｅｎｓ　）ら、ジーン（ （）ｅｎｅ　）第１８巻、１−１２頁（１９８２）に記載の方法に従って行なっ た。

図１８　シラスミドｐＥｋ　２−７の模式図。

図１９　（）ＡＰＤＨプロモーター／調節領域とＧＡＰＤＨ停止／ポリアデニル 化領域の転写支配を受ける、シュードキモシンをコードするヌクレオチド配列の 、酵母染色体への挿入に使用されろシラスミドの模式図２０　プラスミド１）Ｕ ＲＹ　５２８−０３を含有するサツカロミセス・セレビシェ（ｓ、　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ　）により合成された（Ｃ）、又はタウマドコンカスフルーツ（Ｔｈ ａｕｍａ、ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｒｕｉｔｓ　）の種衣から精製したｍＲＮＡの 指令を受ける小麦胚芽蛋白合成系で試験１管内（ｉｎ　ｖｊ、ｔｒｏ　）で合成 した（ｂ）、（３５Ｓ）システィン標識したソーマチン様蛋白の螢光。ａｌは放 射能マーカー蛋白〔アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）より入手〕を示し、ｄは タウマトコン力スフル−ツ（Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｒｕｉｔｓ　） の種衣より単離したソーマチンＨの位置を示す。図１７の凡例に記載した方法に より酵母の細胞を溶解した。ｍＲＮＡ小麦胚芽翻訳と免疫沈降法はエル・エデン ズ（ＬＥｄｅｎｓ　）も、ゾーン（Ｇｅｎｅ　）第１８巻、１−１２頁（１９８ ２年）に記載の方法により行なった。

図２１　サツカロミセス響セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ、ｅ　）の好 ましいコドンを使用した（フレ）（プロ）（シュート）キモシンをコードする遺 伝子のヌクレオチド配列。

図２２　サツカロミセス響セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｊ、５ｉａｅ　）の好 ましいコドンを使用した（プレ）（プロ）ソ図２６　サツカロミセス響セレビシ ェ（ｓ、　ｃｅｒｅｖ＋５１ａｅ　）の好ましい′コドンを使用した、リーダー 配列酸性ホスファターゼとインベルターゼをコードスル遺伝子のヌクレオチド配 列。

図２４　インベルターゼ、酸性ホスファターゼ又はソーマチンをコードする遺伝 子のリーダー配列、又は２つの設計されたコンセンサスリーダー配列を与えられ た、プロキモシンをコードする遺伝子の作成の模式図。

図２５２つの設計されたコンセン４スリーグー配列のヌクレオチド配列。

浄書（内容に裏足なし） 図 ４ 紙 第３図 莞５図 特表昭Ｇｏ−５０１２９００の 第７０図 第８図 鬼１０図 ■ 第１２図 第１３図 第１４図 第１６図 第１８区 日ｑ、ｌｌ＋ 毘２１図 す７加ミを又・尤しビンＩ／ＮＪｉしいコドン０アレプロキモシンのリーグ配ゲ １ＡＴＧＡＧＡＴＧ丁Ｔ　ＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴ　ＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴ　ＴＴ ＣＧＣＴＴＴＧＴ　ＣＣＣＡＡＧＧＴ−１７４−１６５−１５５−１４５−１３ ５−１２７１ｊ７カ０ミを太ヤしｒシエの望１い］ド）０ブ［１１Ｖ−）シュー ドへ化シンのＯＮ八へ−列ち力０ミャス七しどシ１の望ましいコドンのシュード バート＋１シシのＤＮＡ配列ＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＣＧＧ　ＴＡ ＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧ　ＧＴＴＴＣ−４５−３６−２６−１， ６−６−１ サツ力ロミｔス七しじシ１の望１ＬＬ’ｌトンのキモランのＤＮＡ配列范２２図 リッツ０ミセス・ヤしじシエの望ましいコドンのプレブＤソーマナンのり−ダゝ 配列すッカＤミｔス・ｔしじシエの望ましＩｓ］ドシの渣熟ソ〜７干シのＤＮＡ 配列リツす目ミを又−ｔｌ／ｒジエの７ましい］ド′シのブ白ジーマナンのＮ吋 生Ｘプ子ドＤＮＡ西υ国際調査報告 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 面イ１す彰ｌｌ３Ｈ卸１じ梨庁しく番）Ｌｊ’ｚ坑會法子４ρ込ｇｆ包３、補正 をする者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日付 昭和４０年４月３０日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 浦、、。ｉｎ。□ｌ　Ａｕ１ｋａｌｌ。１．、ＪＣＴ／ＥＰ　８４／ＱＯ１５３ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔｈｒ＋　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＩ：、５ＥＡＲＣＨＲ ＥＰＯＲＴ　ＯＮ第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ、Ｃｊ’　識別記号　庁内整理番号＠発明者　ビサール、クリステ イアーン　オミ ０発　明　者　ベリツプス、コルネリス　セオ　オドルス 一うンダ国２９０７　ブイジエイ　力ペレ　エイ／ディー　イユセル。

：ノエセルフ　７７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 のＧＡＰＤＨ遺伝子の１つのレギユロン領域の少なくとも一部を含有する。酵母 ＲＮＡポリメラーゼ■による転写を開始させることができるＤＮＡ配列において 、蛋白質合成開始のためのヌクレオチド配列領域の操作を容易にするため少な（ とも１つの制限酵素切断部位を含む様にレギユロン領域を任意に改変されている 基本的に図２に示されたＤＮＡ配列を包含することを特徴とする、上記ＤＮＡ配 列。 ヲ特徴とする、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ。 ｃｅｒｅｖｊｓｉａ、ｅ　）のＧＡＰＤＨ遺伝子の１つに属′１−ろ停止／ポリ アデニル化領域の少なくとも一部を有する、酵母ＲＮＡポリメラーゼＨによる転 写の停止、及びｍＲＮＡのポリアデニル化を行なうことが可能なりＮＡ配列。 （３）組換えＤＮＡプラスミド又は酵母染色体中へ挿入され得るＤＮＡ配列であ って、 （ｂ）　サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＰ ＤＨ遺伝子とは異なる１つ又は２つ以上の構造遺伝子、及び（Ｃ１から（ｆｌの うち少な（とも２つ、３ 又は２つ以上の特異的ＤＮＡ配列、及び／又は（ｄ）１つ又は２つ以上の選択マ ーカ、及び／又は染色体への安定な挿入を可能にする１つ又は２つ以上のヌクレ オチド配列、又は前記酵母におけるＤＮＡ複製を調節する１つ又は２つ以上のＤ ＮＡ配列、及び／又は ＋ｆ）　蛋白質の移動を助ける３０以下のアミノ酸残基より成るシグナルポリペ プチドをコードしており、構造遺伝子の上流でかつ同じ解読フレーム内に位置し ているＤＮＡ配列を包含する、上記ＤＮＡ配列。 （４）　ｆｂｌの構造遺伝子はソーマチン又はキモシン、又はそれらの各種対立 遺伝子型又は改変型（この改変型はソーマチンの甘味性やキモシンの凝乳性、又 はこれらのソーマチン様蛋白質又はキモシン様蛋白質の前駆体を損わない）をコ ードすることを特徴とする請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。 （５１（ｃ）の特異的ＤＮＡ配列は基本的に図６に示されたＤＮＡ配列であるこ とを特徴とする請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。 （６）　シグナルポリペプチドをコードする（ｆｌのＤＮＡ配列は以下のものを コードするＤＮＡ配列より成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第３ 項記載のＤＮＡ配列： ６４ ｔａｌ　サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベル ターゼを移動させるシグナルポリペプチド、すなわちＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕｉ］、ａ、−Ｇｌｙ ・Ｐｈｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ・ｌ１ｅ−８ｅｒ−Ａｌａ。 散性ホスファターゼを移動させるシグナルポリペプチド、すなわちＭｅｔ−Ｐｈ ｅ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｖａｌ　・Ｖａｌ・Ｔｈｙ−８ｅｒ　・Ｔ　］］Ｇ−Ｌｅ ｕ−ＡｌａＡｌａ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ・Ａｓｎ−Ａｌａ。 （ｃｌ　ンーマチン様蛋白質の未成熟型のシグナルポリペプチド、丁なわちＭｅ ｔ−Ａｌａ−Ａ、］、ａ・Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈ　ｅ　’　Ｐ ｈ　ｅ　’　Ｌｅ　ｕ　’　Ｐｈ　ｅ　’　Ｐ　ｒ　Ｏ’　Ｐｈｅ　’　Ｌｅ　 ｕ　’　Ｌｅ　ｕ　’　Ｌｅ　ｕ　’　Ｌｅ　Ｌ］　’　Ｔｈ　ｒ　・Ｌｅｕｏ Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ。 （ｄｌ　キモシン様蛋白質の未成熟型のソグナルボリペ−プチド、丁なわちＭｅ ｔ・Ａｒｇ・Ｃｙｓ−Ｌｅｕ・Ｖａ、１−Ｖａｌ−Ｌｅｕ・Ｌｅ　ｕ　’　Ａ　 ｌ　ａ　・Ｖａ　１　・Ｐｈ　ｅ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｅ　ｕ−３ｅ　ｒ−０１ｎ　 ’　ＯＩ　Ｙ　Ｉおよび（ｅ）２つのコンセンヤスシグナルポリペプチド、すな わちＭｅｔ・５ｅｒ−Ｌｙｓ・Ａｌａ・Ａｌａ−Ｌｅｕ・Ａｌａ−Ｐｈｅ・Ｉ　 ］、ｅ−Ａｌａ　・Ｐｈｅ−Ｖａ１４１ｅ−Ｖａｌ・Ｌｅｕ・Ｉｌｅ・Ｖａｌ・ Ａｓｎ−Ａｌａおよびに、’、ｅｔ−８ｅｒ・Ｌｙｓ・Ｐｈｅ−Ｖａｌ　・ｌ１ ｅ−Ｖａ１４ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ・Ａ［ａ　・Ａｌａ−Ｌｅｕ・Ａｌａ−Ｐｈ ｅ・Ｉｌｅ・Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ　０（７１ｆｂ）の構造遺伝子のコドン、 又はシグナルポリペプチドをコードするｆｆ）のＤＮＡ配列のコドン、又はその 両者が、酵母に好適なコドンに改変されていることを特徴とする請求の範囲第３ 項記載のＤＮＡ配列。 （８）　酵母に好適なコドンとして以下のコドンを使用６５　符表昭ＧＯ−５０ １２９０（２）することを特徴とする請求の範囲第７項記載の■っＮＡＧＡＣ又 はＧＡＴ　アスパラギン酸　ＴＴＣフェニルア５ｒ＝ンＧＡＡクルタミン酸Ａｃ ｃ又ハＡｃＹ′　スレオニンＡＴＣ又はＡＴＴ　インロイシン　ＣＴＣ又はＣＩ ’ＩＴ　バリン。 （９１ｒＤＮＡ配列を含有する酵母の調製方法において、請求の範囲第３項に記 載のＤＮＡ配列を、サツカロミセス（Ｓａ、ｃｃｈａ、ｒｏｍｙｃｅＳ　）、ク ルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）、テ／＜！　＋）　オミ（！ 　ス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、（庫ｏｄｏｔｏｒｕ、ｌａ　）酵母内に、 プラスミドとして又は酵母デノムヘ加えることにより導入することを特徴とする 、上記方法。 ａ＠　プラスミドとして又は酵母ｒツムへ導入する、請求の範囲第６項記載のｒ ＤＮＡ配列を含有する酵母。 ０υ　ｒＤＮＡ配列を含有する酵母の培養により蛋白質を調製する方法において 、請求の範囲第１０項記載の酵母を蛋白質生産のために使用し、ｒ　ＤＮＡ配列 は、該蛋白質をコードする遺伝子、又はプロセシング中に該蛋白質を生成し得る 前駆体をコードする構造遺伝子を含有することを特徴とする、上記方法。 θｚ　請求の範囲第１１項の方法により産生される蛋白質。