JPS60259187A - プラスミノーゲン活性化因子を増収する方法 - Google Patents
プラスミノーゲン活性化因子を増収する方法Info
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- JPS60259187A JPS60259187A JP60081493A JP8149385A JPS60259187A JP S60259187 A JPS60259187 A JP S60259187A JP 60081493 A JP60081493 A JP 60081493A JP 8149385 A JP8149385 A JP 8149385A JP S60259187 A JPS60259187 A JP S60259187A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
良用座背l
プラスミノゲン活性化因子(PA)は、2−頻ブラスミ
ン分子を生成する、プテスミノゲン中のArgssa
Va15e1ペプチド結合ノ加水分解によりその作用を
及ぼすセリンプロテアーゼである。プラスミンは一般的
タンパク質分解活性を有し、そして循環する血液の生理
学的環境において、主としてフィブリンを攻撃する。プ
ラスミノゲン活性化因子は繊維素溶解系において重要な
役割を演じ、脈管の内部または外部の血栓、凝塊または
m維素沈着物を溶解することにより、血栓塞栓症の脈管
の病気の発生およびその克服に強く影響を及ぼす。
ン分子を生成する、プテスミノゲン中のArgssa
Va15e1ペプチド結合ノ加水分解によりその作用を
及ぼすセリンプロテアーゼである。プラスミンは一般的
タンパク質分解活性を有し、そして循環する血液の生理
学的環境において、主としてフィブリンを攻撃する。プ
ラスミノゲン活性化因子は繊維素溶解系において重要な
役割を演じ、脈管の内部または外部の血栓、凝塊または
m維素沈着物を溶解することにより、血栓塞栓症の脈管
の病気の発生およびその克服に強く影響を及ぼす。
プラスミノゲン活性化因子は、体液、例えば、血液およ
び尿、および種々の組織学的源の充実組織から弔離され
てきた。哺乳動物の細胞培養物もプラスミノゲン活性化
因子を生産することが知られている。同一の動物の異る
組織から誘導される細胞系統(cell 1ine)に
より、同一・腫瘍形成性物質(oncogenic a
g e nt)で独立に形質転換された単一の型の細
胞から誘導される同一の組織学的をの細胞により、生産
されるプラスミノゲン活性化因子の量において大きい差
が存在しうる。
び尿、および種々の組織学的源の充実組織から弔離され
てきた。哺乳動物の細胞培養物もプラスミノゲン活性化
因子を生産することが知られている。同一の動物の異る
組織から誘導される細胞系統(cell 1ine)に
より、同一・腫瘍形成性物質(oncogenic a
g e nt)で独立に形質転換された単一の型の細
胞から誘導される同一の組織学的をの細胞により、生産
されるプラスミノゲン活性化因子の量において大きい差
が存在しうる。
増大した量のプラスミノゲン活性化因子を生産すること
ができる細胞を得ること、および工業的規模でプラスミ
ノゲン活性化因子を生産する動物細胞を使用する方法を
改良する技術を確立することが緊急に要求されている。
ができる細胞を得ること、および工業的規模でプラスミ
ノゲン活性化因子を生産する動物細胞を使用する方法を
改良する技術を確立することが緊急に要求されている。
r る 1
欧州特許出願113,319 A2号は、血清および他
の高分子の生長因子の不存在で増殖することができる人
間の細胞系統ならびにこのような細胞系統を生産するた
めに利用する方法を開示している。欧州特許出願112
,174 A 2 号は、広い範囲の懸濁液および単層
の細胞を生長することができる血清不合培地を記載して
おり、前記培地はフェツイン、トランスフェリンおよび
置換ホスファチジル−コリンを含有する。
の高分子の生長因子の不存在で増殖することができる人
間の細胞系統ならびにこのような細胞系統を生産するた
めに利用する方法を開示している。欧州特許出願112
,174 A 2 号は、広い範囲の懸濁液および単層
の細胞を生長することができる血清不合培地を記載して
おり、前記培地はフェツイン、トランスフェリンおよび
置換ホスファチジル−コリンを含有する。
生物学化学雑誌(J 、Bi o l 、Chem、。
256.7035−7041 (1981)中に教示さ
れているように、新生細胞源の人間の細胞系統、例えば
、色素細胞腫細胞、は実質的の量のプラスミノゲン活性
化因子を生産することができることは知られている。
れているように、新生細胞源の人間の細胞系統、例えば
、色素細胞腫細胞、は実質的の量のプラスミノゲン活性
化因子を生産することができることは知られている。
悪性細胞系統、例えば、頚部癌、喉頭癌、口腔の表皮細
胞癌、結腸および直腸癌の細胞はプラスミノゲン活性化
因子を生産することが示された1カ子細胞生化学(Mo
lecular Ce1lular Biochemi
str )、v。
胞癌、結腸および直腸癌の細胞はプラスミノゲン活性化
因子を生産することが示された1カ子細胞生化学(Mo
lecular Ce1lular Biochemi
str )、v。
1.15.No、2,149−153ページ(1977
)参照]。
)参照]。
2種類の準安定前立腺癌の細胞系統、PC−3およびD
U−145,は血清、ホルモン類または生長因子を含有
しない定められた培地中の長期間の培養において生長し
たことが報告された[Proc、Natl、Acad、
sci、、Vo、78、No、9.5673−5676
(1981)1゜ 準安定潜在的腫瘍発生性の漸進的損失は、人間の表皮細
胞癌の生体外の順次の継代接種後に認められた。しかし
ながら、プラスミノゲン活性化因子に関すると、高い水
準の生産は腫瘍発生の保持および転位によく相関関係を
もっていた[癌研究(Cancer Re5aerch
)、40.2310−2315 (1980)]。
U−145,は血清、ホルモン類または生長因子を含有
しない定められた培地中の長期間の培養において生長し
たことが報告された[Proc、Natl、Acad、
sci、、Vo、78、No、9.5673−5676
(1981)1゜ 準安定潜在的腫瘍発生性の漸進的損失は、人間の表皮細
胞癌の生体外の順次の継代接種後に認められた。しかし
ながら、プラスミノゲン活性化因子に関すると、高い水
準の生産は腫瘍発生の保持および転位によく相関関係を
もっていた[癌研究(Cancer Re5aerch
)、40.2310−2315 (1980)]。
]へ−ンズBarnes)およびサトウ(Sato)は
、゛血清不合培地中の人間の哺乳動物腫瘍細胞系統の生
長(Growth of a Human Mamma
ry Tummour Ce1l Line in a
Serum−Free Medium)” (Nat
ure、0Ctober 1979)中で、インシュリ
ン、トランスフェリン、表皮細胞生長因子、プロスタグ
ランジンF および低温不溶生グロブリンを補充2α した血清不合培地中のMCF−7細胞の生長を報告して
いる。この研究において使用する合成栄養培地はハム(
Ham)のF−12とダルベツコ(Dulbecco)
変性イーグル(Eagle)の培地とのl:l混合物で
あり、抗生物質、重炭酸ナトリウム、HEPESおよび
ナトリウムセレナイトが補充されている。
、゛血清不合培地中の人間の哺乳動物腫瘍細胞系統の生
長(Growth of a Human Mamma
ry Tummour Ce1l Line in a
Serum−Free Medium)” (Nat
ure、0Ctober 1979)中で、インシュリ
ン、トランスフェリン、表皮細胞生長因子、プロスタグ
ランジンF および低温不溶生グロブリンを補充2α した血清不合培地中のMCF−7細胞の生長を報告して
いる。この研究において使用する合成栄養培地はハム(
Ham)のF−12とダルベツコ(Dulbecco)
変性イーグル(Eagle)の培地とのl:l混合物で
あり、抗生物質、重炭酸ナトリウム、HEPESおよび
ナトリウムセレナイトが補充されている。
これらの参考文献のいずれも、プラスミノゲン活性化因
子分泌細胞からのプラスミノゲン活性化因子の収量を、
胎児子牛血清を木質的に含有しない培地中でこのような
細胞を生長させることにより、増加できることを示唆ま
たは教示していない。
子分泌細胞からのプラスミノゲン活性化因子の収量を、
胎児子牛血清を木質的に含有しない培地中でこのような
細胞を生長させることにより、増加できることを示唆ま
たは教示していない。
魚肌d若
本発明は、プラスミノゲン活性化因子生産性細胞系統か
ら得られるプラスミノゲン活性化因子(FA)の収量を
増加する方法、および比較的多い量のプラスミノゲン活
性化因子を生産することができる細胞系統に関する。こ
の方法は、胎児子牛血清(ウシ血清)を含有する適当な
生長培地中で生長するプラスミノゲン活性化因子生産性
細胞を生長させ、そして減少する量の胎児子牛血清を含
有する前記生長培地の1系列を通して前記細胞な継代接
1ft(pass)することにより胎児子牛血清を木質
的含有しない前記適当な培地中で前記細胞を生長させる
ことを包含する。
ら得られるプラスミノゲン活性化因子(FA)の収量を
増加する方法、および比較的多い量のプラスミノゲン活
性化因子を生産することができる細胞系統に関する。こ
の方法は、胎児子牛血清(ウシ血清)を含有する適当な
生長培地中で生長するプラスミノゲン活性化因子生産性
細胞を生長させ、そして減少する量の胎児子牛血清を含
有する前記生長培地の1系列を通して前記細胞な継代接
1ft(pass)することにより胎児子牛血清を木質
的含有しない前記適当な培地中で前記細胞を生長させる
ことを包含する。
比較的大量のプラスミノゲン活性化因子を生産すること
のできる生物学的に純粋な組織培養物は、人間の前立腺
の腺癌[アメリカン・タイプ・カルチャーコレクション
(ATCC)(t heAmerican Type
Cu1tureCo 11 ect i onK)から
入手できる、細胞受託物系統(CRC)−1435と表
示]。本発明の方法に従い適応させたとき、比較的大量
のプラスミノゲン活性化因子を生産することのできる生
物学的に純粋な組織培養物はATCCCRC−1622
およびATCCCRC−1579である。
のできる生物学的に純粋な組織培養物は、人間の前立腺
の腺癌[アメリカン・タイプ・カルチャーコレクション
(ATCC)(t heAmerican Type
Cu1tureCo 11 ect i onK)から
入手できる、細胞受託物系統(CRC)−1435と表
示]。本発明の方法に従い適応させたとき、比較的大量
のプラスミノゲン活性化因子を生産することのできる生
物学的に純粋な組織培養物はATCCCRC−1622
およびATCCCRC−1579である。
登別1411に説用
プラスミノゲン活性化因子は培養において腫瘍細胞によ
り生産することができることはよく知られている。本発
明において使用することのできる哺乳動物からの腫瘍細
胞の例は、色素細胞腫、前立腺、***(breast)
、結腸、卵巣、膵臓、頚部、直腸、子宮内膜および線維
芽細胞の腫瘍細胞を包含する。好ましい細胞系統は、哺
乳動物の腫瘍細胞は、色素細胞腫、前立腺、***、結腸
、卵巣、膵臓および子宮内膜である。適当な癌細胞系統
は、受託所、例えば、アメリカンΦタイフ令カルチャー
コレクション(ATCC)(t he America
n Type Cu1ture Co11ection
、12301 Parklawn Drive、Roc
kville。
り生産することができることはよく知られている。本発
明において使用することのできる哺乳動物からの腫瘍細
胞の例は、色素細胞腫、前立腺、***(breast)
、結腸、卵巣、膵臓、頚部、直腸、子宮内膜および線維
芽細胞の腫瘍細胞を包含する。好ましい細胞系統は、哺
乳動物の腫瘍細胞は、色素細胞腫、前立腺、***、結腸
、卵巣、膵臓および子宮内膜である。適当な癌細胞系統
は、受託所、例えば、アメリカンΦタイフ令カルチャー
コレクション(ATCC)(t he America
n Type Cu1ture Co11ection
、12301 Parklawn Drive、Roc
kville。
MD 20852)から入手可能であり、あるいは大学
、病院または研究所における多数の研究者から得ること
ができる。癌細胞系統の同一性は、非常に重要というわ
けではない;本発明の方法はプラスミ/ゲン活性化因子
生産性細胞から得られるプラスミノゲン活性化因子の縦
を約5〜約60倍程度に多く増加させることができる。
、病院または研究所における多数の研究者から得ること
ができる。癌細胞系統の同一性は、非常に重要というわ
けではない;本発明の方法はプラスミ/ゲン活性化因子
生産性細胞から得られるプラスミノゲン活性化因子の縦
を約5〜約60倍程度に多く増加させることができる。
ここで示すように、プラスミノーゲン活性化因子の好ま
しい高い収量の生産体は、人間の前立腺の腺癌、ATC
CCRL−1435である。本発明の方法に従い適応さ
せたとき、比較的大量のプラスミノゲン活性化因子を生
産することのできる生物学的に純粋な組織培養物はAT
CCCRC−1622およびATCCCRC−1579
である。
しい高い収量の生産体は、人間の前立腺の腺癌、ATC
CCRL−1435である。本発明の方法に従い適応さ
せたとき、比較的大量のプラスミノゲン活性化因子を生
産することのできる生物学的に純粋な組織培養物はAT
CCCRC−1622およびATCCCRC−1579
である。
ここで使用するとき、「適当な生長培地」とい用語は、
ウェイマウス(Wa ymo u t h) (7)M
B 752 / 1、ダルベツコ最小必須培地(Dul
becco Minimal Es5ential M
e d i um)(MEN)およびハム(Ham)の
F−12培地のそれぞれ約1:1:l〜約3: 1 :
2の比(重量)で含有する、以後詳述するような培地を
意味する。
ウェイマウス(Wa ymo u t h) (7)M
B 752 / 1、ダルベツコ最小必須培地(Dul
becco Minimal Es5ential M
e d i um)(MEN)およびハム(Ham)の
F−12培地のそれぞれ約1:1:l〜約3: 1 :
2の比(重量)で含有する、以後詳述するような培地を
意味する。
この方法は1.プラスミノゲン活性化因子を生産する親
の癌細胞系統を選択し、そしてこの細胞系統を最初に約
5〜約20%の胎児子牛血清を含有する適当な生長培地
中で全面生長(conflue n c y)に生長さ
せることを包含する。細胞系統が全面生長に到達後、細
胞を、通常トリズシン化により取り出し、そして減少す
る量の胎児子牛血清を含有するl系列の適当な生長培地
中で継代培養(subculture)する。胎児子牛
血清の取り出しの速度は、子牛血清を順次に減少し、そ
して細胞生長の生育性を検査することにより容易に決定
することができる。例えば、親細胞をほぼ10%の胎児
子牛血清を含有する適当な生長培地中で全面生長に生長
させることができる。
の癌細胞系統を選択し、そしてこの細胞系統を最初に約
5〜約20%の胎児子牛血清を含有する適当な生長培地
中で全面生長(conflue n c y)に生長さ
せることを包含する。細胞系統が全面生長に到達後、細
胞を、通常トリズシン化により取り出し、そして減少す
る量の胎児子牛血清を含有するl系列の適当な生長培地
中で継代培養(subculture)する。胎児子牛
血清の取り出しの速度は、子牛血清を順次に減少し、そ
して細胞生長の生育性を検査することにより容易に決定
することができる。例えば、親細胞をほぼ10%の胎児
子牛血清を含有する適当な生長培地中で全面生長に生長
させることができる。
次いで、細胞を取り出し、そしてほぼ5%の胎児子牛血
清を含有する適当な生長培地中で少なくとも1回の継代
接種(passage)で継代培養する。細胞が全面生
長に到達した後、細胞を再び取り出し、はぼ2.5%の
胎児子牛血清を含有する適当な生長培地中で少なくとも
1回の継代接種で継代培養する。この手順を使用する適
当な生長培地が胎児子牛血清を本質的に含有しなくなる
まで反復する。本発明において、2倍のファクターの順
次の減少は好ましい方法であることがわかった。
清を含有する適当な生長培地中で少なくとも1回の継代
接種(passage)で継代培養する。細胞が全面生
長に到達した後、細胞を再び取り出し、はぼ2.5%の
胎児子牛血清を含有する適当な生長培地中で少なくとも
1回の継代接種で継代培養する。この手順を使用する適
当な生長培地が胎児子牛血清を本質的に含有しなくなる
まで反復する。本発明において、2倍のファクターの順
次の減少は好ましい方法であることがわかった。
商業的に入手可能な生長培地の種々の組み合わせは本発
明における使用に適することが発見された。しかしなが
ら、胎児子牛血清の濃度が減少するにつれて、本発明の
方法において使用する適当な生長培地は相応して次の生
長因子を補充しなくてはならない:フェツイン(fet
ufn)、ウシ血清アルブミン、インシュリン、トラン
スフェリン、5α−ジヒドロテストステロンおよびデキ
サメタソン(dexamet hasone)、これら
の生長因子を添加しなくてはならない、胎児子牛血清の
順次の減少の間の時点は、当業者により容易に決定する
ことができ、そして培養する細胞系統のタイプおよび培
養を老雄している特定の条件のような因子に依存して変
化するであろう。
明における使用に適することが発見された。しかしなが
ら、胎児子牛血清の濃度が減少するにつれて、本発明の
方法において使用する適当な生長培地は相応して次の生
長因子を補充しなくてはならない:フェツイン(fet
ufn)、ウシ血清アルブミン、インシュリン、トラン
スフェリン、5α−ジヒドロテストステロンおよびデキ
サメタソン(dexamet hasone)、これら
の生長因子を添加しなくてはならない、胎児子牛血清の
順次の減少の間の時点は、当業者により容易に決定する
ことができ、そして培養する細胞系統のタイプおよび培
養を老雄している特定の条件のような因子に依存して変
化するであろう。
細胞の生存性がそうでなければ胎児子牛血清の濃度の減
少のために脅かされるような時点に、生長因子を添加し
なければならない、ということで十分である:しかしな
がら、適当な培地が細胞の生長を維持するために十分な
濃度の胎児子牛血清を含有するとき、上に記載した生長
因子の添加は不必要であり、そして引き続いて適当な生
長培地中で細胞を生長させるとき困難の導く。
少のために脅かされるような時点に、生長因子を添加し
なければならない、ということで十分である:しかしな
がら、適当な培地が細胞の生長を維持するために十分な
濃度の胎児子牛血清を含有するとき、上に記載した生長
因子の添加は不必要であり、そして引き続いて適当な生
長培地中で細胞を生長させるとき困難の導く。
ここで記載するように使用するために適当な生長培地は
、ウェイマウス(Waymouth)のMB752/l
培地、ダルベ、7=+(DulbecCo)MENおよ
びハム(Ham)のF−12培地(GIBCOLabo
ratories、Grand l5land、New
Yowkから商業的に入手できる)を−緒に混合する
ことにより得ることができる。比(重量)はそれぞれ1
:1=1〜3:1:2の範囲であることができる。
、ウェイマウス(Waymouth)のMB752/l
培地、ダルベ、7=+(DulbecCo)MENおよ
びハム(Ham)のF−12培地(GIBCOLabo
ratories、Grand l5land、New
Yowkから商業的に入手できる)を−緒に混合する
ことにより得ることができる。比(重量)はそれぞれ1
:1=1〜3:1:2の範囲であることができる。
好ましい培地、以後“SYC”培地という、はウェイマ
ウス(Waymouth)のMB752/l、ダルヘラ
+ (D u l b e c c o) MENおよ
びハム(Ham)のF−12培地のそれぞれ1:l:l
(重量)混合物から構成されている。
ウス(Waymouth)のMB752/l、ダルヘラ
+ (D u l b e c c o) MENおよ
びハム(Ham)のF−12培地のそれぞれ1:l:l
(重量)混合物から構成されている。
細胞の生長は、使用する適当な培地がSYc培地である
とき、最適であることが観察された。
とき、最適であることが観察された。
ウェイマウス(Waymout h) のMB752/
1の完全な不存在において、細胞の生長は大きく遅延さ
れる。これらの培地は表Iに示すような組成を有する。
1の完全な不存在において、細胞の生長は大きく遅延さ
れる。これらの培地は表Iに示すような組成を有する。
前述のように、胎児子牛血清の濃度が順次に各継代接種
毎に減少するにつれて、適当な生長培地を50〜150
mg/lのフェツイン;50〜150mg/lのウシ血
清アルブミン;5〜10m g / 1のインシュリン
;5〜40mg/lのトランスフェリン;5〜200J
Lg/lの5α−ジヒドロテストステロン;そして50
〜200μg/lのデキサメタソンを補充することが必
要になる。インシュリンおよびトラスフェリンは重要な
生長因子であり、それらが存在しないと、それ以外のす
べての生長因子を添加して適当な生長培地を補充した、
1回の継代接種後に細胞は死ぬであろうことが観察され
た。
毎に減少するにつれて、適当な生長培地を50〜150
mg/lのフェツイン;50〜150mg/lのウシ血
清アルブミン;5〜10m g / 1のインシュリン
;5〜40mg/lのトランスフェリン;5〜200J
Lg/lの5α−ジヒドロテストステロン;そして50
〜200μg/lのデキサメタソンを補充することが必
要になる。インシュリンおよびトラスフェリンは重要な
生長因子であり、それらが存在しないと、それ以外のす
べての生長因子を添加して適当な生長培地を補充した、
1回の継代接種後に細胞は死ぬであろうことが観察され
た。
次の実施例により、本発明をさらに説明する。
実施1」
受託所から受取った後、人間の前立腺の腺癌、ATCC
CRL−1435、をアールの最小必須培地(Earl
e’s Minimal Es5e、nt ial M
ejium) (MEM) (GIBCOから商業的に
入手できる)中で全面生長に生長させることにより安定
化させた。この手順は次のように実施した。25m1の
MEMおよび10%の胎児子牛血清を175m1容の培
養フラスコに入れ、37℃において5%のCO□雰囲気
中で維持し、そして5X10Sの上の腺癌細胞を添加し
た。親細胞をフラスコから5mlの部分の0.25%の
トリプシンの添加により取り出した。
CRL−1435、をアールの最小必須培地(Earl
e’s Minimal Es5e、nt ial M
ejium) (MEM) (GIBCOから商業的に
入手できる)中で全面生長に生長させることにより安定
化させた。この手順は次のように実施した。25m1の
MEMおよび10%の胎児子牛血清を175m1容の培
養フラスコに入れ、37℃において5%のCO□雰囲気
中で維持し、そして5X10Sの上の腺癌細胞を添加し
た。親細胞をフラスコから5mlの部分の0.25%の
トリプシンの添加により取り出した。
次いで、上の安定化手順からの親細胞を、前もって準備
した量の10%の胎児子牛血清を含有するSYC培地へ
添加し、そして37℃で維持した。細胞はほぼ1週で全
面生長に到達し、その後それらを前述のようにトリプシ
ンで取り出し、そしである量の5%の胎児子牛血清を含
有するSYC培地へ添加した。細胞を再び、全面生長に
到達するまで、37℃に維持した。この手順をそれぞれ
2.5%および1.25%の胎児子牛血清を含有するS
YC培地を使用して2回反復した。1゜25%の胎児子
牛血清濃度において、フェツイン(75mg/ml);
ウシ血清アルブミン(75mg/ml);インシュリフ
(8mg/l); トランスフェリン(25mg/l
); 5α〜ジヒドロテストステロン(100μg/l
)およびデキサメタソン(100ILg/l)で補充す
る。細胞はほぼ10日で全面生長に到達した。
した量の10%の胎児子牛血清を含有するSYC培地へ
添加し、そして37℃で維持した。細胞はほぼ1週で全
面生長に到達し、その後それらを前述のようにトリプシ
ンで取り出し、そしである量の5%の胎児子牛血清を含
有するSYC培地へ添加した。細胞を再び、全面生長に
到達するまで、37℃に維持した。この手順をそれぞれ
2.5%および1.25%の胎児子牛血清を含有するS
YC培地を使用して2回反復した。1゜25%の胎児子
牛血清濃度において、フェツイン(75mg/ml);
ウシ血清アルブミン(75mg/ml);インシュリフ
(8mg/l); トランスフェリン(25mg/l
); 5α〜ジヒドロテストステロン(100μg/l
)およびデキサメタソン(100ILg/l)で補充す
る。細胞はほぼ10日で全面生長に到達した。
次いで、胎児子牛血清が存在しない以外、1゜25%の
胎児子牛血清の継代接種におけるのと同一の生長因子を
含有するSYC培地中に細胞を継代接種した。細胞はほ
ぼ1週で全面生長に到達した。
胎児子牛血清の継代接種におけるのと同一の生長因子を
含有するSYC培地中に細胞を継代接種した。細胞はほ
ぼ1週で全面生長に到達した。
次いで、ヒの細胞を含有子牛血清を含有しないSYC培
地(上と同一の生長因子を含有する)を通して10回継
代接種して、細胞系統を安定化した。安定化の決定は、
各継代接種の間開−の生長パターンおよび生産されるプ
ラスミノゲン活性化因子(FA)の量を観測することに
より達成した。10回の継代接種後、生物学的に純粋な
変更された全面生長細胞(PC−3fと表示、そして受
託番号CRL−8539でATCCに受託された)を、
次の手順によりプラスミノゲン活性化因子の生産につい
て評価した[化学的繊維素溶解および血栓溶解における
進歩(Pro ressin Fibrinol si
s and 工]orombol 5is)、Vo、3
,315−322ページに記載されている]、。
地(上と同一の生長因子を含有する)を通して10回継
代接種して、細胞系統を安定化した。安定化の決定は、
各継代接種の間開−の生長パターンおよび生産されるプ
ラスミノゲン活性化因子(FA)の量を観測することに
より達成した。10回の継代接種後、生物学的に純粋な
変更された全面生長細胞(PC−3fと表示、そして受
託番号CRL−8539でATCCに受託された)を、
次の手順によりプラスミノゲン活性化因子の生産につい
て評価した[化学的繊維素溶解および血栓溶解における
進歩(Pro ressin Fibrinol si
s and 工]orombol 5is)、Vo、3
,315−322ページに記載されている]、。
100plの部分の培養流体(全面生長後に得た)を1
00μmのヒトのプラスミノゲン(0゜33mg/ml
)と−緒に37℃において15分間インキュベーション
し、その後250ILlのトリス(Tris)緩衝液c
o、iモルのトリス;0 、2モルcy)NaCl ;
pH7、4)および250川1(7)トリペプチド基
質(Valeu−1ys−p−nitro−anili
de;Kabi 。
00μmのヒトのプラスミノゲン(0゜33mg/ml
)と−緒に37℃において15分間インキュベーション
し、その後250ILlのトリス(Tris)緩衝液c
o、iモルのトリス;0 、2モルcy)NaCl ;
pH7、4)および250川1(7)トリペプチド基
質(Valeu−1ys−p−nitro−anili
de;Kabi 。
St ockho’1m、Sweden)を添加した。
この混合物をさらに3分間インキュベーションし、その
後反応を1OoJLlの50%酢酸の添加により停止さ
せた0反応混合物の吸収を405nmにおいて読み、次
いで商業的に入手可能なウロキナーゼ(Calbino
chem、、LaJolla、CA)で同一手順により
発生させたウロキナーゼの標準曲線と比較した。この検
定技術により、培養流体中に存在するプラスミノゲン活
性化因子からのプラスミノゲンの活性化により生産され
るプラスミンの量を測定することにより細胞が生産する
プラスミノゲン活性化因子を定量することができる。
後反応を1OoJLlの50%酢酸の添加により停止さ
せた0反応混合物の吸収を405nmにおいて読み、次
いで商業的に入手可能なウロキナーゼ(Calbino
chem、、LaJolla、CA)で同一手順により
発生させたウロキナーゼの標準曲線と比較した。この検
定技術により、培養流体中に存在するプラスミノゲン活
性化因子からのプラスミノゲンの活性化により生産され
るプラスミンの量を測定することにより細胞が生産する
プラスミノゲン活性化因子を定量することができる。
試験結果を表IIに記載する。細胞が生産するプラスミ
ノゲン活性化因子の量を培養流体の1ml当りのCTA
単位で表わす[ザ壷コミッティー會オン嗜トロンボリテ
ィック・エイジェント・オブ・ザQナショナル・バー1
インスチチユート(the Comm1ttee on
Thr。
ノゲン活性化因子の量を培養流体の1ml当りのCTA
単位で表わす[ザ壷コミッティー會オン嗜トロンボリテ
ィック・エイジェント・オブ・ザQナショナル・バー1
インスチチユート(the Comm1ttee on
Thr。
mbolytic Agents of theNat
ional He&rt In<t、i++1te)に
より規定された。Thromb、Diath、Haem
or、、21.259ページ(1969)に記載されて
いる]、対照として、親細胞系統(ATCC−1435
)(1)fy7゜ミノゲン活性化因子の活性をまた決定
した。
ional He&rt In<t、i++1te)に
より規定された。Thromb、Diath、Haem
or、、21.259ページ(1969)に記載されて
いる]、対照として、親細胞系統(ATCC−1435
)(1)fy7゜ミノゲン活性化因子の活性をまた決定
した。
人J
(FAの活性、CTA単位/ml)
細胞系統 48時間 72時間 96時間ATCCCR
L−143511,518,5死亡
PC−3f(A
TCCCRL
−8539) 28.5 45.0 70.4上の試験
結果が示すように、血清不合培地を通る親細胞系統の継
代接種はある細胞系統を生産した。この細胞系統は、親
細胞系統が生産するプラスミノゲン活性イ):因子の1
#±18 FsmTΔmbニ比il、て、70.4CT
A単位までのプラスミノゲン活性化因子を生産し、はぼ
4倍の増加を示した。有利には、変更された細胞系統は
さらに24時間の間生存することができた。
結果が示すように、血清不合培地を通る親細胞系統の継
代接種はある細胞系統を生産した。この細胞系統は、親
細胞系統が生産するプラスミノゲン活性イ):因子の1
#±18 FsmTΔmbニ比il、て、70.4CT
A単位までのプラスミノゲン活性化因子を生産し、はぼ
4倍の増加を示した。有利には、変更された細胞系統は
さらに24時間の間生存することができた。
尖蔦11
親細胞系統としてヒトの膵臓癌細胞系統、ATCC−1
420、を使用して、実施例Iに記載する手順を反復し
た。ここに記載する手順により得られた生物学的に純粋
な変更された細胞系統をPaCa−2fと表示し、そし
て受託番号ATCCCRL−8725でATCCにおい
て受託された。得られた試験結果を下表■に要約する:
人1 (FAの活性、CTA単位/ m l )細胞系統 4
8時間 72時間 96時間ATCC14 20、2,57,5死亡 PaCa−2f (ATCCC RL−8725,415,025,2 5) 上の試験結果が示すように、血清不合培地を通る親細胞
系統の継代接種はある細胞系統を生産した。この細胞系
統は、25.2CTA単位までのプラスミノゲン活性化
因子を生産し、はぼ3倍の増加、ならびに24時間の生
存能力の増加を示した。
420、を使用して、実施例Iに記載する手順を反復し
た。ここに記載する手順により得られた生物学的に純粋
な変更された細胞系統をPaCa−2fと表示し、そし
て受託番号ATCCCRL−8725でATCCにおい
て受託された。得られた試験結果を下表■に要約する:
人1 (FAの活性、CTA単位/ m l )細胞系統 4
8時間 72時間 96時間ATCC14 20、2,57,5死亡 PaCa−2f (ATCCC RL−8725,415,025,2 5) 上の試験結果が示すように、血清不合培地を通る親細胞
系統の継代接種はある細胞系統を生産した。この細胞系
統は、25.2CTA単位までのプラスミノゲン活性化
因子を生産し、はぼ3倍の増加、ならびに24時間の生
存能力の増加を示した。
衷施11
親細胞系統としてマウスの色素細胞腫細胞系統、B−1
6[ジャクンン研究所(Jacks。
6[ジャクンン研究所(Jacks。
n Lab、、Bar Harbor、Maine)か
ら入手可能]を使用して、実施例工に記載する手順を反
復した。ここに記載する手順により得られた生物学的に
純粋な変更された細胞系統をB−16と表示した。得ら
れた試験結果を下表■に要約する: 人1 (PA(7)活性、CTA単位/m’l)細胞系統 2
4時間 48時間 96時間B−16 0.70 1.
20 死亡 細胞系統 96時間 B−16−−− B−163,2 生物学的に純粋な変更された細胞系統は、24時間にお
いて3倍のプラスミノゲン活性化因子の増加および48
時間において2倍のプラスミノゲン活性化因子の増加を
示した。さらに、変更された細胞系統は96時間まで生
存することができた。
ら入手可能]を使用して、実施例工に記載する手順を反
復した。ここに記載する手順により得られた生物学的に
純粋な変更された細胞系統をB−16と表示した。得ら
れた試験結果を下表■に要約する: 人1 (PA(7)活性、CTA単位/m’l)細胞系統 2
4時間 48時間 96時間B−16 0.70 1.
20 死亡 細胞系統 96時間 B−16−−− B−163,2 生物学的に純粋な変更された細胞系統は、24時間にお
いて3倍のプラスミノゲン活性化因子の増加および48
時間において2倍のプラスミノゲン活性化因子の増加を
示した。さらに、変更された細胞系統は96時間まで生
存することができた。
実111■
親細胞系統としてATCC−1622、子宮内膜腺癌細
胞系統(ATCCから入手可能)を使用して、実施例工
に記載する手順を反復した。未発明の方法により得られ
た生物学的に純粋な変更された細胞系統をKLE と表
示し、そして受託番号ATCCCRL−8726でAT
CCにおいて受託された。細胞が全面生長に到達した後
48時間にプラスミノゲン活性化因子の活性を測定し、
そして得られた試験結果を下表Vに示す。
胞系統(ATCCから入手可能)を使用して、実施例工
に記載する手順を反復した。未発明の方法により得られ
た生物学的に純粋な変更された細胞系統をKLE と表
示し、そして受託番号ATCCCRL−8726でAT
CCにおいて受託された。細胞が全面生長に到達した後
48時間にプラスミノゲン活性化因子の活性を測定し、
そして得られた試験結果を下表Vに示す。
人N
(PAの活性、CTA単位単位/m
側胞系統 48時間
ATCCCRL−162
20,05
KLE (ATCCCR3,o3
L−8726)
表Vに示されるように、変更された細胞系統、KLE
は、48時間において親細胞系統よりも60倍のプラス
ミノゲン活性化因子の生産の増加を示した。
は、48時間において親細胞系統よりも60倍のプラス
ミノゲン活性化因子の生産の増加を示した。
丈蔦諮N
親細胞系統として受託番号ATCC−1579でATC
Cから入手可能なメラニ欠乏の色素細胞腫細胞系統を使
用して、実施例工に記載する手順を反復した。本発明の
方法により得られた生物学的に純粋な変更された細胞系
統をML と表示し、そして受託番号ATCCCRL−
8724でATCCにおいて受託された。細胞が全面生
長に到達した後48時間にプラスミノゲン活性化因子の
活性を測定し、そして得られた試験結果を下表■に示す
。
Cから入手可能なメラニ欠乏の色素細胞腫細胞系統を使
用して、実施例工に記載する手順を反復した。本発明の
方法により得られた生物学的に純粋な変更された細胞系
統をML と表示し、そして受託番号ATCCCRL−
8724でATCCにおいて受託された。細胞が全面生
長に到達した後48時間にプラスミノゲン活性化因子の
活性を測定し、そして得られた試験結果を下表■に示す
。
表j
(FA(7)活性、CTA単位/ m l )細胞系統
4a時間 ATCCCRL−157 90a KL (ATCCCRL o、o7 −8724) a 活性の水準は検定の検出限界より下であった。
4a時間 ATCCCRL−157 90a KL (ATCCCRL o、o7 −8724) a 活性の水準は検定の検出限界より下であった。
特許出願人 マイルス参ラボラドリース・インコーポレ
ーテツド
ーテツド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、プラスミノゲン活性化因子生産性細胞を胎児子牛血
清を含有する適当な生長培地中で生長させ、そして減少
する量の胎児子牛血清を含有する前記適当な生長培地の
1系列を通してこのような細胞を継代接種する工程から
なり、これにより前記細胞は前記胎児子牛血清を木質的
に含有しない前記M当な生長培地中で全面生長に到達す
ることができ、そして前記細胞は初期のプラスミノゲン
活性化因子生産性細胞の水準より大きい水準でプラスミ
ノゲン活性化因子を生産することができることを特徴と
するプラスミノゲン活性化因子生産性細胞から得られる
プラスミノゲン活性化因子の収部を増加する方法。 2、プラスミノゲン活性化因子生産性細胞は、色素細胞
腫、前立腺、***、結腸、卵巣、膵臓、や口部、直腸、
子宮内膜および線維芽細胞の腫瘍細胞から成る群より選
択される哺乳動物の腫瘍細胞である特許請求の範囲第1
項記載の方法。 3、哺乳動物の腫瘍細胞は、色素細胞腫、前立腺、***
、結腸、卵巣、膵臓および子宮内膜から成る群より選択
される人間の癌細胞である特許請求の範囲第2項記載の
方法。 4、腫瘍細胞系統が人間の前立腺の腺癌である特許請求
の範囲第3項記載の方法。 5、人間の前立腺の腺癌はATCCCRL−1435で
ある特許請求の範囲第4項記載の方法。 6、適当な生長培地はSYC培地である特許請求の範囲
第1項記載の方法。 7、SYC培地はフェツイン、ウシ血清アルブミン、イ
ンシュリン、トランスフェリン、5α−ジヒドロテスト
ステロンおよびデキサメタソンを含有する特許請求の範
囲第6項記載の方法。 8、フェツインは50〜150mg/ l (7)濃度
で存在し;ウシ血清アルブミンは50〜150m g
、/ ]の濃度で存在し;インシュリンは5〜10 m
g / lの濃度で存在し;トランスフェリンは5〜
40mg/lの濃度で存在し;5α−ジヒドロテストス
テロンは5〜200延g/LIMB度で存在し:そして
デキサメタソンは50〜200ルg/Iの濃度で存在す
る特許請求の範囲第7項記載の方法。 9、フェツインは75mg/lの濃度で存在し;ウシ血
清アルブミンは75mg/lの濃度で存在し;インシュ
リンは8 m g / lの濃度で存在しニドランスフ
ェリンは25mg/lの濃度で存在し:5α−ジヒドロ
テストステロンは100gg/lの濃度で存在し:そし
てデキサメタソンは100kg/lの濃度で存在する特
許請求の範囲第7項記載の方法。 10、胎児子牛血清の濃度は前記継代接種の各々を通し
て2倍のファクターで順次に減少されている特許請求の
範囲第1項記載の方法。 11、人間の前立腺の腺癌細胞系統、ATCCCRL−
1435、を胎児子牛血清を含有する適当な生長培地中
で生長させ、そして減少する量の胎児子牛血清を含有す
る前記適当な生長培地の1系列を通してこのような細胞
を継代接種する工程からなり、これにより前記細胞系統
は前記胎児子牛血清を本質的に含有しない前記適当な生
長培地中で全面生長に到達することができ、そして前記
細胞系統は初期のプラスミノゲン活性化因子生産性細胞
系統の水準より大きい水準でプラスミノゲン活性化因子
を生産することができることを特徴とする人間の前立腺
の腺癌細胞系統、ATCCCRL−1435、から得ら
れるプラスミノゲン活性化因子の収量を増加させる方法
。 12、適当な生長培地はSYC培地である特許請求の範
囲第11項記載の方法。 13、前記SYC培地はフェツイン、ウシ血清アルブミ
ン、インシュリン、トランスフェリン、5α−ジヒドロ
テストステロンおよびデキサメタソンを含有する特許請
求の範囲第12項記載の方法。 14.7xツインは50〜150mg/lの濃度で存在
し:ウシ血清アルブミンは50〜150m g / 1
の濃度で存在し;インシュリンは5〜Long/lの濃
度で存在し;トランスフェリンは5〜40mg/lの濃
度で存在し;5α−ジヒドロテストステロンは5〜20
0gg/lの濃度で存在し;そしてデキサメタソンは5
0〜200gg/ 1の濃度で存在する特許請求の範囲
第13項記載の方法。 15、フェツインは75mg/lの濃度で存在し;ウシ
血清アルブミンは75mg/lの濃度で存在し:インシ
ュリンは8mg/lの濃度で存在しニドランスフェリン
は25mg/lの濃度で存在し;5α−ジヒドロテスト
ステロンは110Ox/lの濃度で存在し;そしてデキ
サメタソンは1100p/lの濃度で存在する特許請求
の範囲第14項記載の方法。 16、胎児子牛血清の濃度は前記継代接種の各々を通し
て2倍のファクターで順次に減少されている特許請求の
範囲第11項記載の方法。 17、SYC培地と表示される化学的に定められる生長
培地。 18、フェツイン、ウシ血清アルブミン、インシュリン
、トランスフェリン、5α−ジヒドロテストステロンお
よびデキサメタソンを含有する特許請求の範囲第17項
記載の化学的に定められる生長培地。 19、フェツインを50〜150mg/1t7)6度で
含有し;ウシ血清アルブミンを50〜150mg/lの
濃度で含有し;インシュリンを5〜10mg/lの濃度
で含有しニドランスフェリンを5〜40mg/lの濃度
で含有し:5α−ジヒドロテストステロンを50〜20
0.g/lの濃度で含有し;そしてデキサメタソンを5
0〜200gg/lの濃度で存在する特許請求の範囲第
18項記載の化学的に定められる生長培地。 20.フェツインを75mg/lの濃度で含有し;ウシ
血清アルブミンを75mg/lの濃度で含有し;インシ
ュリンを8mg/lの濃度で含有し;トランスフェリン
を25mg/lの濃度で含有し:5α−ジヒドロテスト
ステロンを1OOJ1.g/lの濃度で含有し;そして
デキサメタソンを100.g/lの濃度で存在する特許
請求の範囲第20項記載の化学的に定められる生長培地
。 21、ATCC受託番号CRL−8539を有するPC
−3fと表示されるプラスミノゲン活性化因子分泌性細
胞系統の生物学的に純粋な培養物。 22、ATCC受託番号CRL−8725を有するPa
Ca−2fと表示されるプラスミノゲン活性化因子分泌
性細胞系統の生物学的に純粋な培養物。 23、ATCC受託番号CRL−8726を有するKL
E、と表示されるプラスミノゲン活性化因子分泌性細胞
系統の生物学的に純粋な培養物。 24、ATCC受託番号CRL−8724を有するML
と表示されるプラスミノゲン活性化因子分易性細胞系
統の生物学的に純粋な培養物。 2、特許請求の範囲第21項記載の細胞系統により分泌
されたプラスミノゲン活性化因子。 2、特許請求の範囲第22項記載の細胞系統により分泌
されたプラスミノゲン活性化因子。 2、特許請求の範囲第23項記載の細胞系統により分泌
されたプラスミノゲン活性化因子。 2、特許請求の範囲第24項記載の細胞系統により分泌
されたプラスミノゲン活性化因子。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60186884A | 1984-04-19 | 1984-04-19 | |
US601868 | 1984-04-19 | ||
US704593 | 1985-02-22 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2276605A Division JPH03151873A (ja) | 1984-04-19 | 1990-10-17 | プラスミノゲン活性化因子産生細胞系 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60259187A true JPS60259187A (ja) | 1985-12-21 |
JPH0358270B2 JPH0358270B2 (ja) | 1991-09-04 |
Family
ID=24409076
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60081493A Granted JPS60259187A (ja) | 1984-04-19 | 1985-04-18 | プラスミノーゲン活性化因子を増収する方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60259187A (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5728009A (en) * | 1980-06-11 | 1982-02-15 | Leuven Res & Dev Vzw | Novel plasminogen activator and drug having thrombosis dissolving activity |
JPS5865219A (ja) * | 1981-07-15 | 1983-04-18 | イエダ・リサ−チ・アンド・デベロツプメント・コンパニ−・リミテツド | プラスミノ−ゲン賦活体の製造法 |
JPS59134733A (ja) * | 1983-01-24 | 1984-08-02 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 生物活性物質の製法 |
-
1985
- 1985-04-18 JP JP60081493A patent/JPS60259187A/ja active Granted
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5728009A (en) * | 1980-06-11 | 1982-02-15 | Leuven Res & Dev Vzw | Novel plasminogen activator and drug having thrombosis dissolving activity |
JPS5865219A (ja) * | 1981-07-15 | 1983-04-18 | イエダ・リサ−チ・アンド・デベロツプメント・コンパニ−・リミテツド | プラスミノ−ゲン賦活体の製造法 |
JPS59134733A (ja) * | 1983-01-24 | 1984-08-02 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 生物活性物質の製法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0358270B2 (ja) | 1991-09-04 |
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