JPS60252422A - ハイブリツド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明は新規ハイブリッド繊維素溶解性酵素、それらの
製造方法並びに血栓症系疾病の治療におけるそれらの用
途に関する。

従来の技術 ヒト繊維素溶解性酵素に２種の群に大別でき、すなわち
直接フィブリンを消化する一群、例えばトリプシン及び
プラスミン、及び不活性なチモーゲン（酵素前駆体）を
活性化することにより間接的にフィブリンを消化する第
二の群、プラスミノゲンがある。後者の群にプラスミノ
ゲンアクチベーターからなるが、免疫学的基準、分子量
及びポリペプチド組成に基ずく２種の主要タイプにより
代表されている（　ＣｏｅｅｅｎｒＤ、ｅｔａｅ　、　
ｄ　９８２　、　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、＋４８　＋　２９４−２９６参照
）。主要タイプの１種のウロキナーゼ型プラスミノゲン
アクチベーター（ｕ−ＰＡ）１ｄ泌尿系酵素ウロキナー
ゼに似ているのに対し、もう一方の主要タイプである組
織型プラスミノゲンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）に血液
中で見出された外因性アクチベーター、ケイオトロピッ
ク（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　）塩により組織から抽出し
たアクチベーター及び培養黒色腫細胞から分泌されたア
クチベーターに類似している（　Ｒｉｊ−ｋｅｎ、Ｄ、
Ｌ、ａｎｄ　ＣｏｅｅｅａｙＤ、＋１９８１　＋Ｊ、Ｂ
ｉｏｅ、Ｃｈｅｍ、。

２５６　、７０３５−７（１４１、Ｒｉｊｋｅｎ、Ｄ、
Ｌ、ｅｔａ６．、Ｊ、Ｌａｂ。

Ｃ６１ｎ、Ｍｅｄ。、９７．４７７−４７８　参照）。

ヒトプラスミノゲンアクチベーターに血栓症の治療に使
用されている。しかしながら、ｕ−ＰＡはこれらがフィ
ブリン結合プラスミノゲンと同じ位動率的に循環性プラ
スミノゲンを活性化してしまう欠点を有し、かつｕ−Ｐ
Ａ及びｔ−ＰＡｆｉいずれも、それらり）活性が急速な
清掃率及び天然アンチプロテアーゼによる不活性化のた
めに生体内で急速に消失してしまうという欠点を有して
いる。

発明が解決しようとする問題点 上記ヒト繊維素溶解性酵素は単鎖及び二本鎖構造いずれ
としても存在する一群のプロテアーゼに属し、二本鎖に
ジスルフィド橋により結合されている。本発明において
、２種のこのようなブ°ロチアーゼの所望σ〕性質が２
種のブ″ロチアーゼの各々からの＠全含有する単ハイブ
リッド蛋白質分子を形成することにより結合されうろこ
とが見出された０ 〔発明の構成〕 問題を解決するための手段 従って、本発明は異なる二本鎖プロテアーゼの一本鎖に
、捷たは同一プロテアーゼの同−鎖に結合した二本鎖プ
ロテアーゼ活性鎖からなり、ハイブリッド蛋白質中の鎖
の少なくとも１本は繊維素溶解活性プロテアーゼから銹
導され、ハイブリッド蛋白質に除去可能な遮断性基で遮
断されていてもよい繊維素溶解活性に必須な触媒部位を
有することを特徴とする繊維素溶解活性ハイブリッド蛋
白質ケ提供する。

ｉ朋 二本鎖プロテアーゼ構造はプロテアーゼ活性を有さない
Ａ鎖及びプロテアーゼ活性を有するＢ鎖を含有する。Ａ
鎖のあるもり）汀、例えばプラスミン及びｔ−ＰＡから
誘導されたものは高いフィブリン親和性を有する。本発
明の好捷しいハイブリッド蛋白質に異なるプロテアーゼ
のＢ＠に結合した１種のプロテアーゼのＡ鎖を含む。

好適にはプロテアーゼの少なくとも１種にセリンプロテ
アーゼである。

本明細書中で使用した「除去可能な遮断性基（ｒｅｒｎ
ｏｖａＭｅ　Ｍｏｃｋｉｎｐ　９ｒｏｕｐ　）　Ｊとい
う表現には加水分解の偽−次速度定数が等張水性媒体で
ｐＨ７，４で３７℃でＩ　Ｏ−’／秒−１０−３／秒の
範囲であるような速度グ）加水分解により除去可能な基
が含捷れる。

このような遮断性基は欧州特許第０００９８７９号中に
記載され、これらの例には置換されていてもよいベンゾ
イルまたは置換されていてもよいアクリロイルのような
アシル基が含まれる。

ベンゾイル遮断性基の好適な存在任意σ）置換基にはハ
ロゲン％　Ｃｌ−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ
４−６アルカノイルオキシ、Ｃ１−６フルカノイルアミ
ノ、アミノ−！、りｌ−１′ｐ−シアニジンが含まれる
。

アクリロイル遮断性基の好適な存在任意の置換基ＶＣｎ
　Ｃ１−６アルキル、フリル、フェニルまたにＣ３−６
アルキルフエニルが含まれる。

好捷しくに、存在任意の除去可能な遮断性基に４−アミ
ノベンゾイル、Ｎ−メチルアミノ、ベンゾイル、Ｎ、Ｎ
−ジ−メチル−アミノベンゾイルまたは４−メトキシベ
ンゾイルである。

本発明＋７）ハイブリッド蛋白質の例は下記の通りであ
る。

ａ）プラスミンＡ鎖（ＰＬ−Ａ）及び組織プラスミノゲ
ンアクチベーターＢ鎖（ｔ−ＦＡ−Ｂ）ｂ）ｔ−ＰＡ、
Ａ鎖（ｔ−ｐＡ−Ａ）及びウロキナーゼブラスミノゲン
アクチベーターＢｇ（ｕ　−ＰＡ−Ｂ） ｃ）Ｐｌ、’−Ａ及びｕ−ＰＡ−Ｂ ｄ）　ｔ−４）Ａ、−Ａ及びＰＬ−Ｂ ｅ）アシル化ＩＰＬ−Ａ及びｔ−ＰＡ　Ｂ。

本発明のハイブリッド蛋白質に寄与する原蛋白質り）両
者が繊維素溶解活性であることが好ましいが、両者り）
一方が繊維素溶解不活性であることも可能である。例え
ば、原蛋白質の一方が繊維素溶解不活性物質のプロトン
ビンであってもよい。

本発明グ）ハイブリッド蛋白質に１釉のプロテアーゼの
釦を他ψ）プロテアーゼＤ鎖と酸化性条件下で所望なら
ば透析下で、混合することにより製造できる。

好ましくは、混合／透析方法に分子状酸素の存在下で１
日以上行なわれ、得られたハイブリッド蛋白質にクロマ
トグラフィー技術により単離される０ ジスルフィド結合形成速度を高めるため有利に使用され
うるであろう様々な方法が従来知られており、例工ば、
インシュリンの合成に関する英国特許第２０７２６８０
号に記載されたように−Ｓ　Ｓ　０３誘導体を用いるも
のがある。

ハイブリッド蛋白質が遮断された触媒部位を含イ１する
場合、遮断に欧州特許第０００９８７９号に記載の方法
と類似した方法により個々の）鎖上または形成されたハ
イブリッド蛋白質上で行なわれる。遮断に好甘しくはハ
イブリッド蛋白質の形成後に行なわれる。

あるいは、本発明のハイブリッド蛋白質は各蛋白質り）
遺伝情報（ＤＮＡ配列）を取り、これを切断及び結１」
−ることによりハイブリッド蛋白質グ）ためグ）新しい
コードづけを構成（５、そしてこのＤＮＡ配列金原核動
物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ　）または真核動物（ｅｕｒ
ｏｋａｒｙｏｔｅ　）宿主中に表現することにより製造
できる。

個々のプロテアーゼ鎖げそれら自体各原プロテアーゼの
緩和な還元によって鎖中ジスルフィド橋全切り、次いで
親和性クロマトグラフィーにまり官節性鎖全分離させる
ことにより製造できる。次いで、個々の鎖に使用するた
め必要になるオで最長数ケ月間も好ましくは一７０℃な
いし０°Ｃの温度で保存できる。本発明のハイブリッド
蛋白質げ好捷しくに血栓症系疾病治療用医薬組成物とし
て投与される。

従って、本発明にまた本発明のハイブリッド蛋白質全医
薬として適当な担体と組合せて含有する医薬組成物を提
供する。

本発明の組成物に人間へ静脈内投与するのに適した医薬
組成物と同様な常法によって処方されうる０ 典型的には、静脈内投与用組成物は滅菌ハイブリッド蛋
白質の滅菌等張水性緩衝液中溶液である。

必要な場合、組成物ｒｉまたハイブリッド蛋白質を溶液
中に保つための可溶化剤及び注射部位の痛みを和げるた
めのりグノカインのような局部麻酔剤を含んでもよい。

一般に、ハイブリッド蛋白質に単位投艙量剤型として提
供され、例えは、活性単位で表わした蛋白質量を示し、
かつ遊離蛋白質が遊離されてくる時間を示したアンプル
や薬包のような気密容器中の乾燥粉末または水不含濃縮
物として提供される。蛋白質が注入により投与されるべ
き場合、これに滅菌医薬銘柄「注射用水」を含有する注
入ビンを用いて小口供給される。蛋白質が注射により投
与されるべき場合、滅菌注射用水のアンプルを用いて小
口供給される。注射用または注入用組成物は投Ａに成分
を混合することにより製造できる。

物質グ）投与量は繊維素溶解必要責及びそれが必要な速
度、血栓塞栓症状の程度及び血栓の位置及び大きさによ
り異なる。使用すべき正確な投与量は病気の性質の点か
ら必然的に治療を指揮する医者により情況に応じて決定
されなければならない０しかしながら、一般に、成熟血
栓り）治療中の患者に体重１ゆ当り０．０１〜２．０〜
の８宛投与ｔを５回までの投与量に分けて注射によりま
ｆｃに注入により受ける。

上で示した投薬量範囲内では、本発明の化合物について
何ら不利な毒性効果は観察されなかった。

従って、本発明の別の観点において、効果的な非毒性賛
の本発明ハイブリッド蛋白質を患者に投与することを含
む血栓症系疾病方法を提供する０実施例 以下、実施例により本発明を例示する。

実施例１ Ｌｙｓ−プラスミンＡ鎖／１−ＰＡＢ鎖ハイブリッドの
合成 本実施例全便宜上下記の４部位に分ける。

（ａ）　プラスミンＣＦ′）Ａ鎖の単離（ｂ）ｔ−ＰＡ
のＢ鎖の単離 （ｃ）　プラスミンＡ鎖／１−ＰＡＢ鎖ハイブリッドの
形成 （ψ　ハイブリッドの特徴づけ （ａ）　プラスミンのＡ＠の単離 本質的に塩不含のプラスミノゲン（２，０ＩＩＩｆ７）
。

０、０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　／　０．１　Ｍ　ＮａＣｅ／
２５９Ｄｖ／ｖ　）グリセロールｐ９．０に１５η／ｄ
の割合で溶解したものを低分子量ｕ　−Ｆ　Ａ　（Ａｂ
ｂｏｔｔ　）により５００ＣＴＡｕ／ｍｔ（１０００：
　１のプラスミノゲン：ｕ−ＰＡモル比に等しい）の割
合で２７℃にて１時間活性化することによりプラスミン
１に製造した。

プラスミンのその構成成分Ａ及びＢ鎖への緩和な還元及
びその後のそれらの分離ｔａ　Ｓｕｍｎａｒｉａ、Ｌ、
ｅｔａｅ、らの方法（Ｊ、ＢｉＯ／、Ｃｈｅｍ、、１９
７９，２５４．６８１１）をわずかに修正した方法を用
いて行なった。プラスミン及びｕ−ＦＡ混合物をロイペ
プチン（１５ｍｌｌ／ａｔ　）及びジチオスレイトール
（０，０５Ｍ）で処理し、Ｎ２　で−掃し、６℃で更に
３時間恒温維持した。次いで、全内容物を予め０．１　
ＭＮａＨｚＰＯ４／　Ｏ，ｌ　１ｖ／−ロイベブチ’、
ｔ　ｐＨ７，４で平衡化しであるリジンセファロース（
５ｅｐｂａｒｏｓｅ、登録商標）　ＣＬ４Ｂのカラム（
Ｖｔ１．Ｍ）に適用した。適用した試料を、基底線が安
定化するまで０、ＩＭＮａＴ−１＊ＰＯ４／　ｏ、　０
０３　Ｍジチオスレイト−ＪＬ　ｐＨ７，４で洗刺した
。次いで、プラスミンのＡ鎖を０．ＩＭＮａＨｔＰＯ４
／　０．００３　Ｍジチオスレイトール／　０．５　Ｎ
６−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）ｌ）Ｎ７．４を用い
てカラムから脱着させた。クロマトグラフィーを６゛Ｃ
にて１００ｄ／ｈ／ｃＪで行なった。全フラクション（
公称１．５　ｍ　）をグリセロール（０，５ｇ）中に集
めた。カラムからの溶出液＠２８０ｎｍで連続監視した
。ＥＡＣＡ含有フラクション中の蛋白質濃度を牛血清ア
ルブミンを標準として用いＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａ
ｎａ＃、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９７６．７２゜２４８）
により決定した。ピークフラクションは３２０μ９蛋白
質／ｌ１ｌＩ！を含有していた。この溶液ｌｄを０．０
５　Ｍ　ｔ’リス、０．０２　Ｍ　Ｌ−リジン及び０．
００３Ｍ　ＥＤＴＡで０，０５−の２０倍濃縮原料溶液
の添加により増加させた。ｐＨにニュートラリット（、
Ｎｅｕｔｒａｉｆｆｉｔ　、登録商標）紙（Ｍｅｒｃｋ
　）を用いて、８．５−９．０と記録された。この溶液
にプラスミンのＡ調音含有しており、氷上で約２時間保
存した。

（ｂ）　ｔ　−Ｐ　Ａ、　１７′）　Ｂ鎖の単離上とし
て二本鎖ｔ　、−Ｐ　Ａ　（蛋白質分解により決定して
０．６５　ｍ？　）からなる唾剤全０．０５Ｍトリス／
　０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ６／　２５　％　（ｖ／ｖ）　
グリｔ　Ｏ−ＪＬｐＨ９，０中に２　ｍ？　／　ｍｔ、
　ｑ）割合で溶解した。ｔ−ＰＡ溶液をジチオスレイト
ール（０，ＯＩＭ）及びロイペブ′チン（２ｍ９　／　
ｍｔ　）と共に窒素雰囲気中で１時間６℃にて恒温維持
することにより緩和な還元を行ｆｚツｆｃ、ｏ混合物ノ
全ｆｉｒ予め０．１　Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４１０，１ｍ９
　／　ｄロイペプチンｐＨ７，４で平衡化しであるリジ
ンセファロースＣＬ４Ｂり）カラム（Ｖｔ２０ｍ　）　
に適用した。カラムを基底線が安定化するまで０．　ｉ
Ｍ　ＮａＨｔＰＯｔ　ｌ　ｏ、　００３　Ｍジチオスレ
イトール声７．４で洗浄した。クロマトグラフィーの全
部分？６℃にて１００　ｍｅ／　ｈ　／洲で行なった。

フラクション（公称Ｑ、　６　ｍＡ　）　ｋグリセロー
ル（０，２ｍＡ）中に集めたＯ　Ｖｏ　フラクション（
未吸着物質、実質的ににｔ　−Ｐ　Ａ、　Ｂ鎖、全含有
）を蛋白質含量についてかつＳ　−２２８８（Ｋａｂｆ
ｖｉｔｒｕｍ　）ｉ用いてアミド分解活性について分析
した。最高のアミド分解活性？有するフラクションを貯
蔵しておくことにより、１６５μ９の蛋白質及び２５．
０００ＳＵ　（ここで０、２　ｍ＆　／　ｄ大豆トリプ
シン抑制剤含有０．１　Ｍ　トリエンｐＨ８，０、０，
０５％ＮａＮ３　中１　ｍ　Ｍ　Ｓ　−２２８８１α 金柑いてｌ５Ｕ＝△Ｑｐ　Ｏ，００１劃−１）を含有４
０５　ｎｍ する溶液を得た。この貯蔵物は０．０５　Ｍ　トリス、
０、０２　Ｍ　Ｔ、−リジン及び０．００３　ＭＥＤＴ
Ａを用い０、ＩＪゴの２０倍濃縮原料溶液の添加により
増加させた。−１ハにュートラリフト紙を使用して）９
．０と配録され、次いで貯蔵物を氷上で１時間保存した
。

（ｃ）　プラスミンＡ鎖／１−ＰＡＢ鎖ハイブリッド１
７）形成 上記のプラスミンＡ鎖の製剤（３２０μ９の蛋白質）及
び上記のｔ−ＰＡＢ鎖の製剤（１６０μ９の蛋白質）を
小さなポリスチレン容器中で混合した。

混合物を、約０．　ＯＯＩ　ＭＥＤＴＡ中でオートクレ
ーブ処理した後充分に水洗した６、　３５　ｒａｎ　（
８／　３２”）透析管（５ｃｌｅＡｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｌｔｄ、）に移（−た
。この、各調型をほぼ等モルｉ　（５，３ｎｍｏｄ　）
含有する混合物（３，２ｄ、１５０μｙ蛋白漬／−）を
３０容＋７′）　２５　％　（ｖ／ｖ）　グリセロール
１０．０４Ｍトリス１０．０２ＭＬ−リジン／　０．０
８　Ｍ　ＮａＣｅ１０．００３Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ９，
０に対して６℃で３日間透析することにより空気の存在
下において緩和な酸化に付（−た。透析緩衝液は攪拌し
た。非拡散物質に一４０°Ｃで４日間保存し、次いで更
に６℃で８日間４０容の同一緩衝液で透析した。非拡散
物質のアリコートを定期的に取出し、−４０℃で保存し
た。

（ｄ）　ハイブリッドの特徴づけ ８％分離ゲル中４％積重ねゲルを用い、それ以外ｎ　Ｌ
ａｅｍｒｎ６ｉ　（Ｎａｔｕｒｅ、１９７０　＊２２７
＋６８０）に記載されたようにドテシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）
を用いることによりハイブリッド含有溶液の各種Ｍｒ酸
成分分離した。繊維素溶解活性帯を、Ｇｒａｎｅｅｇｉ
−Ｐｉｐ−ｅｒｎｏ　＆　Ｒｅｔｃｂ　（Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、　、１９７８　、　Ｉ　４８　、２２３　）に
本質的に記載されていたようにフイブリンチモグラフイ
ーを用いて同定した。これらの実験は、透析の開始から
１５分後のハイブリッド混合物において、血栓崩壊活性
がチモグラムのＭｒ　＝　３２，０００の領域中にほと
んど完全に存在することが立証している。しかしながら
、２４時間、７２時間及び９日目に取出した試料におい
て、顕著な繊維素溶解活性がまたＭｒ＝８８，０００及
び９２，０００で二重項（ｄｏｕｂｌｅｔ　）　（以下
、９０に二重項と称する）として存在していた。捷た、
特異抗体をチモグラムに入れることにより９０に二重項
繊維素溶解活性は抗−ｔ　−Ｐ　Ａ　Ｉ９Ｇにより抑制
されうるが、抗−ｕ−ＰＡＩ９Ｇの対照製剤によっては
抑制されないことが示された。９０に二重項において繊
維素溶解活性がプラスミンＡ＠製剤のプラスミン汚染に
よるものであるりるという可能性Ｆｌ　（ａ）プラスミ
ンによるフィブリン層の溶解に対する相対的非感性、中
）ｔ＝１５分の試料における９０に二重項活性の笑質的
不存在及び〔ｃ）２種抗体含有チモグラム上の対照的な
９０に二重項の活性により除外される。

実施例２ Ｌｙｓ−プラスミンＡ／１−ＦＡハイブリッドの合成は
下記の点全除き、実質的に実施例１に記載（−たよりに
行なった。

（ａ）ｔ　−ＦＡ還元工程中ロイペプチンを省略した。

Ｑ））　ｔ−ＰＡ還元は５℃で２時間であった。

（ｃ）　透析前混合物に３ｎｒｒＩＯｅ１７′）各鎧型
を含有していた０ （ｄ）　透析に４０容透析緩衝液／２４時間１５℃に対
し、次いで４０容透析緩衝液７２４時ｖ５℃に対して行
なった。

透析した滞留物（２，４ｍ　）に５容００２Ｍ燐酸塩／
　０．１５　Ｍ　ＮａＣＪ／　０．０１％トウイーン８
０．ｐ）７．４ＣＰＢＳ／ＴＷ）で希釈し、Ｐ　Ｂ　Ｓ
　／ＴＶで平衡化したリジンセファロースのカラム（Ｖ
ｔ２．９ｄ）に適用した。透析した滞留物を適用した後
、カラムｋ　（ａ）　Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔ　Ｗ　、　（
ｂ）　０．０２　Ｍ　トリス１０．５ＭＮａＣｇ１０．
０１％トウィーン８０　、　ｐＨ７，４及び（ｃ）　（
１））と同一だが更に０．５　Ｍ　Ｔ、−アルギニンを
含有しているもσ）で洗浄した。クロマトグラフィーの
全部分’ｔｒｉ　５０ｄ／ｈ／ｄで５℃で行なった。カ
ラムからの溶出液をフラクションとして集めた。

各フラクションは色素形成性物質Ｓ−２２８８全用いて
分析した。結果＋１−ｊＳ−２２８８活性のほとんどが
未吸着物質を含有しているフラクション中にあることを
示した。残りはアルギニン可解離性物質を含有するフラ
クション中にあった。

５ＤＳＰＡＧＥ　により、次いでフィブリンチモグーを
含有しており、またアルギニン可解離性物質はわずかＭ
ｒ＝約９０，０００プラスミノゲンアクチベーター全含
有していることが明らかである。

Ｍｒ＝９０，０００アクチベーターを含有するフラクシ
ョンを同様に製造したハイブリッド製剤と共に貯蔵し、
固体ＰＥＧ２０，０ＯＯＫ対して６℃で２時間透析し、
透析した滞留物を除去した。次いでこＤ溶液をセファデ
ックスＧ−２５を用いて０．０５Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３中
に緩衝液交換し、親液性化した。親液化的溶液１ｄ　Ｓ
　Ｄ　Ｓ　ＰＡＧＥにより次いでチモグラフイーにより
分析したところＭｒ約９０，０００（これに約８８，０
００及び約９２，０００における２種からなる二重項と
考えられる）にて繊維素溶解活性の単−主要帯及び約１
５０，００　Ｑ及び約８６，０００の副成分を示した。

フィブリン板によるまたげ８−２２８８？用いる分析は
全体として製剤に対し０．２〜０，３の繊維素溶解活性
対アミド分解活性（ＩＵ：ＳＵ）を与えた。フィブリン
板上の製剤σ）投与景応答はｔ−ＰＡのものと相似して
いた。

実施例３ Ｌｙｓ−プラスミンＡ鎖の単離は下ａｅＤ点を除き実施
例ｉ　ｖｃ　ｉｉｔ、”載したものと同様であった。

（ａ）　ジチオスレイトールとの恒温維持に５℃で３．
５時間であった。

（ｂ）　リジンセファロース床容積ｆ１１．５ｄであり
た。

ピークを７ミノカブロン酸（ＥＡＣＡ）含有フラクショ
ン（１７ｍｌ　）　（ｉ７０．０５　Ｍ　）リス、０，
０２Ｍ　Ｌ−リジン及びｏ、ｏ　ｏ　３Ｍ　ＥＤＴＡ　
を用い２０倍濃縮原料溶液の添加により増加させた。溶
液をＮ九０１−１を用いてｐＨ９，０に調整した。この
溶液０．１ｄを一４０℃で約３ケ月間保存した（溶液Ａ
）。

第二１７’）ピーク−ＥＡＣＡ含有フラクション（ｃａ
、　１．７Ｔｎ！、）　ｆ−４０℃で約３ケ月処理した
。

次いで、これを解凍し、上記したようにトリス／＃ｙｓ
／ＥＤＴＡ混合物で増加することにより溶液Ｂを得た。

次いで、溶液Ａを解凍し、溶液Ｂと混合することにより
溶液Ｃを得た。この溶液の全容積に１．７８　ｍであり
、ｐ１４１ｄニュートラリフト紙を用いてｐＨ８，５〜
９，０で記録した。蛋白質金１ｔ−ｔ１２１μ９蛋白質
／−であった。溶液Ｃは必要になるまで氷上で保持した
。

（ｂ）　ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベータ−１
ｘ　５００，０ＯＯＩＵ（５Ｑ；’）　ｕ−ＰＡ（５ｅ
ｒｏｎｏ）を脱イオンＨ２０に２０〜／ｍ！で溶解した
。２ｍ９に相当する０、０９５ｍをポリプロピレン微試
験管（５ａｒｓｔｅｄｔ　）に移し、０．０２Ｍ２−メ
ルカプトエタノール１０１ＭトリスＨＣｅ　／　０．３
　Ｍ　ＮａＯＨ１０、０４Ｍ　ＥＤＴＡｐＨ８，０の等
容積と混合し、２１〜２４℃で１７時間培養した。次い
で、試料全３日前に調製した同様な組成の還元ｕ　−Ｐ
Ａ溶液０．０２Ｉｎｌと混合した。この混合物０．２ｄ
を１．８−〇、　０２　Ｍ　ｌ’リス１０．００３Ｍ２
−メルカプトエタノールｐＨ７，４を用いて１０倍希釈
し、０．０２　Ｍトリス１０．００３Ｍ２−メルカプト
エタノールｐＨ７，４で平衡化しておいたｐ−アミノベ
ンズアミジンセファロース（Ｐｉｅｒｃｅ　）のカラム
（Ｖｔ約４ｍ）に適用した、還元したｕ−ＰＡ溶液の適
用後、カラムを（ａ＞平衡化緩衝液、（ｂ）　０．０２
　Ｍ　トリス１０．５Ｍ　ＮａＣ６／　２５　％　（ｖ
／ｖ）グリセロール１０．００３Ｍ２−メルカプトエタ
ノールｐＨ７，４及び（ｃ）　（ｂ）と同一だが更に０
．５　Ｍ　Ｌ−アルギニンを含有しているもので洗浄１
−た。

ビークアルギニン含有フラクション（容＃４．９−）を
０．０５　Ｍ　トリス／　０．０２　Ｍ　Ｌ−リジン１
０．００３　Ｍ　ＥＤＴＡ　を用い０．２４５ｍ１（１
”３２０倍濃縮原刺溶液の添加により増１Ｊａさせた。

が（け８．５と記録された。蛋白質含量を８２μｇ／ａ
ｔ、であった。この溶液を「ｕ−ＰＡＢ鎖貯蔵物」とみ
なした。

（ｅ）　プラスミンＡ／ｕ−ＰＡＢハイブリッドの合成 ｕ−、Ｔ’ＡＢ鎖貯蔵物（１，３ｍｌの上記溶液）及び
Ｌｙｓ−プラスミンＡ鎖貯蔵物（１，７６ｍｌのプラス
ミンＡ貯蔵物の溶液Ｃ）を混合することにより全容積３
．０６　ｍｌのｕ−ＰＡＢ及びプラスミンＡの等モル月
゛（公称３．６ｎｍｏｅ）溶液を得た。この溶液をメゾ
イセＪＬ、ｉ＜イスキング（ＭｅｄｉｃｅｅＪ　Ｖｉａ
ｋｉｎｇ　）管系に移し、ｏ、ｏ５Ｍトリス／　０．０
２　Ｍ　Ｌ−リジン１０．０８Ｍ　ＮａＣｅ　１０．０
０３Ｍ　ＥＤＴＡ／２５　％（ｖ／ｖ　’）グリセロー
ル、ｐｉ（９（３０容／２４時間）に対し、次いで新し
い透析液（３０容／３日間）に対して透析した。全ての
透析は空気（大気）の存在下で５℃で行なった。４日目
に存在する透析した滞留物はポリスチレン小ビンに移し
、−４０℃で保存した。

（ｄ）　生成物の特徴づけ及び精製 ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　次いでフイブリンチモグラフイーを
、いずれも実施例１に記載したように、透析工程を通し
採取された全試料について行なった。

これらはＭｒ約９’０．０００の繊維素溶解性酵素が〇
−２４時間の透析期間中に生成され、その後収量に余り
変化がなかったことを示した。全透析滞留物（３，７ｒ
ｎｌ）を９容０．０２Ｍ燐酸塩／　０．１５　ＭＮａＣ
６／　０．０１％トウイーン８０．ｐＨ７，４で希釈し
、希釈緩衝液で平衡化したリジンセファロース０カラム
（Ｖｔ１．８ｍ）　に直接適用した。透析滞留物を適用
した後、カラム＝ｋ　（ａ）平衡化緩衝液及び（ｂ）（
ａ）と同一だが更に０．５　Ｍ　ｔ−アミノカプロン酸
（ＥＡＣＡ、）’ｅ金含有るもので順次洗浄した。クロ
マトグラフィーの全部分に５℃でｓＯ＊／ｈ／ｄで行な
った。ピークＥＡＣＡ含有フラクションを０．０５　Ｍ
　Ｎ１（４ＨＣＯ３中に緩衝液交替し、親液化した。親
液化液を脱イオンＨ２０で再調製した。この溶液はフィ
ブリン板上で決定して３６０ＣＴＡ単位のプラスミノゲ
ンアクチベーターを含有していた。ＳＤＳ　ＰＡＧＥ次
いでフイブリンチモブラフイーにより、製剤は単一繊維
素溶解活性成分をＭｒ　＝約９０，０００に含有してお
り、これｔｆｆＭｒ　がプラスミンＡ／１−ＰＡＢハイ
ブリッドと同一であった。

実施例４ ハイブリッドプラスミンＡ／１−ＰＡＢの可逆活性部位
アシル化方法は実質的に先行文献（Ｓｍｉ−ｔｈ　、Ｒ
，Ａ、Ｇ、　、欧州特許第０００９８７９号）に言ｅ載
された通りであった。

要するに、塩不含親液化Ｌｙｓ−プラスミンＡ／１−Ｐ
ＡＢ　（１５，０００ＩＵ　）をＯ，ｌ　Ｍ燐酸塩ｐＨ
７；　４　（２，Ｉ　ｍ７！　）に溶解し、２６℃で１
ｍＭ４−アミジノフェニルｐ−アミノ安息香ｍ（ＡＰＡ
Ｂ）で０．０４２ｄのＡＰＡＢ（ジメチルスルホキシド
中５０　ｍＭ　）の添加により培養した。七−３０分に
おける培養物の分析により９９．６　％の原アミド分解
活性が抑制されたことを示した。ｔ＝４０ｆ＋にて、溶
液をセファデックスＧ−２５ｔ−用いて５℃にて０．０
２Ｍ燐酸塩／　０．１５　Ｍ　ＮａＣｅ　／　０．０１
　％トウィーン８０　［）Ｈ７，４（３，Ｏｄ　）中に
緩衝液交替することによシ過剰のアシル化試薬を除去し
た。

生成物を一７０℃で保存した。

生成物に約８８分の脱アシル化半減期及び約１、３７　
Ｘ　１０−４秒−１の脱アシル化速度定数を有すること
が分った。脱アシル化ハイブリッドのＩＵ：た。

実施例４Ａ 実施例４に記載された方法と同様の方法により２種の表
題ハイブリッド蛋白質を製造した。

実施例５ ウナキローゼ型ブラスミノゲンアクチベータ−（５ｅｒ
ｏｎｏ、　１０　ｇ　）　’ｋ、還元時間中の２−メル
カプトエタノール濃度を０．０２Ｍとし、温置時間を２
４時間とした以外に実質的に実施例３に記載した通り緩
かに還元した。緩かに還元したｕ　−、ＰＡ製剤（ｉ、
ｏｇ）を次いで（０，００３Ｍの最終２−メルカプトエ
タノール濃度を与えるよう）　０．０２Ｍトリス１０．
００１１Ｍ２−メルカプトエタノールｐＨ７，４（９ｄ
）と混合し、次いで実施例３に記載したようにｐ−アミ
ノベンズアミジンセファロースのクロマトグラフィーに
かけた。ピークアルギニン可解離性フラクションは（４
４φＤ／ｖ）の最終グリセロール濃度を与えるように）
グリセロール中に集めたが、主としてｕ　−ＰＡＢｔＪ
ｔ含有してｂた。これらのフラクションに使用するまで
７日間−４０℃で貯蔵保存した。

（ｂ）　ｔ　−Ｐ　Ａ　Ａ鎖の単離 ０、０５　Ｍ　トリス／　０．　Ｉ　ＮａＣｇ　／　２
５　％　（ｖ／ｖ）グリセロールｐＨ９中２１０，０Ｏ
Ｏ８Ｕ／ｍの二本鎖ｔ　−ＰＡ（４８０，０ＯＯ８Ｕ）
’ｅジチオスレイトール（１０ｄ）で処理し、窒素で一
掃し、５８Ｃで２時間恒温維持した。次いで、この維持
混合物ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　ＮａＨｚＰＯｉｌｏ、１η／ｄ
ロイペプシンｐＨ７，４で平衡化させたリジンセファロ
ースカラム（Ｖｔ８．６ｓ　）に適用した。維持混合物
の適用後、カラムを（ａ）　０．　Ｉ　ＭＮａＨｚＰＯ
４／　０．００３　ＭジチオスレイトールｐＨ７，４及
び（ｂ）　（ａ）と同一だが更に０．５Ｍε−アミノカ
プロン酸（ＥＡＣＡ）ｅ含有するもので洗浄した。緩衝
液（ｂ）の溶離液をグリセロール中に集めることにより
約２５％（ｖ／ｖ　）の最終グリセロール濃度を与えた
。全ての溶離は約１００　ｍｌ／　ｈ　／　ｃｒｌで行
なった。

ピークＥＡＣＡフラクション１ｄｔ−ＦＡＡ鎖を含有し
ていると考えられ、約４０日間−４０℃で貯蔵保存した
。次いでＡ鎖滞留物をセファデックスＧ−２５０カラム
を用いて０．０２Ｍ燐酸塙７０．３Ｍ　ＮａＣｄ／　０
．００３　Ｍジチオスレイトール１０．０１壬トウイー
ン８０ｐＨ７，４中に緩衝液交換した。Ａ鎖を含有する
セファデックスカラムのフラクション１ＰＥｅｚｏ、ｏ
ｏｏに対して透析により濃縮した。更に、セファデック
スＧ−２５カラムかけることにより行なった。適用した
物質を平衡化Ｈ衝液、次いで０．１　Ｍ燐酸塩／　０．
５　Ｍ　ＥＡＣＡｌｏ、　００３　Ｍジチオスレイトー
ルｐＨ７，４で洗い流した。非吸着溶液を含有するフラ
クションをＰＥＧ２０．０００に対して透析することに
より８０μ９蛋白質／　Ｌｎｔケ含有する５、６ｄσ）
溶液を得た。

ｕ　−ＰＡ１３　＃Ｉ貯蔵物（１１，，２ｍｌ　）を０
．０５　Ｍ　トリス、Ｏ，０，２Ｍ　Ｔ、−リジン及び
０．００３　Ｍ　ＥＤＴＡ−で０．５６ｄの２０倍濃縮
原料溶液の添加により増加させ、氷上に保持した。ｔ　
−ＰＡ、　Ａ鎖貯蔵物（５，６ｄ）を、０．２８　ｍｌ
グ）２０倍濃縮原料溶液を電相いて同様に増加させた。

次いで、ｕ−ＰＡＢ鎖貯蔵物及びｔ−ＰＡ、Ａ＠貯蔵物
を混合し、次いで透析管系に移した。混合物を４０容０
．０４Ｍトリス１０．０２ＭＬ−リジン／　０．０８　
Ｍ　ＮａＣ６１０、ＯＯ３Ｍ　ＥＤＴＡ、　／　２５　
％　（ｖ／ｖ）グリセロールｐＨ９、０に対し５℃で２
４時間次いで新しい緩衝液（４０容）に対して５℃で５
日間透析−た。

透析滞留物を６８目に透析袋から取出し、４容０、０２
　Ｍ燐酸塩／　０．１５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ！　／　０．０
１　％　トウイーンｓ　Ｏ、ＰＨ７，４（ＰＢＳ／ＴＷ
）で希釈し、ＰＢＳ／ＴＷで平衡化しておいたリジンセ
ファロースのカラムに直接適用した。適用したハイブリ
ッド溶液をＰ　Ｂ　Ｓ　／ＴＷと共に流した。次いで。

カラム’ｋ（ａ）　０．０２　Ｍ　トリス／　０．５　
Ｍ　ＮａＣｅ　／　０．０１係トウイーン８０　ｐＨ７
，４及び（ｂ）　（ａ）と同一だが更に０．５Ｍアルギ
ニンを含有するもので洗浄した。カラムからの溶出物を
フラクションとして集めた。

Ｓ−２２８８を使用する分析に基すいて、Ｌ−アルギニ
ン可解離性アミド分解活性を含有する２種Ｄフラクショ
ンを貯蔵した。こσ）最終貯蔵物はｔ、−ＰＡ、Ａ鎖／
ｕ−ＰＡ、Ｂ鎖ハイブリッドを含有するものと考えられ
た。実施例１に記載したように、ＳＤＳ　Ｉ）ＡＧＥ　
及びフイブリンチモグラフイーにより分析したところ、
この貯蔵物ｉＭｒ＝約４０．０００，４７，０００，５
６，０００．６５，０００．及び＋９＋０．０００にて
５種のプラスミノゲンアクチベーターを含有することが
分った。特異抗体を他σ）フイブリンチモグラムに入れ
ることにより、Ｍｒ＝約４０．ＱＯｏ。

５６．０００及び６５，０００の種が抗−ｔ−ＰＡ　Ｐ
？Ｇ及び抗−ｕ　−ＦＡ　Ｉ９Ｇいずれによっても中和
しうろことが立証された。これらの種はｔ−ＰＡＡ／ｕ
、−ＰＡＢハイブリッドであると考えられた０３種ｎＭ
ｒ　のハイブリッドの出現はｔ−ｐＡＡ鎖が複数形態で
存在する一部分解したｔ−ＦＡを最初に使用Ｌ＊ことニ
ヨル（例えば、Ｂａｎｙａ　ｉ　、Ｌ、　ｅ　ｔａｇ　
。

１９Ｂ３．ＦＥ１３Ｓ　Ｌｅｔｔ、、１６３．３７−４
１）。

実施例６ （ａ）　ツロ宏 雄性Ｄｕｎｋｉｎ　Ｈａｒｔｇｅｙモルモット（３５０
〜４５０！９）をウレタン（２５％　ｗ／ｖ　／ｉＪ液
；　６　ｍｌ、　／　ｋｇ　１　、ｐ）で麻酔した。１
本り頚動脈を血液試料の採取のため力ヌユーレ処理した
。１本の大腿静脈をヘパリン（５０Ｕ／ｋｇ　ｉ、ｖ、
）の試験化合物の注射のため処理した。ヘパリン処理約
５分後、投与前血液試料（２ｄ）ｋ取り、０．１容の１
２９ｒｎＭクエン酸ナトリウムと混合した。次いで、試
験化合物を１０秒間要して注射した（＋ｍ９／に９）。

更に血液試料全正確に２．４．８．１６．３０　及び６
０分後に取った。ヘパリン処理（５０ＴＪ　／　’ｃｇ
ｉ、ｖ、）を３０分後採取試料の後にカヌユーレ開存を
保持するために繰返した。全てのクエン酸塩処理血液試
料は各実験の最後まで氷上に保持し、次いで４℃で１５
分間１７００夕で遠心分離することにより血漿ｋｍだ。

オイグロピンフラクションは各血漿０．１ｍ’ｚ：１．
８２ｍの氷冷ｏ、　ｏ　Ｉ　Ｊ　％　（ｖ／ｖ）酢酸水
溶液に添加することにより沈殿させた。氷上で３０５＋
間放置後、全試験管を４℃で１５分間１７００９で遠心
分離した。上澄液を注ぎ出し、各試験管の内壁を慎重に
拭いて乾燥させ、各沈殿ｆ　Ｏ，０１％　（ｖ／ｖ）　
トウイーン８０を含有する０、４ｄ燐ｌｌ！＃塩緩衝化
食塩水中で再沈殿させた。次いでアリコート（３０μｅ
）を４回分フィブリン板に適用した。フィブリン板Ｈ０
，０２９Ｍバルビトンの１２５ｍＭ　ＮａＣ／！中溶液
ｐＨ７，４中に溶解しｆｃｏｏ、４％（ｗ／ｖ　）ヒト
フイプリノゲシ（Ｋａｂｉ、ＱｒａｄｅＬ、Ｆ６−ｏｗ
　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、５ｃｏｔ６ａｎｄ　）
から、こｆｌ、１ｌＯＸ１０傭平方プラスチツク血（５
ｔｅｒｉＪｉｎ　）中にピペット注入しく］０ｄ）０．
３ｍの牛トロンビン（５０Ｎ　Ｔ　Ｈ単位／　ｄ、　Ｐ
ａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ、Ｕ、に、）と急速混合すること
により凝血させて作製した。板は通常１８〜２４時間、
もし必要ならば更に長時間３７℃で装置し、ブロモフェ
ノールブルー水溶液で染色した。各溶解帯について、互
いに垂直な２つσ）直径１Ｖｅｒｎｉｅｒカリバスを用
いて測定した。

各試料の全ての直径を平均化させ、この平均値全検量線
に対して繊維素溶解活性に転換した。検量線に各動物の
前投与量血漿に様々な既知量の化合物を添加することに
より得た。これらの標準は実験試料と同一方法を用い同
時に処理した。検量線を作るため、直径（圃）を化合物
の１０９．。濃度に対してプロットした。各実験試料に
おける化合物の崩漿中濃度は各モルモットの体重ゆ当り
血漿５０ゴと仮定して期待されるものに対する百分率と
して表わした。

（ｂ）　結果゛ 第１図はｔ−ＦＡ、プラスミンＡ鎖／ｌ　−ＰＡＢ＠ハ
イブリッド及びハイブリッドのアシル化誘導体（４−ア
ミノベンソイル）のモルモット血流からの清掃率を示す
。

生体内血栓崩壊は一般に顕著な濃度のアクチベーターが
長時間存在することを必要とする長期に亘る事像である
と考えられている。ｔ　−ＰＡの場合、その活性に非常
に速かに消失するが、ハイブリッドの活性に血流中非常
に延長される。薬力学における一層の改良がハイブリッ
ド蛋白質の４−アミノベンゾイル誘導体において見られ
る（約２分の半減期を有するｔ−ＰＡの急速な清掃車様
相に比較して約１０６分のアシル化ハイブリッド０半減
期）。

【図面の簡単な説明】

第１図はｔ−ＰＡ、プラスミシＡ鎖／１−ＰＡＢ鎖ハイ
ブリッド及び４−アミノベンゾイル−プラスミンＡ鎖／
１−ＰＡＢ鎖ハイブリッドのモルモット血流からの清掃
率２表わす。 代理人　弁理士　秋　沢　政　光 他１名 ２重の浄Ｓ（内容に変ｆなし） −Ａ３１１固 Ｂ寺Ｐ司（オ’ｊｆ−’＋／＋隻つ今）（金　円）　昭
和６０年／　月鰐日 才早　願昭、ｎ−第ユク訣６？デ号 ３、補正をする者 事件との関係　出屡質に 居　所　東京都中央区日本橋兜町１２番１号大洋ビル８
、補正の内容　別紙の通りｊｔ９１ｂ↑ｌ−１？イア°
４１（内炉：ｌ＜ｆｒｖＬ）１鴎境補正書 昭和６０年二月／日 １、事件の表示 特願昭５９−２７２６９４号 ２、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組威
螢 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 住　所　イギリス国ミドルセックス州、ブレンド７オー
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス（番地
なし） 名　称　ビーチャム・グループφピーエルシー４、代理
人 居　所　東京都中央区日本橋兜町１２番１号６、補正の
対象　明細書〈発明の詳細な説明）７、補正の内容　別
紙の通り 一／７″Ｌ 補　正　の　内　容 １　、　明細書（タイ７°肇ｇ）・よ３暫の）中（１）
Ｍ８頁６行〜７行目の「Ｎ−メチルアミノ、ベンゾイル
」を「Ｎ−メチルアミノベンゾイル」に改める。 （２）第１３頁１０行目のｒｐ　９．ＯＪを１ｐＨ９，
ＯＪに改める。 自発手続補正書 昭和６０年２月２１・日 特許庁　長　官　殿 １、事件の表示 特願昭５９−２７２６９４号 ２、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及び それを含む医薬組成物 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 住　所　イギリス国ミドルセックス州、ブレン）７ｒ−
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス（番地
なし） 名　称　ビーチャム・グループ・ピーエルシー４、代理
人 ５、補正による増加する発明の数　なし補　正　の　内
　容 １、明細書第８頁第１行目の「ｐ−シ７ニノノ」を［ｐ
−グアニジノ」に改める。 自発手続補正書 昭和６０年２月２６月 特願昭５９−２７２６９４号 ２、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成
物 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 住　所　イギリス国ミドルセックス州、ブレンド７オー
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス（番地
なし） 名　称　ビーチャム・グループ・ビーエルシー４、代理
人 ６、補正の対象　明細書（発明の詳細な説明）７、補正
の内容　別紙の通り 補正の内容 １、明細書第３３頁第９行の巨１　ｍｇ／ｋｇ）Ｊをｒ
（１ｍｌ／ｋｇ）Ｊに改める。 指令による手続補正帯 昭和６０年７月　２日 特許庁　五、宮　殿 ２、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成
物 ３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 ウス（番地なし） 名　称　ビーチャム・グループ・ビーエルシー４、代理
人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）異なる二本鎖プロテアーゼの一本鎖にまたは同一
   プロテアーゼの同−鎖に結合した二本鎖プロテアーゼの
   一鎖からなり、ハイブリッド蛋白質中の鎖の少なくとも
   １本に繊維素溶解活性プロテアーゼから銹導され、ハイ
   ブリッド蛋白質に除去可能な遮断性基で遮断されていて
   もよい繊維素溶解活性に必須な触媒部位を有することを
   特徴とする繊維素溶解活性ハイブリット蛋白質。 Ｃ）異なるプロテアーゼのＢ鎖に結合した１種のプロテ
   アーゼＯＡ鎖からなる特許請求の範囲第（］）項項記載
   ハイブリッド蛋白質。 （３）少なくとも１種のプロテアーゼはセリンプロテア
   ーゼである特許請求の範囲第（１）または（２）項に記
   載りハイブリッド蛋白質。 （４）組織プラスミノゲンアクチベーターＢ鎖に結合し
   たプラスミンＡ鎖、 ウロキナーゼブラスミノゲンアクチベーターＢ鎖に結合
   した組織プラスミノゲンアクチベーターＡ鎖、 ウロキナーゼブラスミノゲンアクチベーターＢ鎖に結合
   したプラスミンＡ鎖、 プラスミンＢ鎖に結合した組織プラスミノゲンアクチベ
   ーターＡ鎖、または 組織プラスミノゲンアクチベーターＢ鎖に結合したアシ
   ル化プラスミンＡ鎖 からなる特許請求の範囲第（１）〜（３）項のいずれか
   一つの項に記載のハイブリッド蛋白質。 （５）組織ブラスミノゲンアクチベーターＢ鎖に結合し
   た４−アミノベンゾイルプラスミンＡ鎖からなる特許請
   求の範囲第（４）項記載のハイブリッド蛋白質。 （６）その活性部位にて速断されていてもよい１種のプ
   ロテアーゼの一鎖をやはりその活性部位にて遮断されて
   いてもよい他のプロテアーゼの−鎖と酸化条件下で混合
   し、次いで所望ならば除去可能な遮断性基でいかなる触
   媒部位も遮断することを特徴とする特許請求の範囲第（
   １）〜（５）項のいずれか一つの項に記載１）ハイブリ
   ッド蛋白質の製造方法。 （７）透析下で行なわれる特許請求の範囲第（６）項記
   載の方法。 （８）各蛋白質の遺伝情報（ＤＮＡ配列）を取り、これ
   全切断及び結合することによりハイブリッド蛋白質のた
   めの新しいＤＮＡコードづけを構成しかつこのＤＮＡを
   原核動物またに真核動物宿主中に表現し、次いで所望な
   らば除去可能な遮断性基で触媒部位を遮断することを特
   徴とする特許請求の範囲第（１）〜（５）項のいずれか
   一つの項に記載のハイブリッド蛋白質の製造方法。 （９）特許請求の範囲第（１）項記載の繊維素溶解活性
   ハイブリッド蛋白質を医薬として適当な担体と組合せて
   含有することを特徴とする医薬組成物。 （１０）血栓症系疾病の治療に使用するための特許請求
   の範囲第（１）項記載の繊維素溶解活性バイブリド蛋白
   質。