JPS60252422A - ハイブリツド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents
ハイブリツド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成物Info
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- JPS60252422A JPS60252422A JP59272694A JP27269484A JPS60252422A JP S60252422 A JPS60252422 A JP S60252422A JP 59272694 A JP59272694 A JP 59272694A JP 27269484 A JP27269484 A JP 27269484A JP S60252422 A JPS60252422 A JP S60252422A
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- protease
- plasminogen activator
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
産業上の利用分野
本発明は新規ハイブリッド繊維素溶解性酵素、それらの
製造方法並びに血栓症系疾病の治療におけるそれらの用
途に関する。
製造方法並びに血栓症系疾病の治療におけるそれらの用
途に関する。
従来の技術
ヒト繊維素溶解性酵素に2種の群に大別でき、すなわち
直接フィブリンを消化する一群、例えばトリプシン及び
プラスミン、及び不活性なチモーゲン(酵素前駆体)を
活性化することにより間接的にフィブリンを消化する第
二の群、プラスミノゲンがある。後者の群にプラスミノ
ゲンアクチベーターからなるが、免疫学的基準、分子量
及びポリペプチド組成に基ずく2種の主要タイプにより
代表されている( CoeeenrD、etae 、
d 982 、 Thromb。
直接フィブリンを消化する一群、例えばトリプシン及び
プラスミン、及び不活性なチモーゲン(酵素前駆体)を
活性化することにより間接的にフィブリンを消化する第
二の群、プラスミノゲンがある。後者の群にプラスミノ
ゲンアクチベーターからなるが、免疫学的基準、分子量
及びポリペプチド組成に基ずく2種の主要タイプにより
代表されている( CoeeenrD、etae 、
d 982 、 Thromb。
Haemostas、+48 + 294−296参照
)。主要タイプの1種のウロキナーゼ型プラスミノゲン
アクチベーター(u−PA)1d泌尿系酵素ウロキナー
ゼに似ているのに対し、もう一方の主要タイプである組
織型プラスミノゲンアクチベータ−(t−PA)に血液
中で見出された外因性アクチベーター、ケイオトロピッ
ク(chaotropic )塩により組織から抽出し
たアクチベーター及び培養黒色腫細胞から分泌されたア
クチベーターに類似している( Rij−ken、D、
L、and CoeeeayD、+1981 +J、B
ioe、Chem、。
)。主要タイプの1種のウロキナーゼ型プラスミノゲン
アクチベーター(u−PA)1d泌尿系酵素ウロキナー
ゼに似ているのに対し、もう一方の主要タイプである組
織型プラスミノゲンアクチベータ−(t−PA)に血液
中で見出された外因性アクチベーター、ケイオトロピッ
ク(chaotropic )塩により組織から抽出し
たアクチベーター及び培養黒色腫細胞から分泌されたア
クチベーターに類似している( Rij−ken、D、
L、and CoeeeayD、+1981 +J、B
ioe、Chem、。
256 、7035−7(141、Rijken、D、
L、eta6.、J、Lab。
L、eta6.、J、Lab。
C61n、Med。、97.477−478 参照)。
ヒトプラスミノゲンアクチベーターに血栓症の治療に使
用されている。しかしながら、u−PAはこれらがフィ
ブリン結合プラスミノゲンと同じ位動率的に循環性プラ
スミノゲンを活性化してしまう欠点を有し、かつu−P
A及びt−PAfiいずれも、それらり)活性が急速な
清掃率及び天然アンチプロテアーゼによる不活性化のた
めに生体内で急速に消失してしまうという欠点を有して
いる。
用されている。しかしながら、u−PAはこれらがフィ
ブリン結合プラスミノゲンと同じ位動率的に循環性プラ
スミノゲンを活性化してしまう欠点を有し、かつu−P
A及びt−PAfiいずれも、それらり)活性が急速な
清掃率及び天然アンチプロテアーゼによる不活性化のた
めに生体内で急速に消失してしまうという欠点を有して
いる。
発明が解決しようとする問題点
上記ヒト繊維素溶解性酵素は単鎖及び二本鎖構造いずれ
としても存在する一群のプロテアーゼに属し、二本鎖に
ジスルフィド橋により結合されている。本発明において
、2種のこのようなブ°ロチアーゼの所望σ〕性質が2
種のブ″ロチアーゼの各々からの@全含有する単ハイブ
リッド蛋白質分子を形成することにより結合されうろこ
とが見出された0 〔発明の構成〕 問題を解決するための手段 従って、本発明は異なる二本鎖プロテアーゼの一本鎖に
、捷たは同一プロテアーゼの同−鎖に結合した二本鎖プ
ロテアーゼ活性鎖からなり、ハイブリッド蛋白質中の鎖
の少なくとも1本は繊維素溶解活性プロテアーゼから銹
導され、ハイブリッド蛋白質に除去可能な遮断性基で遮
断されていてもよい繊維素溶解活性に必須な触媒部位を
有することを特徴とする繊維素溶解活性ハイブリッド蛋
白質ケ提供する。
としても存在する一群のプロテアーゼに属し、二本鎖に
ジスルフィド橋により結合されている。本発明において
、2種のこのようなブ°ロチアーゼの所望σ〕性質が2
種のブ″ロチアーゼの各々からの@全含有する単ハイブ
リッド蛋白質分子を形成することにより結合されうろこ
とが見出された0 〔発明の構成〕 問題を解決するための手段 従って、本発明は異なる二本鎖プロテアーゼの一本鎖に
、捷たは同一プロテアーゼの同−鎖に結合した二本鎖プ
ロテアーゼ活性鎖からなり、ハイブリッド蛋白質中の鎖
の少なくとも1本は繊維素溶解活性プロテアーゼから銹
導され、ハイブリッド蛋白質に除去可能な遮断性基で遮
断されていてもよい繊維素溶解活性に必須な触媒部位を
有することを特徴とする繊維素溶解活性ハイブリッド蛋
白質ケ提供する。
i朋
二本鎖プロテアーゼ構造はプロテアーゼ活性を有さない
A鎖及びプロテアーゼ活性を有するB鎖を含有する。A
鎖のあるもり)汀、例えばプラスミン及びt−PAから
誘導されたものは高いフィブリン親和性を有する。本発
明の好捷しいハイブリッド蛋白質に異なるプロテアーゼ
のB@に結合した1種のプロテアーゼのA鎖を含む。
A鎖及びプロテアーゼ活性を有するB鎖を含有する。A
鎖のあるもり)汀、例えばプラスミン及びt−PAから
誘導されたものは高いフィブリン親和性を有する。本発
明の好捷しいハイブリッド蛋白質に異なるプロテアーゼ
のB@に結合した1種のプロテアーゼのA鎖を含む。
好適にはプロテアーゼの少なくとも1種にセリンプロテ
アーゼである。
アーゼである。
本明細書中で使用した「除去可能な遮断性基(rern
ovaMe Mockinp 9roup ) Jとい
う表現には加水分解の偽−次速度定数が等張水性媒体で
pH7,4で37℃でI O−’/秒−10−3/秒の
範囲であるような速度グ)加水分解により除去可能な基
が含捷れる。
ovaMe Mockinp 9roup ) Jとい
う表現には加水分解の偽−次速度定数が等張水性媒体で
pH7,4で37℃でI O−’/秒−10−3/秒の
範囲であるような速度グ)加水分解により除去可能な基
が含捷れる。
このような遮断性基は欧州特許第0009879号中に
記載され、これらの例には置換されていてもよいベンゾ
イルまたは置換されていてもよいアクリロイルのような
アシル基が含まれる。
記載され、これらの例には置換されていてもよいベンゾ
イルまたは置換されていてもよいアクリロイルのような
アシル基が含まれる。
ベンゾイル遮断性基の好適な存在任意σ)置換基にはハ
ロゲン% Cl−6アルキル、C1−6アルコキシ、C
4−6アルカノイルオキシ、C1−6フルカノイルアミ
ノ、アミノ−!、りl−1′p−シアニジンが含まれる
。
ロゲン% Cl−6アルキル、C1−6アルコキシ、C
4−6アルカノイルオキシ、C1−6フルカノイルアミ
ノ、アミノ−!、りl−1′p−シアニジンが含まれる
。
アクリロイル遮断性基の好適な存在任意の置換基VCn
C1−6アルキル、フリル、フェニルまたにC3−6
アルキルフエニルが含まれる。
C1−6アルキル、フリル、フェニルまたにC3−6
アルキルフエニルが含まれる。
好捷しくに、存在任意の除去可能な遮断性基に4−アミ
ノベンゾイル、N−メチルアミノ、ベンゾイル、N、N
−ジ−メチル−アミノベンゾイルまたは4−メトキシベ
ンゾイルである。
ノベンゾイル、N−メチルアミノ、ベンゾイル、N、N
−ジ−メチル−アミノベンゾイルまたは4−メトキシベ
ンゾイルである。
本発明+7)ハイブリッド蛋白質の例は下記の通りであ
る。
る。
a)プラスミンA鎖(PL−A)及び組織プラスミノゲ
ンアクチベーターB鎖(t−FA−B)b)t−PA、
A鎖(t−pA−A)及びウロキナーゼブラスミノゲン
アクチベーターBg(u −PA−B) c)Pl、’−A及びu−PA−B d) t−4)A、−A及びPL−B e)アシル化IPL−A及びt−PA B。
ンアクチベーターB鎖(t−FA−B)b)t−PA、
A鎖(t−pA−A)及びウロキナーゼブラスミノゲン
アクチベーターBg(u −PA−B) c)Pl、’−A及びu−PA−B d) t−4)A、−A及びPL−B e)アシル化IPL−A及びt−PA B。
本発明のハイブリッド蛋白質に寄与する原蛋白質り)両
者が繊維素溶解活性であることが好ましいが、両者り)
一方が繊維素溶解不活性であることも可能である。例え
ば、原蛋白質の一方が繊維素溶解不活性物質のプロトン
ビンであってもよい。
者が繊維素溶解活性であることが好ましいが、両者り)
一方が繊維素溶解不活性であることも可能である。例え
ば、原蛋白質の一方が繊維素溶解不活性物質のプロトン
ビンであってもよい。
本発明グ)ハイブリッド蛋白質に1釉のプロテアーゼの
釦を他ψ)プロテアーゼD鎖と酸化性条件下で所望なら
ば透析下で、混合することにより製造できる。
釦を他ψ)プロテアーゼD鎖と酸化性条件下で所望なら
ば透析下で、混合することにより製造できる。
好ましくは、混合/透析方法に分子状酸素の存在下で1
日以上行なわれ、得られたハイブリッド蛋白質にクロマ
トグラフィー技術により単離される0 ジスルフィド結合形成速度を高めるため有利に使用され
うるであろう様々な方法が従来知られており、例工ば、
インシュリンの合成に関する英国特許第2072680
号に記載されたように−S S 03誘導体を用いるも
のがある。
日以上行なわれ、得られたハイブリッド蛋白質にクロマ
トグラフィー技術により単離される0 ジスルフィド結合形成速度を高めるため有利に使用され
うるであろう様々な方法が従来知られており、例工ば、
インシュリンの合成に関する英国特許第2072680
号に記載されたように−S S 03誘導体を用いるも
のがある。
ハイブリッド蛋白質が遮断された触媒部位を含イ1する
場合、遮断に欧州特許第0009879号に記載の方法
と類似した方法により個々の)鎖上または形成されたハ
イブリッド蛋白質上で行なわれる。遮断に好甘しくはハ
イブリッド蛋白質の形成後に行なわれる。
場合、遮断に欧州特許第0009879号に記載の方法
と類似した方法により個々の)鎖上または形成されたハ
イブリッド蛋白質上で行なわれる。遮断に好甘しくはハ
イブリッド蛋白質の形成後に行なわれる。
あるいは、本発明のハイブリッド蛋白質は各蛋白質り)
遺伝情報(DNA配列)を取り、これを切断及び結1」
−ることによりハイブリッド蛋白質グ)ためグ)新しい
コードづけを構成(5、そしてこのDNA配列金原核動
物(prokaryote )または真核動物(eur
okaryote )宿主中に表現することにより製造
できる。
遺伝情報(DNA配列)を取り、これを切断及び結1」
−ることによりハイブリッド蛋白質グ)ためグ)新しい
コードづけを構成(5、そしてこのDNA配列金原核動
物(prokaryote )または真核動物(eur
okaryote )宿主中に表現することにより製造
できる。
個々のプロテアーゼ鎖げそれら自体各原プロテアーゼの
緩和な還元によって鎖中ジスルフィド橋全切り、次いで
親和性クロマトグラフィーにまり官節性鎖全分離させる
ことにより製造できる。次いで、個々の鎖に使用するた
め必要になるオで最長数ケ月間も好ましくは一70℃な
いし0°Cの温度で保存できる。本発明のハイブリッド
蛋白質げ好捷しくに血栓症系疾病治療用医薬組成物とし
て投与される。
緩和な還元によって鎖中ジスルフィド橋全切り、次いで
親和性クロマトグラフィーにまり官節性鎖全分離させる
ことにより製造できる。次いで、個々の鎖に使用するた
め必要になるオで最長数ケ月間も好ましくは一70℃な
いし0°Cの温度で保存できる。本発明のハイブリッド
蛋白質げ好捷しくに血栓症系疾病治療用医薬組成物とし
て投与される。
従って、本発明にまた本発明のハイブリッド蛋白質全医
薬として適当な担体と組合せて含有する医薬組成物を提
供する。
薬として適当な担体と組合せて含有する医薬組成物を提
供する。
本発明の組成物に人間へ静脈内投与するのに適した医薬
組成物と同様な常法によって処方されうる0 典型的には、静脈内投与用組成物は滅菌ハイブリッド蛋
白質の滅菌等張水性緩衝液中溶液である。
組成物と同様な常法によって処方されうる0 典型的には、静脈内投与用組成物は滅菌ハイブリッド蛋
白質の滅菌等張水性緩衝液中溶液である。
必要な場合、組成物riまたハイブリッド蛋白質を溶液
中に保つための可溶化剤及び注射部位の痛みを和げるた
めのりグノカインのような局部麻酔剤を含んでもよい。
中に保つための可溶化剤及び注射部位の痛みを和げるた
めのりグノカインのような局部麻酔剤を含んでもよい。
一般に、ハイブリッド蛋白質に単位投艙量剤型として提
供され、例えは、活性単位で表わした蛋白質量を示し、
かつ遊離蛋白質が遊離されてくる時間を示したアンプル
や薬包のような気密容器中の乾燥粉末または水不含濃縮
物として提供される。蛋白質が注入により投与されるべ
き場合、これに滅菌医薬銘柄「注射用水」を含有する注
入ビンを用いて小口供給される。蛋白質が注射により投
与されるべき場合、滅菌注射用水のアンプルを用いて小
口供給される。注射用または注入用組成物は投Aに成分
を混合することにより製造できる。
供され、例えは、活性単位で表わした蛋白質量を示し、
かつ遊離蛋白質が遊離されてくる時間を示したアンプル
や薬包のような気密容器中の乾燥粉末または水不含濃縮
物として提供される。蛋白質が注入により投与されるべ
き場合、これに滅菌医薬銘柄「注射用水」を含有する注
入ビンを用いて小口供給される。蛋白質が注射により投
与されるべき場合、滅菌注射用水のアンプルを用いて小
口供給される。注射用または注入用組成物は投Aに成分
を混合することにより製造できる。
物質グ)投与量は繊維素溶解必要責及びそれが必要な速
度、血栓塞栓症状の程度及び血栓の位置及び大きさによ
り異なる。使用すべき正確な投与量は病気の性質の点か
ら必然的に治療を指揮する医者により情況に応じて決定
されなければならない0しかしながら、一般に、成熟血
栓り)治療中の患者に体重1ゆ当り0.01〜2.0〜
の8宛投与tを5回までの投与量に分けて注射によりま
fcに注入により受ける。
度、血栓塞栓症状の程度及び血栓の位置及び大きさによ
り異なる。使用すべき正確な投与量は病気の性質の点か
ら必然的に治療を指揮する医者により情況に応じて決定
されなければならない0しかしながら、一般に、成熟血
栓り)治療中の患者に体重1ゆ当り0.01〜2.0〜
の8宛投与tを5回までの投与量に分けて注射によりま
fcに注入により受ける。
上で示した投薬量範囲内では、本発明の化合物について
何ら不利な毒性効果は観察されなかった。
何ら不利な毒性効果は観察されなかった。
従って、本発明の別の観点において、効果的な非毒性賛
の本発明ハイブリッド蛋白質を患者に投与することを含
む血栓症系疾病方法を提供する0実施例 以下、実施例により本発明を例示する。
の本発明ハイブリッド蛋白質を患者に投与することを含
む血栓症系疾病方法を提供する0実施例 以下、実施例により本発明を例示する。
実施例1
Lys−プラスミンA鎖/1−PAB鎖ハイブリッドの
合成 本実施例全便宜上下記の4部位に分ける。
合成 本実施例全便宜上下記の4部位に分ける。
(a) プラスミンCF′)A鎖の単離(b)t−PA
のB鎖の単離 (c) プラスミンA鎖/1−PAB鎖ハイブリッドの
形成 (ψ ハイブリッドの特徴づけ (a) プラスミンのA@の単離 本質的に塩不含のプラスミノゲン(2,0IIIf7)
。
のB鎖の単離 (c) プラスミンA鎖/1−PAB鎖ハイブリッドの
形成 (ψ ハイブリッドの特徴づけ (a) プラスミンのA@の単離 本質的に塩不含のプラスミノゲン(2,0IIIf7)
。
0、05 M Tris / 0.1 M NaCe/
259Dv/v )グリセロールp9.0に15η/d
の割合で溶解したものを低分子量u −F A (Ab
bott )により500CTAu/mt(1000:
1のプラスミノゲン:u−PAモル比に等しい)の割
合で27℃にて1時間活性化することによりプラスミン
1に製造した。
259Dv/v )グリセロールp9.0に15η/d
の割合で溶解したものを低分子量u −F A (Ab
bott )により500CTAu/mt(1000:
1のプラスミノゲン:u−PAモル比に等しい)の割
合で27℃にて1時間活性化することによりプラスミン
1に製造した。
プラスミンのその構成成分A及びB鎖への緩和な還元及
びその後のそれらの分離ta Sumnaria、L、
etae、らの方法(J、BiO/、Chem、、19
79,254.6811)をわずかに修正した方法を用
いて行なった。プラスミン及びu−FA混合物をロイペ
プチン(15mll/at )及びジチオスレイトール
(0,05M)で処理し、N2 で−掃し、6℃で更に
3時間恒温維持した。次いで、全内容物を予め0.1
MNaHzPO4/ O,l 1v/−ロイベブチ’、
t pH7,4で平衡化しであるリジンセファロース(
5epbarose、登録商標) CL4Bのカラム(
Vt1.M)に適用した。適用した試料を、基底線が安
定化するまで0、IMNaT−1*PO4/ o、 0
03 Mジチオスレイト−JL pH7,4で洗刺した
。次いで、プラスミンのA鎖を0.IMNaHtPO4
/ 0.003 Mジチオスレイトール/ 0.5 N
6−アミノカプロン酸(EACA)l)N7.4を用い
てカラムから脱着させた。クロマトグラフィーを6゛C
にて100d/h/cJで行なった。全フラクション(
公称1.5 m )をグリセロール(0,5g)中に集
めた。カラムからの溶出液@280nmで連続監視した
。EACA含有フラクション中の蛋白質濃度を牛血清ア
ルブミンを標準として用いBradfordの方法(A
na#、Biochem、、1976.72゜248)
により決定した。ピークフラクションは320μ9蛋白
質/l1lI!を含有していた。この溶液ldを0.0
5 M t’リス、0.02 M L−リジン及び0.
003M EDTAで0,05−の20倍濃縮原料溶液
の添加により増加させた。pHにニュートラリット(、
Neutraiffit 、登録商標)紙(Merck
)を用いて、8.5−9.0と記録された。この溶液
にプラスミンのA調音含有しており、氷上で約2時間保
存した。
びその後のそれらの分離ta Sumnaria、L、
etae、らの方法(J、BiO/、Chem、、19
79,254.6811)をわずかに修正した方法を用
いて行なった。プラスミン及びu−FA混合物をロイペ
プチン(15mll/at )及びジチオスレイトール
(0,05M)で処理し、N2 で−掃し、6℃で更に
3時間恒温維持した。次いで、全内容物を予め0.1
MNaHzPO4/ O,l 1v/−ロイベブチ’、
t pH7,4で平衡化しであるリジンセファロース(
5epbarose、登録商標) CL4Bのカラム(
Vt1.M)に適用した。適用した試料を、基底線が安
定化するまで0、IMNaT−1*PO4/ o、 0
03 Mジチオスレイト−JL pH7,4で洗刺した
。次いで、プラスミンのA鎖を0.IMNaHtPO4
/ 0.003 Mジチオスレイトール/ 0.5 N
6−アミノカプロン酸(EACA)l)N7.4を用い
てカラムから脱着させた。クロマトグラフィーを6゛C
にて100d/h/cJで行なった。全フラクション(
公称1.5 m )をグリセロール(0,5g)中に集
めた。カラムからの溶出液@280nmで連続監視した
。EACA含有フラクション中の蛋白質濃度を牛血清ア
ルブミンを標準として用いBradfordの方法(A
na#、Biochem、、1976.72゜248)
により決定した。ピークフラクションは320μ9蛋白
質/l1lI!を含有していた。この溶液ldを0.0
5 M t’リス、0.02 M L−リジン及び0.
003M EDTAで0,05−の20倍濃縮原料溶液
の添加により増加させた。pHにニュートラリット(、
Neutraiffit 、登録商標)紙(Merck
)を用いて、8.5−9.0と記録された。この溶液
にプラスミンのA調音含有しており、氷上で約2時間保
存した。
(b) t −P A、 17′) B鎖の単離上とし
て二本鎖t 、−P A (蛋白質分解により決定して
0.65 m? )からなる唾剤全0.05Mトリス/
0. I M NaC6/ 25 % (v/v)
グリt O−JLpH9,0中に2 m? / mt、
q)割合で溶解した。t−PA溶液をジチオスレイト
ール(0,OIM)及びロイペブ′チン(2m9 /
mt )と共に窒素雰囲気中で1時間6℃にて恒温維持
することにより緩和な還元を行fzツfc、o混合物ノ
全fir予め0.1 M NaH2PO410,1m9
/ dロイペプチンpH7,4で平衡化しであるリジ
ンセファロースCL4Bり)カラム(Vt20m )
に適用した。カラムを基底線が安定化するまで0. i
M NaHtPOt l o、 003 Mジチオスレ
イトール声7.4で洗浄した。クロマトグラフィーの全
部分?6℃にて100 me/ h /洲で行なった。
て二本鎖t 、−P A (蛋白質分解により決定して
0.65 m? )からなる唾剤全0.05Mトリス/
0. I M NaC6/ 25 % (v/v)
グリt O−JLpH9,0中に2 m? / mt、
q)割合で溶解した。t−PA溶液をジチオスレイト
ール(0,OIM)及びロイペブ′チン(2m9 /
mt )と共に窒素雰囲気中で1時間6℃にて恒温維持
することにより緩和な還元を行fzツfc、o混合物ノ
全fir予め0.1 M NaH2PO410,1m9
/ dロイペプチンpH7,4で平衡化しであるリジ
ンセファロースCL4Bり)カラム(Vt20m )
に適用した。カラムを基底線が安定化するまで0. i
M NaHtPOt l o、 003 Mジチオスレ
イトール声7.4で洗浄した。クロマトグラフィーの全
部分?6℃にて100 me/ h /洲で行なった。
フラクション(公称Q、 6 mA ) kグリセロー
ル(0,2mA)中に集めたO Vo フラクション(
未吸着物質、実質的ににt −P A、 B鎖、全含有
)を蛋白質含量についてかつS −2288(Kabf
vitrum )i用いてアミド分解活性について分析
した。最高のアミド分解活性?有するフラクションを貯
蔵しておくことにより、165μ9の蛋白質及び25.
000SU (ここで0、2 m& / d大豆トリプ
シン抑制剤含有0.1 M トリエンpH8,0、0,
05%NaN3 中1 m M S −22881α 金柑いてl5U=△Qp O,001劃−1)を含有4
05 nm する溶液を得た。この貯蔵物は0.05 M トリス、
0、02 M T、−リジン及び0.003 MEDT
Aを用い0、IJゴの20倍濃縮原料溶液の添加により
増加させた。−1ハにュートラリフト紙を使用して)9
.0と配録され、次いで貯蔵物を氷上で1時間保存した
。
ル(0,2mA)中に集めたO Vo フラクション(
未吸着物質、実質的ににt −P A、 B鎖、全含有
)を蛋白質含量についてかつS −2288(Kabf
vitrum )i用いてアミド分解活性について分析
した。最高のアミド分解活性?有するフラクションを貯
蔵しておくことにより、165μ9の蛋白質及び25.
000SU (ここで0、2 m& / d大豆トリプ
シン抑制剤含有0.1 M トリエンpH8,0、0,
05%NaN3 中1 m M S −22881α 金柑いてl5U=△Qp O,001劃−1)を含有4
05 nm する溶液を得た。この貯蔵物は0.05 M トリス、
0、02 M T、−リジン及び0.003 MEDT
Aを用い0、IJゴの20倍濃縮原料溶液の添加により
増加させた。−1ハにュートラリフト紙を使用して)9
.0と配録され、次いで貯蔵物を氷上で1時間保存した
。
(c) プラスミンA鎖/1−PAB鎖ハイブリッド1
7)形成 上記のプラスミンA鎖の製剤(320μ9の蛋白質)及
び上記のt−PAB鎖の製剤(160μ9の蛋白質)を
小さなポリスチレン容器中で混合した。
7)形成 上記のプラスミンA鎖の製剤(320μ9の蛋白質)及
び上記のt−PAB鎖の製剤(160μ9の蛋白質)を
小さなポリスチレン容器中で混合した。
混合物を、約0. OOI MEDTA中でオートクレ
ーブ処理した後充分に水洗した6、 35 ran (
8/ 32”)透析管(5cleAtific Ins
trument Centre Ltd、)に移(−た
。この、各調型をほぼ等モルi (5,3nmod )
含有する混合物(3,2d、150μy蛋白漬/−)を
30容+7′) 25 % (v/v) グリセロール
10.04Mトリス10.02ML−リジン/ 0.0
8 M NaCe10.003M EDTA pH9,
0に対して6℃で3日間透析することにより空気の存在
下において緩和な酸化に付(−た。透析緩衝液は攪拌し
た。非拡散物質に一40°Cで4日間保存し、次いで更
に6℃で8日間40容の同一緩衝液で透析した。非拡散
物質のアリコートを定期的に取出し、−40℃で保存し
た。
ーブ処理した後充分に水洗した6、 35 ran (
8/ 32”)透析管(5cleAtific Ins
trument Centre Ltd、)に移(−た
。この、各調型をほぼ等モルi (5,3nmod )
含有する混合物(3,2d、150μy蛋白漬/−)を
30容+7′) 25 % (v/v) グリセロール
10.04Mトリス10.02ML−リジン/ 0.0
8 M NaCe10.003M EDTA pH9,
0に対して6℃で3日間透析することにより空気の存在
下において緩和な酸化に付(−た。透析緩衝液は攪拌し
た。非拡散物質に一40°Cで4日間保存し、次いで更
に6℃で8日間40容の同一緩衝液で透析した。非拡散
物質のアリコートを定期的に取出し、−40℃で保存し
た。
(d) ハイブリッドの特徴づけ
8%分離ゲル中4%積重ねゲルを用い、それ以外n L
aemrn6i (Nature、1970 *227
+680)に記載されたようにドテシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)
を用いることによりハイブリッド含有溶液の各種Mr酸
成分分離した。繊維素溶解活性帯を、Graneegi
−Pip−erno & Retcb (J、Exp、
Med、 、1978 、 I 48 、223 )に
本質的に記載されていたようにフイブリンチモグラフイ
ーを用いて同定した。これらの実験は、透析の開始から
15分後のハイブリッド混合物において、血栓崩壊活性
がチモグラムのMr = 32,000の領域中にほと
んど完全に存在することが立証している。しかしながら
、24時間、72時間及び9日目に取出した試料におい
て、顕著な繊維素溶解活性がまたMr=88,000及
び92,000で二重項(doublet ) (以下
、90に二重項と称する)として存在していた。捷た、
特異抗体をチモグラムに入れることにより90に二重項
繊維素溶解活性は抗−t −P A I9Gにより抑制
されうるが、抗−u−PAI9Gの対照製剤によっては
抑制されないことが示された。90に二重項において繊
維素溶解活性がプラスミンA@製剤のプラスミン汚染に
よるものであるりるという可能性Fl (a)プラスミ
ンによるフィブリン層の溶解に対する相対的非感性、中
)t=15分の試料における90に二重項活性の笑質的
不存在及び〔c)2種抗体含有チモグラム上の対照的な
90に二重項の活性により除外される。
aemrn6i (Nature、1970 *227
+680)に記載されたようにドテシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)
を用いることによりハイブリッド含有溶液の各種Mr酸
成分分離した。繊維素溶解活性帯を、Graneegi
−Pip−erno & Retcb (J、Exp、
Med、 、1978 、 I 48 、223 )に
本質的に記載されていたようにフイブリンチモグラフイ
ーを用いて同定した。これらの実験は、透析の開始から
15分後のハイブリッド混合物において、血栓崩壊活性
がチモグラムのMr = 32,000の領域中にほと
んど完全に存在することが立証している。しかしながら
、24時間、72時間及び9日目に取出した試料におい
て、顕著な繊維素溶解活性がまたMr=88,000及
び92,000で二重項(doublet ) (以下
、90に二重項と称する)として存在していた。捷た、
特異抗体をチモグラムに入れることにより90に二重項
繊維素溶解活性は抗−t −P A I9Gにより抑制
されうるが、抗−u−PAI9Gの対照製剤によっては
抑制されないことが示された。90に二重項において繊
維素溶解活性がプラスミンA@製剤のプラスミン汚染に
よるものであるりるという可能性Fl (a)プラスミ
ンによるフィブリン層の溶解に対する相対的非感性、中
)t=15分の試料における90に二重項活性の笑質的
不存在及び〔c)2種抗体含有チモグラム上の対照的な
90に二重項の活性により除外される。
実施例2
Lys−プラスミンA/1−FAハイブリッドの合成は
下記の点全除き、実質的に実施例1に記載(−たよりに
行なった。
下記の点全除き、実質的に実施例1に記載(−たよりに
行なった。
(a)t −FA還元工程中ロイペプチンを省略した。
Q)) t−PA還元は5℃で2時間であった。
(c) 透析前混合物に3nrrIOe17′)各鎧型
を含有していた0 (d) 透析に40容透析緩衝液/24時間15℃に対
し、次いで40容透析緩衝液724時v5℃に対して行
なった。
を含有していた0 (d) 透析に40容透析緩衝液/24時間15℃に対
し、次いで40容透析緩衝液724時v5℃に対して行
なった。
透析した滞留物(2,4m )に5容002M燐酸塩/
0.15 M NaCJ/ 0.01%トウイーン8
0.p)7.4CPBS/TW)で希釈し、P B S
/TVで平衡化したリジンセファロースのカラム(V
t2.9d)に適用した。透析した滞留物を適用した後
、カラムk (a) P B S / T W 、 (
b) 0.02 M トリス10.5MNaCg10.
01%トウィーン80 、 pH7,4及び(c) (
1))と同一だが更に0.5 M T、−アルギニンを
含有しているもσ)で洗浄した。クロマトグラフィーの
全部分’tri 50d/h/dで5℃で行なった。カ
ラムからの溶出液をフラクションとして集めた。
0.15 M NaCJ/ 0.01%トウイーン8
0.p)7.4CPBS/TW)で希釈し、P B S
/TVで平衡化したリジンセファロースのカラム(V
t2.9d)に適用した。透析した滞留物を適用した後
、カラムk (a) P B S / T W 、 (
b) 0.02 M トリス10.5MNaCg10.
01%トウィーン80 、 pH7,4及び(c) (
1))と同一だが更に0.5 M T、−アルギニンを
含有しているもσ)で洗浄した。クロマトグラフィーの
全部分’tri 50d/h/dで5℃で行なった。カ
ラムからの溶出液をフラクションとして集めた。
各フラクションは色素形成性物質S−2288全用いて
分析した。結果+1−jS−2288活性のほとんどが
未吸着物質を含有しているフラクション中にあることを
示した。残りはアルギニン可解離性物質を含有するフラ
クション中にあった。
分析した。結果+1−jS−2288活性のほとんどが
未吸着物質を含有しているフラクション中にあることを
示した。残りはアルギニン可解離性物質を含有するフラ
クション中にあった。
5DSPAGE により、次いでフィブリンチモグーを
含有しており、またアルギニン可解離性物質はわずかM
r=約90,000プラスミノゲンアクチベーター全含
有していることが明らかである。
含有しており、またアルギニン可解離性物質はわずかM
r=約90,000プラスミノゲンアクチベーター全含
有していることが明らかである。
Mr=90,000アクチベーターを含有するフラクシ
ョンを同様に製造したハイブリッド製剤と共に貯蔵し、
固体PEG20,0OOK対して6℃で2時間透析し、
透析した滞留物を除去した。次いでこD溶液をセファデ
ックスG−25を用いて0.05M NH4HCO3中
に緩衝液交換し、親液性化した。親液化的溶液1d S
D S PAGEにより次いでチモグラフイーにより
分析したところMr約90,000(これに約88,0
00及び約92,000における2種からなる二重項と
考えられる)にて繊維素溶解活性の単−主要帯及び約1
50,00 Q及び約86,000の副成分を示した。
ョンを同様に製造したハイブリッド製剤と共に貯蔵し、
固体PEG20,0OOK対して6℃で2時間透析し、
透析した滞留物を除去した。次いでこD溶液をセファデ
ックスG−25を用いて0.05M NH4HCO3中
に緩衝液交換し、親液性化した。親液化的溶液1d S
D S PAGEにより次いでチモグラフイーにより
分析したところMr約90,000(これに約88,0
00及び約92,000における2種からなる二重項と
考えられる)にて繊維素溶解活性の単−主要帯及び約1
50,00 Q及び約86,000の副成分を示した。
フィブリン板によるまたげ8−2288?用いる分析は
全体として製剤に対し0.2〜0,3の繊維素溶解活性
対アミド分解活性(IU:SU)を与えた。フィブリン
板上の製剤σ)投与景応答はt−PAのものと相似して
いた。
全体として製剤に対し0.2〜0,3の繊維素溶解活性
対アミド分解活性(IU:SU)を与えた。フィブリン
板上の製剤σ)投与景応答はt−PAのものと相似して
いた。
実施例3
Lys−プラスミンA鎖の単離は下aeD点を除き実施
例i vc iit、”載したものと同様であった。
例i vc iit、”載したものと同様であった。
(a) ジチオスレイトールとの恒温維持に5℃で3.
5時間であった。
5時間であった。
(b) リジンセファロース床容積f11.5dであり
た。
た。
ピークを7ミノカブロン酸(EACA)含有フラクショ
ン(17ml ) (i70.05 M )リス、0,
02M L−リジン及びo、o o 3M EDTA
を用い20倍濃縮原料溶液の添加により増加させた。溶
液をN九01−1を用いてpH9,0に調整した。この
溶液0.1dを一40℃で約3ケ月間保存した(溶液A
)。
ン(17ml ) (i70.05 M )リス、0,
02M L−リジン及びo、o o 3M EDTA
を用い20倍濃縮原料溶液の添加により増加させた。溶
液をN九01−1を用いてpH9,0に調整した。この
溶液0.1dを一40℃で約3ケ月間保存した(溶液A
)。
第二17’)ピーク−EACA含有フラクション(ca
、 1.7Tn!、) f−40℃で約3ケ月処理した
。
、 1.7Tn!、) f−40℃で約3ケ月処理した
。
次いで、これを解凍し、上記したようにトリス/#ys
/EDTA混合物で増加することにより溶液Bを得た。
/EDTA混合物で増加することにより溶液Bを得た。
次いで、溶液Aを解凍し、溶液Bと混合することにより
溶液Cを得た。この溶液の全容積に1.78 mであり
、p141dニュートラリフト紙を用いてpH8,5〜
9,0で記録した。蛋白質金1t−t121μ9蛋白質
/−であった。溶液Cは必要になるまで氷上で保持した
。
溶液Cを得た。この溶液の全容積に1.78 mであり
、p141dニュートラリフト紙を用いてpH8,5〜
9,0で記録した。蛋白質金1t−t121μ9蛋白質
/−であった。溶液Cは必要になるまで氷上で保持した
。
(b) ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベータ−1
x 500,0OOIU(5Q;’) u−PA(5e
rono)を脱イオンH20に20〜/m!で溶解した
。2m9に相当する0、095mをポリプロピレン微試
験管(5arstedt )に移し、0.02M2−メ
ルカプトエタノール101MトリスHCe / 0.3
M NaOH10、04M EDTApH8,0の等
容積と混合し、21〜24℃で17時間培養した。次い
で、試料全3日前に調製した同様な組成の還元u −P
A溶液0.02Inlと混合した。この混合物0.2d
を1.8−〇、 02 M l’リス10.003M2
−メルカプトエタノールpH7,4を用いて10倍希釈
し、0.02 Mトリス10.003M2−メルカプト
エタノールpH7,4で平衡化しておいたp−アミノベ
ンズアミジンセファロース(Pierce )のカラム
(Vt約4m)に適用した、還元したu−PA溶液の適
用後、カラムを(a>平衡化緩衝液、(b) 0.02
M トリス10.5M NaC6/ 25 % (v
/v)グリセロール10.003M2−メルカプトエタ
ノールpH7,4及び(c) (b)と同一だが更に0
.5 M L−アルギニンを含有しているもので洗浄1
−た。
x 500,0OOIU(5Q;’) u−PA(5e
rono)を脱イオンH20に20〜/m!で溶解した
。2m9に相当する0、095mをポリプロピレン微試
験管(5arstedt )に移し、0.02M2−メ
ルカプトエタノール101MトリスHCe / 0.3
M NaOH10、04M EDTApH8,0の等
容積と混合し、21〜24℃で17時間培養した。次い
で、試料全3日前に調製した同様な組成の還元u −P
A溶液0.02Inlと混合した。この混合物0.2d
を1.8−〇、 02 M l’リス10.003M2
−メルカプトエタノールpH7,4を用いて10倍希釈
し、0.02 Mトリス10.003M2−メルカプト
エタノールpH7,4で平衡化しておいたp−アミノベ
ンズアミジンセファロース(Pierce )のカラム
(Vt約4m)に適用した、還元したu−PA溶液の適
用後、カラムを(a>平衡化緩衝液、(b) 0.02
M トリス10.5M NaC6/ 25 % (v
/v)グリセロール10.003M2−メルカプトエタ
ノールpH7,4及び(c) (b)と同一だが更に0
.5 M L−アルギニンを含有しているもので洗浄1
−た。
ビークアルギニン含有フラクション(容#4.9−)を
0.05 M トリス/ 0.02 M L−リジン1
0.003 M EDTA を用い0.245m1(1
”320倍濃縮原刺溶液の添加により増1Jaさせた。
0.05 M トリス/ 0.02 M L−リジン1
0.003 M EDTA を用い0.245m1(1
”320倍濃縮原刺溶液の添加により増1Jaさせた。
が(け8.5と記録された。蛋白質含量を82μg/a
t、であった。この溶液を「u−PAB鎖貯蔵物」とみ
なした。
t、であった。この溶液を「u−PAB鎖貯蔵物」とみ
なした。
(e) プラスミンA/u−PABハイブリッドの合成
u−、T’AB鎖貯蔵物(1,3mlの上記溶液)及び
Lys−プラスミンA鎖貯蔵物(1,76mlのプラス
ミンA貯蔵物の溶液C)を混合することにより全容積3
.06 mlのu−PAB及びプラスミンAの等モル月
゛(公称3.6nmoe)溶液を得た。この溶液をメゾ
イセJL、i<イスキング(MediceeJ Via
king )管系に移し、o、o5Mトリス/ 0.0
2 M L−リジン10.08M NaCe 10.0
03M EDTA/25 %(v/v ’)グリセロー
ル、pi(9(30容/24時間)に対し、次いで新し
い透析液(30容/3日間)に対して透析した。全ての
透析は空気(大気)の存在下で5℃で行なった。4日目
に存在する透析した滞留物はポリスチレン小ビンに移し
、−40℃で保存した。
Lys−プラスミンA鎖貯蔵物(1,76mlのプラス
ミンA貯蔵物の溶液C)を混合することにより全容積3
.06 mlのu−PAB及びプラスミンAの等モル月
゛(公称3.6nmoe)溶液を得た。この溶液をメゾ
イセJL、i<イスキング(MediceeJ Via
king )管系に移し、o、o5Mトリス/ 0.0
2 M L−リジン10.08M NaCe 10.0
03M EDTA/25 %(v/v ’)グリセロー
ル、pi(9(30容/24時間)に対し、次いで新し
い透析液(30容/3日間)に対して透析した。全ての
透析は空気(大気)の存在下で5℃で行なった。4日目
に存在する透析した滞留物はポリスチレン小ビンに移し
、−40℃で保存した。
(d) 生成物の特徴づけ及び精製
SDS PAGE 次いでフイブリンチモグラフイーを
、いずれも実施例1に記載したように、透析工程を通し
採取された全試料について行なった。
、いずれも実施例1に記載したように、透析工程を通し
採取された全試料について行なった。
これらはMr約9’0.000の繊維素溶解性酵素が〇
−24時間の透析期間中に生成され、その後収量に余り
変化がなかったことを示した。全透析滞留物(3,7r
nl)を9容0.02M燐酸塩/ 0.15 MNaC
6/ 0.01%トウイーン80.pH7,4で希釈し
、希釈緩衝液で平衡化したリジンセファロース0カラム
(Vt1.8m) に直接適用した。透析滞留物を適用
した後、カラム=k (a)平衡化緩衝液及び(b)(
a)と同一だが更に0.5 M t−アミノカプロン酸
(EACA、)’e金含有るもので順次洗浄した。クロ
マトグラフィーの全部分に5℃でsO*/h/dで行な
った。ピークEACA含有フラクションを0.05 M
N1(4HCO3中に緩衝液交替し、親液化した。親
液化液を脱イオンH20で再調製した。この溶液はフィ
ブリン板上で決定して360CTA単位のプラスミノゲ
ンアクチベーターを含有していた。SDS PAGE次
いでフイブリンチモブラフイーにより、製剤は単一繊維
素溶解活性成分をMr =約90,000に含有してお
り、これtffMr がプラスミンA/1−PABハイ
ブリッドと同一であった。
−24時間の透析期間中に生成され、その後収量に余り
変化がなかったことを示した。全透析滞留物(3,7r
nl)を9容0.02M燐酸塩/ 0.15 MNaC
6/ 0.01%トウイーン80.pH7,4で希釈し
、希釈緩衝液で平衡化したリジンセファロース0カラム
(Vt1.8m) に直接適用した。透析滞留物を適用
した後、カラム=k (a)平衡化緩衝液及び(b)(
a)と同一だが更に0.5 M t−アミノカプロン酸
(EACA、)’e金含有るもので順次洗浄した。クロ
マトグラフィーの全部分に5℃でsO*/h/dで行な
った。ピークEACA含有フラクションを0.05 M
N1(4HCO3中に緩衝液交替し、親液化した。親
液化液を脱イオンH20で再調製した。この溶液はフィ
ブリン板上で決定して360CTA単位のプラスミノゲ
ンアクチベーターを含有していた。SDS PAGE次
いでフイブリンチモブラフイーにより、製剤は単一繊維
素溶解活性成分をMr =約90,000に含有してお
り、これtffMr がプラスミンA/1−PABハイ
ブリッドと同一であった。
実施例4
ハイブリッドプラスミンA/1−PABの可逆活性部位
アシル化方法は実質的に先行文献(Smi−th 、R
,A、G、 、欧州特許第0009879号)に言e載
された通りであった。
アシル化方法は実質的に先行文献(Smi−th 、R
,A、G、 、欧州特許第0009879号)に言e載
された通りであった。
要するに、塩不含親液化Lys−プラスミンA/1−P
AB (15,000IU )をO,l M燐酸塩pH
7; 4 (2,I m7! )に溶解し、26℃で1
mM4−アミジノフェニルp−アミノ安息香m(APA
B)で0.042dのAPAB(ジメチルスルホキシド
中50 mM )の添加により培養した。七−30分に
おける培養物の分析により99.6 %の原アミド分解
活性が抑制されたことを示した。t=40f+にて、溶
液をセファデックスG−25t−用いて5℃にて0.0
2M燐酸塩/ 0.15 M NaCe / 0.01
%トウィーン80 [)H7,4(3,Od )中に
緩衝液交替することによシ過剰のアシル化試薬を除去し
た。
AB (15,000IU )をO,l M燐酸塩pH
7; 4 (2,I m7! )に溶解し、26℃で1
mM4−アミジノフェニルp−アミノ安息香m(APA
B)で0.042dのAPAB(ジメチルスルホキシド
中50 mM )の添加により培養した。七−30分に
おける培養物の分析により99.6 %の原アミド分解
活性が抑制されたことを示した。t=40f+にて、溶
液をセファデックスG−25t−用いて5℃にて0.0
2M燐酸塩/ 0.15 M NaCe / 0.01
%トウィーン80 [)H7,4(3,Od )中に
緩衝液交替することによシ過剰のアシル化試薬を除去し
た。
生成物を一70℃で保存した。
生成物に約88分の脱アシル化半減期及び約1、37
X 10−4秒−1の脱アシル化速度定数を有すること
が分った。脱アシル化ハイブリッドのIU:た。
X 10−4秒−1の脱アシル化速度定数を有すること
が分った。脱アシル化ハイブリッドのIU:た。
実施例4A
実施例4に記載された方法と同様の方法により2種の表
題ハイブリッド蛋白質を製造した。
題ハイブリッド蛋白質を製造した。
実施例5
ウナキローゼ型ブラスミノゲンアクチベータ−(5er
ono、 10 g ) ’k、還元時間中の2−メル
カプトエタノール濃度を0.02Mとし、温置時間を2
4時間とした以外に実質的に実施例3に記載した通り緩
かに還元した。緩かに還元したu −、PA製剤(i、
og)を次いで(0,003Mの最終2−メルカプトエ
タノール濃度を与えるよう) 0.02Mトリス10.
0011M2−メルカプトエタノールpH7,4(9d
)と混合し、次いで実施例3に記載したようにp−アミ
ノベンズアミジンセファロースのクロマトグラフィーに
かけた。ピークアルギニン可解離性フラクションは(4
4φD/v)の最終グリセロール濃度を与えるように)
グリセロール中に集めたが、主としてu −PABtJ
t含有してbた。これらのフラクションに使用するまで
7日間−40℃で貯蔵保存した。
ono、 10 g ) ’k、還元時間中の2−メル
カプトエタノール濃度を0.02Mとし、温置時間を2
4時間とした以外に実質的に実施例3に記載した通り緩
かに還元した。緩かに還元したu −、PA製剤(i、
og)を次いで(0,003Mの最終2−メルカプトエ
タノール濃度を与えるよう) 0.02Mトリス10.
0011M2−メルカプトエタノールpH7,4(9d
)と混合し、次いで実施例3に記載したようにp−アミ
ノベンズアミジンセファロースのクロマトグラフィーに
かけた。ピークアルギニン可解離性フラクションは(4
4φD/v)の最終グリセロール濃度を与えるように)
グリセロール中に集めたが、主としてu −PABtJ
t含有してbた。これらのフラクションに使用するまで
7日間−40℃で貯蔵保存した。
(b) t −P A A鎖の単離
0、05 M トリス/ 0. I NaCg / 2
5 % (v/v)グリセロールpH9中210,0O
O8U/mの二本鎖t −PA(480,0OO8U)
’eジチオスレイトール(10d)で処理し、窒素で一
掃し、58Cで2時間恒温維持した。次いで、この維持
混合物k O,I M NaHzPOilo、1η/d
ロイペプシンpH7,4で平衡化させたリジンセファロ
ースカラム(Vt8.6s )に適用した。維持混合物
の適用後、カラムを(a) 0. I MNaHzPO
4/ 0.003 MジチオスレイトールpH7,4及
び(b) (a)と同一だが更に0.5Mε−アミノカ
プロン酸(EACA)e含有するもので洗浄した。緩衝
液(b)の溶離液をグリセロール中に集めることにより
約25%(v/v )の最終グリセロール濃度を与えた
。全ての溶離は約100 ml/ h / crlで行
なった。
5 % (v/v)グリセロールpH9中210,0O
O8U/mの二本鎖t −PA(480,0OO8U)
’eジチオスレイトール(10d)で処理し、窒素で一
掃し、58Cで2時間恒温維持した。次いで、この維持
混合物k O,I M NaHzPOilo、1η/d
ロイペプシンpH7,4で平衡化させたリジンセファロ
ースカラム(Vt8.6s )に適用した。維持混合物
の適用後、カラムを(a) 0. I MNaHzPO
4/ 0.003 MジチオスレイトールpH7,4及
び(b) (a)と同一だが更に0.5Mε−アミノカ
プロン酸(EACA)e含有するもので洗浄した。緩衝
液(b)の溶離液をグリセロール中に集めることにより
約25%(v/v )の最終グリセロール濃度を与えた
。全ての溶離は約100 ml/ h / crlで行
なった。
ピークEACAフラクション1dt−FAA鎖を含有し
ていると考えられ、約40日間−40℃で貯蔵保存した
。次いでA鎖滞留物をセファデックスG−250カラム
を用いて0.02M燐酸塙70.3M NaCd/ 0
.003 Mジチオスレイトール10.01壬トウイー
ン80pH7,4中に緩衝液交換した。A鎖を含有する
セファデックスカラムのフラクション1PEezo、o
ooに対して透析により濃縮した。更に、セファデック
スG−25カラムかけることにより行なった。適用した
物質を平衡化H衝液、次いで0.1 M燐酸塩/ 0.
5 M EACAlo、 003 Mジチオスレイトー
ルpH7,4で洗い流した。非吸着溶液を含有するフラ
クションをPEG20.000に対して透析することに
より80μ9蛋白質/ Lntケ含有する5、6dσ)
溶液を得た。
ていると考えられ、約40日間−40℃で貯蔵保存した
。次いでA鎖滞留物をセファデックスG−250カラム
を用いて0.02M燐酸塙70.3M NaCd/ 0
.003 Mジチオスレイトール10.01壬トウイー
ン80pH7,4中に緩衝液交換した。A鎖を含有する
セファデックスカラムのフラクション1PEezo、o
ooに対して透析により濃縮した。更に、セファデック
スG−25カラムかけることにより行なった。適用した
物質を平衡化H衝液、次いで0.1 M燐酸塩/ 0.
5 M EACAlo、 003 Mジチオスレイトー
ルpH7,4で洗い流した。非吸着溶液を含有するフラ
クションをPEG20.000に対して透析することに
より80μ9蛋白質/ Lntケ含有する5、6dσ)
溶液を得た。
u −PA13 #I貯蔵物(11,,2ml )を0
.05 M トリス、O,0,2M T、−リジン及び
0.003 M EDTA−で0.56dの20倍濃縮
原料溶液の添加により増加させ、氷上に保持した。t
−PA、 A鎖貯蔵物(5,6d)を、0.28 ml
グ)20倍濃縮原料溶液を電相いて同様に増加させた。
.05 M トリス、O,0,2M T、−リジン及び
0.003 M EDTA−で0.56dの20倍濃縮
原料溶液の添加により増加させ、氷上に保持した。t
−PA、 A鎖貯蔵物(5,6d)を、0.28 ml
グ)20倍濃縮原料溶液を電相いて同様に増加させた。
次いで、u−PAB鎖貯蔵物及びt−PA、A@貯蔵物
を混合し、次いで透析管系に移した。混合物を40容0
.04Mトリス10.02ML−リジン/ 0.08
M NaC610、OO3M EDTA、 / 25
% (v/v)グリセロールpH9、0に対し5℃で2
4時間次いで新しい緩衝液(40容)に対して5℃で5
日間透析−た。
を混合し、次いで透析管系に移した。混合物を40容0
.04Mトリス10.02ML−リジン/ 0.08
M NaC610、OO3M EDTA、 / 25
% (v/v)グリセロールpH9、0に対し5℃で2
4時間次いで新しい緩衝液(40容)に対して5℃で5
日間透析−た。
透析滞留物を68目に透析袋から取出し、4容0、02
M燐酸塩/ 0.15 M Na(J! / 0.0
1 % トウイーンs O、PH7,4(PBS/TW
)で希釈し、PBS/TWで平衡化しておいたリジンセ
ファロースのカラムに直接適用した。適用したハイブリ
ッド溶液をP B S /TWと共に流した。次いで。
M燐酸塩/ 0.15 M Na(J! / 0.0
1 % トウイーンs O、PH7,4(PBS/TW
)で希釈し、PBS/TWで平衡化しておいたリジンセ
ファロースのカラムに直接適用した。適用したハイブリ
ッド溶液をP B S /TWと共に流した。次いで。
カラム’k(a) 0.02 M トリス/ 0.5
M NaCe / 0.01係トウイーン80 pH7
,4及び(b) (a)と同一だが更に0.5Mアルギ
ニンを含有するもので洗浄した。カラムからの溶出物を
フラクションとして集めた。
M NaCe / 0.01係トウイーン80 pH7
,4及び(b) (a)と同一だが更に0.5Mアルギ
ニンを含有するもので洗浄した。カラムからの溶出物を
フラクションとして集めた。
S−2288を使用する分析に基すいて、L−アルギニ
ン可解離性アミド分解活性を含有する2種Dフラクショ
ンを貯蔵した。こσ)最終貯蔵物はt、−PA、A鎖/
u−PA、B鎖ハイブリッドを含有するものと考えられ
た。実施例1に記載したように、SDS I)AGE
及びフイブリンチモグラフイーにより分析したところ、
この貯蔵物iMr=約40.000,47,000,5
6,000.65,000.及び+9+0.000にて
5種のプラスミノゲンアクチベーターを含有することが
分った。特異抗体を他σ)フイブリンチモグラムに入れ
ることにより、Mr=約40.QOo。
ン可解離性アミド分解活性を含有する2種Dフラクショ
ンを貯蔵した。こσ)最終貯蔵物はt、−PA、A鎖/
u−PA、B鎖ハイブリッドを含有するものと考えられ
た。実施例1に記載したように、SDS I)AGE
及びフイブリンチモグラフイーにより分析したところ、
この貯蔵物iMr=約40.000,47,000,5
6,000.65,000.及び+9+0.000にて
5種のプラスミノゲンアクチベーターを含有することが
分った。特異抗体を他σ)フイブリンチモグラムに入れ
ることにより、Mr=約40.QOo。
56.000及び65,000の種が抗−t−PA P
?G及び抗−u −FA I9Gいずれによっても中和
しうろことが立証された。これらの種はt−PAA/u
、−PABハイブリッドであると考えられた03種nM
r のハイブリッドの出現はt−pAA鎖が複数形態で
存在する一部分解したt−FAを最初に使用L*ことニ
ヨル(例えば、Banya i 、L、 e tag
。
?G及び抗−u −FA I9Gいずれによっても中和
しうろことが立証された。これらの種はt−PAA/u
、−PABハイブリッドであると考えられた03種nM
r のハイブリッドの出現はt−pAA鎖が複数形態で
存在する一部分解したt−FAを最初に使用L*ことニ
ヨル(例えば、Banya i 、L、 e tag
。
19B3.FE13S Lett、、163.37−4
1)。
1)。
実施例6
(a) ツロ宏
雄性Dunkin Hartgeyモルモット(350
〜450!9)をウレタン(25% w/v /iJ液
; 6 ml、 / kg 1 、p)で麻酔した。1
本り頚動脈を血液試料の採取のため力ヌユーレ処理した
。1本の大腿静脈をヘパリン(50U/kg i、v、
)の試験化合物の注射のため処理した。ヘパリン処理約
5分後、投与前血液試料(2d)k取り、0.1容の1
29rnMクエン酸ナトリウムと混合した。次いで、試
験化合物を10秒間要して注射した(+m9/に9)。
〜450!9)をウレタン(25% w/v /iJ液
; 6 ml、 / kg 1 、p)で麻酔した。1
本り頚動脈を血液試料の採取のため力ヌユーレ処理した
。1本の大腿静脈をヘパリン(50U/kg i、v、
)の試験化合物の注射のため処理した。ヘパリン処理約
5分後、投与前血液試料(2d)k取り、0.1容の1
29rnMクエン酸ナトリウムと混合した。次いで、試
験化合物を10秒間要して注射した(+m9/に9)。
更に血液試料全正確に2.4.8.16.30 及び6
0分後に取った。ヘパリン処理(50TJ / ’cg
i、v、)を30分後採取試料の後にカヌユーレ開存を
保持するために繰返した。全てのクエン酸塩処理血液試
料は各実験の最後まで氷上に保持し、次いで4℃で15
分間1700夕で遠心分離することにより血漿kmだ。
0分後に取った。ヘパリン処理(50TJ / ’cg
i、v、)を30分後採取試料の後にカヌユーレ開存を
保持するために繰返した。全てのクエン酸塩処理血液試
料は各実験の最後まで氷上に保持し、次いで4℃で15
分間1700夕で遠心分離することにより血漿kmだ。
オイグロピンフラクションは各血漿0.1m’z:1.
82mの氷冷o、 o I J % (v/v)酢酸水
溶液に添加することにより沈殿させた。氷上で305+
間放置後、全試験管を4℃で15分間17009で遠心
分離した。上澄液を注ぎ出し、各試験管の内壁を慎重に
拭いて乾燥させ、各沈殿f O,01% (v/v)
トウイーン80を含有する0、4d燐ll!#塩緩衝化
食塩水中で再沈殿させた。次いでアリコート(30μe
)を4回分フィブリン板に適用した。フィブリン板H0
,029Mバルビトンの125mM NaC/!中溶液
pH7,4中に溶解しfcoo、4%(w/v )ヒト
フイプリノゲシ(Kabi、QradeL、F6−ow
I、aboratories、5cot6and )
から、こfl、1lOX10傭平方プラスチツク血(5
teriJin )中にピペット注入しく]0d)0.
3mの牛トロンビン(50N T H単位/ d、 P
arke−Davis、U、に、)と急速混合すること
により凝血させて作製した。板は通常18〜24時間、
もし必要ならば更に長時間37℃で装置し、ブロモフェ
ノールブルー水溶液で染色した。各溶解帯について、互
いに垂直な2つσ)直径1Vernierカリバスを用
いて測定した。
82mの氷冷o、 o I J % (v/v)酢酸水
溶液に添加することにより沈殿させた。氷上で305+
間放置後、全試験管を4℃で15分間17009で遠心
分離した。上澄液を注ぎ出し、各試験管の内壁を慎重に
拭いて乾燥させ、各沈殿f O,01% (v/v)
トウイーン80を含有する0、4d燐ll!#塩緩衝化
食塩水中で再沈殿させた。次いでアリコート(30μe
)を4回分フィブリン板に適用した。フィブリン板H0
,029Mバルビトンの125mM NaC/!中溶液
pH7,4中に溶解しfcoo、4%(w/v )ヒト
フイプリノゲシ(Kabi、QradeL、F6−ow
I、aboratories、5cot6and )
から、こfl、1lOX10傭平方プラスチツク血(5
teriJin )中にピペット注入しく]0d)0.
3mの牛トロンビン(50N T H単位/ d、 P
arke−Davis、U、に、)と急速混合すること
により凝血させて作製した。板は通常18〜24時間、
もし必要ならば更に長時間37℃で装置し、ブロモフェ
ノールブルー水溶液で染色した。各溶解帯について、互
いに垂直な2つσ)直径1Vernierカリバスを用
いて測定した。
各試料の全ての直径を平均化させ、この平均値全検量線
に対して繊維素溶解活性に転換した。検量線に各動物の
前投与量血漿に様々な既知量の化合物を添加することに
より得た。これらの標準は実験試料と同一方法を用い同
時に処理した。検量線を作るため、直径(圃)を化合物
の109.。濃度に対してプロットした。各実験試料に
おける化合物の崩漿中濃度は各モルモットの体重ゆ当り
血漿50ゴと仮定して期待されるものに対する百分率と
して表わした。
に対して繊維素溶解活性に転換した。検量線に各動物の
前投与量血漿に様々な既知量の化合物を添加することに
より得た。これらの標準は実験試料と同一方法を用い同
時に処理した。検量線を作るため、直径(圃)を化合物
の109.。濃度に対してプロットした。各実験試料に
おける化合物の崩漿中濃度は各モルモットの体重ゆ当り
血漿50ゴと仮定して期待されるものに対する百分率と
して表わした。
(b) 結果゛
第1図はt−FA、プラスミンA鎖/l −PAB@ハ
イブリッド及びハイブリッドのアシル化誘導体(4−ア
ミノベンソイル)のモルモット血流からの清掃率を示す
。
イブリッド及びハイブリッドのアシル化誘導体(4−ア
ミノベンソイル)のモルモット血流からの清掃率を示す
。
生体内血栓崩壊は一般に顕著な濃度のアクチベーターが
長時間存在することを必要とする長期に亘る事像である
と考えられている。t −PAの場合、その活性に非常
に速かに消失するが、ハイブリッドの活性に血流中非常
に延長される。薬力学における一層の改良がハイブリッ
ド蛋白質の4−アミノベンゾイル誘導体において見られ
る(約2分の半減期を有するt−PAの急速な清掃車様
相に比較して約106分のアシル化ハイブリッド0半減
期)。
長時間存在することを必要とする長期に亘る事像である
と考えられている。t −PAの場合、その活性に非常
に速かに消失するが、ハイブリッドの活性に血流中非常
に延長される。薬力学における一層の改良がハイブリッ
ド蛋白質の4−アミノベンゾイル誘導体において見られ
る(約2分の半減期を有するt−PAの急速な清掃車様
相に比較して約106分のアシル化ハイブリッド0半減
期)。
第1図はt−PA、プラスミシA鎖/1−PAB鎖ハイ
ブリッド及び4−アミノベンゾイル−プラスミンA鎖/
1−PAB鎖ハイブリッドのモルモット血流からの清掃
率2表わす。 代理人 弁理士 秋 沢 政 光 他1名 2重の浄S(内容に変fなし) −A311固 B寺P司(オ’jf−’+/+隻つ今)(金 円) 昭
和60年/ 月鰐日 才早 願昭、n−第ユク訣6?デ号 3、補正をする者 事件との関係 出屡質に 居 所 東京都中央区日本橋兜町12番1号大洋ビル8
、補正の内容 別紙の通りjt91b↑l−1?イア°
41(内炉:l<frvL)1鴎境補正書 昭和60年二月/日 1、事件の表示 特願昭59−272694号 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組威
螢 3、補正をする者 事件との関係 出願人 住 所 イギリス国ミドルセックス州、ブレンド7オー
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス(番地
なし) 名 称 ビーチャム・グループφピーエルシー4、代理
人 居 所 東京都中央区日本橋兜町12番1号6、補正の
対象 明細書〈発明の詳細な説明)7、補正の内容 別
紙の通り 一/7″L 補 正 の 内 容 1 、 明細書(タイ7°肇g)・よ3暫の)中(1)
M8頁6行〜7行目の「N−メチルアミノ、ベンゾイル
」を「N−メチルアミノベンゾイル」に改める。 (2)第13頁10行目のrp 9.OJを1pH9,
OJに改める。 自発手続補正書 昭和60年2月21・日 特許庁 長 官 殿 1、事件の表示 特願昭59−272694号 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及び それを含む医薬組成物 3、補正をする者 事件との関係 出願人 住 所 イギリス国ミドルセックス州、ブレン)7r−
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス(番地
なし) 名 称 ビーチャム・グループ・ピーエルシー4、代理
人 5、補正による増加する発明の数 なし補 正 の 内
容 1、明細書第8頁第1行目の「p−シ7ニノノ」を[p
−グアニジノ」に改める。 自発手続補正書 昭和60年2月26月 特願昭59−272694号 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成
物 3、補正をする者 事件との関係 出願人 住 所 イギリス国ミドルセックス州、ブレンド7オー
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス(番地
なし) 名 称 ビーチャム・グループ・ビーエルシー4、代理
人 6、補正の対象 明細書(発明の詳細な説明)7、補正
の内容 別紙の通り 補正の内容 1、明細書第33頁第9行の巨1 mg/kg)Jをr
(1ml/kg)Jに改める。 指令による手続補正帯 昭和60年7月 2日 特許庁 五、宮 殿 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成
物 3、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ウス(番地なし) 名 称 ビーチャム・グループ・ビーエルシー4、代理
人
ブリッド及び4−アミノベンゾイル−プラスミンA鎖/
1−PAB鎖ハイブリッドのモルモット血流からの清掃
率2表わす。 代理人 弁理士 秋 沢 政 光 他1名 2重の浄S(内容に変fなし) −A311固 B寺P司(オ’jf−’+/+隻つ今)(金 円) 昭
和60年/ 月鰐日 才早 願昭、n−第ユク訣6?デ号 3、補正をする者 事件との関係 出屡質に 居 所 東京都中央区日本橋兜町12番1号大洋ビル8
、補正の内容 別紙の通りjt91b↑l−1?イア°
41(内炉:l<frvL)1鴎境補正書 昭和60年二月/日 1、事件の表示 特願昭59−272694号 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組威
螢 3、補正をする者 事件との関係 出願人 住 所 イギリス国ミドルセックス州、ブレンド7オー
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス(番地
なし) 名 称 ビーチャム・グループφピーエルシー4、代理
人 居 所 東京都中央区日本橋兜町12番1号6、補正の
対象 明細書〈発明の詳細な説明)7、補正の内容 別
紙の通り 一/7″L 補 正 の 内 容 1 、 明細書(タイ7°肇g)・よ3暫の)中(1)
M8頁6行〜7行目の「N−メチルアミノ、ベンゾイル
」を「N−メチルアミノベンゾイル」に改める。 (2)第13頁10行目のrp 9.OJを1pH9,
OJに改める。 自発手続補正書 昭和60年2月21・日 特許庁 長 官 殿 1、事件の表示 特願昭59−272694号 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及び それを含む医薬組成物 3、補正をする者 事件との関係 出願人 住 所 イギリス国ミドルセックス州、ブレン)7r−
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス(番地
なし) 名 称 ビーチャム・グループ・ピーエルシー4、代理
人 5、補正による増加する発明の数 なし補 正 の 内
容 1、明細書第8頁第1行目の「p−シ7ニノノ」を[p
−グアニジノ」に改める。 自発手続補正書 昭和60年2月26月 特願昭59−272694号 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成
物 3、補正をする者 事件との関係 出願人 住 所 イギリス国ミドルセックス州、ブレンド7オー
ド、グレートウェストロード、ビーチャムハウス(番地
なし) 名 称 ビーチャム・グループ・ビーエルシー4、代理
人 6、補正の対象 明細書(発明の詳細な説明)7、補正
の内容 別紙の通り 補正の内容 1、明細書第33頁第9行の巨1 mg/kg)Jをr
(1ml/kg)Jに改める。 指令による手続補正帯 昭和60年7月 2日 特許庁 五、宮 殿 2、発明の名称 ハイブリッド蛋白質、その製法及びそれを含む医薬組成
物 3、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ウス(番地なし) 名 称 ビーチャム・グループ・ビーエルシー4、代理
人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)異なる二本鎖プロテアーゼの一本鎖にまたは同一
プロテアーゼの同−鎖に結合した二本鎖プロテアーゼの
一鎖からなり、ハイブリッド蛋白質中の鎖の少なくとも
1本に繊維素溶解活性プロテアーゼから銹導され、ハイ
ブリッド蛋白質に除去可能な遮断性基で遮断されていて
もよい繊維素溶解活性に必須な触媒部位を有することを
特徴とする繊維素溶解活性ハイブリット蛋白質。 C)異なるプロテアーゼのB鎖に結合した1種のプロテ
アーゼOA鎖からなる特許請求の範囲第(])項項記載
ハイブリッド蛋白質。 (3)少なくとも1種のプロテアーゼはセリンプロテア
ーゼである特許請求の範囲第(1)または(2)項に記
載りハイブリッド蛋白質。 (4)組織プラスミノゲンアクチベーターB鎖に結合し
たプラスミンA鎖、 ウロキナーゼブラスミノゲンアクチベーターB鎖に結合
した組織プラスミノゲンアクチベーターA鎖、 ウロキナーゼブラスミノゲンアクチベーターB鎖に結合
したプラスミンA鎖、 プラスミンB鎖に結合した組織プラスミノゲンアクチベ
ーターA鎖、または 組織プラスミノゲンアクチベーターB鎖に結合したアシ
ル化プラスミンA鎖 からなる特許請求の範囲第(1)〜(3)項のいずれか
一つの項に記載のハイブリッド蛋白質。 (5)組織ブラスミノゲンアクチベーターB鎖に結合し
た4−アミノベンゾイルプラスミンA鎖からなる特許請
求の範囲第(4)項記載のハイブリッド蛋白質。 (6)その活性部位にて速断されていてもよい1種のプ
ロテアーゼの一鎖をやはりその活性部位にて遮断されて
いてもよい他のプロテアーゼの−鎖と酸化条件下で混合
し、次いで所望ならば除去可能な遮断性基でいかなる触
媒部位も遮断することを特徴とする特許請求の範囲第(
1)〜(5)項のいずれか一つの項に記載1)ハイブリ
ッド蛋白質の製造方法。 (7)透析下で行なわれる特許請求の範囲第(6)項記
載の方法。 (8)各蛋白質の遺伝情報(DNA配列)を取り、これ
全切断及び結合することによりハイブリッド蛋白質のた
めの新しいDNAコードづけを構成しかつこのDNAを
原核動物またに真核動物宿主中に表現し、次いで所望な
らば除去可能な遮断性基で触媒部位を遮断することを特
徴とする特許請求の範囲第(1)〜(5)項のいずれか
一つの項に記載のハイブリッド蛋白質の製造方法。 (9)特許請求の範囲第(1)項記載の繊維素溶解活性
ハイブリッド蛋白質を医薬として適当な担体と組合せて
含有することを特徴とする医薬組成物。 (10)血栓症系疾病の治療に使用するための特許請求
の範囲第(1)項記載の繊維素溶解活性バイブリド蛋白
質。
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