JPS6027514B2 - デキストラナ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は不完全菌でパェシロマィセス （Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属に類似する性質を有す
るが異なるデキストラナーゼ生産館を有する微生物ＴＣ
Ｉ−Ｎｏ．９０１１を培養し、その培養物からデキスト
ラナーゼを採取することを特徴とするデキストラナ−ゼ
の製造法に関するものであり、その目的とするところは
デキストランに作用させ、イソマルトースを工業的に製
造する方法、および特にう蝕原性菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃ瓜ｍｕｔａ瓜など）由釆のデキストランに作用し
、強力なデキストラン分解能を有するデキストラナーゼ
を発酵工業的に製造する方法を提供することにある。

本発明者はデキストランを基準として、土壌中の多数の
微生物について検索、検討した結果、パェシロマィセス
属菌に類似する性質を有するが異なる菌が強力なデキス
トラナーゼ生産館を有することを見い出し、デキストラ
ン分解酵素を分離することに成功し、本発明方法を完成
するに至った。

以下に本発明方法について詳述する。

まず本発明方法において用いる微生物はパェシロマィセ
ス属に類似する性質を有するが、菌叢が栄養源によつて
特異的に異なるデキストラン分解酵素生産菌であり、本
発明方法の実施例に用いた微生物は不完全菌、ＴＣＩ−
恥．９０１１（以下単に「Ｎｏ．９０１１」と称する）
であって、この菌種は本発明者の発見に係り、軽井沢地
方の土壌から分離されたものであり、昭和５７年６月２
５日附工業技術院微生物工業技術研究所へ徴工研菌寄第
６６０２号として寄託された。該ＴＣＩ−Ｎｏ．９０１
１は次の菌学的性質を有する。ＴＣＩ−Ｎｏ．９０１１
の菌学的性質【１’各培地における生育状態 ■ ツアベツク・ドック塔地 コロニーは円型、コロニーの表面は綿毛状で濃緑色の菌
叢を中心に澄色・黄色・緑色の菌論の菌叢をなし生育す
る。

■ バレイン・培地 コロニーは円型、コロニーの表面は綿毛状で中心は白色
、黄緑色の菌叢がその周辺に広がり生育する。

■ ＹＰＳＳ培地 コロニーは円型、コロニーの表面は綿毛状で、濃緑色の
菌叢が一面に広がり、局綾部は白色を示し、生育する。

■ 麦芽培地 コロニーは円型、コロニーの表面は綿毛状で、生育が進
むにつれて菌叢の色は黄緑色から階緑色に変化し、生育
は良好である。

■ 合成ムコール培地 コロニーは円型、コロニーの表面は綿毛状で、生育が進
むにつれて、菌叢の色は澄色から黄土色に変化し、生育
する。

■ オートミール培地 コロニーは円型、コロニ−表面は綿毛状で生育が進むに
つれて菌叢の色が白色から黄緑色、脂緑色に変化し、生
育良好である。

■ サブロー培地 コロニ−は円型、コロニーの表面は綿毛状で中心が青緑
色から黄緑色の菌叢が周辺に広がり生育し、表面は赤褐
色の色素を生産する。

以上の培地においてＴＣＩ一Ｍ．９０１１の生育状態は
繁夫培地内部に菌糸が侵入し、生育する性質を有し、菌
叢は一般に綿毛状となり生育する。

菌叢の色は各塔地によって異にし、デキストランを含む
培地に生育すると中心部は燈色から外部に従って青線色
の菌叢を示し生育する。色素は培地により異にするが、
主に赤褐色または黄色を示す。分生子の形成は第１図の
顕微鏡写真の通りであり、分生子は卵型で褐色、緑階色
を示す。

■ 各生理的性質■ 最適生育条件 ｐＨ６．５で好気性を示す。

最適生育温度は３０℃である。■ 生育の範囲 柵３〜８で好気性で生育し、生育し得る温度は１５ｑ０
〜３７０で特に好ましい温度は２０〜３０℃である。

｛３’各炭素源の利用性 マルトース、デキストリン、フルクトース、サツカロー
ス、でんぷん、グルコース、キシロース、ラフイノー、
マンノース、イヌ１」ン、トレハロースを利用し、酸を
生産する。

ラクトース、アラビノース、ガラクトースは酸を生産し
ない。以上の述べた性質に基づき、「微生物の分類と同
定」（長谷川武治、１９７５）「ＴｈｅＦｕ増ｉ」（Ｇ
．Ｃ．Ａｉｎｓｗｏｎｈｅｔａｌ，１９７３）に記載の
分類方法に従って比較検索した結果、不完全菌（Ｄｅｕ
ｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）の一種と考えられる。

従って不完全菌の分類基準である分生子形成とその分生
子型について比鮫懸討するとＴＣＩ−Ｎｏ．９０１１は
分生子柄は裸生で分生子柄から分生子着生までの部分は
べニチラスに似ているが、分生子の形成はフィアロスポ
ア（Ｐｈｉａｌｏｓｐｏｒｅ）型で、一見べニシリウム
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｍｍ）属に似ているが、最先端の枝
（Ｐｈｉａｌｉｄｅｓｐｒｉｇｍａ）が細長く、分生子
柄の分岐も密でなく形成も異にする。また菌叢は褐色、
綿毛状等はパェシロマィセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅ
ｓ）属に類似する点がある。

しかし本菌株は培地組成によって菌叢の色が大きく異な
り分生子の色も異なる特徴を有する。よって本発明者は
不完全菌ｎＣＩ−Ｎｏ．９０１１と命名した。

なお本発明方法においてその他その自然的および紫外線
照射、ニトロソグアニジン等による変異方法を用いて処
理した人工的変異株の使用を当然包含するものである。
次に本発明のデキストラン分解酵素の製造法についてで
あるが、パェシロマィセス属に類似する性質を有するが
異なるＴＣＩ−Ｎｏ．９０１１菌株を天然、または人工
培地に培養する。

使用塔地は液体または団体でもよいが、工業的生産には
液体培地を用いて通気蝿梓培養法が有効である。培地の
栄養源としては微生物に一般に用いられているものが用
いられる。例えば炭素源としてはデキストランが最も有
効で、窒素源としてはべプトン、酵母エキス、硝酸ナト
リウムなどが用いられる。無機塩としては、りん酸、マ
グネシウム、カリウムなどの塩類が用いられる。さらに
分子量７万のデキストランを１．０Ｗ／Ｖ％培地に基質
として添加することによってデキストラナーゼの生産は
高収率に得られる。特に好ましい培養条件は温度２５〜
３０ｑｏ、培養基のｐＨは６〜７である。培養時間は培
養条件によって異にするが通常静直培養では５〜１０日
間、通気繍梓培養では２〜３日間であるが、デキストラ
ナーゼが培養物中に最高の活性を示す時期に培養を終了
する。このようにして充分に活性を示す培養物をフィー
ルタープレス等で猿遇し、繭体を除去し、瀞液を得る。
酵素活性を有する櫨液から酵素を分離精製する方法は、
例えば塩析分別法、溶剤沈殿法、イオン交換樹脂製方法
、函気泳動などで分離精製することができる。更にこれ
らの方法を適宜組み合せることでも精製できる。このよ
うにして得られた酵素は次記のとおりの理化学的性質を
有する。酵素の理化学的諸性質 ‘１｝ 作用及び基質特異性 本酵素はＱ−１，６−グルコシド結合の多糖物質を加水
分解する性質を示し、特にグルコース、ィソマルトース
に分解する性質のエンドタイプ（ｅｎｄｏツｐｅ）であ
る。

‘２｝ 至適ＰＨ及び安定舟 本酵素の作用ｐＨは第２図の如き曲線として得られ、作
用の至適ｐＨの範囲は３〜６であり、ＰＨ５．０で最大
活性を示す。

ｐＨ安定性は第３図に示されているようにＰＨ４〜６で
ある。【３１作用適温の範囲 本酵素の作用至適温度は第４図に示されているように、
３０〜５００○であり、４０００で最大活性を示す。

また酵素の温度安定性は第５図に示されているように、
３ぴ０以下である。‘４１ 酵素に対する金属塩の阻害
、活性化および安定化本酵素はリチウム、マグネシウム
に対して安定、亜鉛、鉄、マンガン、モリブデン、コバ
ルト、カルシウム、銀、水銀に対して阻害が見られ、鉛
、スズ、銅は著しい阻害を示す。

脚 力価測定法 １％デキストラン（分子量７万）溶液１０泌に０．１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）４の‘および１の【酵素溶液
を加える。

酵素作用温度３７０で２ぴ分間反応後遊離してくる還元
糖をソモキ−・ネルソン（Ｓｏｍｏｇｙｉ，Ｎｅｌｓｏ
ｎ）法で測定し、１時間あたり１一ｍｏｌのィソマルト
ースに相当する還元糖の増加を１単位とする（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６０，６１，１９４５，１９５，１
９，１９５２）■ 分子量本酵素の分子量はゲル渡過ク
ロマトグラフィー（トョパールＨＷ−６価、東洋曹達工
業畑，製）により約４６０００である。

｛７１月ｌ 精製方法は前述及び実施例に記載のとおりでなある。

■ 元素分析法 本酵素の如き高分子の酵素で元素分析を行なって炭素、
窒素、水素及び酸素の分析値を算出してもその特性を示
すことは不可能であるので元素分析の測定は行なってい
ない。

以上説明したように本発明方法はパェシロマィセス属に
類似する性質を有するが菌叢を異にする不完全菌ＴＣＩ
−Ｎｏ．９０１１の如き本酵素の生産菌を培養し、その
培養液より強力なデキストラン分解酵素を極めて有利に
製造するものである。

以下に本発明方法を実施例によって詳述する。

実施例 １【１） 栄養源実施例 ｛ィー デキストラン（分子量７万）１％、ポリベプト
ン０．４％、酵母エキス０．３％、りん酸第１カリウム
０．１４％、りん酸第２カリウム０．０７％、硫酸マグ
ネシウム０．０５％より成る組成をＩＮ水酸化ナトリウ
ム溶液でｐＨ７．０に調整した培地２００の【を５００
泌振遼培養用フラスコに分注、滅菌した後、ＴＣＩ−Ｎ
ｏ．９０１１（徴工研菌寄託受理第６６０２号）を接種
し、３ぴ０，７幼時間振函培養した。

かくして得られた培養物をブフナーロードで櫨過した培
養櫨液についてデキストラン分解酵素活性を測定した結
果、培養液１の【あたり約１０山単位のデキストラン分
解酵素活性を有した。｛ｏ｝ デキストラン（分子量７
方）２％、石 ソーダ０．６％、りん酸第２カリウム０
．４％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸第１鉄０．
００１％、塩化カリウム０．０５％より成る組成をＩＮ
塩酸溶液でｐＨ６．０に調整した培地２００の‘を５０
０叫振遼培養用フラスコに分注、滅菌した後、ＴＣＩ−
Ｎｏ．９０１１（徴工研菌寄託受理番号第６６０２号）
を接種し、３０ｏｏで６斑寺間振鰹培養した。

このようにして得られた培養物を櫨遇した培養渡液につ
いてデキストラン分解酵素活性を測定した結果、培養櫨
液１の【あたり約１２山単位のデキストラン分解酵素活
性を有した。■ 精製実施例 栄養源実施例‘ィ｝の組成培地３０そをジャーファーメ
ンターに分注、滅菌後、栄養源実施例【ィ｝の培養液２
００の‘を接種し、３０℃で通気燈梓培養をおこなった
。

培養期間、隆時的に培養液の酵素活性を調べ、最高の酵
素活性を示す時点（約６０時間）で培養物を渡過し、培
養櫨液２５そを得た。この培養櫨液のデキストラン分解
酵素活性は１泌あたり１６８単位であった。かくして得
られた培養櫨液に硫安７０％相当量を加えて、鷹梓放置
し、沈殿してくる酵素蛋白質を遠心分離機で採取した。
この沈殿物をｐＨ６．０，ＩＭりん酸緩衝液５００叫に
溶解して溶解物をセルロース・チューブに入れ、ｐＨ６
．０，０．００１Ｍりん酸緩衝液で透析脱塩を行なった
。透析酵素溶液の活性は２３８３単位／泌（活性収率４
８％）であった。この酵素溶液を凍結乾燥し、粗酵素粉
末総を得た。

粗酵素粉末１雌あたり４２８単位であった。更に得られ
た粗酵素１００雌を柵６．０，０．０９Ｍ酢酸緩衝液１
００の上に溶解し、ｐＨ６．０，０．０８ Ｍ酢酸緩衝
液で緩衝化したイオン交換体のＣＭーセルロースに流出
させ、不純物の蛋白質を除去した。次にｐＨ６．０，０
．０９Ｍ酢酸緩衝液で緩衝化したイオン交換体のＤＥＡ
Ｅ−セルロースに前述した流出酵素液を流し、酵素を吸
着させた。その後、０．０８Ｍ酢酸緩衝液に食塩濃度（
０〜０．９Ｍの範囲）を徐々に上げて、吸着させた酵素
を溶出させ、酵素活性区分を約４５の【採取した。これ
までの収率は９５％であった。更にこの酵素活性区分を
透析脱塩した後、凍結乾燥し、１５雌の酵素精製乾燥粉
末を得た。この凍結乾燥品をゲル櫨過剤（トョパールＨ
Ｗ−６岬東洋曹達工業製）にかけ、分子量選別法により
、精製分離をおこなった。この精製分離操作で、酵素活
性区分を取り、透析脱塩した後、凍結乾燥し、精製酵素
８Ｍ（１６０山筆位／雌）を得た。実施例 ２ ィソマルトースの製造 実施例１‘ィ’に示した粗酵素溶液１８０の‘にデキス
トラン（分子量７万）５．４夕（３％Ｗ／Ｖ）を添加し
た。

この混合液を温度４ぴ０に保ち、２時間酵素反応を行な
った。酵素反応終了後、櫨過助剤（セラィト：酸性白土
＝３：ＩＶ／Ｖ）をひいたプフナーロートで吸引櫨過し
、不溶物を除去した。この酵素反応櫨液を既知の方法で
Ｈ型、ＯＨ型に調整したダイヤイオンＰＫ−２２０、ダ
イヤイオンＳＡ−２帆（三菱化成工業肌製）それぞれ１
００の上に流出させ、塩類・蛋白質等を除去した。この
酵素分解糖溶液を活性炭クロマトグラフィー（クロマト
用活性炭、和光純薬雌製）を用いて、種々の糖の吸着を
おこなった。吸着後、蒸留水より１０％メタノールの範
囲で濃度勾配をつけた溶液で、糖の溶出分離をおこなっ
た。ィソマルトースの区分約３００の‘を集め、減圧濃
縮し、エタノール１０の【を加えてィソマルトースを析
出させた。この析出したイソマルトースを櫨過法により
集め、デシケーターで減圧乾燥した。乾燥した純ィソマ
ルトース７００の２を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の使用菌不完全菌ＴＣＩ−Ｎｏ．９
０１１の顕微鏡写真であり、第２図は本発明方法による
酵素の各母における活性を示すグラフである。 第３図は本酵素の各ｐＨにおける安定性を示し、第４図
は本酵素の各温度における活性を示すグラフである。第
５図は本酵素の各温度における安定性を示すグラフであ
る。第２図 第３図 第１図 第４図 第５図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ デキストラナーゼ生産能の有する不完全菌に属する
   ＴＣＩ−Ｎｏ．９０１１を培養し、その培養物よりデキ
   ストラナーゼを採取することを特徴とするデキストラナ
   ーゼの製造法。