JPS6049480B2 - ベタイン型ポリマ−による酵素または菌体の固定化方法 - Google Patents
ベタイン型ポリマ−による酵素または菌体の固定化方法Info
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- JPS6049480B2 JPS6049480B2 JP52070214A JP7021477A JPS6049480B2 JP S6049480 B2 JPS6049480 B2 JP S6049480B2 JP 52070214 A JP52070214 A JP 52070214A JP 7021477 A JP7021477 A JP 7021477A JP S6049480 B2 JPS6049480 B2 JP S6049480B2
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- enzymes
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はベタイン型の架橋性モノマーの架橋重合体を担
体とした酵素または菌体の固定化方法に関するものてあ
る。
体とした酵素または菌体の固定化方法に関するものてあ
る。
酵素は繊維工業、食品加エ工業、医薬品製造工業などの
広い分野において、触媒として利用されている極めて作
用特異性の高い物質である。
広い分野において、触媒として利用されている極めて作
用特異性の高い物質である。
しかしながら酵素を利用する反応系においてノは、1
酵素自体が熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒などに不安
定で、酵素反応を行うのに適した条件下ても比較的速く
失活し、反応時間の経過とともに反応速度が低下するi
2酵素反応においては水に酵素を溶解させた状態で基質
に作用させるバッチ方式が採用されているので、目的と
する反応終了後に、酵素を変性除去せしめ、生成物の取
り出しを行うものてあるので、酵素が使い捨てにされる
ために不経済である3工業的に酵素反応を行う場合の粗
酵素液の使用においては、かかる触媒中に酵素以外の蛋
白質、着色物質等の夾雑物が存在するのでこれを除去す
る操作が必要となり、反応生成物の分離精製が複雑とな
り、収率の低下の原因となる等の欠点を伴うものである
。
酵素自体が熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒などに不安
定で、酵素反応を行うのに適した条件下ても比較的速く
失活し、反応時間の経過とともに反応速度が低下するi
2酵素反応においては水に酵素を溶解させた状態で基質
に作用させるバッチ方式が採用されているので、目的と
する反応終了後に、酵素を変性除去せしめ、生成物の取
り出しを行うものてあるので、酵素が使い捨てにされる
ために不経済である3工業的に酵素反応を行う場合の粗
酵素液の使用においては、かかる触媒中に酵素以外の蛋
白質、着色物質等の夾雑物が存在するのでこれを除去す
る操作が必要となり、反応生成物の分離精製が複雑とな
り、収率の低下の原因となる等の欠点を伴うものである
。
そこで、近時上述の様な欠点を除去する目的て、酵素活
性を有する安定な水不溶性のタイプに変え、これを一般
の化学反応に用いる固体触媒と同様に扱い得るようにし
た所謂固定化酵素にする方法が開発されており、その固
定化方法として(a)水不溶性の担体に酵素を結合せし
める担体結合法(b)酵素を2官能試薬と反応させて架
橋させる架橋法(c)酵素をゲルの格子の中に包み込む
か半透膜性のポリマーて被覆する包括法等が提案されて
いる。
性を有する安定な水不溶性のタイプに変え、これを一般
の化学反応に用いる固体触媒と同様に扱い得るようにし
た所謂固定化酵素にする方法が開発されており、その固
定化方法として(a)水不溶性の担体に酵素を結合せし
める担体結合法(b)酵素を2官能試薬と反応させて架
橋させる架橋法(c)酵素をゲルの格子の中に包み込む
か半透膜性のポリマーて被覆する包括法等が提案されて
いる。
上記各方法のうち、担体結合法は不溶性の固体表面に酵
素を化学結合、イオン結合あるいは物理的吸着によつて
担持せしめて固定化するものであるが、酵素活性はその
分子構造の変化に鋭敏であつて化学的に他の分子に結合
させる場合著しく失活の確率が増す。
素を化学結合、イオン結合あるいは物理的吸着によつて
担持せしめて固定化するものであるが、酵素活性はその
分子構造の変化に鋭敏であつて化学的に他の分子に結合
させる場合著しく失活の確率が増す。
イオン結合あるいは物理的吸着の場合は操作が容易ては
あるもののイオン強度やPHの変化等によつて酵素が担
体から脱落しやすく、酵素の固定化という本来の目的が
十分に達成されていない。また架橋法は酵素分子同士を
酵素分子中にある官能基を利用して二官能試薬によつて
、架橋、固定化する方法てあり、化学反応を伴うために
酵素の活性を低下させるだけでなく複雑な工程と高価な
試薬を必要とし、しばしば激しい反応条件をも必要とす
る等の欠点があり、さらに包括法はポリマーのゲルの格
子の中に酵素を取り込むかあるいはナイロンやポリウレ
ア等のポリマーの皮膜でマイクロカプセル化するもので
あるが、現在提案されているポリアクリルアミドのゲル
の中に酵素を取り込む方法は、酵素自体がゲルを作るポ
リマーと化学的に結合していないので、ゲルの格子が大
きすぎると酵素が流出する恐れがあり、また格子が小さ
すぎると酵素反応の速度が遅くなり、格子の大きさの調
節が厄介である等の欠点を有するものである。本発明は
特許請求の範囲に記載した構成とすることにより、酵素
または菌体(以下酵素等と表示する)を閉じ込めるゲル
を、酵素等と極めて親和性の大きなポリマーで構成せし
めるもので、上記のような欠点を有することのない、即
ち酵素等の活性を低下させることなく長期にわつて安定
した効力を発揮しうる固定化酵素等の製造を可能にした
ものである。
あるもののイオン強度やPHの変化等によつて酵素が担
体から脱落しやすく、酵素の固定化という本来の目的が
十分に達成されていない。また架橋法は酵素分子同士を
酵素分子中にある官能基を利用して二官能試薬によつて
、架橋、固定化する方法てあり、化学反応を伴うために
酵素の活性を低下させるだけでなく複雑な工程と高価な
試薬を必要とし、しばしば激しい反応条件をも必要とす
る等の欠点があり、さらに包括法はポリマーのゲルの格
子の中に酵素を取り込むかあるいはナイロンやポリウレ
ア等のポリマーの皮膜でマイクロカプセル化するもので
あるが、現在提案されているポリアクリルアミドのゲル
の中に酵素を取り込む方法は、酵素自体がゲルを作るポ
リマーと化学的に結合していないので、ゲルの格子が大
きすぎると酵素が流出する恐れがあり、また格子が小さ
すぎると酵素反応の速度が遅くなり、格子の大きさの調
節が厄介である等の欠点を有するものである。本発明は
特許請求の範囲に記載した構成とすることにより、酵素
または菌体(以下酵素等と表示する)を閉じ込めるゲル
を、酵素等と極めて親和性の大きなポリマーで構成せし
めるもので、上記のような欠点を有することのない、即
ち酵素等の活性を低下させることなく長期にわつて安定
した効力を発揮しうる固定化酵素等の製造を可能にした
ものである。
即ち、本発明者は、酵素の特異性を利用した酵素反応は
、一般に水系を利用して行われるものであることから、
酵素等を固定化する場合のキャリヤーとして、即ち酵素
等を閉じ込めるゲルとしては水不溶性であることが要求
されるが、酵素が有する活性の発現のためには担体たる
ポリマーが親水性てあることの方が望ましく、しかも酵
素等が存在する雰囲気を酵素等自体と極めて親和性に富
むものにすることにより、酵素等の触媒作用が安定した
状態で長期に亘つて発現されることを見い出し、本発明
を完成するに至つた。
、一般に水系を利用して行われるものであることから、
酵素等を固定化する場合のキャリヤーとして、即ち酵素
等を閉じ込めるゲルとしては水不溶性であることが要求
されるが、酵素が有する活性の発現のためには担体たる
ポリマーが親水性てあることの方が望ましく、しかも酵
素等が存在する雰囲気を酵素等自体と極めて親和性に富
むものにすることにより、酵素等の触媒作用が安定した
状態で長期に亘つて発現されることを見い出し、本発明
を完成するに至つた。
本発明は、
一般式
(式中Rl,R2,R3はそれぞれ水素またはメチル基
を、Xは−SO3または−COOを、nは1乃至20の
範囲内の整数を表わす)で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーを重合して得られるベタイン型ポリマー、あ
るいは前記一般式(1)で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーを一般式 (式中R4,R5はそれぞれ水素またはメチル基を、R
6は炭素数1乃至20のアルキル基またはアラルキル基
を、Xは−SO3または−COOを、mは1乃至20の
範囲内の整数を表わす)で表示されるベタイン型の非架
橋性のモノマーと共重合させて得られるベタイン型ポリ
マーによるゲルの格子の中に酵素等を閉じ込めることに
より酵素を固定させるものてあるので、担体として利用
されるポリマーには、ベタイン型の架橋性モノマーが有
するトリアリル型の3官能性による架橋及びゲル化によ
る水不溶性とともに、同じく架橋性モノマー及び一般式
〔■〕の共重合体の場合は該一般式〔■〕のモノマーが
有する−SO3−または−COO−による親水性が付与
されているので、酵素等を固定化する場合の担体たるポ
リマーに必要な水不溶性でしかも親水性という両者の性
質を兼有するものてある。
を、Xは−SO3または−COOを、nは1乃至20の
範囲内の整数を表わす)で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーを重合して得られるベタイン型ポリマー、あ
るいは前記一般式(1)で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーを一般式 (式中R4,R5はそれぞれ水素またはメチル基を、R
6は炭素数1乃至20のアルキル基またはアラルキル基
を、Xは−SO3または−COOを、mは1乃至20の
範囲内の整数を表わす)で表示されるベタイン型の非架
橋性のモノマーと共重合させて得られるベタイン型ポリ
マーによるゲルの格子の中に酵素等を閉じ込めることに
より酵素を固定させるものてあるので、担体として利用
されるポリマーには、ベタイン型の架橋性モノマーが有
するトリアリル型の3官能性による架橋及びゲル化によ
る水不溶性とともに、同じく架橋性モノマー及び一般式
〔■〕の共重合体の場合は該一般式〔■〕のモノマーが
有する−SO3−または−COO−による親水性が付与
されているので、酵素等を固定化する場合の担体たるポ
リマーに必要な水不溶性でしかも親水性という両者の性
質を兼有するものてある。
さらに、本発明においては、担体として生成するポリマ
ーはベタイン型を保持しているので、これと両性電解質
てある酵素等との親和性が極めて大きく、酵素等は周囲
の担体と非常になじみ易い状態に維持されることとなり
、酵素に安定した好ましい環境を与えるものである。
ーはベタイン型を保持しているので、これと両性電解質
てある酵素等との親和性が極めて大きく、酵素等は周囲
の担体と非常になじみ易い状態に維持されることとなり
、酵素に安定した好ましい環境を与えるものである。
このことは、酵素による触媒作用は、酵素の活性中心(
結合部位)て行われるが、酵素が電場など周囲の環境に
影響されて活性を低下させやすいという性質を有する。
しかも、本発明においては担体として使用されるポリマ
ーがベタイン型であるので、ポリマー自体の有する正、
負の電荷により酵素との親和性を発現する一方て、ポリ
マー自体は全体として中性てあるのて酵素に対しては悪
影響を及ぼすことがないからである。本発明は上記の通
りの構成からなるもので、一般式〔1〕で表示されるベ
タイン型の架橋lモノマーを重合させることにより、担
体たるポリマーに水不溶性かつ親水性を発現せしめ、し
かも酵素と親和性の強い環境を酵素に与えるものてある
が、特許請求の範囲第2番目に記載した構成においては
、一般式〔1〕て表示されるベタイン型の架橋性モノマ
ーを、一般式〔旧で表示されるベタイン型の非架橋性モ
ノマーと共重合させて得られるポリマーを酵素固定の担
体とするものてあり、特に酵素が触媒として使用される
場合の酵素反応系の親水性および疎水性の程度を、一般
式〔旧で表示されるベタイン型の非架橋性モノマーの種
類と量によつて加減し得るので、用途を考慮した触媒を
得るための酵素の固定方法としての特徴を有するもので
ある。
結合部位)て行われるが、酵素が電場など周囲の環境に
影響されて活性を低下させやすいという性質を有する。
しかも、本発明においては担体として使用されるポリマ
ーがベタイン型であるので、ポリマー自体の有する正、
負の電荷により酵素との親和性を発現する一方て、ポリ
マー自体は全体として中性てあるのて酵素に対しては悪
影響を及ぼすことがないからである。本発明は上記の通
りの構成からなるもので、一般式〔1〕で表示されるベ
タイン型の架橋lモノマーを重合させることにより、担
体たるポリマーに水不溶性かつ親水性を発現せしめ、し
かも酵素と親和性の強い環境を酵素に与えるものてある
が、特許請求の範囲第2番目に記載した構成においては
、一般式〔1〕て表示されるベタイン型の架橋性モノマ
ーを、一般式〔旧で表示されるベタイン型の非架橋性モ
ノマーと共重合させて得られるポリマーを酵素固定の担
体とするものてあり、特に酵素が触媒として使用される
場合の酵素反応系の親水性および疎水性の程度を、一般
式〔旧で表示されるベタイン型の非架橋性モノマーの種
類と量によつて加減し得るので、用途を考慮した触媒を
得るための酵素の固定方法としての特徴を有するもので
ある。
この共重合体による酵素の固定においては、一般式〔1
〕で表示されるモノマーにより担体たるポリマーに十分
な水不溶性と親水性とを兼備させるものであるから、一
般式〔1〕て表示されるモノマーは少なくとも1モル%
以上が必要であるが、該モノマーの全てが架橋構造に関
与することはなく、一部はフリーのまま残ると考えられ
ることから5モル%以上を使用するのが好ましい。
〕で表示されるモノマーにより担体たるポリマーに十分
な水不溶性と親水性とを兼備させるものであるから、一
般式〔1〕て表示されるモノマーは少なくとも1モル%
以上が必要であるが、該モノマーの全てが架橋構造に関
与することはなく、一部はフリーのまま残ると考えられ
ることから5モル%以上を使用するのが好ましい。
本発明において使用される前記一般式〔1〕て表示され
るモノマーの例としては、スルホメチルトリアリルアン
モニウム、スルホメチルトリメタアリルアンモニウム、
カルボメチルトリメタアリルアンモニウム、スルホエチ
ルトリアリルアンモニウム、スルホエチルトリメタアリ
ルアンモニウム、カルボエチルトリアリルアンモニウム
、カルボエチルトリメタアリルアンモニウム、スルホプ
ロピルトリアリルアンモニウム、スルホプロピルトリメ
タアリルアンモニウム、カルボプロピルトリアリルアン
モニウム、カルボプロピルメタアリルアンモニウム、及
びスルホプチルトリアリルアンモニウム、スルホヘキシ
ルトリアリルアンモニウム、スルホオクチルトリアリル
アンモニウム、スルホドデシルトリアリルアンモニウム
、スルホヘキサデシルトリアリルアンモニウム、スルホ
オクタデシルトリアリルアンモニウム並びにこれらの化
合物のスルホベタイン型化合物に対応するカルボベタイ
ン型化合物、アリル型化合物に対応するメタアリル型化
合物等の化合物が、また前記一般式〔旧で表示されるモ
ノマーの例としては、スルホメチル●メチル◆ジアリル
アンモニウム、スルホメチル・メチル◆ジメタアリルア
ンモニウム、カルボメチル・メチル●ジアリルアンモニ
ウム、カルボメチル・メチル・ジメタアリルアンモニウ
ム、スルホプロピル●エチル●ジアリルアンモニウム、
スルホプロピル●エチル・ジメタアリルアンモニウム、
カルボプロピル●エチル●ジアリルアンモニウム、カル
ボプロピル●エチル●ジメタアリルアンモニウム、スル
ホプロピル●ブチル●ジアリルアンモニウム、スルホプ
ロピル・ブチル・ジメタアリルアンモニウム、カルボプ
ロピル●ブチル●ジアリルアンモニウム、カルボプロピ
ル●ブチル●ジメタアリルアンモニウム、スルホプロピ
ル●ヘキシル◆ジアリルアンモニウム、スルホプロピル
●ヘキシル●ジメタアリルアンモニウム、カルボプロピ
ル・ヘキシル●ジアリルアンモニウム、カルボプロピル
●ヘキシル●ジメタアリルアンモニウム、スルホアミル
●ヘキシル◆ジアリルアンモニウム、スルホアミル●ヘ
キシル●ジメタアリルアンモニウム、カルボアミル・ヘ
キシル・ジアリルアンモニウム、カルボアミル●ヘキシ
ル●ジメタアリルアンモニウム、及びスルホオクチル・
デシル・ジアリルアンモニウム、スルホドデ゛シル●オ
クタデシル◆ジアリルアンモニウム、スルホプロピル●
ベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホプロピル●ヘ
キシルベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホプロピ
ル●ドデシルベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホ
プロピル●フェニルエチル◆ジアリルアンモニウム、ス
ルホプロピル●フェニルブチル●ジアリルアンモニウム
、スルホヘキシル●ベンジル◆ジアリルアンモニウム、
スルホデシル◆ベンジル◆ジアリルアンモニウム並びに
これらの化合物のスルホベタイン型化合物に対応するカ
ルボベタイン型化合物、アリル型化合物に対応するジメ
タアリル型化合物等の化合物が使用できる。
るモノマーの例としては、スルホメチルトリアリルアン
モニウム、スルホメチルトリメタアリルアンモニウム、
カルボメチルトリメタアリルアンモニウム、スルホエチ
ルトリアリルアンモニウム、スルホエチルトリメタアリ
ルアンモニウム、カルボエチルトリアリルアンモニウム
、カルボエチルトリメタアリルアンモニウム、スルホプ
ロピルトリアリルアンモニウム、スルホプロピルトリメ
タアリルアンモニウム、カルボプロピルトリアリルアン
モニウム、カルボプロピルメタアリルアンモニウム、及
びスルホプチルトリアリルアンモニウム、スルホヘキシ
ルトリアリルアンモニウム、スルホオクチルトリアリル
アンモニウム、スルホドデシルトリアリルアンモニウム
、スルホヘキサデシルトリアリルアンモニウム、スルホ
オクタデシルトリアリルアンモニウム並びにこれらの化
合物のスルホベタイン型化合物に対応するカルボベタイ
ン型化合物、アリル型化合物に対応するメタアリル型化
合物等の化合物が、また前記一般式〔旧で表示されるモ
ノマーの例としては、スルホメチル●メチル◆ジアリル
アンモニウム、スルホメチル・メチル◆ジメタアリルア
ンモニウム、カルボメチル・メチル●ジアリルアンモニ
ウム、カルボメチル・メチル・ジメタアリルアンモニウ
ム、スルホプロピル●エチル●ジアリルアンモニウム、
スルホプロピル●エチル・ジメタアリルアンモニウム、
カルボプロピル●エチル●ジアリルアンモニウム、カル
ボプロピル●エチル●ジメタアリルアンモニウム、スル
ホプロピル●ブチル●ジアリルアンモニウム、スルホプ
ロピル・ブチル・ジメタアリルアンモニウム、カルボプ
ロピル●ブチル●ジアリルアンモニウム、カルボプロピ
ル●ブチル●ジメタアリルアンモニウム、スルホプロピ
ル●ヘキシル◆ジアリルアンモニウム、スルホプロピル
●ヘキシル●ジメタアリルアンモニウム、カルボプロピ
ル・ヘキシル●ジアリルアンモニウム、カルボプロピル
●ヘキシル●ジメタアリルアンモニウム、スルホアミル
●ヘキシル◆ジアリルアンモニウム、スルホアミル●ヘ
キシル●ジメタアリルアンモニウム、カルボアミル・ヘ
キシル・ジアリルアンモニウム、カルボアミル●ヘキシ
ル●ジメタアリルアンモニウム、及びスルホオクチル・
デシル・ジアリルアンモニウム、スルホドデ゛シル●オ
クタデシル◆ジアリルアンモニウム、スルホプロピル●
ベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホプロピル●ヘ
キシルベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホプロピ
ル●ドデシルベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホ
プロピル●フェニルエチル◆ジアリルアンモニウム、ス
ルホプロピル●フェニルブチル●ジアリルアンモニウム
、スルホヘキシル●ベンジル◆ジアリルアンモニウム、
スルホデシル◆ベンジル◆ジアリルアンモニウム並びに
これらの化合物のスルホベタイン型化合物に対応するカ
ルボベタイン型化合物、アリル型化合物に対応するジメ
タアリル型化合物等の化合物が使用できる。
本発明は上記のようなモノマーを酵素を含有する水溶媒
中で(共)重合させるものであるが、この際の重合開始
剤としては、一般のラジカル重合開始剤が全て使用可能
てあり、例えは第3級ブチルパーオキサイド、クメンパ
ーオキサイドのような有機過酸化物、α、α″−アゾビ
スイソブチロニトリルのごとき脂肪族アゾ化合物、過硫
酸アンモニウム、過硫酸カリのごとき無機過酸化物、硝
酸アンモニウム、硝酸カリのごとき硝酸塩等のーー般の
ラジカル重合開始剤を使用することができ、また光重合
も可能てある。
中で(共)重合させるものであるが、この際の重合開始
剤としては、一般のラジカル重合開始剤が全て使用可能
てあり、例えは第3級ブチルパーオキサイド、クメンパ
ーオキサイドのような有機過酸化物、α、α″−アゾビ
スイソブチロニトリルのごとき脂肪族アゾ化合物、過硫
酸アンモニウム、過硫酸カリのごとき無機過酸化物、硝
酸アンモニウム、硝酸カリのごとき硝酸塩等のーー般の
ラジカル重合開始剤を使用することができ、また光重合
も可能てある。
さらに例えば過硫酸アンモニウムー亜硫酸ナトリウム系
、過硫酸アンモニウムー亜硫酸ナトリウム−ハイドロキ
ノン系、過硫酸アンモニウムー硫.酸鉄−アスコルビン
酸系のようなレドックス系開始剤を使用することもでき
る。
、過硫酸アンモニウムー亜硫酸ナトリウム−ハイドロキ
ノン系、過硫酸アンモニウムー硫.酸鉄−アスコルビン
酸系のようなレドックス系開始剤を使用することもでき
る。
酸化性のラジカル重合開始剤を使用する際に開始剤の量
が多くなると、重合中に酵素が失活する場合があるから
使用量は適宜抑えなければならな・゛い。
が多くなると、重合中に酵素が失活する場合があるから
使用量は適宜抑えなければならな・゛い。
例えばAPS−カタラーゼの場合には、開始剤がモノマ
ーに対して3〜4%以上になると失活するようである。
また、レドックス系開始剤の使用においては、ハイドロ
キノンの添加がある場合には重合収率が低下する傾向に
ある。
ーに対して3〜4%以上になると失活するようである。
また、レドックス系開始剤の使用においては、ハイドロ
キノンの添加がある場合には重合収率が低下する傾向に
ある。
また低温レドックス系開始剤、例えば過硫酸アンモニウ
ムー硫酸鉄−アスコルビン酸系は低温で重合を行うこと
ができるので酵素活性に対する温度の影響を少なくする
ことが゛てきて好ましい。重合時間は使用される開始剤
の種類によつても異なるが、酸化性開始剤の場合には時
間が長くなると酵素が酸化され、その活性が低下するの
で長時間の重合は避けるべきである。
ムー硫酸鉄−アスコルビン酸系は低温で重合を行うこと
ができるので酵素活性に対する温度の影響を少なくする
ことが゛てきて好ましい。重合時間は使用される開始剤
の種類によつても異なるが、酸化性開始剤の場合には時
間が長くなると酵素が酸化され、その活性が低下するの
で長時間の重合は避けるべきである。
本発明の方法によつて殆んど全ての酵素を固定化し得る
が、その効果が特に顕著な酵素を例示するならば、カタ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ、L−アミノ酸オキシ
ダーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アルギナー
ゼ、コリンエステラーゼ、β−グルコミダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、ペプシン
、パーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、
ウレアーゼ、ウリカーゼ等によつて代表される。
が、その効果が特に顕著な酵素を例示するならば、カタ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ、L−アミノ酸オキシ
ダーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アルギナー
ゼ、コリンエステラーゼ、β−グルコミダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、ペプシン
、パーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、
ウレアーゼ、ウリカーゼ等によつて代表される。
次に本発明の酵素の固定化方法ならびに固定化された酵
素の活性について実施例に基いて説明する。
素の活性について実施例に基いて説明する。
実施例1
スルホプロピルトリアリルアンモニウム(以下SPTA
Amと略記する)の70%水溶液(溶媒:PH6.86
の標準緩衝液)に所定量の水に所定量のカタラーゼを溶
解させた水溶液及び重合開始剤を添加し、30℃にて、
重合条件の異なる重合反応を行い、ゲル状物質を生成せ
しめ、SPTAAm重合体によるカタラーゼの固定を行
つた。
Amと略記する)の70%水溶液(溶媒:PH6.86
の標準緩衝液)に所定量の水に所定量のカタラーゼを溶
解させた水溶液及び重合開始剤を添加し、30℃にて、
重合条件の異なる重合反応を行い、ゲル状物質を生成せ
しめ、SPTAAm重合体によるカタラーゼの固定を行
つた。
重合反応条件と得られたゲル状物質の湿重量(収量)と
を第1表に示す。
を第1表に示す。
尚、得られたゲルは、予め乳鉢で潰し、ガラスフィルタ
ー中でPH7の緩衝液てよく洗つてから冷蔵庫(5℃)
にて保存し、反応に供した。
ー中でPH7の緩衝液てよく洗つてから冷蔵庫(5℃)
にて保存し、反応に供した。
幻 グルリ砥里重
前記実施例1に基いて得られた固定化カタラーゼの作用
を確認するために、実験番号B,C,Dによつて得られ
たそれぞれのゲル状物質からなる固定化カタラーゼ′B
l,Cl,Dlを2H202→2FI20+02 の反応を促進させる触媒として作用させ、過酸化水素の
分解反応の程度を実験1により計測し、固定化カタラー
ゼの活性をみた。
を確認するために、実験番号B,C,Dによつて得られ
たそれぞれのゲル状物質からなる固定化カタラーゼ′B
l,Cl,Dlを2H202→2FI20+02 の反応を促進させる触媒として作用させ、過酸化水素の
分解反応の程度を実験1により計測し、固定化カタラー
ゼの活性をみた。
実験1
30%の過酸化水素溶液10m1に、PH6.86の標
準緩衝液50m1を加え、更に水を加えて250m1に
調整した溶液から1007711を採取し、前記固定化
カタラーゼたるそれぞれのゲル状物質1gを添加し、マ
グネチツクスターラーで攪拌しながら室温にて所定の時
間反応を行ない、得られた反応液2m1をピペットアウ
トし、これをNO.lの濾紙で濾過し、得られた濾液を
、50%ヨウ化カリウム1mt112N一硫酸2TrL
11水2m1の入つている三角フラスコに採取し、10
%モリブデン酸アンモニウム2滴を加えて5分間放置後
、1/10N−チオ硫酸ナトリウムで滴定し、過酸化水
素の濃度を測定した。
準緩衝液50m1を加え、更に水を加えて250m1に
調整した溶液から1007711を採取し、前記固定化
カタラーゼたるそれぞれのゲル状物質1gを添加し、マ
グネチツクスターラーで攪拌しながら室温にて所定の時
間反応を行ない、得られた反応液2m1をピペットアウ
トし、これをNO.lの濾紙で濾過し、得られた濾液を
、50%ヨウ化カリウム1mt112N一硫酸2TrL
11水2m1の入つている三角フラスコに採取し、10
%モリブデン酸アンモニウム2滴を加えて5分間放置後
、1/10N−チオ硫酸ナトリウムで滴定し、過酸化水
素の濃度を測定した。
反応時間の経過と反応液中の過酸化水素の濃度との関係
を固定化カタラーゼ司について第2表に、また固定化カ
タラーゼBl,ClおよびD1を触媒として利用したと
きの過酸化水素の濃度の変化を無触媒下ての濃度の変化
と比較して第1図に掲示する。
を固定化カタラーゼ司について第2表に、また固定化カ
タラーゼBl,ClおよびD1を触媒として利用したと
きの過酸化水素の濃度の変化を無触媒下ての濃度の変化
と比較して第1図に掲示する。
固定化カタラーゼの添加量を変えて、該カタラーゼの活
性を次の実験2に基いて測定した。
性を次の実験2に基いて測定した。
実験2実験1と同様に30%の過酸化水素溶液10m1
に、PH6.86の標準緩衝液50m1を加え、更に水
を加えて250m1に調整した溶液から100m1を採
取し、前記実施例1によつて得られた固定化カタラーゼ
C1たるゲル状物質をそれぞれ1g,0.5g,0.2
5g,0.1g添加し、以後実験1と同様の方法で反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度を求めた。
に、PH6.86の標準緩衝液50m1を加え、更に水
を加えて250m1に調整した溶液から100m1を採
取し、前記実施例1によつて得られた固定化カタラーゼ
C1たるゲル状物質をそれぞれ1g,0.5g,0.2
5g,0.1g添加し、以後実験1と同様の方法で反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度を求めた。
反応溶液中の過酸化水素の濃度を第2図に掲示する。
本発明方法によつて得られる固定化カタラーゼの繰り返
し使用による活性の変化を次の実験3に基いて測定した
。
し使用による活性の変化を次の実験3に基いて測定した
。
実験3
実験1と同様に30%の過酸化水素溶液10m1にPH
6.86の標準緩衝液50m1を加え、更に水を加えて
250m1に調整した溶液から100m1を採取し、前
記実施例1によつて得られた固定化カタラーゼC1たる
ゲル状物質1gを添加し、マグネチツクスターラーで攪
拌しながら室温にて3紛間反応を行ない、この間の反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度の変化を実験1と同
様の方法て求めた。
6.86の標準緩衝液50m1を加え、更に水を加えて
250m1に調整した溶液から100m1を採取し、前
記実施例1によつて得られた固定化カタラーゼC1たる
ゲル状物質1gを添加し、マグネチツクスターラーで攪
拌しながら室温にて3紛間反応を行ない、この間の反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度の変化を実験1と同
様の方法て求めた。
反応終了後、反応に用いたゲルをガラスフィルターを用
いて回収しPH7の緩衝液て洗つてから上と同様の方法
て活性を測定した。第3図はこのようにして測定した固
定化カタラーゼの1回、5回、10回目の反応における
活性を示す。図より10回繰返し使用しても活性はほと
んど低下していな”いことが確認された。本発明方法に
よつて得られる固定化カタラーゼの保存性を、次の実験
4に基いて測定することにより観察した。
いて回収しPH7の緩衝液て洗つてから上と同様の方法
て活性を測定した。第3図はこのようにして測定した固
定化カタラーゼの1回、5回、10回目の反応における
活性を示す。図より10回繰返し使用しても活性はほと
んど低下していな”いことが確認された。本発明方法に
よつて得られる固定化カタラーゼの保存性を、次の実験
4に基いて測定することにより観察した。
実験4前記実施例1によつて得られた固定化カタラーゼ
B1たるゲル状物質を5℃の冷蔵庫に湿潤状態でそれぞ
れ2日、6日、9日および22日間保存したものを、実
験1と同様に30%の過酸化水素溶液10m1に、PH
6.86の標準緩衝液50m1を加え、更に水を加えて
250m1に調整した溶液から採取した100mtの溶
液に1g宛添加し、以後実験1と同様の方法により反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度の変化を求めた結果
を第4図に掲示する。
B1たるゲル状物質を5℃の冷蔵庫に湿潤状態でそれぞ
れ2日、6日、9日および22日間保存したものを、実
験1と同様に30%の過酸化水素溶液10m1に、PH
6.86の標準緩衝液50m1を加え、更に水を加えて
250m1に調整した溶液から採取した100mtの溶
液に1g宛添加し、以後実験1と同様の方法により反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度の変化を求めた結果
を第4図に掲示する。
実施例2
SPTAATT1とスルホプロピルメチルジアリルアン
モニウム(以一μSPMDAAmと略記する)とのモル
比1:1泪及び1:3.33の混合モノマーのモノマー
濃度71%水溶液(溶媒:PH6.86の標準緩衝液)
にモノマー1g当り14.24m9のカタラーゼ及びモ
ノマーに対して0.72%のAPSを添加し、30℃に
おいて8.5〜9時間共重合を行つてゲル状物質を生成
せしめ、SPTAAm−SPMDAAml共重合体ゲル
によるカタラーゼの固定を行つた。
モニウム(以一μSPMDAAmと略記する)とのモル
比1:1泪及び1:3.33の混合モノマーのモノマー
濃度71%水溶液(溶媒:PH6.86の標準緩衝液)
にモノマー1g当り14.24m9のカタラーゼ及びモ
ノマーに対して0.72%のAPSを添加し、30℃に
おいて8.5〜9時間共重合を行つてゲル状物質を生成
せしめ、SPTAAm−SPMDAAml共重合体ゲル
によるカタラーゼの固定を行つた。
得られた固定化カタラーゼを用いて、固定化カタラーゼ
添加量0.5g/100mL(反応液)、過酸化水素濃
度0.425モル/e及び反応温度30′Cにおいて*
8過酸化水素の分解反応を実施例1と同様に行つた結果
、過酸化水素の分解反応については上記両共重合体ゲル
による固定化カタラーゼはSPTAArrl重合体ゲル
による固定化カタラーゼと同等の分解促進効果を示した
。
添加量0.5g/100mL(反応液)、過酸化水素濃
度0.425モル/e及び反応温度30′Cにおいて*
8過酸化水素の分解反応を実施例1と同様に行つた結果
、過酸化水素の分解反応については上記両共重合体ゲル
による固定化カタラーゼはSPTAArrl重合体ゲル
による固定化カタラーゼと同等の分解促進効果を示した
。
実施例3
SPTAAn1とスルホプロピルプロピルジアリルアン
モニウムの1:1モル比の混合モノマーの71%水溶液
(PH6.86の標準緩衝液)にカタラーゼ14.29
mg/gモノマー)及びAPS(モノマーに対し0.7
2%)を添加し、実施例2と同様にカタラーゼの固定を
行つた。
モニウムの1:1モル比の混合モノマーの71%水溶液
(PH6.86の標準緩衝液)にカタラーゼ14.29
mg/gモノマー)及びAPS(モノマーに対し0.7
2%)を添加し、実施例2と同様にカタラーゼの固定を
行つた。
得られた固定化カタラーゼを用いて実施例2と同じ条件
で過酸化水素の分解反応を行つた結果、SPTAAm重
合体ゲルによる固定化カタラーゼと同等の分解促進効果
が認められた。
で過酸化水素の分解反応を行つた結果、SPTAAm重
合体ゲルによる固定化カタラーゼと同等の分解促進効果
が認められた。
実施例4
SPTAAm及びSPTAAm−SPMDAAm混合モ
ノマーの水溶液にグルコースオキシダーゼを添加し、A
PSを開始剤として30゜Cにおいて重合を行つてグル
コースオキシダーゼの固定化を行つた。
ノマーの水溶液にグルコースオキシダーゼを添加し、A
PSを開始剤として30゜Cにおいて重合を行つてグル
コースオキシダーゼの固定化を行つた。
重合条件は下記第3表の通りである。得られた固定化グ
ルコースオキシダーゼを用いてβ−D−(+)グルコー
スの酸化反応を行つた。
ルコースオキシダーゼを用いてβ−D−(+)グルコー
スの酸化反応を行つた。
すなわち、β−D(+)グルコースをPH6.86の標
準緩衝液に濃度0.05モル/fで溶解し、これに酸素
を吹き込んでから固定化グルコースオキシターゼ(G−
2及びG−3)を1g/100m1の割合で添加し、2
5℃において反応を行つた。反応量は所定反応時毎に反
応液を濾過し、生成した過酸化水素をヨード滴定によつ
て測定することによつて求めた。結果を第5図に示す。
*実施例5 SPTAAr]1をPH6.86の標準緩衝液に溶解し
(濃度70.4%)、これにD−アミノ酸オキシダーゼ
14.29m9(モノマー1g当り)及びAPSO.7
8%(対モノマー)を加え、30℃において7時間の重
合を行い、ゲル化させた。
準緩衝液に濃度0.05モル/fで溶解し、これに酸素
を吹き込んでから固定化グルコースオキシターゼ(G−
2及びG−3)を1g/100m1の割合で添加し、2
5℃において反応を行つた。反応量は所定反応時毎に反
応液を濾過し、生成した過酸化水素をヨード滴定によつ
て測定することによつて求めた。結果を第5図に示す。
*実施例5 SPTAAr]1をPH6.86の標準緩衝液に溶解し
(濃度70.4%)、これにD−アミノ酸オキシダーゼ
14.29m9(モノマー1g当り)及びAPSO.7
8%(対モノマー)を加え、30℃において7時間の重
合を行い、ゲル化させた。
得られた固定化D−アミノ酸オキシダーゼは次のD−ア
ミノ酸の酸化反応に対して十分な活性を保持しているこ
とが確認されている。
ミノ酸の酸化反応に対して十分な活性を保持しているこ
とが確認されている。
第1〜第5図は本発明の方法によつて得られた固定化酵
素の活性度を示すグラフである。
素の活性度を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 酵素または菌体を含有する水溶媒中にて、一般式▲
数式、化学式、表等があります▼ ・・・・・・( I ) (式中R_1,R_2,R_3は水素またはメチル基を
、Xは−SO_3または−COOを、nは1乃至20の
範囲内の整数を表わす)で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーをラジカル重合することを特徴とするベタイ
ン型ポリマーによる酵素または菌体の固定化方法。 2 酵素または菌体を含有する水溶媒中にて、一般式▲
数式、化学式、表等があります▼・・・・・・( I )
(式中R_1,R_2,R_3は水素またはメチル基を
、Xは−SO_3または−COOを、nは1乃至20の
範囲内の整数を表わす)で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーと、一般式▲数式、化学式、表等があります
▼・・・・・・(II)(式中R_4,R_5は水素また
はメチル基を、R_6は炭素数1乃至20のアルキル基
またはアラルキル基を、Xは−SO_3または−COO
を、mは1乃至20の範囲内の整数を表わす)で表示さ
れるベタイン型の非架橋性モノマーとをラジカル共重合
させることを特徴とするベタイン型ポリマーによる酵素
または菌体の固定化方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP52070214A JPS6049480B2 (ja) | 1977-06-14 | 1977-06-14 | ベタイン型ポリマ−による酵素または菌体の固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP52070214A JPS6049480B2 (ja) | 1977-06-14 | 1977-06-14 | ベタイン型ポリマ−による酵素または菌体の固定化方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS545096A JPS545096A (en) | 1979-01-16 |
JPS6049480B2 true JPS6049480B2 (ja) | 1985-11-01 |
Family
ID=13425044
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52070214A Expired JPS6049480B2 (ja) | 1977-06-14 | 1977-06-14 | ベタイン型ポリマ−による酵素または菌体の固定化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6049480B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4708998A (en) * | 1985-01-02 | 1987-11-24 | Exxon Research And Engineering Company | Cyclopolymerizable sulfobetaine monomer |
US4585846A (en) * | 1985-01-02 | 1986-04-29 | Exxon Research And Engineering Co. | Cyclopolymerizable sulfobetaine monomer |
US4822847A (en) * | 1986-01-27 | 1989-04-18 | Exxon Research And Engineering Company | Method of increasing viscosity of an aqueous solution with a sulfo betaine polymer |
CN110959050B (zh) * | 2017-08-04 | 2022-07-29 | 日东纺绩株式会社 | 电镀液添加剂及其用途 |
-
1977
- 1977-06-14 JP JP52070214A patent/JPS6049480B2/ja not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS545096A (en) | 1979-01-16 |
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