JPS6025929A - Encapsulated cell, manufacture and use - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はカプセル化した生活細胞、その製造方法およ
びその用途に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to encapsulated living cells, methods for their production and uses thereof.

試験管中での細胞（動物又は植物源のいずれを問わず）
の使用は最近の技術進歩にともなって新らたに注目され
つつある。たとえば試験管中でのバイブリドマスの培養
は特異性のモノクロン抗体の製造に今日、日常的に利用
されている。ノｊン細娠ラインが試験管中でこのような
バイブリドマスの形成および潜在的発ガン性および枕元
ガン性化合物の選別および試験のために利用される。又
、すい臓細胞がインシュリンの製造および導出のために
試験管中および生体中で利用される。さらに、分離され
た非可動化細胞の工業的利用が注目を集めている。なぜ
ならば、これらは生化学反応の触媒として用いることが
でき、これらの反応が合成および分析判定に重要な手段
として使用できるからである（　Ｖ＠ｎｋａｔｓｕｂｒ
ａｍａｎｉａｎ＋　”非可動化微生物細胞ｌ′。Cells in vitro (whether of animal or plant origin)
The use of is receiving new attention due to recent technological advances. For example, culturing hybrid masses in test tubes is now routinely used for the production of specific monoclonal antibodies. The non-carcinogenic lines are utilized for the formation of such hybrid masses in vitro and for the screening and testing of potentially carcinogenic and bedside cancerous compounds. Pancreatic cells are also used for the production and delivery of insulin in vitro and in vivo. Furthermore, the industrial use of isolated non-mobilized cells is attracting attention. This is because they can be used as catalysts for biochemical reactions, and these reactions can be used as important tools for synthesis and analytical determination (V@nkatsubr
amanian+ ``immobilized microbial cell l'.

１．０６　ＡＳＣシンポジウムシリーズ（１９７９）参
照）。1.06 ASC Symposium Series (1979)).

多くの場合、宿主への異物細胞の直接的導入は宿主中に
きびしい免疫応答を生じさせる。たとえば、宿主、たと
えばマウスの腹水にハイブリドマ細胞を生育させる場合
、マウスは免疫応答を防止するため予備処理しなければ
ならない。In many cases, direct introduction of foreign cells into a host generates a severe immune response in the host. For example, if hybridoma cells are grown in the ascites of a host, such as a mouse, the mouse must be pretreated to prevent an immune response.

全インシーリン細胞をヒトに注射する２、複雑な様相の
免疫応答が現われる。したがって、宿主にそのような細
胞を導入することを容易にし、試験管中で細胞の操作を
容易にする対策が要請される。When whole insulin cells are injected into humans, a complex immune response emerges. Therefore, measures are needed to facilitate the introduction of such cells into a host and to facilitate the manipulation of cells in vitro.

生活細胞ではないが生物学的に活性な物質のカプセル化
又は捕捉について多くの方法が提案されている。Many methods have been proposed for the encapsulation or entrapment of biologically active substances that are not living cells.

たとえば、米国特許！４，２５１．３８７　；属４．２
５５．４１１　；　＆　４．２５７．８８４には界面重
合により半透膜マイクロカプセルの製造法、および免疫
分析およびクロマトグラフィにおける利用が開示されて
いる。カプセル化される物質および親水性モノマーを疎
水性連続相中で乳化し、重合はこの連続相中に第２のモ
ノマーを溶解させることによって開始され、重合は親水
性滴状体と疎水性連続相との界面でのみ形成され、その
結果、マイクロポーラスで不明確なカプセル膜が形成さ
れる。親水性モノマーに対する連続相の親和性は連続相
の極性を変えることにより変化させることができ、均一
なカプセル膜および所定の透過性を有するマイクロカプ
セルがつくられる。米国特許Ａ３，７８０，１９５には
活性物質のカプセル化が開示されている。それによれば
、殻組成物用溶媒中に活性物質と殻組成物とを分散させ
てカプセル組成物全形成し１これを分散相中に活性物質
を含む粒子となし、ついで低分子ポリグリコールを添加
することにより殻組成物から溶媒を除去する。この脱溶
媒化操作は最初にカプセル組成物を粘性の白鉱物油に分
散させて個々に分離した粒子を形成させ、ついで無水ポ
リグリコールを添加することにより促進される。この殻
物質としては卵および血液アルブミン等のタン・ｆり質
が用いられる。その他米国特許屋２，８８９，２５２　
；Ａ３，６９１，０９０；煮３，７１４，０６５；應３
，５１６，９４２；Ａ３，６６４，９３．６　；Ａ３，
６４２，９７８　；Ａ　３．１３７．６３１に薬剤のカ
プセル化が開示されている。米国特許Ａ　３．１３７．
６３１にはアルブミンの如き天然物質中にてカプセル化
をおこない、ついでホルムアルデヒド、グリオキサール
等の架橋剤で処理してカプセル膜の安定性を向上させる
方法が開示されている。For example, a US patent! 4,251.387 ; Genus 4.2
55.411; & 4.257.884 discloses the production of semipermeable membrane microcapsules by interfacial polymerization and their use in immunoassays and chromatography. The substance to be encapsulated and the hydrophilic monomer are emulsified in a hydrophobic continuous phase, the polymerization is initiated by dissolving the second monomer in this continuous phase, and the polymerization is formed by dissolving the hydrophilic droplets and the hydrophobic continuous phase. , resulting in the formation of a microporous and ill-defined capsule membrane. The affinity of the continuous phase for hydrophilic monomers can be varied by changing the polarity of the continuous phase, creating microcapsules with uniform capsule membranes and predetermined permeability. US Patent A3,780,195 discloses encapsulation of active substances. According to this, a capsule composition is formed by dispersing the active substance and the shell composition in a solvent for the shell composition, 1 this is made into particles containing the active substance in the dispersed phase, and then a low molecular weight polyglycol is added. The solvent is removed from the shell composition by. This desolvation operation is facilitated by first dispersing the capsule composition in viscous white mineral oil to form discrete particles and then adding the anhydrous polyglycol. As the shell material, egg and protein such as blood albumin are used. Other U.S. Patent Office 2,889,252
;A3,691,090;Ni3,714,065;3
,516,942;A3,664,93.6;A3,
642,978; A 3.137.631 discloses the encapsulation of drugs. US Patent A 3.137.
No. 631 discloses a method for improving the stability of the capsule membrane by encapsulating it in a natural substance such as albumin and then treating it with a crosslinking agent such as formaldehyde or glyoxal.

各種薬剤を均質に分散させて軟質固形マイクロ粒子（カ
プセルではない）を形成する方法が米国特許Ａ４，１８
７．２８５　（アルブミン中にテクネチウム−９，９ｍ
’ｚ分散させたもの）；煮４、１４７．７６７　（血清
アルブミン中に薬剤を分散させたもの）；煮４，１０７
，２８８（架橋された血清アルブミン粒子に薬剤を分散
させたもの〕；煮３，９３７，６６８（薬剤、殺虫剤、
染料等を含有させたアルブミン粒子）　；Ａ４，０２４
，２３３（錫を分散させたマイクロ凝集化ヒト血清アル
ブミン）　；Ａ４，０９４，９６５等に開示されている
。A method for homogeneously dispersing various drugs to form soft solid microparticles (not capsules) is disclosed in U.S. Patent A4,18.
7.285 (technetium-9.9m in albumin)
'z Dispersion); Boiled 4, 147.767 (Drug dispersed in serum albumin); Boiled 4,107
, 288 (drugs dispersed in cross-linked serum albumin particles); Boiled 3,937,668 (drugs, insecticides,
Albumin particles containing dye etc.); A4,024
, 233 (micro-aggregated human serum albumin with tin dispersed therein); A4,094,965, etc.

又、種々の微生物、たとえば・々クチリア、ウィルス等
の抗原を含む多種の物質のマイクロカプセル化が本願発
明と同時に係属する米国特許出願Ａ１９４，１２７に記
載されている。その出願の方法は溶媒中に活性剤を溶解
又は分散させ、この溶媒中にさらに膜壁形成物質を溶解
させる方法、すなわち、活性剤と膜壁形成物質を含む溶
媒を連続軸加工媒体中に分散させ、分散工程からの溶媒
の一部を揮散させて、懸濁液中に活性物質を含むマイク
ロカプセルを形成させ、最後に、マイクロカプセルから
溶媒の残りを抽出させる方法である。Microencapsulation of a wide variety of substances, including antigens of various microorganisms, such as cutilia, viruses, etc., is also described in co-pending U.S. Patent Application No. 194,127. The method of the application is a method of dissolving or dispersing an active agent in a solvent and further dissolving a film wall-forming substance in this solvent, that is, a method in which a solvent containing an active agent and a film wall-forming substance is dispersed in a continuous shaft processing medium. The method involves evaporating a portion of the solvent from the dispersion step to form microcapsules containing the active substance in suspension, and finally extracting the remainder of the solvent from the microcapsules.

これらの多くの公知技術を生活細胞に適用するとなると
多くの問題が生ずる。すなわち、公知技術の多くは生活
細胞の生存を維持させるのには条件がきびしすぎる。た
とえば、有機溶媒、高温、反応性モノマー、架橋条件の
使用は生活細胞の生存を危くする。さらに細胞の脱水又
は浸透圧破損を避けるのも容易ではない。さらに大きい
問題は栄養分と排出生成物の透過を膜壁に具備させるこ
との必要性である。もし、細胞がマイクロ分子又は生物
学的集団、たとえば抗体又はプイリオンの源として使用
される場合、このようなマイクロ分子の排出を許容する
大きさの孔を膜壁に具備させなければならない。細胞が
カプセル化され、それが宿主に注射されたときは、これ
らが、マイクロ分子又は生物学的集団の源とならなけれ
ばならず、その孔はマイクロ分子又は集団の排出を許容
し得る正しい直径のもので、かつ宿主の免疫システムの
ためにマイクロカプセル化された細胞を破壊するような
宿主の分子又は細胞の浸入を防止し得る径のものでなけ
ればならない。Many problems arise when applying these many known techniques to living cells. In other words, many of the known techniques have conditions that are too harsh for maintaining the survival of living cells. For example, the use of organic solvents, high temperatures, reactive monomers, and crosslinking conditions compromise the survival of living cells. Furthermore, it is not easy to avoid cell dehydration or osmotic damage. An even bigger problem is the need to provide membrane walls for passage of nutrients and excreted products. If cells are used as a source of micromolecules or biological populations, such as antibodies or molecules, the membrane wall must be provided with pores of a size that allow the egress of such micromolecules. When cells are encapsulated and injected into a host, they must be the source of the micromolecules or biological population, and the pores must be of the correct diameter to allow the egress of the micromolecules or population. The microencapsulated cells should be of a size that prevents the entry of host molecules or cells that would destroy the microencapsulated cells due to the host's immune system.

そのため、生活細胞の生活力を維持させ得るゆるい条件
下で生活細胞をカプセル化することができ、かつカシセ
ルの膜壁に適当に制御された孔を形成し得る方法が要望
されていた。Therefore, there has been a need for a method that can encapsulate living cells under mild conditions that can maintain the vitality of the living cells, and that can form appropriately controlled pores in the membrane wall of the Cassicel.

この発明は上記事情に＠みてなされたものであって、生
活細胞のカプセル化およびその用途を提供することを目
的とする。This invention was made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide encapsulation of living cells and uses thereof.

すなわち、この発明は架橋化タン・やり室壁からなるカ
シセル中に収容してなる生活細胞を含む組成物を提供す
るものである。That is, the present invention provides a composition containing living cells housed in a case cell made of a crosslinked tongue chamber wall.

さらに、この発明は （、）　生活細胞をカプセル壁形成タン・臂り質の水溶
液中に分散させる工程と； （ｂ）　水性非混和性、細胞相容性連続的処理媒体中に
て」二艷細胞含有媒体の水性滴状物を形成する工程と； （ｃ）該処理媒体に可溶で上記水性滴状物に実質的に不
溶性の架橋剤で上記タン・臂り質を架橋させる工程と； を具備する生活細胞のカプセル化法を提供するものであ
る。Further, the present invention comprises (a) dispersing living cells in an aqueous solution of capsule wall-forming tongue and lining material; forming aqueous droplets of a cell-containing medium; (c) crosslinking the tongue and tongue with a crosslinking agent that is soluble in the treatment medium and substantially insoluble in the aqueous droplets; The present invention provides a method for encapsulating living cells comprising:

本発明はカプセル化生活細胞のゆるやかで、かつ効率的
な製造を提供するものであり、これは制御された多孔質
カプセル膜壁の形成に適した条件を見出したことに基づ
くもので、その結果、ハイブリドマ生育、薬剤導出等積
々の領域においてカプセル化細胞の使用が可能となる。The present invention provides a gradual and efficient production of encapsulated living cells, and is based on the discovery of conditions suitable for the formation of controlled porous capsule membrane walls, resulting in Encapsulated cells can be used in a wide range of areas, including hybridoma growth, drug derivation, etc.

上述の如く本発明の方法は３つの段階、すなわち、 （、）　生活細胞をカプセル壁形成タンパク質の水溶液
中に分散させる工程と； （ｂ）　水性非混和性、細胞相容性連続的処理媒体中に
て上記細胞含有媒体の水性滴状物を形成する工程と； （、）　該処理媒体に可溶で上記水性滴状物に実質的に
不溶性の架橋剤で上記タン・母り質を架橋させる工程と
； ふらなるものである。As described above, the method of the present invention involves three steps: (a) dispersing living cells in an aqueous solution of capsule wall-forming proteins; (b) dispersing living cells in an aqueous immiscible, cell-compatible continuous processing medium; forming aqueous droplets of the cell-containing medium; (a) crosslinking the tongue-matrix with a crosslinking agent soluble in the treatment medium and substantially insoluble in the aqueous droplets; The process is a random thing.

この方法の第１の工程は最終的にカプセル膜壁を形成す
るタンパク質溶液の形成である。したがって、この膜壁
物質は水は実質的に水性の溶液に可溶でなければならず
、架橋されてカプセルを形成し得るものでなければなら
ない。この水溶性タンノック質の適当な例としてはカゼ
イン、コラーゲン、ゼラチン、大豆タンノ’？り、グル
テン、アルブミン、免疫グロブリン、又はこれらの変性
物あるいは誘導体である。この殻形成タンパクは水性溶
媒中に、好ましくはその実用的最少量を用いて、溶解す
る。その溶媒量は装置で取扱い可能な粘度を超えるもの
であってはならない。さらに、その粘度は細胞の良好な
分散が得られる程度としなければならない。たとえばタ
ン・臂り質を５〜９５重量係、好ましくは５〜２５重量
％含むようにする。この段階で、抗酸化剤、保存剤、界
面活性剤を含めてもよい。The first step in this method is the formation of a protein solution that ultimately forms the capsule membrane wall. Therefore, the membrane wall material must be soluble in substantially aqueous solutions and must be capable of being crosslinked to form capsules. Suitable examples of water-soluble tannock substances include casein, collagen, gelatin, and soybean tannin. gluten, albumin, immunoglobulin, or modified products or derivatives thereof. The shell-forming protein is dissolved in the aqueous solvent, preferably using the minimum practical amount thereof. The amount of solvent should not exceed the viscosity that can be handled by the equipment. Furthermore, the viscosity must be such that good dispersion of the cells is obtained. For example, the amount of tongue and buttock material is 5 to 95% by weight, preferably 5 to 25% by weight. Antioxidants, preservatives, and surfactants may be included at this stage.

このタン／Ｊ？り賃金有殻形成溶液に対し、カプセル化
されるべき細胞の懸濁液を加える。これら細胞は後述の
如く、適当な栄養含有媒体、たとえば塩、還元剤、抗生
物質、血清、緩衝剤等を含む培養媒体に添加して用いら
れる。試験管中での動物細胞ラインのための、又は微生
物のための培養媒体は公知である。細胞は破壊を防止す
るため、ゆるやかな方法を用いて殻形成タンパク含有溶
液に均一に分散される。他の方法としては、殻形成タン
パク含有溶液を最初に適当な培養媒体に添加し、この中
間溶液を滅菌し、これに生活細胞を含むペレットその他
の適当な形状のものを添加する。これらの細胞をついで
懸濁液中に分散させる。添加される細胞の数はマイクロ
カプセル中の所望濃度によって定められるが、一般に溶
液１ゴ当り１０　〜１０　個、好ましくは１０４〜１０
８個の範囲で使用される。This tan/J? Add the suspension of cells to be encapsulated to the shell-forming solution. These cells are used by being added to a culture medium containing an appropriate nutrient-containing medium, such as salt, reducing agent, antibiotics, serum, buffer, etc., as described below. Culture media for animal cell lines in vitro or for microorganisms are known. The cells are uniformly dispersed in the shell-forming protein-containing solution using a gentle method to prevent destruction. Another method is to first add the shell-forming protein-containing solution to a suitable culture medium, sterilize this intermediate solution, and add to it a pellet or other suitable form containing living cells. These cells are then dispersed into a suspension. The number of cells added is determined by the desired concentration in the microcapsules, but is generally 10 to 10 cells, preferably 10 to 10 cells per solution.
Used in a range of 8.

この発明の方法の第２の段階は連続的処理媒体（又は加
工媒体）中に水相を分散させることである。この処理媒
体は水相と混和しないものでなければならない。この水
性非混和相の剥きしては鉱油又は非鉱質油であって、生
活細胞と、この連続媒体が相容性全有することが条件と
される＠すなわち、この連続相は製造中において、細胞
代謝を害しないか妨害しないことが必要とされる。この
水性非混和相の例としては、シリコーンオイル、ピーナ
ツ油、綿実油、ゴマ油等である。界面活性剤（乳化剤）
をこの連続的処理媒体に加えて、マイクロカプセルが凝
集するを全防止したり、エマル−）ヨン中でのマイクロ
滴状体の大きさを制御するようにしてもよい。The second step of the method of this invention is to disperse the aqueous phase in the continuous processing medium. This treatment medium must be immiscible with the aqueous phase. This aqueous immiscible phase must be stripped of mineral oil or non-mineral oil and must be completely compatible with the living cells and this continuous medium during production. It is required that it not harm or interfere with cellular metabolism. Examples of this aqueous immiscible phase are silicone oil, peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, and the like. Surfactant (emulsifier)
may be added to this continuous processing medium to completely prevent agglomeration of the microcapsules or to control the size of the microdroplets in the emulsion.

この分散体はコロイドミル、ホモ？ナイザー等の装置に
よって連続相処理媒体を機械的に攪拌することによって
得られる。簡単な機械的攪拌器を用いることもでき、又
そのようなものはより好ましいと云える。その理由は細
胞の破壊を防止するために十分にゆるやかな攪拌が要請
されるからである。エマルジョンはこの連続相処理媒体
に水溶液の小滴を添加することによって形成することも
できる。この分散工程の好ましい例としては水溶液をゴ
マ油中に分散させることである。Is this dispersion colloid mill or homo? It is obtained by mechanically agitating the continuous phase processing medium by means of a device such as a nizer. A simple mechanical stirrer can also be used and is preferred. The reason for this is that sufficiently gentle stirring is required to prevent cell destruction. Emulsions can also be formed by adding droplets of an aqueous solution to this continuous phase processing medium. A preferred example of this dispersion step is to disperse the aqueous solution in sesame oil.

水溶液の形成およびこの水溶液の処理媒体中への分散に
おける温度は特に制限はないが、マイクロカプセルの大
きさ、品質に影きょうを与える。さらに、用いられる連
続相処理媒体の種類によっては、その温度は低過ぎては
ならない。The temperature at which the aqueous solution is formed and the dispersion of this aqueous solution into the processing medium is not particularly limited, but it will affect the size and quality of the microcapsules. Furthermore, depending on the type of continuous phase processing medium used, its temperature must not be too low.

低過ぎると水性溶媒および処理媒体が固化するか重粘に
なり過ぎて実用的に取扱い不能となるからである。他方
、この温度が高すぎても、処理媒体が蒸発して細胞の生
活力が失われることになる。したがって、この分散工程
は安定な操作条件に維持し得る温度、好ましくＩ′ｉｏ
℃ないし４０℃の範囲、特に好ましくは２５℃ないし３
７℃の範囲とすべきである。This is because if it is too low, the aqueous solvent and processing medium will solidify or become too thick and viscous, making it practically impossible to handle. On the other hand, if this temperature is too high, the treatment medium will evaporate and the cells will lose their vitality. This dispersion step is therefore carried out at a temperature that can be maintained under stable operating conditions, preferably I'io.
℃ to 40℃, particularly preferably 25℃ to 3℃
It should be in the range of 7°C.

第２の工程において、安定なエマルションを維持し得る
ものであれば水性滴状体の量についての制限はない。し
力≧し、その量が大きすぎて２つの異なる滴状体間で架
橋が生じたり、逆に小さすぎて処理後にマイクロカプセ
ルが回収できなくなっても良くない。理想的には水相対
処理媒体の割合は０．１〜９９容量部対１００容量部の
範囲、より好ましくは１〜５０容量部対１００容量部の
範囲とすべきである。In the second step, there is no limit to the amount of aqueous droplets as long as a stable emulsion can be maintained. It is not good if the force is too large and cross-linking occurs between two different droplets, or if it is too small and the microcapsules cannot be recovered after treatment. Ideally the ratio of water to treatment medium should range from 0.1 to 99 parts by volume to 100 parts by volume, more preferably from 1 to 50 parts by volume to 100 parts by volume.

処理媒体中の水性滴状体の安定なエマルジョンに対して
架橋剤が次に添加される。この架橋剤は官能基および構
造について多くの条件が必要である。第１に架橋剤は連
続的処理媒体に実質的に可溶であり、水性滴状体に不溶
でなければならない。この条件は極めて重要である。な
ぜならば、これが水性滴状体への架橋剤の導入を防止し
、したがって細胞相互の広範な架橋又は細胞とカプセル
の内壁との架橋の可能性を防止するための制御要−累と
なるからである。はとんどの細胞が表面にタン・ぞり質
を含み、これらのクン・臂り質が架橋剤と架橋し得る基
を有するから、架橋剤の水溶性は回避されなければなら
ない。この架橋剤がほとんど排他的に非水性連続相に可
溶であるため、架橋反応は水性滴状体と非水性連続相と
の間の界面でほとんど起り、界面型架橋が得られる。A crosslinking agent is then added to the stable emulsion of aqueous droplets in the processing medium. This crosslinking agent requires many requirements regarding functional groups and structure. First, the crosslinking agent must be substantially soluble in the continuous processing medium and insoluble in the aqueous droplets. This condition is extremely important. This is because this constitutes a control element to prevent the introduction of cross-linking agents into the aqueous droplets and thus the possibility of extensive cross-linking between cells or between cells and the inner wall of the capsule. be. Water solubility of the cross-linking agent must be avoided since most cells contain on their surface tunica and these tunica possess groups that can be cross-linked with the cross-linking agent. Since this crosslinker is almost exclusively soluble in the non-aqueous continuous phase, the cross-linking reaction occurs mostly at the interface between the aqueous droplets and the non-aqueous continuous phase, resulting in interfacial cross-linking.

第２の条件は架橋剤の架橋能が適当な製造温度で起るこ
とである。第３の条件は少なくとも二官能価のものであ
って、タンノｅり質殻物質上で少なくとも２以上の架橋
可能域で架橋できるものであることである。第４の条件
は架橋剤が安定なエマルジョンの条件の下でタン・ｆり
質の天然の官能基と容易に反応する基を有することが必
要とされる。このような官能基の例は水酸基、アミノ基
、カルブキシル基、チオール基である。より好ましくけ
末端アミン基又はリシンのε−基の如きタンパク質のア
ミン基が利用される。The second condition is that the crosslinking ability of the crosslinking agent occurs at a suitable manufacturing temperature. The third condition is that it is at least difunctional and can be crosslinked in at least two or more crosslinkable regions on the charcoal material. The fourth condition requires that the crosslinking agent have a group that readily reacts with the natural functional groups of the protein under stable emulsion conditions. Examples of such functional groups are hydroxyl, amino, carboxyl, thiol groups. More preferably, terminal amine groups or protein amine groups such as the ε-group of lysine are utilized.

本発明における架橋剤の好ましい例としては油溶性ハロ
ダン化二酸でありて、タン・母り質アミノ基とアミド結
合を形成し得るものである。A preferred example of the crosslinking agent in the present invention is an oil-soluble halodanated diacid, which is capable of forming an amide bond with a tan/matrix amino group.

たとえば、Ｘ０Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＸ　（ｆｃ　タ
’　Ｌ、Ｘはハロダン、好ましくはふつ素、臭素、塩素
、ｎは−般の４〜１２の整数〕で表わされる化合物であ
る。最も好ましい例はアジポイルクロリド又はセバコイ
ルクロリドである。・一般に、ヒドロキシ又はアミン−
反応性多官能価油溶性架橋剤の全てのものを使用できる
。第５の条件は架橋剤が連続相処理媒体と反応しないこ
とである。For example, it is a compound represented by is adipoyl chloride or sebacoyl chloride.Generally, hydroxy or amine-
Any reactive multifunctional oil-soluble crosslinker can be used. The fifth condition is that the crosslinking agent does not react with the continuous phase processing medium.

この処理媒体中の架橋剤の濃度は任意に調整でき、その
下限はカシセル膜壁が自己支持力を形成し得ない濃度で
あり、上限は架橋が多過ぎて固くなりすぎ、不透過性と
なる濃度である。The concentration of crosslinking agent in this treatment medium can be adjusted arbitrarily; the lower limit is the concentration at which the Cassicell membrane wall cannot form a self-supporting force, and the upper limit is the concentration at which the membrane wall becomes too stiff and impermeable due to too much crosslinking. It is concentration.

この上限は連続相処理媒体中での架橋剤の溶解度によっ
ても左右される。この架橋剤の濃度は当業者が容易に判
断し易るものであり、一般に０．００１〜１０■／１０
０ｍ１（処理媒体）の範囲で用いられる。This upper limit also depends on the solubility of the crosslinking agent in the continuous phase processing medium. The concentration of this crosslinking agent is easily determined by those skilled in the art, and is generally 0.001 to 10/10
It is used in the range of 0 m1 (processing medium).

殻形成タンパク質に対する架橋剤の割合は所望とする架
橋剤の緊張度、使用するタン・やり質の活性架橋性官能
基の数、滴状体のサイズ、反応時間、膜厚によっても左
右される。一般にこの適当な割合はタン・やり質１モル
当り架橋剤１〜１，０００モルであろう。The ratio of crosslinking agent to shell-forming protein also depends on the desired tonicity of the crosslinking agent, the number of active crosslinking functional groups on the tongue/spear material used, droplet size, reaction time, and film thickness. Generally, a suitable ratio will be from 1 to 1,000 moles of crosslinking agent per mole of tongue/silk.

架橋剤の添加後、得られた懸濁液を連続的に攪拌して、
エマルジョン中の滴状体を所望の架橋が得られるまで維
持する。架橋剤の反応温度条件は前述の如く維持し、又
は架橋を促進させるために若干上昇させる。この時間は
一般に数分ないし数時間、好ましくけ５〜１０分ないし
２時間、より好ましくは１５分ないし１時間である。After addition of the crosslinking agent, the resulting suspension is continuously stirred,
The droplets are maintained in the emulsion until the desired crosslinking is achieved. The reaction temperature conditions for the crosslinking agent are maintained as described above or slightly increased to promote crosslinking. This time is generally from several minutes to several hours, preferably from 5 to 10 minutes to 2 hours, more preferably from 15 minutes to 1 hour.

多くの場合、処理媒体中に得られるマイクロカプセルの
懸濁液を、たとえばカプセル化バイブリドマスの注射に
おいて動物の復膜に直接使用できる。この方法は処理媒
体が反応終了時に架橋剤を全く含まない場合、およびカ
プセルの形成に生物との相客性を有する処理媒体、たと
えばゴマ油を利用した場合に特に好ましい。この方法に
よれば、現場でマイクロカプセルを作り、その得られた
カプセル分散物を動物中に注射することができる。In many cases, the resulting suspension of microcapsules in a treatment medium can be used directly in the animal's reconvulsion, for example in the injection of encapsulated hybrid masses. This method is particularly preferred if the treatment medium does not contain any crosslinking agent at the end of the reaction and if a treatment medium compatible with organisms, such as sesame oil, is utilized for the formation of the capsules. According to this method, microcapsules can be made in situ and the resulting capsule dispersion can be injected into animals.

そのほか、処理媒体からカプセルを分離し、水性又は非
水性洗浄液で洗うようにしてもよい。Alternatively, the capsules may be separated from the treatment medium and washed with an aqueous or non-aqueous cleaning solution.

この分離は攪拌を中断し、ついでデカンテーション又は
遠心分離によっておこなうことができる０さらに、処理
媒体を水相上に層として形成させ、この二１１構造物を
遠心分離してマイクロカプセルを処理媒体力・ら水相へ
強制的に移すようにしてもよい。この場合の水相はカプ
セル化細胞の生育を促す培養媒体であることが好ましい
Ｏ 本発明の好ましい具体例として、出発タン・ぐり質溶液
は水溶性ポラータン化合物（すなわち孔形成又は乱発生
化合物）、たとえば目？す（ビニルアルコール）、カル
はキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、
でん粉、最も好ましくは多価グリコール等のグリコール
を含むものであってもよい。この化合物の存在はカプセ
ル化の際に細胞を保穫し、カプセルｆｉＪ　ｍ中に多く
の孔を形成させる。このポラータン化合物は架橋工程に
おいて、タン／４′り質分子相互間に捕捉され、水溶液
とカプセルとの接触の際に除去され、カプセルの膜壁に
多くの孔を形成させるものと思われる。このポラータン
化合物の添加量は比較的広範囲で変えることができ、細
胞の数、所望とする多孔度、ポラーケ９ンの溶解度、カ
プセル組成物の賞等によっても左右される。一般に、そ
の水溶液中の濃度はｌｙｙ／ｍｌないＬ　１９　／ｒｎ
ｌ　、好ｔＬ＜１ｄ２００〜６００塾偵であろう。ボラ
−ダンのタンパク質に対する割合ｆｄｌ：１０〜１０：
１（重量）である。本発明で用いられるポリグリコール
なま分子ｍ″が１００〜１’０．０００のものである。This separation can be carried out by interrupting the agitation and then decantation or centrifugation.The treatment medium is then formed as a layer on the aqueous phase and the structure is centrifuged to release the microcapsules under the force of the treatment medium.・It may be forcibly transferred to the aqueous phase. The aqueous phase in this case is preferably a culture medium that promotes growth of the encapsulated cells. In a preferred embodiment of the invention, the starting tongue solution contains a water-soluble poratan compound (i.e., a pore-forming or promiscuous compound), For example, eyes? (vinyl alcohol), cal (xymethylcellulose), poly(vinylpyrrolidone),
It may also contain starch, most preferably glycols such as polyhydric glycols. The presence of this compound preserves the cells during encapsulation and causes the formation of many pores in the capsule fiJ m. It is believed that this poratan compound is trapped between the tan/4' lithium molecules during the crosslinking process and is removed when the aqueous solution comes into contact with the capsule, forming many pores in the membrane wall of the capsule. The amount of poratan compound added can vary within a relatively wide range and will depend on the number of cells, the desired porosity, the solubility of Polaque 9, the quality of the capsule composition, etc. Generally, its concentration in aqueous solution is lyy/ml or L 19 /rn
l, good tL<1d200-600 would be a school detective. Ratio of Boradan to protein fdl: 10-10:
1 (weight). The raw polyglycol molecule m'' used in the present invention is 100 to 1'0.000.

このうち、ノリエチレングリコール、特に分子７４，０
００〜６，０００のもの（より好ましくはこの上限に近
いもの）が用いられる。Among these, Noriethylene glycol, especially molecular 74,0
00 to 6,000 (more preferably close to this upper limit).

本発明の他の好ましい態様は形成されたカプセルにカプ
セル膜壁分解酵素（又は劣化酵素）全接触させるこさに
よシカプセルの膜壁の孔径を訓節する方′法である。カ
プセルの膜壁が主としてタン・ぞり質からなる場合はタ
ンパク質分解酵素、たとえばトリゾシン、ギモトリグシ
ン等をカプセルの緩衝水性懸濁液に加えて十分な時間繁
殖させて所望のサイズに孔を拡大させる。Another preferred embodiment of the present invention is a method of adjusting the pore size of the membrane wall of the capsule by bringing the capsule membrane wall degrading enzyme (or degrading enzyme) into total contact with the formed capsule. If the membrane wall of the capsule is primarily composed of tunicin, a proteolytic enzyme, such as trizocin, gymotrigcin, etc., is added to the buffered aqueous suspension of the capsule and allowed to propagate for a sufficient period of time to enlarge the pores to the desired size.

一般にこの時間は１〜２分から１〜２時間、好ましくは
１〜２分から３０分の間である。この酵素消化は、酵素
抑制剤、たとえばタン・ぐり分解抑制剤、たとえば大豆
トリノシン抑制剤をカプセル分散体に加えるか、又はカ
プセル力≧ら酵素を洗い流すことによって中止させるこ
ともできる。Generally this time is between 1-2 minutes and 1-2 hours, preferably between 1-2 minutes and 30 minutes. This enzymatic digestion can also be stopped by adding enzyme inhibitors, such as tongue decomposition inhibitors, such as soy trinosine inhibitors, to the capsule dispersion or by washing away the enzyme from the capsule force.

他の好ましい態様として、力！セルの膜壁がタン・セフ
質を主成としていないで０．１〜８０重量係が酵素分解
性の他の物質、たとえばポリサッカライド、ケラチン、
ＤＮＡ　、　ＲＮＡ　、コラ−ダン等の物質で形成され
ている場合である。タンパク質および他の酵素分解性物
質で膜壁がつくられているカプセルの形成後、カプセル
の孔径はこの他の酵素分解性物質を分解する酵素で処理
することにより拡大させることができる。この物質がポ
リサッカライドの場合はぼりサツカライド分解酵素が用
いられる。セルロース１コラーゲン、ｐＮＡ　、　ＲＮ
Ａ１でん粉、ケラチンが添加された場合はセルラーゼ、
コラナーゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、アミラーゼ、ケ
ラチナーゼ・等を用いて孔径を拡大し得る。この分解酵
素による処理時間は上述のタン・やり分解酵素の場合と
同様にして調節し得る。Another preferred aspect is power! The membrane wall of the cell is not mainly composed of protein and cephalic substances, and the weight ratio of 0.1 to 80% is other enzymatically degradable substances, such as polysaccharides, keratin,
This is the case when it is made of substances such as DNA, RNA, and colladan. After the formation of capsules whose membrane walls are made of proteins and other enzymatically degradable substances, the pore size of the capsules can be enlarged by treatment with enzymes that degrade the other enzymatically degradable substances. If this substance is a polysaccharide, a saccharide-degrading enzyme is used. Cellulose 1 collagen, pNA, RN
A1 starch, cellulase if keratin is added,
Pore size can be expanded using colanase, DNase, RNase, amylase, keratinase, etc. The treatment time with this degrading enzyme can be adjusted in the same manner as in the case of the tongue and spear degrading enzyme described above.

本発明のカプセルは球形粒子であり、場合によっては不
規則な形状としてもよい。カプセルは１μｍ以下から数
ミリの直径に変えることができる。標準注射針での投与
のためには１μｍ以下ないし２５０μｍの径のもの（マ
イクロカシセル）が好ましい。The capsules of the present invention are spherical particles, which may optionally be irregularly shaped. Capsules can vary in diameter from less than 1 μm to several millimeters in diameter. For administration with standard injection needles, those with a diameter of 1 μm or less to 250 μm (microcassicles) are preferred.

膜壁の孔径は少なくとも細胞の生育および生活力を維持
するために必要な栄養の出入りを許容し得る大きさを有
し、力λつ細胞自体の排出を防止し得る程度に小さくな
くてはならない。理想的には分子量１０，０００〜５０
０．’０００のマイクロ分子（公知の免疫グロブリン又
はグイリオンを含めて）の排出を許容し得る孔径のもの
が好ましい。り゛イリオンは通常約３．’０００　Ｘ以
下の直径を有するから、孔径は５ｘ〜１５μｍ、よυ好
ましくは２０Ｘ〜０．３μｍとする・本発明でカプセル
化可能な細胞の性質、種類について特に制限はなく、動
物からのもの、植物からのもの、微生物からのもののい
ずれであってもよい。又細胞はノ・イプリドマ細胞の如
く人工のものであってもよい。この人工のものけカプセ
ル化にとって好ましいものの一つであるＯ細胞ラインか
ら得られる他の細胞、たとえばミエロマ（ｍｙｅｌｏｍ
ａ　）細胞もカプセル化可能である。さらに、バクテリ
ヤ細胞の如き微生物細胞もカプセル化可能である。これ
らのうち最も好ましいバクテリヤ細胞は薬理学的に有用
な物質を分泌するものおよびＤＮＡ再結合技法によりつ
くられる新規なバクテリヤ棟であって咄乳動物、ドナー
等の異質物からの遺伝子によりてコードを付された物質
を表わすバクテリヤである。この異質の遺伝子を表わす
バクテリヤ細胞の例としてはインターフェロン、生育モ
ルモン、インシュリン（すい１藏細胞自体によってつく
り得るものであることはもちろんである）、その他のモ
ルモン、ノロモルモンｍ分子等である０１カッセル当り
の細胞の数はカプセルの大きさにもよるが、１〜１００
０．好ましくは１〜１００程度であろう。生育および再
生によりカプセル内の細胞密度は増大し、生育は飽和レ
ベルに達することになる。この飽和レベルは細胞の種類
、カッセルのサイズによっても異なる。The pore size of the membrane wall must be at least large enough to allow the inflow and outflow of nutrients necessary to maintain cell growth and vitality, and must be small enough to prevent the cells from expelling themselves. . Ideally the molecular weight is 10,000-50
0. A pore size that allows the evacuation of '000 micromolecules (including known immunoglobulins or gyrions) is preferred. Rielion is usually about 3. Since the diameter is less than '000X, the pore size should be 5x to 15μm, preferably 20X to 0.3μm. There are no particular restrictions on the nature or type of cells that can be encapsulated in the present invention, including those from animals. , from plants, or from microorganisms. The cells may also be artificial, such as N. ipridoma cells. Other cells obtained from the O cell line, which is one of the preferred for this artificial Mononoke encapsulation, such as myeloma
a) Cells can also be encapsulated. Additionally, microbial cells such as bacterial cells can also be encapsulated. Among these, the most preferred bacterial cells are those that secrete pharmacologically useful substances and new bacterial cells created by DNA recombination techniques that are encoded by genes from foreign sources such as mammals, donors, etc. It is a bacterium that represents the attached substance. Examples of bacterial cells expressing this foreign gene include interferon, growth mormon, insulin (which can of course be produced by pancreatic cells themselves), other mormons, noromormon m molecules, etc. The number of cells varies from 1 to 100, depending on the size of the capsule.
0. Preferably it will be about 1 to 100. Growth and regeneration will increase the cell density within the capsule and growth will reach a saturation level. This saturation level also varies depending on the cell type and casselle size.

これらは実験的に、特定の細胞／カプセルサイズについ
ての飽和限度を知ることかで亀よう。These depend experimentally on knowing the saturation limit for a particular cell/capsule size.

本発明はさらに所望の細胞のカプセル化のため使用者に
利用されるキットの製造を提供するものである。このキ
ットは一般に試験管、薬ビン、グラス、球状物等を収容
するために区分した容器金１以上有するキャリヤーから
なる。この容器はさらにポラダン、その他の酵素分解可
能物質、栄養媒体、界面活性剤等とともに膜壁形成タン
・やり質からなる第１の容器手段を具備するものであっ
てもよい。この膜壁形成物質は溶液又は凍結乾燥し念状
態で存在させることができる。第２の容器手段として、
適当な架橋剤を収容するもの、第３の容器手段として、
水非混和性処理媒体を収容するものが考えられる。The present invention further provides for the manufacture of a kit for use by a user for encapsulation of desired cells. The kit generally consists of a carrier having one or more compartments for containing test tubes, vials, glasses, spheres, etc. The container may further include a first container means consisting of a membrane-walled tongue material along with poladan, other enzymatically degradable materials, nutritional media, surfactants, and the like. The wall-forming material can be present in solution or freeze-dried. As a second container means,
as a third container means containing a suitable crosslinking agent;
Containing a water-immiscible treatment medium is contemplated.

他の容器手段としては所望の細胞、分解酵素、他の膜壁
形成物質等を収容するものが挙げられる。このキットは
通常カタログ、小冊、ノヤンフレット等による指示書を
収容させる・このキットを利用する場合、使用者は第１
の容器手段内の物質の溶液をつくり、カプセル化すべき
細胞の分散体を形成し、上記溶液を処理媒体に加え、水
性の滴状体を分散させて安定なエマルジョンを形成し、
架橋剤を加えて膜壁形成を生じさせるだけでよい。もち
ろん、その他の任意の工程をさらに付加してもよい。Other container means include those containing desired cells, degrading enzymes, other membrane wall-forming substances, and the like. This kit usually contains catalogs, pamphlets, instructions in Noyanfret, etc. When using this kit, the user must
forming a solution of the substance in a container means to form a dispersion of cells to be encapsulated, adding said solution to a processing medium and dispersing the aqueous droplets to form a stable emulsion;
Simply add a crosslinking agent to cause membrane wall formation. Of course, other arbitrary steps may be further added.

本発明のカプセルは特に動物の、細胞に対する免疫応答
を最少限にしたい場合に、その動物への該細胞の投与に
特に適している・したがって、ハイブリドマ細胞を含む
カッセルを動物中に注射することにより、該細胞を該動
物内で生育させることができる。薬剤投与も、薬理学的
活性物質を生成させる細胞を含むカッセルを動物に注射
することにより、著るしく容易となる。The capsules of the invention are particularly suitable for the administration of cells to animals, especially when it is desired to minimize the animal's immune response to the cells; therefore, by injecting the cassette containing the hybridoma cells into the animal. , the cells can be grown within the animal. Drug administration is also greatly facilitated by injecting the animal with a cassette containing cells that produce the pharmacologically active substance.

インシュリンを生成さきたり、生長ホルモン又はインタ
ーフェロンを生成させたりして、これらの活性物質の速
効的および連続的供給源を与える再結合バクテリヤを動
物中に注、射することもできる。カシセル化したすい臓
細胞を糖尿病患者に注射してインシュリンの供給源とす
ることもできる。抗体、酵素、その他生物学的活性物質
を生成させる細胞を投与することもできる。Recombinant bacteria that produce insulin, growth hormone or interferon, and provide an immediate and continuous source of these active substances, can also be injected into the animal. Cassicellated pancreatic cells can also be injected into diabetic patients to provide a source of insulin. Cells that produce antibodies, enzymes, and other biologically active substances can also be administered.

ここで興味深いことは投与の対象又は宿主として使われ
る動物からのタン・ぐり質を用いてマイクロカプセル又
はカッセルの製造をおこなう方法である。これによって
、免疫応答の問題は減少する。たとえばＢＳＡ　壁の使
用は受理上として牛科動物の使用を容易にする。ヒト血
清アルブミンからなるタン／マク質膜壁の使用はヒトへ
のカプセルの投与を容易にする。Of interest here is a method for producing microcapsules or cassels using tongue material from animals used as administration targets or hosts. This reduces the problem of immune response. For example, the use of BSA walls facilitates the use of bovine animals as a receptacle. The use of a tongue/macro membrane wall consisting of human serum albumin facilitates administration of the capsule to humans.

カプセルの投与は局部投与、静脈投与、腹膜内注射、筋
肉注射、輸液、環流等によっておこなうことができる。Administration of capsules can be carried out by local administration, intravenous administration, intraperitoneal injection, intramuscular injection, infusion, perfusion, and the like.

そのほか、本発明のカプセルは他の用途を有する。たと
えば、従来の非可動化微生物細胞又は酵素の代りに触媒
物質として役立てることがテキル。又、分解カプセル化
微生物を利用して酸素等のガスを解放させ、これを酸素
電極によりモニターすることなどにより分析等に使用す
ることもできる。In addition, the capsules of the invention have other uses. For example, technology can serve as a catalytic material in place of traditional immobilized microbial cells or enzymes. Furthermore, it is also possible to use decomposing encapsulated microorganisms to release gases such as oxygen, which can be used for analysis and the like by monitoring this with an oxygen electrode.

マイクロカプセルを治療を目的として用いる場合、投与
量は年令、性別、患者の状態、他の同時投与薬剤、副作
用等を考慮して決定される。When microcapsules are used for therapeutic purposes, the dosage is determined in consideration of age, gender, patient condition, other concurrently administered drugs, side effects, and the like.

たとえば、一定時間当り循環系にどの程度インシーリン
、インターフェロンを放出させるかは所定の対象につき
容易に計算することができ、これにより所定の細胞を含
むマイクロカシセルの適量を注射することができる。For example, the amount of incilin or interferon to be released into the circulatory system per given period of time can be easily calculated for a given subject, and thereby an appropriate amount of microcassicles containing a given cell can be injected.

タン・９り壁形成物質の一部又は全体に免疫グロブリン
からのものを用いたカッセルは特に有用である。免疫グ
ロブリンの特定の種類のものを選び、膜壁含有抗体の補
助として抗原部に向けられるカプセルをつくることがで
き、このカプセルを生活細胞の指定されたキャリアシス
テムに変えることができる。Particularly useful are casselles in which part or all of the wall-forming material is made from immunoglobulins. By selecting a specific type of immunoglobulin, one can create a capsule that is targeted to the antigen site as an adjunct to membrane-containing antibodies, turning this capsule into a designated carrier system for living cells.

（実施例） すべてのマイクロカプセル化用装置を消毒したのち、ウ
シ血清アルブミン、ＢＳＡ（１００ｍ９）をＲＰＭＩ　
１６４０培養基（重炭酸ソーダ、２−メルカ７’）エタ
ノール、被ニジリン、ストレプトマイシン、カビ菌帯お
よび１０チの熱不活性化ウシ胎児血清を含む）　１　ｍ
ｌ中に溶解させた。この溶ｏ、ヲミリポアフィルタ（タ
イ７’ＨＡ、０．４５μｍ、ミリボア社Ｂｅｄｆｏｒｄ
　、マサチューセット州。(Example) After disinfecting all microencapsulation equipment, bovine serum albumin and BSA (100 m9) were added to RPMI.
1640 culture medium (soda bicarbonate, 2-Merka 7') containing ethanol, dicarboxylic acid, streptomycin, mycozoa and 10 g heat-inactivated fetal bovine serum) 1 m
It was dissolved in l. This melt O, Millipore filter (Tie 7'HA, 0.45μm, Millipore Bedford)
, Massachusetts.

米国）を介して滅菌試験管に通過させることにより滅菌
した。次にポリエチレングリコール（ＰＥＧ　、　Ｃａ
ｒｂｏｗａｘ　６，０００　（商品名）　Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ビッツ・々−り、米国）２０
０叩をこのＢＳＡ溶液に溶解させ、約１０ノ・イブリド
マ細胞を含むペレットをＢＳＡ　−ＰＥＧ媒体混合物０
．５ゴ中に懸濁させた。Sterilized by passage through a sterile test tube (US). Next, polyethylene glycol (PEG, Ca
rbowax 6,000 (Product name) Fisher
Scientific, Bitz Library, USA) 20
0 cells were dissolved in this BSA solution and the pellet containing approximately 10 cells was placed in the BSA-PEG medium mixture.
．． It was suspended in 50ml.

この懸濁液を、５０ゴ樹脂釜に収容した滅菌ゴマ油２０
ｍ１に、温度３７℃、攪拌速度１．２０Ｏｒｐｍ、で滴
下しながら加えた。その結果、ＢＳＡ。This suspension was mixed with 20% sterilized sesame oil in a 50% resin pot.
It was added dropwise to m1 at a temperature of 37° C. and a stirring speed of 1.20 rpm. As a result, B.S.A.

ＰＥＧ　、細胞および培養基からなる水性マイクロ滴状
体を含む水／オイルエマルジョンが得られた。この水相
をゴマ油に添加した１分後に塩化セバコイル（２ｍｌの
ゴマ油に０．２ｄ溶解させたもの）を上記樹脂釜に添加
した。この添加ののち２分後攪拌速度を１．２０　Ｏｒ
ｐｍ、から９０　Ｏｒｐｍ。A water/oil emulsion containing aqueous microdroplets consisting of PEG, cells and culture medium was obtained. One minute after adding this aqueous phase to the sesame oil, sebacoyl chloride (0.2 d dissolved in 2 ml of sesame oil) was added to the resin kettle. Two minutes after this addition, the stirring speed was increased to 1.20 Or
pm, to 90 Orpm.

に減少させた。この状態で４０分間維持し、塩化セバコ
イルをＢＳＡに架橋させてマイクロカプセル壁を形成さ
せた。さらに４０分後、樹脂釜を静カ・に遠心分離して
マイクロカプセルを沈降させた。上澄液を除去したのち
、マイクロカプセルを新しい戚閑ゴマ油で洗浄し、残留
する塩化セバコイルを除去した。decreased to This state was maintained for 40 minutes to crosslink sebacoyl chloride to BSA and form microcapsule walls. After a further 40 minutes, the resin pot was statically centrifuged to sediment the microcapsules. After removing the supernatant, the microcapsules were washed with fresh sesame oil to remove residual sebacoyl chloride.

このマイクロカシセルを培養基に移すため、マイクロカ
プセルを再び遠心分離し、上澄液を除去した。さらにヘ
ゲタン２ｄ’ｒマイクロカプセルベレツトに加え、さら
に直ちに５　ｍｌの培養基と混合した。この混合物をつ
いで遠心分離し、上澄液を除去し、マイクロカプセルペ
レットを新しい培養基で再度洗浄し、適当なＰＨに調節
した。In order to transfer the microcassicles to a culture medium, the microcapsules were centrifuged again and the supernatant liquid was removed. Further, it was added to the Hegetan 2d'r microcapsule pellet and immediately mixed with 5 ml of culture medium. The mixture was then centrifuged, the supernatant removed, and the microcapsule pellets washed again with fresh culture medium and adjusted to the appropriate pH.

マイクロカプセル化後の細胞生活力をこのマイクロカッ
セルを中性赤中で培養することにより実証することがで
きた。すなわち、このマイクロカプセル化細胞はこの中
性赤を汚どし生活力を有することを示した。第２の手段
として、このマイクロカプセルを開き、露出した細胞を
トリ・ンン青で培養した。その結果、細胞の染色が見ら
れず＼これによって細胞の生活力が認められた。この細
胞は少なくとも２ケ月間生活力を示した。Cell viability after microencapsulation could be demonstrated by culturing the microcassettes in neutral red. In other words, this microencapsulated cell stained this neutral red color and was shown to have vitality. As a second step, the microcapsules were opened and the exposed cells were cultured with Tri-N-Blue. As a result, no staining of the cells was observed, indicating the vitality of the cells. The cells showed viability for at least 2 months.

出願人代理人　弁理士　鈴　江　武　彦■、事件の表示 特願昭５８−１３１０９７号 ２、発明の名称 カプセル化細胞、その製造方法および用途３　補正をす
る者 事件との関係　特許出に１１１人 ザーストール・リサーチ・アンド・デイペロツデメント
・コーポレーション ４代理人 住所　東京都港区虎ノ門１丁［１２６市５５　第１７森
ビル〒１０５　ｌｉ占０３　（５０２）　３１８１　（
大代表）　３７、補正の内容　別紙の通り 明細書の浄書（内容に変更なし） １９２−Applicant's representative Patent attorney Takehiko Suzue■, Indication of the case Patent application No. 1982-131097 2, Name of the invention Encapsulated cells, manufacturing method and uses thereof 3 Person making the amendment Relationship with the case 111 people filed the patent application Thestor Research and Dayperots Dement Corporation 4 Agent Address: 1-chome Toranomon, Minato-ku, Tokyo [126 City 55 Daiichi Mori Building 105 li 03 (502) 3181 (
Main representative) 37. Contents of the amendment: Reprint of the specification as shown in the attached sheet (no change in content) 192-

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）架橋化タンパク胃壁からなるカプセル中に収容し
てなる生活細胞を含む組成物。 （２）　タンパク質がアルブミン、カゼイン、コラ−ダ
ン、ゼラチン、大豆タンパク、グルテンおよび免疫グロ
ブリンから選ばれるものである特許請求の範囲第１項記
載の組成物。 （３）　該タンパク胃壁がさらに水溶性ポラダン化合物
を含む特許請求の範囲第１項記載の組成物。 （４）　該タンパク胃壁がさらに酵素劣化物質を含む特
許請求の範囲第１項記載の組成物。 （５）酵素劣化物質がポリサツカリド、タンパクまたは
核酸である特許請求の範囲第４項記載の組成物。 （６）架橋化タンパク胃壁が多孔質であって、細胞養分
の通過を許容し得るものである特許請求の範囲第１項記
載の組成物。 （７）　架橋イヒタン・やり室壁が多孔質であって、分
子ｉ（５００，０００以下の分子又は粒子を通過させ得
るものである特許請求の範囲第１項記載の組成物。 （８）該分子が免疫グロブリンである特許請求の範囲第
７項記載の組成物。 （９）　免疫グロブリンがモノクロン抗体である特許請
求の範囲第８項記載の組成物。 ０１　該分子がヴイリオンである特許請求の範囲第７項
記載の組成物。 α力　該タンパク胃壁が直径５Ｘないし１５μｍの孔を
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組成物。 （６）該細胞が動物、植物、微生物、および人工の細胞
から選ばれるものである特許請求の範囲第１項記載の組
成物。 （１３該細胞がハイブリドマ細胞である特許請求の範囲
第１２項記載の組成物。 αゆ　該細胞がウィルス感染細胞である特許請求の範囲
第１２項記載の組成物。 α０　該細胞がバクテリヤ細胞である特許請求の範囲第
１２項記載の組成物。 αＱ　該バクテリヤ細胞が該バクテリヤのＤＮＡに再結
合された非バクテリヤ遺伝子によってコードを付された
生成物を表わしている特許請求の範囲第１５項記載の組
成物。 ０ｆ）該非バクテリヤ遺伝子が哺乳動物遺伝子である特
許請求の範囲第１６項記載の組成物。 （１１Ｇ　該細胞のための栄養媒体と結合されている特
許請求の範囲第１項記載の組成物。 αリ　栄養媒体が試験管媒体である特許請求の範囲第１
８項記載の組成物。 （イ）栄養媒体が生体媒体である特許請求の範囲第１０
項記載の組成物。 Ｑツ　生体媒体が動物の腹水である特許請求の範囲第２
０項記載の組成物。 磐　該カプセルが平均直径２５０μｍ以下のものである
特許請求の範囲第１項記載の組成物。 に）（ａ）　生活細胞をカプセル壁形成タンパク質の水
溶液中に分散させる工程と； （ｂ）　水性ｊ−混和性、細胞相容性連続的処理媒体中
にて上記細胞含有媒体の水性滴状物を形成する工程と； （ｃ）　該処理媒体に可溶で上記水性滴状物に実質的に
不溶性の架橋剤で上記タン・す１ｔｌ−架橋させる工程
と； を具備する生活細胞のカプセル化法。 （ハ）該タンパク質の水溶液が該細胞のための栄養を含
む特許請求の範囲第２３項記載の方法。 （ハ）　該タンパク質がアルブミン、カゼイン、コラ−
ダン、ゼラチン、大豆タン・セフ、グルテン、免疫グロ
ブリン必ら選ばれるものである特許請求の範囲第２３項
記載の方法。 （ハ）　該溶液がさらに酵素劣化物質を含む特許請求の
範囲第２３項記載の方法。 （イ）酵素劣化物質がポリサツカリド、タン・ぐりま゛
たは核酸である特許請求の範囲第２６項記載の方法。 （ハ）該細胞が動物、植物、微生物、および人工の細胞
から選ばれるものである特許請求の範囲第２３項記載の
方法。 （ハ）　該細胞がノ・イブリドマ細胞である特許請求の
範囲第２８項記載の方法。 （ト）該細胞がバクテリヤ細胞である特許請求の範囲第
２８項記載の方法。 ０め　該バクテリヤ細胞が該バクテリヤのＤＮＡに再結
合された非バクテリヤ遺伝子によってコードを付された
生成物を表わしている特許請求の範囲第３０項記載の方
法。 ０２　該非バクテリヤ遺伝子が哺乳動物遺伝子である特
許請求の範囲第３１項記載の方法。 ０３　該カプセルが平均直径２５０μｍ以下のものであ
る特許請求の範囲第２３項記載の方法。 （ロ）処理媒体が植物油又は鉱物油である特許請求の範
囲第２３項記載の方法。 （→　処理媒体がピーナツ油、ごま油、綿実油から選ば
れるものである特許請求の範囲第２３項記載の方法。 （ト）架橋剤がタンノクク質のアミノ基、水酸基、カル
？キシ基又はチオール基と反応し得る少なくとも二宮着
目性物質である特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ０乃　架橋剤がノ・ロダン化工酸である特許請求の範囲
第３６項記載の方法。 ０→　該ハロダン化二酸が ＸＯＣ−（ＣＨ２）□−ｃｏｘ （但し、Ｘは／％　７：ｙ　ｊ’ン、ｎは４〜１２の整
数）、の構造式からなるものである特許請求の範囲第３
７項記載の方法。 ０→　水性不溶性溶媒で架橋化されたカプセルを洗浄す
る工程をさらに含む特許請求の範囲第２３項記載の方法
。 θＱ　カプセル壁形成タン・々り質の水性溶液がさらに
水溶性ポラダン化合物を含む特許請求の範囲第２３項記
載の方法。 １４］）　該ポラダン化合物を該溶液中に１ダ〜１９／
ｍｌ含む特許請求の範囲第４０項記載の方法。 ０埠　該ポラダン化合物がポリ（ビニルアルコール）、
カル？キシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン
）、でん粉又はグＩＪ　＝＋−ルである特許請求の範囲
第４０項記載の方法〇０）　該ポラダン化合物が分子量
１００ないし１０．０００のポリグリコールである特許
請求の範囲第４０項記載の方法。 ＬＬ４◆　形成された架橋化カプセルにカプセル壁劣化
酵素を十分な時間添加して該壁中の孔を所定の平均サイ
ズに拡大させる工程をさらに含む特許請求の範囲第２３
項記載の方法。 （６）該酵素がタンパク質分解酵素である特許請求の範
囲第４４項記載の方法。 （ト）　形成された架橋化カプセルにカプセル壁劣化酵
素を十分な一時間添加して該壁中の孔を所定の平均サイ
ズに拡大させる工程を含む特許請求の範囲第２６又は２
７項記載の方法。 Ｇ１）該酵素がポリサツカリド分解酵素、ＤＮアーゼ、
ＲＮアーゼ、ケラチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、
コラーダナーゼから選ばれるものである特許請求の範囲
第４６項記載の方法。 （４０細胞を架橋化タン・ぞり質からなる壁面からなる
カプセル中で生育することを特徴とする細胞の繁殖方法
。 （６）該壁面が分子量５００，０００以下の分子・直径
３，００９Ｘ以下の粒子を通過させるのに十分な孔を特
徴とする特許請求の範囲第４８項記載の方法。 −分子が免疫グロブリンである特許請求の範囲第４９項
記載の方法。 （財）　免疫グロブリンがモノクロン抗体である特許請
求の範囲第５０項記載の方法。 ６つ　該細胞が動物、植物、微生物、および人工の細胞
から選ばれるものである特許請求の範囲第４８項記載の
方法。 ６３　該細胞がノ・イブリドマ細胞である特許請求の範
囲第５２項記載の方法。 ■　該細胞がウィルス感染細胞である特許請求の範囲第
５２項記載の方法。 曽　該細胞がバクテリヤ細胞である特許請求の範囲第５
２項記載の方法。 曽　該バクテリヤ細胞が該バクテリヤのＤＮＡに再結合
された非バクテリヤ遺伝子によってコードを付された生
成物を表している特許請求の範囲第５５項記載の方法。 ６′／）該非バクテリヤ遺伝子が哺乳動物遺伝子である
特許請求の範囲第５６項記載の方法。 競　該細胞を動物の体内で生育させる特許請求の範囲第
４８項記載の方法。 曽　該細胞を動物の腹水中で生育させる特許請求の範囲
第５８項記載の方法◇ ■　該カプセルの膜壁に含まれるタンパク質が該動物か
ら得られたものである特許請求の範囲第５８項記載の方
法。[Scope of Claims] (1) A composition containing living cells housed in a capsule made of a cross-linked protein gastric wall. (2) The composition according to claim 1, wherein the protein is selected from albumin, casein, colladan, gelatin, soy protein, gluten and immunoglobulin. (3) The composition according to claim 1, wherein the protein stomach wall further contains a water-soluble poladan compound. (4) The composition according to claim 1, wherein the protein stomach wall further contains an enzyme-degrading substance. (5) The composition according to claim 4, wherein the enzymatically degraded substance is polysaccharide, protein, or nucleic acid. (6) Cross-linked protein The composition according to claim 1, wherein the stomach wall is porous and can allow passage of cell nutrients. (7) The composition according to claim 1, wherein the cross-linked Ihitan chamber wall is porous and is capable of passing molecule i (up to 500,000 molecules or particles). The composition of claim 7, wherein the molecule is an immunoglobulin. (9) The composition of claim 8, wherein the immunoglobulin is a monoclonal antibody. 01 The composition of claim 8, wherein the molecule is a virion. The composition according to claim 7, wherein the protein stomach wall is characterized by pores with a diameter of 5X to 15 μm. (6) The cell is an animal, a plant, a microorganism, and artificial cells. (13) The composition according to claim 12, wherein the cells are hybridoma cells. The composition according to claim 12, which is a cell. α0 The composition according to claim 12, wherein the cell is a bacterial cell. αQ The composition according to claim 12, wherein the bacterial cell is 16. The composition of claim 15, wherein the composition represents a product encoded by a bacterial gene.Ofc) The composition of claim 16, wherein the non-bacterial gene is a mammalian gene. 11G The composition of claim 1, which is combined with a nutrient medium for said cells.Claim 1, wherein the nutrient medium is a test tube medium.
Composition according to item 8. (b) Claim 10 in which the nutrient medium is a biological medium.
Compositions as described in Section. QT Claim 2 in which the biological medium is animal ascites
Composition according to item 0. The composition according to claim 1, wherein the capsules have an average diameter of 250 μm or less. (a) dispersing living cells in an aqueous solution of capsule wall-forming proteins; (b) aqueous droplets of said cell-containing medium in an aqueous, miscible, cell-compatible continuous processing medium; (c) crosslinking with a crosslinking agent soluble in the processing medium and substantially insoluble in the aqueous droplets; . (c) The method according to claim 23, wherein the aqueous solution of the protein contains nutrients for the cells. (c) The protein is albumin, casein, collagen.
24. The method according to claim 23, wherein the selected ingredients are necessarily selected from Dan, gelatin, soybean tongue/ceph, gluten, and immunoglobulin. (c) The method according to claim 23, wherein the solution further contains an enzyme-degrading substance. (a) The method according to claim 26, wherein the enzymatically degraded substance is polysaccharide, protein, or nucleic acid. (c) The method according to claim 23, wherein the cells are selected from animal, plant, microorganism, and artificial cells. (c) The method according to claim 28, wherein the cells are No. ibridoma cells. (g) The method according to claim 28, wherein the cell is a bacterial cell. 31. The method of claim 30, wherein said bacterial cell represents a product encoded by a non-bacterial gene recombined with said bacterial DNA. 02. The method according to claim 31, wherein the non-bacterial gene is a mammalian gene. 03. The method according to claim 23, wherein the capsules have an average diameter of 250 μm or less. (b) The method according to claim 23, wherein the processing medium is vegetable oil or mineral oil. (→ The method according to claim 23, wherein the processing medium is selected from peanut oil, sesame oil, and cottonseed oil. The method according to claim 23, wherein the reactable at least Ninomiya substance of interest is the method according to claim 36, wherein the crosslinking agent is a non-rodanic acid. 0→ the dihalodanide. Claim 3, in which the acid has the structural formula: XOC-(CH2)□-cox (wherein,
The method described in Section 7. 24. The method of claim 23, further comprising the step of washing the crosslinked capsules with an aqueous insoluble solvent. 24. The method of claim 23, wherein the aqueous solution of θQ capsule wall-forming tannin further comprises a water-soluble poladan compound. 14]) The poladan compound is added to the solution at a concentration of 1 da to 19/
41. The method of claim 40, comprising ml. 0 埠 The poladan compound is poly(vinyl alcohol),
Cal? The method according to claim 40, wherein the poladan compound is oxymethylcellulose, poly(vinylpyrrolidone), starch or glycol. The method according to scope item 40. LL4◆ Claim 23 further comprising the step of adding a capsule wall degrading enzyme to the formed crosslinked capsule for a sufficient period of time to enlarge the pores in the wall to a predetermined average size.
The method described in section. (6) The method according to claim 44, wherein the enzyme is a proteolytic enzyme. (g) Adding a capsule wall-degrading enzyme to the formed crosslinked capsule for a sufficient period of time to enlarge the pores in the wall to a predetermined average size.
The method described in Section 7. G1) The enzyme is polysaccharide degrading enzyme, DNase,
RNase, keratinase, cellulase, amylase,
47. The method of claim 46, wherein the method is selected from coladanases. (A method for propagating cells characterized by growing 40 cells in a capsule consisting of a wall made of cross-linked tan-silicon. (6) The wall has molecules with a molecular weight of 500,000 or less and a diameter of 3,009X or less 49. A method according to claim 48, characterized in that the pores are sufficient to allow the passage of particles of. - a method according to claim 49, wherein the molecule is an immunoglobulin. 6. The method according to claim 50, wherein the cell is selected from animal, plant, microorganism, and artificial cells. 63. The method according to claim 52, wherein the cell is a virus-infected cell. ■ The method according to claim 52, wherein the cell is a virus-infected cell. Zeng: The method according to claim 52, wherein the cell is a bacterial cell. Fifth
The method described in Section 2. 56. The method of claim 55, wherein said bacterial cell represents a product encoded by a non-bacterial gene recombined with said bacterial DNA. 6'/) The method of claim 56, wherein the non-bacterial gene is a mammalian gene. 49. The method according to claim 48, wherein the cells are grown in the body of an animal. Zeng A method according to claim 58 in which the cells are grown in ascites of an animal ◇ ■ A method according to claim 58, wherein the protein contained in the membrane wall of the capsule is obtained from the animal. the method of.