JPS60248626A - Preventive and remedy for infectious disease or pseudomonas aeruginosa - Google Patents

Abstract

PURPOSE:A preventive and remedy showing improved effect on infectious diseases of Pseudomonas aeruginosa, containing a monoclonal antibody having specific affinity for an antigen classified by serotype of Pseudomonas aeruginosa and directly aggregating activity on molds of Pseudomonas aeruginosa. CONSTITUTION:A preventive and remedy of infectious diseases of Pseudomonas aeruginosa containing at least one monoclonal antibody (derived from mouse or man), being reacted with only a strain belonging to one group among molds classified by serotype of Pseudomonas aeruginosa of A-M groups by serological classification, not being reacted with strains belonging to the other groups (antigen specificity classified by serum), having directly aggregating activity on molds of Pseudomonas aeruginosa, having a globulin class belonging to IgG. The monoclonal antibody on Pseudomonas aeruginosa is prepared by cell fusion method or transformation method of B cell with EB virus.

Description

【発明の詳細な説明】 〔■〕発明の背景 本発明は緑膿菌減染症の予防治療に有効性を示すモノク
ローナル抗体に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [■] Background of the Invention The present invention relates to a monoclonal antibody that is effective in the preventive treatment of Pseudomonas aeruginosa hyposmosis.

緑膿菌（以下、シュードモナス・アエルギノーサという
ことがある）は自然界に広く存在し、水、下水等又ヒト
、動物の口腔、腸内からも高率に見出される。この菌が
病原性を発揮するのはこの菌自体の菌力による一般減染
患者におけるよりもむしろ減染抵抗の低下した患者、即
ち癌患者、免疫抑制療法下の人、移植患者、熱傷患者お
よび新生児ｅｔｃである。Pseudomonas aeruginosa (hereinafter sometimes referred to as Pseudomonas aeruginosa) exists widely in nature, and is found at high rates in water, sewage, etc., and also in the oral cavity and intestine of humans and animals. This bacterium exerts pathogenicity not in general attenuated patients due to the bactericidal activity of the bacterium itself, but rather in patients with reduced attenuation resistance, such as cancer patients, people on immunosuppressive therapy, transplant patients, burn patients, and others. Newborns etc.

現在、緑膿菌減染症は最も治療の困難な減染症と考えら
れている。すなわち、緑膿菌はこれまで常用されて来た
抗生物質のほとんどすべてに対して耐性を示すばかりで
なく、近年開発された抗生物質に対しても容易に緑膿菌
が耐性型に誘導される症例が多いからである。又、抗生
物質療法の限界に立って、宿主側の緑膿菌処理能力の増
強をめざした菌体成分による減染防御剤すなわちワクチ
ンの開発、例えば、１３種類以上ある血清型別緑膿菌の
表布抗原をそれぞれ精製して混合した緑膿菌多価ワクチ
ンや緑膿菌の葡清学的共通抗原としてタンパクを主成分
とするＯＥＰ、あるいはＯＥＰ　に重曹から調製したプ
ロテアーゼトキソイド、エラスターゼトキソイドあるい
はエクソトキソイドを加えた３種あるいは４種混合ワク
チン等がある。Currently, Pseudomonas aeruginosa is considered to be the most difficult disease to treat. In other words, not only is Pseudomonas aeruginosa resistant to almost all antibiotics that have been commonly used, but it is also easily induced to become resistant to antibiotics that have been developed in recent years. This is because there are many cases. In addition, in view of the limitations of antibiotic therapy, we are developing anti-infection protection agents, or vaccines, using bacterial body components, with the aim of increasing the host's ability to treat Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa multivalent vaccine prepared by purifying and mixing surface cloth antigens, OEP whose main component is protein as a common chemical antigen of Pseudomonas aeruginosa, or protease toxoid, elastase toxoid, or exoprotease prepared from baking soda in OEP. There are three or four types of mixed vaccines that contain toxoids.

しかしながら、いずれのワクチンも減染防御能あるいは
安全性が不十分で実用性のあるすぐれたものが待望され
ていると言っても過言でない。さらに、健常人の血清か
ら製造したヒト血清免疫グロブリン製剤の受働免疫によ
る免疫グロブリン療法も研究されているが実際の製剤中
には緑膿菌に対する抗体価が低いものが多（、その予防
・治療効果を疑問視する向きも少なくない。However, it is no exaggeration to say that none of these vaccines has sufficient protection against infection or is sufficiently safe, and that a better, more practical vaccine is awaited. Furthermore, immunoglobulin therapy using passive immunization using human serum immunoglobulin preparations prepared from the serum of healthy individuals has been studied, but many of the actual preparations have low antibody titers against Pseudomonas aeruginosa (and their prevention and treatment). There are many people who question its effectiveness.

〔■〕発明の概要 １要　旨 本発明は緑膿菌血清型別抗原に対して特異的な親和性を
もち、かつ緑膿菌菌体に対して直接凝集活性を含せもつ
グロブリンクラスがＩｇＧからなるモノクローナル抗体
を作り単品又はそれらを組み合せることにより予防およ
び治療剤に使用して目的を達成しようとするものである
。[■] Summary of the Invention 1 Summary The present invention provides that the globulin class that has specific affinity for Pseudomonas aeruginosa serotype antigens and has direct agglutination activity against Pseudomonas aeruginosa cells is IgG. The aim is to create monoclonal antibodies consisting of the following and use them as preventive and therapeutic agents, either singly or in combination, to achieve this purpose.

目的とする緑膿菌に対するモノクローナル抗体は緑膿菌
血清型別画で免疫したマウスの肺細胞とマウスミエロー
マ細胞（腫瘍細胞株）との細胞融合に一、、１す・・イ
ブリドーマを作らせたり、ヒトモノクローナル抗体の場
合は、ヒト由来Ｂ細胞をＥＢウィルスでトランスフオー
ムさせたりして抗体産生細胞を作り、それが産生する抗
体の中から血清型別抗原に対して特異的に反応するもの
で該凝集活性をもち、グロブリンクラスがＩｇＧクラス
からなる抗体を選択して作製される。The target monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa is produced by cell fusion of mouse myeloma cells (tumor cell line) with lung cells of mice immunized with Pseudomonas aeruginosa serotypes to produce hybridomas. In the case of human monoclonal antibodies, antibody-producing cells are created by transforming human-derived B cells with EB virus, and the antibodies produced by these cells react specifically to antigens of different serotypes. It is produced by selecting an antibody that has the agglutination activity and whose globulin class is IgG class.

２、効　果 本発明によるモノクローナル抗体の単剤又は２剤以上の
組み合せ製剤により、緑膿菌減染症に対するすぐれた予
防治療効果が達成される。2. Effects The monoclonal antibodies of the present invention, either alone or in combination, can achieve excellent preventive and therapeutic effects against Pseudomonas aeruginosa hypoinfection.

本発明で注目すべきことは、緑膿菌の血清型別抗原に対
して特異に反応するモノクローナル抗体の中で、グラブ
リンクラスがＩｇＧでかつ緑膿菌菌体に直接凝集活性を
もつ抗体は、その抗体と反応する緑膿菌に対１−で極め
て低濃度・低用量で予防、および治療効果を発揮するこ
とを。What should be noted in the present invention is that among the monoclonal antibodies that specifically react with the serotype antigens of Pseudomonas aeruginosa, the antibodies whose glabulin class is IgG and have direct agglutination activity on Pseudomonas cells are , which exhibits prophylactic and therapeutic effects against Pseudomonas aeruginosa that reacts with the antibody at extremely low concentrations and doses.

本発明者らがはじめて見い出したことである。This was discovered for the first time by the present inventors.

〔■〕発明の詳細な説明 １、使用緑膿菌 本発明では使用緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主催の血清
型別検討委員会の決定（１９７５）による血清学的分類
に従った（表１）。[■] Detailed description of the invention 1. Pseudomonas aeruginosa used In the present invention, the classification of Pseudomonas aeruginosa used was in accordance with the serological classification determined by the serotype review committee sponsored by the Pseudomonas aeruginosa research group (1975). (Table 1).

２、モノクローナル抗体の製造 本発明による緑膿菌に対するモノクローナル抗体は細胞
融合法とＤＢウィルスによるトランスフォーメーション
法によって作製される。2. Production of monoclonal antibody The monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa according to the present invention is produced by cell fusion method and transformation method using DB virus.

細胞融合法によるモノクローナル抗体の作製は基本的に
はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法に準拠した
方法（Ｊ　・Ｉｒｒｍｕｎｏｌ　％ｅｔｈｏｄｓ　３９
．２８５−３０８（１９８０）に従って作製した。この
方法によるモノクローナル抗体の作製は一般に（１）準
備、（２）細胞融合、（３）クローニング、（４）モノ
クローナル抗体の検出、（５）大量モノクローナル抗体
の調製、（６）抗体の精製、の工程からなっている。The production of monoclonal antibodies by cell fusion method is basically based on the method of Kohler and Milstein et al.
．． 285-308 (1980). The production of monoclonal antibodies by this method generally includes (1) preparation, (2) cell fusion, (3) cloning, (4) detection of monoclonal antibodies, (5) preparation of large quantities of monoclonal antibodies, and (6) purification of antibodies. It consists of processes.

次に各工程につき詳細な説明を加える。Next, we will add detailed explanations for each step.

（１）準　備 ヒポキカンチン、アミノプテリン、およびチミジン（以
下１（Ａ、Ｔと（・う）含有溶液を調整する。(1) Preparation A solution containing hypochycanthin, aminopterin, and thymidine (hereinafter referred to as 1 (A, T) and (U) is prepared.

これらはいずれも１００倍濃鹿の溶液として貯蔵として
おくと便利である。とくに、ヒポキサンチンおよびチミ
ジン（ＨＴ）は合せてストック溶液を作製すると便利で
ある。各ストック溶液はフィルター沢過（０，２μメン
ブランフイルタ→により・滅菌し、適当量に小分けして
一２０℃にて凍保在する。次に、市販のダルベツコ、ｍ
培地、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレフト
マイシン、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール
、牛胎児血清からなる完全培地（以下、１囮）を調製す
る。これは４℃で６週間保存できる。上記ダルベツコＭ
ＥＭ培地の代りに市販のＲＰＭＩ−１６４０培地を用い
ることも可能である。It is convenient to store all of these as 100 times concentrated solutions. In particular, it is convenient to prepare a stock solution by combining hypoxanthine and thymidine (HT). Each stock solution was sterilized by filter filtration (0.2μ membrane filter →), divided into appropriate amounts, and stored frozen at -20°C.Next, commercially available Dulbecco, m
A complete medium (hereinafter referred to as 1 decoy) consisting of medium, sodium pyruvate, penicillin-streftomycin, L-glutamine, 2-mercaptoethanol, and fetal bovine serum is prepared. This can be stored at 4°C for 6 weeks. Darbetsuko M above
It is also possible to use commercially available RPMI-1640 medium instead of EM medium.

次にＤＭＢＭＫＨＡＴ又はＨＴストック溶液を加えたＨ
ＡＴ培地、又はＨＴ培地を調製する。そして別に再蒸留
水中にＮａＣｌ　、　ＫＣＩ　、　Ｎａｐ、　、）ＪＰ
Ｏ４，２Ｈ２０、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｉ−（２０１グルコ
−＼、フェノールレッドを含有するＧＫＮ塩類溶液を用
意する。Then DMBMKHAT or HT stock solution was added to H
Prepare AT medium or HT medium. and separately NaCl, KCI, Nap, )JP in redistilled water.
A GKN salt solution containing O4,2H20, NaH2PO4, I-(201 Gluco-\, and phenol red) is prepared.

細胞融合にはＨＶＪ法とポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）法の二つの方法があるが、増り扱い方等の点で後者
の方法が有用性が高い。ＰＥＧにはその平均分子量によ
って種々の種類があるが、通常はＰＥＧ−１０００、Ｐ
Ｅａ−，４ｏｏｏ　、ＰＥＧ−６０００の中から適宜選
んで用いられる。融合する細胞や目的によってどの分子
量のものを用いるかは異なってくるが、一般に分子量が
小さい程粘性が少なく扱いやすいが細胞毒性は大きくな
る。細胞融合率および細胞毒性はＰＢＧ　の濃度にとく
に依存する。又メーカーごとのＬｏｔ差もあるので以上
の要点を考えて用いるＰＥＧを決める。用いるＰＥＧの
濃度は一般に、４２．５％〜５０％濃度の間で使用され
る。又ジメチルスルフォオキサイド（ＤＭＳＯ）やポリ
ーＬ−アルギニンは融合効率を高めることが知られてい
る。For cell fusion, the HVJ method and polyethylene glycol (PE) are used.
G) There are two methods, but the latter method is more useful in terms of how to handle increases. There are various types of PEG depending on their average molecular weight, but usually PEG-1000, P
It is appropriately selected from among Ea-, 4ooo, and PEG-6000. The molecular weight to be used will vary depending on the cells to be fused and the purpose, but in general, the smaller the molecular weight, the less viscous and easier to handle, but the greater the cytotoxicity. Cell fusion rate and cytotoxicity are particularly dependent on the concentration of PBG. Also, since there are lot differences between manufacturers, the PEG to be used is determined by considering the above points. The concentration of PEG used is generally between 42.5% and 50% concentration. Furthermore, dimethyl sulfoxide (DMSO) and poly-L-arginine are known to increase fusion efficiency.

しかし、ＤＭＳ　ＯはＰＥＧ溶液の細胞毒性を高めるの
で融合時間を短かくしたり、融合操作後の洗浄をくり返
し十分行うなどの工夫が必要である。However, since DMSO increases the cytotoxicity of the PEG solution, it is necessary to take measures such as shortening the fusion time and repeatedly and thoroughly washing after the fusion operation.

ハイプリドーマの増殖促進に用いられるフィーダー細胞
としては、マウス腹腔マクロファージ又は牌リンパ球が
好適である。いずれの場合も無菌的に採増して細胞浮遊
液を調製する。培養液にて３回洗浄して遠心を室温にて
４００Ｘｇ、１０分間行なう。洗浄後トリバンプルー液
で生細胞数をカウントする。生存率は常に９５％以上の
ものを用いる。As feeder cells used to promote proliferation of hybridomas, mouse peritoneal macrophages or tile lymphocytes are suitable. In either case, collect cells aseptically and prepare a cell suspension. Wash three times with culture solution and centrifuge at 400×g for 10 minutes at room temperature. After washing, count the number of living cells using Trivan blue solution. A survival rate of 95% or higher is always used.

（２）細胞融合 細胞融合に用いる抗体産生細胞をどの動物由来のものを
用いるかは、融合に使用するＨＡＴ培地に減少性のパー
トナ−細胞、すなわち腫瘍細胞株によって異なるが、一
般にマウスとラットが多く用いられている。マウス腫瘍
細胞株とウサギやヒトの抗体産生リンパ球の融合は、ノ
ーイプリドーマの出現頻度の点で効率がよくない場合が
多い。本発明では、以下の理由でマウス由来の抗体産生
リンパ球を用いている。マウス腫瘍細胞株ではすべての
免疫グロブリン産生能を喪失しているものが利用しうろ
こと、また、該細胞株はマウス由来の抗体産生リンパ球
との融合効率が高く、ハイプリドーマの出現頻度も良い
こと、さ゛らにマウスのＩｇＧはクラスを問わス、スべ
てプロティンＡと結合するため抗体の精製が容易に行い
得ることが知られているからである。(2) Cell fusion The animal-derived antibody-producing cells used for cell fusion vary depending on the reduced partner cells, i.e. tumor cell lines, in the HAT medium used for fusion, but in general mice and rats are used. It is often used. Fusion of mouse tumor cell lines and rabbit or human antibody-producing lymphocytes is often inefficient in terms of the frequency of noiplidomas. In the present invention, mouse-derived antibody-producing lymphocytes are used for the following reasons. Mouse tumor cell lines that have lost all immunoglobulin-producing ability are useful, and these cell lines have a high fusion efficiency with mouse-derived antibody-producing lymphocytes and a high incidence of hybridomas. In particular, it is known that mouse IgG, regardless of class, binds to protein A, making it easy to purify antibodies.

マウスの系統では、ＢＡＬＢ／Ｃマウスが最も好適であ
り、抗原によっては他の系統のマウスを用いることも可
能である。抗体産生リンパ球の採増には雌性で８−１２
週令のマウスが最適である。また、本発明のモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマの増得のために細胞融合に
供するマウスの抗体産生リンパ球は第１表のＡ　＝　Ｍ
群に属する緑膿菌菌株をそれぞれ培養し、ホルマリン処
理して得られる無毒化洗浄菌体あるいは該菌体から得ら
れるリポ多糖体画分を抗原としてマウスに皮下あるいは
腹腔内投与により免疫することによって得ることが出来
る。この際、免疫に用いられるアジュバントとしては、
フロイントのアジュバント、ミョウバン、百日咳菌等を
用いることが出来る。抗原の種類によって用いるアジュ
バントや投与ルート、回数、抗原量が異なってくるが、
緑膿菌菌体を抗原とする場合、ｌ−１００μｇの抗原を
等量の７０インドの不完全アジュバントで油中水型して
腹腔投与を２〜５回行ない、最終免疫後３〜４日後日夕
マウス蔵を採増して細胞融合に用いる。なお、細胞融合
の前処置として被免疫マウスの牌蔵リンパ球をあらかじ
め試験管内で抗原刺激するか、抗原と共にレントゲン照
射したマウス宿主内にトランスファーすることは目的と
する抗体産生細胞数を非常に増加させることになり、結
果的に効率良くハイブリドーマを得ることが出来る。Among mouse strains, BALB/C mice are most preferred, and other mouse strains may be used depending on the antigen. 8-12 in females to collect antibody-producing lymphocytes.
Week-old mice are best. In addition, antibody-producing lymphocytes of mice to be subjected to cell fusion to obtain monoclonal antibody-producing hybridomas of the present invention are A = M in Table 1.
By culturing Pseudomonas aeruginosa strains belonging to each group, and immunizing mice by subcutaneous or intraperitoneal administration using detoxified washed bacterial cells obtained by formalin treatment or a lipopolysaccharide fraction obtained from the bacterial cells as an antigen. You can get it. At this time, the adjuvant used for immunization is
Freund's adjuvant, alum, Bordetella pertussis, etc. can be used. Depending on the type of antigen, the adjuvant, administration route, frequency, and amount of antigen used will differ.
When Pseudomonas aeruginosa cells are used as the antigen, 1-100 μg of the antigen is prepared in water-in-oil form with an equal amount of 70 India incomplete adjuvant and administered intraperitoneally 2 to 5 times. Harvest mouse stock and use it for cell fusion. In addition, as a pretreatment for cell fusion, stimulating the immunized mouse's stored lymphocytes with antigen in vitro or transferring them together with the antigen into a mouse host that has been irradiated with X-rays can greatly increase the number of target antibody-producing cells. As a result, hybridomas can be obtained efficiently.

細胞融合に用いられるＨＡＴ　培地に減少性の腫瘍細胞
株は、本発明の場合、ｐ３−ＮＳＩ／１＝Ａｇ４．ｔ（
略号Ｎ５−１）あるいはＰ　３−Ｘ　６３−Ａ　ｇ８、
ｕｌ（略号Ｐ３’ｕｌ）などの通常細胞融合に用いられ
るマウス細胞株が好適である。細胞融合は、腫瘍細胞が
もっとも良く増殖している時（１０４〜５刈０５／ｌ）
に行なう。In the present invention, the HAT medium-reduced tumor cell line used for cell fusion is p3-NSI/1=Ag4. t(
Abbreviation N5-1) or P 3-X 63-A g8,
Mouse cell lines commonly used for cell fusion such as ul (abbreviation P3'ul) are suitable. Cell fusion occurs when tumor cells are proliferating best (104-505/l)
go to

次に実際の細胞融合は次の如く行なう。Next, actual cell fusion is performed as follows.

免疫が成立した動物の牌蔵を無菌的にとり出し、抗体産
生細胞を含むリンパ球液を作成する。パートナ−細胞の
腫瘍細胞に対して約１０倍量のリンパ球液を混和して遠
心し、吸引にて培養液を除去するペレットを解きほぐし
、あらかじめ３７℃に温めておいた４５％ＰＥＧを１ｍ
ｌ加える。The plaque from an immunized animal is removed aseptically and a lymphocyte fluid containing antibody-producing cells is prepared. Mix approximately 10 times the amount of lymphocyte fluid with the tumor cells of the partner cells, centrifuge, and remove the culture medium by aspiration. Loosen the pellet, and add 1 m of 45% PEG pre-warmed to 37°C.
Add l.

細胞同士が良く衝突するように静かに試験管をときどき
振るようにする。５〜６分後、ＤＭＥＭ約５０ｍ１を加
えて反応を止める。遠心を行い上清を吸引除去する。３
７℃に温めておいたＨＡＴ培地をゆっくり加え、大きな
、細胞塊を解きほぐす。Gently shake the test tube from time to time to ensure that the cells collide well with each other. After 5-6 minutes, about 50 ml of DMEM is added to stop the reaction. Centrifuge and aspirate the supernatant. 3
Slowly add HAT medium warmed to 7°C to loosen large cell clumps.

ついで冴ウェル又は９６ウエルの培養プレートに分注す
る。２〜３日毎に培地の半分をＨＡＴ　培地で交換する
。約２週間この操作過程をくり返した後、ハイブリドー
マの増殖が認められたウェルの培養上清につき種々のア
ッセイ法により目的抗体の産生の有無をしらべ、抗体産
生ハイブリドーマを検索する。Then, dispense into Saewell or 96-well culture plates. Replace half of the medium with HAT medium every 2-3 days. After repeating this procedure for about two weeks, the culture supernatants of the wells in which hybridoma growth was observed are examined for the production of the target antibody using various assay methods to search for antibody-producing hybridomas.

（３）クローニング ハイブリドーマが確立したら出来るだけ早くクローニン
グを行う。方法としては、ノ・イブリドーマが３個７ｍ
ｌとなるよう一通常培地で希釈し、９６ウエルのプレー
トに０．２ｍｌ／ウェル毎分注することからなる限界希
釈法、ＤＭＢＭ中に浮遊させたハイブリドーマの懸濁液
とＤＭＢＭ−寒天を等量づつ混和してベトリゾイソシュ
にまき、３７℃のＣＯ２培養器にて約１０日間培養し、
生じたコロニーを裸眼もしくは低倍率の実体顕微鏡で観
察し、パスツールピペットにてつり上げることからなる
軟寒天法、操作が簡単で、クローニングの効率が高いフ
ィブリンゲルを利用したフィブリンゲル法、又これらの
方法とは別に抗原と結合させたフルオレヌセントミクロ
スフエアーをハイブリドーマと反応させて目的抗体産生
ハイプリドーマをシングルクローンとして選別するセル
ソーター法等をいずれも用いることが出来る。(3) Cloning Once the hybridoma is established, perform cloning as soon as possible. As a method, 3 pieces of 7m
The limiting dilution method consists of diluting the suspension of hybridomas suspended in DMBM with DMBM-agar in equal volumes and dispensing 0.2 ml/well into a 96-well plate. The mixture was mixed one by one, spread on Betrizois, and cultured in a CO2 incubator at 37°C for about 10 days.
The soft agar method, which involves observing the resulting colonies with the naked eye or a low-magnification stereomicroscope and lifting them with a Pasteur pipette; the fibrin gel method, which uses fibrin gel, which is easy to operate and has high cloning efficiency; Apart from this method, any method can be used, such as a cell sorter method in which hybridomas are allowed to react with fluorine cent microspheres bound to an antigen, and hybridomas producing the desired antibody are selected as single clones.

本発明者らは、経験的に操作が簡便な限界希釈比か衾田
１て〃ローニンゲシ行ｔｒ１て℃する。The present inventors empirically determined the limit dilution ratio, which is easy to operate, at 1°C and 1°C.

（４）モノクローナル抗体の検出 モノクローナル抗体の検出のためのアッセイ方法として
は以下のような方法がある。１つはプロティンＡを結合
させた赤血球を用いた方法で、特異抗体を検出する方法
の中で優れた鋭敏度、特異性を示す方法である。また凝
集の程度を観察し抗体価を決める凝集反応法、グロブリ
ンクラスあるいはサブクラスを決めるのに最も簡単な方
法で、一般に培養上清を１０倍程度濃縮しなければなら
ないが、放射能標識された上清を抗体で沈降させ、それ
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルなどで展開し確認す
ることも出来るオフタロニー法である。また、ポリビニ
ルクロライド製のＵ字型マイクロタイタープレートに抗
原もしくは細胞を固定しておき、そこへ培養上清を加え
インキュベートして抗原〜抗体反応させた後町又は酵素
で標識した抗マウス抗体あるいはＰｒｏｔｅｉｎＡを加
え洗浄後、各ウェル中の放射活性又は酵素活性を調べる
ラジオイムノアッセイ法や酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）
もある。(4) Detection of monoclonal antibodies Assay methods for detecting monoclonal antibodies include the following methods. One is a method using red blood cells bound to protein A, which shows excellent sensitivity and specificity among methods for detecting specific antibodies. In addition, the agglutination reaction method, which determines the antibody titer by observing the degree of agglutination, is the simplest method to determine the globulin class or subclass. This is an ophthalony method in which the supernatant can be precipitated with an antibody and then confirmed by developing it on a 5DS-polyacrylamide gel or the like. In addition, antigens or cells are immobilized on a U-shaped microtiter plate made of polyvinyl chloride, and culture supernatant is added thereto and incubated to cause an antigen-antibody reaction. After washing, radioimmunoassay or enzyme immunoassay (EIA) is used to examine radioactivity or enzymatic activity in each well.
There is also.

種々のアッセイ法の中で目的に合った方法を選択すれば
よい。基本的には短時間で、感度がよく安価であること
が重要なことである。本発明者らは、次のようなＥＩＡ
法を用いている。Among various assay methods, one may be selected that suits the purpose. Basically, what is important is that it be short, sensitive, and inexpensive. The present inventors conducted the following EIA
law is used.

すなわち、緑膿菌菌体を抗原としてメンブランフィルタ
−Ｋｌ定量ドツトして用い、これにノ・イブリドーマの
培養上清を反応させた後、ベルオキシターゼ標識ウサギ
抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社）を作用さ
せ酵素反応の呈色割合により抗体産生量を測定できるド
ノトイムノパインディングアソセイ法（ＤＩＢＡ法、Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１９　、１４
２　、１９８２　）を用いている。Specifically, Pseudomonas aeruginosa cells were used as antigens as membrane filter-Kl quantitative dots, and after reacting with the culture supernatant of a hybridoma, a rabbit anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with peroxidase (DAKO) was reacted. The donor immuno binding assay method (DIBA method, A
analytic biochem, 119, 14
2, 1982).

（５）大量モノクローナル抗体の調製 大量にモノクローナル抗体を調製する方法としては、拡
大培養法リポソーム；マイクロカプセルを利用した大量
培養法、またヌードマウスにハイプリドーマを移植し血
清中に出現してくる抗体を増得することからなる調製法
、さらにはプリスティンを前投与されたＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの腹腔内にノ・イブリドーマを移植しマウスの腹水
から硫安濃縮やＤＥＡＥ−セルロース、プロティンＡ−
セファロースなとのカラムで精製する調製方法等がある
がいずれも本発明に適用可能である。特に本発明におい
てはノ・イブリドーマを免疫抑制剤（プリスティン）で
前処置したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に移植し該ノ・
イブリドーマの増殖にともなって貯留する腹水から本ｉ
明のモノクローナル抗体を大量調製する方法を大量調製
に採用している。(5) Preparation of large amounts of monoclonal antibodies Methods for preparing large amounts of monoclonal antibodies include expansion culture methods, liposomes; large-scale culture methods using microcapsules, and antibodies that appear in the serum by transplanting hybridomas into nude mice. In addition, the preparation method consists of increasing the amount of ammonium sulfate, DEAE-cellulose, protein A- from the ascites of the mice by transplanting the hybridoma intraperitoneally into BALB/C mice pre-administered with pristine.
There are preparation methods such as purification using a column such as Sepharose, and any of these methods can be applied to the present invention. In particular, in the present invention, the No. 5 hybridoma is transplanted intraperitoneally into BALB/C mice pretreated with an immunosuppressant (pristine).
From ascites that accumulates due to the proliferation of ibridoma
We have adopted a method for large-scale preparation of monoclonal antibodies from Akira.

（６）抗体の精製 ■非特異的精製 腹水等からの本発明のモノクローナル抗体の精製はゲル
ｒ過法、イオン交換セルロースクロマトグラフィー、硫
酸アンモニウムによる塩析法などの公知の方法の組み合
わせにより行うことが出来る。(6) Purification of antibodies - Non-specific purification The monoclonal antibodies of the present invention can be purified from ascites etc. by a combination of known methods such as gel filtration, ion-exchange cellulose chromatography, and salting out with ammonium sulfate. I can do it.

■特異的精製 臭化シアンで活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア社）あるいはアフィゲル−１０（バイオラッド社）に
抗原を結合させ不溶化したカラムに免疫グロブリン画分
又は腹水を流込し抗体を結合させた後、尿素溶液などで
吸着抗体を溶出させて精製するアフィニテイクロマトグ
ラフィーも必要に応じて使用出来る。また本発明のモノ
クローナル抗体がＩｇＧの場合、フロティンＡを固定化
したアフィニティカラムを用いると精製が容易であると
いう点で推奨される。■Antigens were bound to Sepharose 4B (Pharmacia) or Affigel-10 (Bio-Rad) activated with specific purified cyanogen bromide, and the immunoglobulin fraction or ascites was poured into a column to insolubilize it, and antibodies were bound to it. Affinity chromatography, which purifies the adsorbed antibody by eluating it with a urea solution or the like, can also be used if necessary. Furthermore, when the monoclonal antibody of the present invention is IgG, it is recommended to use an affinity column on which Flotin A is immobilized because purification is easy.

３、ヒトモノクローナル抗体の製造 本発明による緑膿菌に対するヒトモノクローナル抗体は
ヒ）Ｂ細胞をＢＢウィルスでトランスフオームすること
により作られる。3. Production of human monoclonal antibodies Human monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa according to the present invention are produced by transforming human B cells with BB virus.

一般にヒトモノクローナル抗体作製法としては、■ヒト
ーヒト　ハイプリドーマ法　■マウスーヒト　ハイプリ
ドーマ法　■ＥＢウィルスによるトランスノオーメーシ
ョン法等カアル。In general, human monoclonal antibody production methods include ■Human-to-human hybridoma method ■Mouse-human hybridoma method ■Transnoemation method using EB virus, etc.

■の方法は現在までのところ、すぐれたヒトミエローマ
細胞が存在していないため目的とす・るハイプリドーマ
増殖性の悪さや遺伝子の欠落等があり完成度の低い技術
となっている。■の方法はマウス−ヒトのため遺伝子が
組み込まれても直ちに遺伝子の欠落現象が起きて安定な
株の樹立がむずかしいという問題を含んでいる。Method (2) has so far been an incomplete technique due to the lack of excellent human myeloma cells, poor proliferation of the desired hybridoma, and missing genes. Method (2) involves the problem that, since the method is mouse-human, even if the gene is inserted, the gene deletion phenomenon occurs immediately, making it difficult to establish a stable strain.

そこで本発明者らは比較的安定な抗体産生細胞株を作製
することが出来るといわれているＥＢウィルストランス
フォーメーション法でヒト由来の本発明のモノクローナ
ル抗体を作製した。Therefore, the present inventors produced the human-derived monoclonal antibody of the present invention using the EB virus transformation method, which is said to be capable of producing relatively stable antibody-producing cell lines.

ヒ）Ｂ細胞の材料は血清中に抗緑膿菌抗体の産生がみら
れる健常人の末梢血や患者の摘出リンパ節（例えば扁桃
腺）を使用し、出来るだけＢ細胞濃度を高めるためファ
イコール・コンレイ比重遠心法などによりＢ細胞を含む
単核細胞画分を濃縮して用いた。h) For B cell materials, peripheral blood of healthy individuals with production of anti-Pseudomonas aeruginosa antibodies in the serum and removed lymph nodes (e.g. tonsils) of patients are used. - Mononuclear cell fraction containing B cells was concentrated and used by Conley gravity centrifugation method.

ＥＢウィルスによるヒトＢ細胞のトランスフォーメーシ
ョン法の基本術式は公知の方法（たとえばＮａｔｕｒｅ
　２６７．５２’、１９７７、第４回日本免疫学会総会
記録３９９頁、１９７４）に準拠し、ＥＢウィルス持続
産生細胞株の培養上清をウィルス源としてヒ）Ｂ細胞に
感染させ、増殖型に変異した細胞集団の中からＤＩＢＡ
法（この場合第２抗体としてカッペル社のベルオキシタ
ーゼ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体を使用）によ
り目的抗体産生細胞集団をスクリーニングし、さらに公
知の抗原感作ヒツジ赤血球を用いたロゼツト形成法およ
び軟寒天コロニー形成法によりモノクローンになった本
発明のモノクローナル抗体産生クローン細胞株をホ得し
た。The basic technique for transforming human B cells using EB virus is a known method (for example, Nature
267.52', 1977, Record of the 4th Annual Meeting of the Japanese Society of Immunology, p. 399, 1974), B cells were infected using the culture supernatant of a cell line that continuously produces EB virus as a virus source, and mutated into a proliferative type. DIBA from the cell population
(in this case, using Kappel's peroxidase-labeled goat anti-human immunoglobulin antibody as the second antibody), the target antibody-producing cell population was screened, and then a rosette formation method using known antigen-sensitized sheep red blood cells and soft agar. A monoclonal monoclonal antibody-producing clonal cell line of the present invention was obtained by a colony formation method.

かくして得られた該抗体産生クローン細胞株からの本発
明のモノクローナル抗体の大量調製は、スピンナーフラ
スコ、ローラーボトルを用いた大量培養等により培養液
を集め、これをマウスモノクローナル抗体の精製法で述
べたと同様の方法で精製することが可能である。The monoclonal antibody of the present invention can be prepared in large quantities from the antibody-producing clonal cell line thus obtained by collecting the culture fluid by mass culturing using spinner flasks, roller bottles, etc., and then using it as described in the method for purifying mouse monoclonal antibodies. It is possible to purify in a similar manner.

なお、本発明のモノクローナル抗体は、上述のようにマ
ウスおよびヒト由来の緑膿菌の血清型別抗原に対して特
異的な親和性を有しかつ緑膿菌菌体に対して直接凝集活
性を持つグロブリンクラスがＩｇＧからなるものである
が、これらの性質は下記に示す方法により規定すること
が出来る。すなわち、緑膿菌の廂清型別抗原に対する特
異的な親和性とは第１表のＡ、−Ｍ群の緑膿菌の血清型
別画のうち、１つの群に属する菌株とのみ反応し、他の
群に属する菌株とは反応しないこと（例えばＡ群の菌と
のみ反応し、他のＢ−Ｍ群とは反応しないこと）を意味
している。As mentioned above, the monoclonal antibody of the present invention has specific affinity for the serotype antigen of Pseudomonas aeruginosa derived from mice and humans, and has direct agglutination activity against Pseudomonas aeruginosa cells. The globulin class it has is IgG, and these properties can be defined by the method shown below. In other words, the specific affinity for the serotype antigen of Pseudomonas aeruginosa means that it reacts only with strains belonging to one of the serotypes of Pseudomonas aeruginosa in groups A and -M in Table 1. , meaning that it does not react with strains belonging to other groups (for example, it reacts only with bacteria of group A and does not react with other groups B-M).

また、本発明のモノクローナル抗体の緑膿菌菌体に対す
る直接凝集活性とは実施例ＩＫ示すように、９６ウエル
の■底マイクロプレート中で緑膿菌のホルマリン処理又
は加熱処理による死菌体をそれぞれ直接凝集する抗体活
性を意味する。In addition, the direct agglutination activity of the monoclonal antibody of the present invention against Pseudomonas aeruginosa cells refers to the direct agglutination activity of Pseudomonas aeruginosa cells, as shown in Example IK. Refers to antibody activity that directly aggregates.

さらに本発明のモノクローナル抗体のグロブリンクラス
は、マウス由来の場合、該精製抗体の七フアクリル８３
００　（ファルマシアネヒ）ヲ用いたゲル？過パターン
およびパーオキシターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（
カノヘル社）ニよるＤＩＢＡ法、ヒト由来の場合は該精
製抗体の七フアクリルＳ−３００によるゲル濾過パター
ンおよびパーオキシターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（
カッペル社）ＫよるＩ）ＩＢＡ法でそれぞれＩｇＧと同
定されたものを意味している。Furthermore, when the globulin class of the monoclonal antibody of the present invention is derived from a mouse, the purified antibody has a heptaphryl 83
Gel using 00 (Pharmacianehi)? Perpatterned and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (
Kanohel Co., Ltd.) DIBA method, and in the case of human origin, the gel filtration pattern of the purified antibody using heptaphacryl S-300 and the peroxidase-labeled goat anti-human IgG antibody (
Kappel Co., Ltd.) I) IBA method, respectively, means those identified as IgG.

ソー発明のモノクローナル抗体が緑膿菌感染に対してす
ぐれた予防および治療効果を示すことは試験例に例示す
る如くであるが、該抗体を緑膿１衣感染症の予防、治療
剤として用いる場合は注射剤の型で用〜・るのが好まし
い。以下に実施例及び試験例を例示し、本発明をさらに
具体的に説明する。As exemplified in the test examples, the monoclonal antibody of the Thor invention exhibits excellent preventive and therapeutic effects against Pseudomonas aeruginosa infection. is preferably used in the form of an injection. EXAMPLES The present invention will be explained in more detail by illustrating Examples and Test Examples below.

実施例１　血清型　緑膿菌に対するマウスモノクローナ
ル抗体の作製とその性質 １）使用菌株 第１表の緑膿菌Ｂ型はＤＬＯＯ２株Ｅ型ｌＩＤ１１３０
株、Ｇ型ＡＴＣＣ１０１４５株、■型ｌＩＤ１０１．０
株をそれぞれ使用した。Example 1 Serotype: Preparation of mouse monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa and its properties 1) Strains used Pseudomonas aeruginosa type B in Table 1 is DLOO2 strain E type ID1130
Strain, type G ATCC10145 strain, type ID101.0
Each strain was used.

２）菌の培養 各菌型録膿菌を普通寒天培地で３７℃１夜培養し、増殖
した菌体を生理食塩液に懸濁し、その０．５ｍｌを重量
らの合成培地（Ｊ　、Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、、８，３　。2) Cultivation of bacteria Each type of P. aeruginosa was cultured overnight at 37°C on an ordinary agar medium, the grown cells were suspended in physiological saline, and 0.5 ml of it was added to the synthetic medium of Weight et al. (J, Biochern, , 8, 3.

７］、１．１．９７８）１５０１η１を含む坂ロフラス
コに接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。培養後
、坂ロフラスコ内に０．３％濃度になるようホルマリン
を加えて充分混合し室温に１時間放置した。ついで培養
液を遠心分離（１２０００Ｘｇ　３０分間）して菌体を
集め、さらに生理食塩液と蒸留水で洗浄処理と遠心分離
を繰返してホルマリン処理菌体を得た。7], 1.1.978) was inoculated into a Sakaro flask containing 1501η1, and cultured with shaking at 37°C for 16 hours. After culturing, formalin was added to the Sakaro flask to a concentration of 0.3%, thoroughly mixed, and left at room temperature for 1 hour. The culture solution was then centrifuged (12,000×g for 30 minutes) to collect bacterial cells, and washing with physiological saline and distilled water and centrifugation were repeated to obtain formalin-treated bacterial cells.

３）免疫 各菌型録膿菌の０．３％ホルマリン処理菌体をフロイン
トの不完全アジュバントでエマルジョンとし、１週問お
きに計５回ＢＡＬ　Ｂ／Ｃマウスの腹腔内に投与して免
疫１〜た。3) Immunization Immunization 1 was carried out by making an emulsion of 0.3% formalin-treated bacterial cells of each type of P. aeruginosa in incomplete Freund's adjuvant and intraperitoneally administering it to BAL B/C mice 5 times every other week. ~Ta.

４）細胞融合 最終免疫の４日後のマウスの牌細胞５　Ｘ　１０８個と
Ｎ５−Ｌマウスミエローマ細胞５　Ｘ　１．０’（［ｆ
ｆｉとの５０％ポリエチレングリコール存在下における
細胞融合によって得られた）・イブリドーマを９６穴ウ
エル平底プレートに分注し、］−Ｉ　Ａ　Ｔ　（ヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有）を添加
１．た１０％牛脂児血清加ダルベツコＭＥＭ培地で５％
σ乃存在下３７°Ｃで培養した。ハイプリドーマの増殖
を認めたウェルについて培養上清の抗緑膿菌モノクロー
ナル抗体の存在の有無を酵素免疫測定法であるドノトイ
ムノパインディングアソセイ法（Ａｎｄｌｙｔｉｃａｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ　１１９，１４２−１４
．７，１９８２．以下り、Ｉ　ＢＡ法といシ）で測定し
た。ＤＩＢＡ法は、９６穴ウエルＵ底マルチプレー１・
を用い、ｌドツト当り０．４μｇの０．３％ホリマリン
処理各菌型録膿菌の全菌体を抗原として固定したメンブ
ランフィルタ−（３，１ｍｍ角）と上記の培養上清１０
０μｍを室温で；３０分、ついでパーオキシターゼ標識
つザギ抗マウス、イムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製
）と３０分反応後、クロルナフトールを基質として発色
させ、抗原を固定したメンブランフィルタ−上に肉眼観
察で発色を認めたものを抗体産生が陽性と判定した。培
養上清にモノクロルナル抗体産生が認められたハイブリ
ドーマはさらに、限界希釈法でクローニングを行ない、
モノクローンにプエっだハイブリドーマはフラスコで増
殖させた後、免疫抑制剤プリスタン（アルドリッチ社）
処置ＢＡＬ］３／Ｃマウスの腹腔内に移植し得られたマ
ウス腹水からプロティンＡ−セファロース（ファルマシ
ア社）、アフィニティヵラム（ＩｇＧ向）、および七フ
アクリル５３００（ＩｇＧ向）を用いてモノクローナル
抗体を精製した。4) Cell fusion 4 days after the final immunization, 5 x 108 mouse tile cells and 5 x 1.0' N5-L mouse myeloma cells ([f
The hybridomas (obtained by cell fusion with fi in the presence of 50% polyethylene glycol) were dispensed into a 96-well flat-bottomed plate, and ]-IAT (containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) was added.1. 5% in Dulbecco's MEM medium supplemented with 10% tallow serum.
Cultured at 37°C in the presence of σ. The presence or absence of anti-Pseudomonas aeruginosa monoclonal antibodies in the culture supernatant of wells in which hybridoma growth was observed was determined using the enzyme immunoassay method (andlytical assay).
Biochemis-try 119, 142-14
．． 7, 1982. It was measured using the IBA method below. The DIBA method is a 96-well U-bottom multiplayer 1.
A membrane filter (3.1 mm square) on which 0.4 μg of 0.3% formalin-treated 0.3% formalin-treated P. pyogenes per 1 dot was immobilized as an antigen and a membrane filter (3.1 mm square) and the above culture supernatant 10
0 μm at room temperature for 30 minutes, then reacted with peroxidase-labeled Tsuzagi anti-mouse and immunoglobulin antibodies (manufactured by DAKO) for 30 minutes, developed color using chlornaphthol as a substrate, and visually observed on a membrane filter on which the antigen was immobilized. Those in which color development was observed were judged to be positive for antibody production. Hybridomas in which monoclonal antibody production was observed in the culture supernatant were further cloned using limiting dilution method.
Monoclonal hybridomas were grown in flasks and treated with the immunosuppressant pristane (Aldrich).
Treatment BAL] A monoclonal antibody was extracted from the mouse ascites fluid obtained by intraperitoneal transplantation of 3/C mice using protein A-Sepharose (Pharmacia), an affinity column (for IgG), and heptaphryl 5300 (for IgG). Purified.

か（して得られた種々の抗緑膿菌モノクローナル抗体産
生ハイプリドーマの中から、本発明者らは緑膿菌の血清
学的分類に基づく各型に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を産生するハイプリドーマ１８株を見い出した。Among the various anti-Pseudomonas aeruginosa monoclonal antibody-producing hybridomas obtained by We found 18 hybridoma strains.

このうち、Ｅ型、Ｂ型、Ｇ型、■型に特異的に反応する
・・イブリドーマはそれぞれ６株、４株、５株、３株で
あった。これらハイブリドーマのうち、はとんどの株が
グロブリンクラスが■ρでＩｇＭは２株だけが産生じた
に過ぎなかった。結果を表２．３．４．５に示す。Of these, 6, 4, 5, and 3 hybridomas reacted specifically to type E, type B, type G, and type ■, respectively. Among these hybridomas, most of the strains were of the globulin class ■ρ, and only two strains produced IgM. The results are shown in Table 2.3.4.5.

ナオ、緑膿菌菌体に対するモノクローナル抗体の直接凝
集活性の測定はつぎの方法で行なった。９６　ウェルの
Ｕ底マルチプレート（ファルコン社）に各血清型の緑膿
菌の０．３％ホルマリン処理あるいは１２０°Ｃ加熱処
理による死菌体の懸濁液（ＰＢＳ・（日に懸濁、ＯＤ　
５４０が０．４）を５０μｍづつ分注した。ついでこれ
にモノクローナル抗体のＰ　Ｂ　Ｓ　（−１による希釈
系列を５０μｍずつ分注し、プレート表面をシーラー（
リンプロ社プレートシーラー）でカバーし、室温で１０
分間振とうし３７°Ｃで１時間静置した。さらにこれを
４℃〜ｉｏ℃で１５時間以上放置した後プレートを室温
にもどしプレートの裏面より透かして菌体の凝集反応像
を観察し判定した。The direct agglutination activity of monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa cells was measured by the following method. A suspension of dead bacterial cells of each serotype of Pseudomonas aeruginosa treated with 0.3% formalin or heat treated at 120°C was placed in a 96-well U-bottom multiplate (Falcon) (suspended in PBS,
540=0.4) was dispensed into 50 μm portions. Next, a monoclonal antibody diluted with PBS (-1) was dispensed into 50 μm portions, and the plate surface was covered with a sealer (
Cover with Linpro Plate Sealer) and incubate at room temperature for 10 minutes.
The mixture was shaken for a minute and left to stand at 37°C for 1 hour. Further, the plate was allowed to stand at 4° C. to io° C. for 15 hours or more, and then the plate was returned to room temperature, and the agglutination reaction image of the bacterial cells was observed and judged through the back of the plate.

試験例Ｉ　血清学的分類による各型録膿菌に特異的に反
応するマウスモノクローナル 抗体の緑膿菌感染に対する防御活性 実施例１で得られた各型に特異的に反応するモノクロー
ナル抗体の緑膿菌に対する感染防御能について検討した
。生後、１０週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹に
各菌型に特異的に反応するモノクローナル抗体をマウス
１匹当り５０１ｇ　。Test Example I Protective activity against Pseudomonas aeruginosa infection of mouse monoclonal antibodies that specifically react with each type of P. aeruginosa according to serological classification. The ability to prevent infection against bacteria was investigated. 501 g of a monoclonal antibody that specifically reacts with each bacterial type was administered to each group of 5 BALB/C female mice at the age of 10 weeks.

５００ｎｇ　、　５μｇ　、　５０ｚ１ｇ　、　５００
ｇｇ　、　５ｍｇ　をそれぞれ腹腔内へ投与し、２時間
後にそれぞれの菌型に特異な菌株を（ＩＴＤｔｔ３ｏ（
Ｅ型）、　ＩＩＤＬＯＯ２（Ｂ型）、ＡＴＣＣ］０１４
５（Ｇ型）、ＩＩＤｔｏｔｏ（Ｉ型））１×１０６腹腔
内へチャレンジした。対照群はモノクローナル抗体のか
わりに生理食塩液のみ投与した。緑膿菌感染後、７日目
に各投与群のマウスの生存率から請求めた。結果は表２
〜５通りで、驚くことに各種モノクローナル抗体の中で
グロブリンクラスがＩｇＧで、強い凝集能活性をもつ抗
体のみに極めて、強力な緑膿菌感染防御効果が認められ
た。500ng, 5μg, 50z1g, 500
gg and 5mg were each administered intraperitoneally, and 2 hours later, a strain specific to each bacterial type (ITDtt3o(
E type), IIDLOO2 (B type), ATCC]014
5 (type G), IIDtoto (type I)) was challenged intraperitoneally with 1×106. In the control group, only physiological saline was administered instead of the monoclonal antibody. The survival rate of mice in each administration group was determined on day 7 after Pseudomonas aeruginosa infection. The results are in Table 2
Surprisingly, among the various monoclonal antibodies, only antibodies with a globulin class of IgG and strong agglutination activity were found to have an extremely strong effect on preventing infection with Pseudomonas aeruginosa.

実施例２　血清型緑膿菌に対するヒトモノクローナル抗
体の作成とその性質 １）Ｅ　Ｂウィルス ＥＢウィルス（以下ＥＢＶ）を産生放出しているＢ９５
−８細胞をＲＰＭＩ−１６４０に２０％ＦＣ８を加えた
培地で培養し、静止期に近い７日目の培養上清を分離し
てウィルス源とした。Example 2 Creation of human monoclonal antibody against serotype Pseudomonas aeruginosa and its properties 1) E B virus B95 which produces and releases EB virus (hereinafter referred to as EBV)
-8 cells were cultured in a medium containing RPMI-1640 and 20% FC8, and the culture supernatant on day 7, near the stationary phase, was separated and used as a virus source.

２）リンパ球の分離 健常人であらかじめ抗緑膿菌抗体の高い人からヘパリン
採血したヘパリン加末梢血を生理食塩水あるいはＰＢＳ
（−１で２倍に希釈後、ｌ／４〜ｌ／３量のリンフォプ
レソプ上に界面がみだれないようにゆっくりと重層した
。重層後、１５５０ｒｐｍ、３０分間、室温で遠心した
。遠沈後、界面層の白く濁った細胞層をパスツールピペ
ットでとり出し、細胞はＰＢＳ（→で１４０Ｏｒｐｍ、
１０分間（１回目）、次に１００Ｏｒｐｍ　、’１０分
間（２，３回目）で遠心洗浄した。細胞はＲＰＭＩ　１
６４０液で５×１０１０６４ｙを再浮遊した。2) Isolation of lymphocytes Heparinized peripheral blood collected in advance from a healthy person with high anti-Pseudomonas aeruginosa antibodies was mixed with physiological saline or PBS.
(After diluting 2 times with -1, it was slowly layered on 1/4 to 1/3 amount of Lymphopresop to avoid disturbing the interface. After layering, it was centrifuged at 1550 rpm for 30 minutes at room temperature. After centrifugation, Take out the white cloudy cell layer of the interface layer with a Pasteur pipette, and soak the cells in PBS (→ at 140 rpm,
Centrifugal washing was performed for 10 minutes (first time), then at 100 rpm for 10 minutes (second and third times). Cells are RPMI 1
5×101064y were resuspended in 640 solution.

３）ＴＩＪンパ球の除去（８９７７球濃縮）０．５％Ａ
ＥＴ処理５ＲＢＣＩ容、単核球細胞浮遊液（５Ｘ　１０
６個／ｒｎｌ）ｌ容、５ＲＢＣ吸収ＦＣ８０，２容を遠
心管（尖底）内で混和し、５分間、室温に放置後、次い
でＬＯＯＯｒｐｍ、５分間、４℃で遠心した。遠沈後、
水中に１時間静置した。反応後、細胞ペレットをパスツ
ールピペットで静かにか（はんし、浮遊液を作りリンフ
ォプレップ上にのせ、１５５０ｒｐｍ、３０分間、４℃
で遠心した。3) Removal of TIJ lymphocytes (concentration of 8977 cells) 0.5% A
ET treated 5RBCI volume, mononuclear cell suspension (5X 10
6 cells/rnl) 1 volume and 5 RBC-absorbed FC80.2 volumes were mixed in a centrifuge tube (pointed bottom), left at room temperature for 5 minutes, and then centrifuged at LOOO rpm for 5 minutes at 4°C. After centrifugation,
It was left standing in water for 1 hour. After the reaction, gently pipette the cell pellet with a Pasteur pipette, make a suspension, place it on Lymphoprep, and incubate at 1550 rpm for 30 minutes at 4°C.
It was centrifuged at

遠沈後、界面上のロゼツトを作らなかった細胞（８９７
７球）をとり出し、ＰＢＳ（−１で上記２と同様に３回
遠心洗浄した。細胞は１×１０７個／ｒｎｌ　（多い時
）〜２．５×１０個／ｆｆＩＩ（少ない時）に培養液に
浮遊した。Cells that did not form rosettes on the interface after centrifugation (897
7 cells) were taken out and centrifuged and washed 3 times in PBS (-1) in the same manner as in 2 above.Cultures were cultured at 1 x 107 cells/rnl (when there are many) to 2.5 x 10 cells/ffII (when there are few). Floated in the liquid.

４）ＢＢＶ感染による細胞株の樹立 培養プレート（２４穴）の１穴に対し、８９７７球浮遊
液（Ｉ　Ｘ　１０７〜２．５　Ｘ　１０６ｆ［Ｗ／ｍｌ
　）　Ｏ，１ｍｌにＥＢＶ液０．１ｍｌを加え、炭酸ガ
ス培養器で３７℃、６０分間インキュベーションした。4) Establishment of cell line by BBV infection 8977 sphere suspension (I x 107 - 2.5 x 106f [W/ml) per well of a culture plate (24 wells)
) 0.1 ml of EBV solution was added to 1 ml of O, and incubated at 37° C. for 60 minutes in a carbon dioxide gas incubator.

インキュベーション後、Ｑ、８ｍｌの培養液を加え全量
１ｍｌとしＣＯ２ガス培養器で３７°Ｃ１静置培養を行
った。ＥＢＶ感染感染後４口５ を加えた。その後４〜５日毎百量の培養液交換を行ない
培養を継続し、そして６週間後、旺盛な細胞増殖が認め
られる培養プレート穴つき実施例１で示したドツトイム
ノバインディングアッセイ法（但し、ベルオキシターゼ
が標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いた）にて
抗体産生能を測定した。該抗体産生がみられた細胞集団
はロゼツト形成法および軟寒天コロニー形成法でクロー
ニングした。クローニングにより増殖能が旺盛なりロー
ン細胞株は、スターリングシステム（インターメソト社
製）Ｋて拡大培養し、培養上清を各型録原菌を抗原とし
たアフィニティーカラムにて精製した。結果は第６、７
、８、９に示す。After incubation, 8 ml of culture solution was added to bring the total volume to 1 ml, and static culture was performed at 37° C. in a CO2 gas incubator. After EBV infection, 4 mouths 5 were added. Thereafter, the culture was continued by replacing the culture medium every 4 to 5 days, and after 6 weeks, a culture plate with holes in which vigorous cell proliferation was observed was used. Antibody production ability was measured using a labeled goat anti-human immunoglobulin antibody. The cell population in which antibody production was observed was cloned by rosette formation method and soft agar colony formation method. The cloned cell line, which showed strong proliferative ability through cloning, was expanded and cultured using the Starling System K (manufactured by Intermethod), and the culture supernatant was purified using an affinity column using each type of progenitor bacteria as an antigen. The results are 6th and 7th
, 8 and 9.

本発明者らは緑膿菌の血清学的分類各型に特異的に反応
するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を１４株欠い出した。このうちＥ型、Ｂ型、Ｇ型、■型
に特異的に反応するハイブリドーマはそれぞれ４株、５
株、２株、３株であった。なお、ヒトモノクローナル抗
体の凝集活性も実施例１に示す方法で測定した。The present inventors have isolated 14 hybridoma strains that produce human monoclonal antibodies that specifically react with each serological type of Pseudomonas aeruginosa. Among these, there are 4 and 5 hybridomas that specifically react to type E, B, G, and ■, respectively.
There were 3 stocks, 2 stocks, and 3 stocks. Incidentally, the agglutination activity of the human monoclonal antibody was also measured by the method shown in Example 1.

試験例２　血清各型緑膿菌に特異的に反応するヒトモノ
クローナル抗体の緑膿菌感染 に対する防御活性 実施例５、６、７、８でそれぞれ得られた各型に特異的
に反応するヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対す
る防御効果について検討した。Test Example 2 Protective activity against Pseudomonas aeruginosa infection of human monoclonal antibodies that specifically react with each serum type of Pseudomonas aeruginosa Human monoclonal antibodies that specifically react with each type obtained in Examples 5, 6, 7, and 8, respectively We investigated the protective effect of antibodies against Pseudomonas aeruginosa infection.

試験例１の方法に従って検討した結果を表６〜９に示す
。ヒトモノクローナル抗体の場合もマウスと同様に、各
種モノクローナル抗体の中でイムノグロブリンクラスが
ＩｇＧで、かつ強い凝集症活性をもつ抗体のみに極めて
強力な緑膿菌感染防御効果が認められた。The results of the study according to the method of Test Example 1 are shown in Tables 6 to 9. In the case of human monoclonal antibodies, as with mice, among various monoclonal antibodies, only antibodies of the immunoglobulin class IgG and having strong agglutination activity were found to have extremely strong protective effects against Pseudomonas aeruginosa infection.

実施例３　液剤 実施例１で得られた抗緑膿菌活性を示したモノクローナ
ル抗体を３Ｍ／１　０アミノ酢酸液で溶かし、グロブリ
ン濃度がＬｍｇ／ｍｌ　Ｋなるようにした。Example 3 Solution The monoclonal antibody exhibiting anti-Pseudomonas aeruginosa activity obtained in Example 1 was dissolved in a 3M/10 amino acetic acid solution to give a globulin concentration of Lmg/ml K.

このよう１にして得られたものを、メンブランフィルタ
−にュクリボアー陥．２０、ヌクリポア社製）を用いて
無菌沢過して１ｍｌずつバイアルに無菌的に分注して本
発明物質の液剤を得た。The material obtained in step 1 was filtered into a membrane filter. 20 (manufactured by Nuclepore) and aseptically dispensed into vials in 1 ml portions to obtain a liquid preparation of the substance of the present invention.

実施例４　凍結乾燥製剤 実施例１で得られた緑膿菌感染に対して効果を示したモ
ノクローナル抗体を最終濃度３ΔＯＭになるようにアミ
ン酢酸を加えた生理食塩に溶かし、Ｌｍｇ／Ｆｎ　Ｉと
し、さらにマンニトールを５０ｍｇ／１ｍ　Ｉ濃度にな
るよう添加して、メンブランフィルタ−にュクリボアー
Ｎｏ、２０．ヌクリポア社製）を用いて無菌沢過し、２
ｍｉずつバイアルに無菌的に分注して凍結乾燥して本発
明物質の凍結乾燥製剤を得た。Example 4 Freeze-dried preparation The monoclonal antibody obtained in Example 1 that was effective against Pseudomonas aeruginosa infection was dissolved in physiological saline to which amine acetic acid was added to a final concentration of 3ΔOM to give Lmg/Fn I. Furthermore, mannitol was added to a concentration of 50 mg/1ml, and the membrane filter was filled with Lucribore No. 20. sterile filter using Nuclepore),
A lyophilized preparation of the substance of the present invention was obtained by aseptically dispensing the amount into vials and freeze-drying.

実施例５　血清Ｅ型録原菌に特′異的に反応するヒトモ
ノクローナル抗体の液剤及び凍 結乾燥製剤 ■）ヒトモノクローナル抗体の大量調製■大量培養 実施例２で得られたモノクローナル抗体Ｎｏ、３を産生
する株を３〜４ケ月の長時間をかけて無血清培地に（Ｈ
Ｂ　ｔ　ｏ　ｔ　培地　富士レビオ社製）馴化した。次
に馴化した細胞を５ｅのスターリングシステム（インタ
ーメッド社製）で培養して下記の精製に供与した。Example 5 Liquid and lyophilized preparations of human monoclonal antibodies that specifically react with serum type E microorganisms ■) Large-scale preparation of human monoclonal antibodies ■ Large-scale cultivation of monoclonal antibodies No. 3 obtained in Example 2 The producing strain was placed in a serum-free medium (H
B tot medium (manufactured by Fujirebio) was adapted. Next, the conditioned cells were cultured in a 5e Starling system (manufactured by Intermed) and used for the purification described below.

■大量精製 ＰｒｏｔｅｉｎＡ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　（７
−ｒ　ルーｑシア社製）又はＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｃｅ
ｌ　を使用してグロブリン１ｉｌ１１両分を約１５　ｍ
ｇ得た。■Mass-purified Protein A-8 epharose 4 B (7
-r (manufactured by Ruqsia) or DEAE 5ephace
About 15 m of globulin 1il11 cars using l
I got g.

２）液剤 実施例３と同様の方法で上記のグロブリン画分１００μ
ｇ／ｆｎｌ濃度の本発明物質の液剤を得た。2) Prepare 100μ of the above globulin fraction in the same manner as in Solution Example 3.
A liquid preparation of the substance of the present invention with a concentration of g/fnl was obtained.

３）凍結乾燥製剤 上記方法にて大量精製して得られたグロブリン画分を実
施例４と同様の方法で本発明物質の凍結乾燥製剤を得た
。3) Freeze-dried preparation A freeze-dried preparation of the substance of the present invention was obtained in the same manner as in Example 4 from the globulin fraction obtained by mass purification using the above method.

実施例３　血清各型緑膿菌特異マウスモノクローナル抗
体を利用した治療効果 試験例１で、予防効果の認められたモノクローナル抗体
Ｎｏ、ｌ、４．５、■、■、Ｂ、ＢｌＹについてそれぞ
れ治療効果の実験を行なった。Example 3 Therapeutic effects using mouse monoclonal antibodies specific for each serum type of Pseudomonas aeruginosa In Test Example 1, the therapeutic effects of monoclonal antibodies No., 1, 4.5, ■, ■, B, and BlY, which were found to have preventive effects, were determined. conducted an experiment.

生後１０週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹に試験
例１と同様にそれぞれのセックローナル抗体に反応する
菌を１×１０６腹腔内へチャレンジして２時間後に、上
記のモノクローナル抗体１１００ｎ　〜ｌｏｍｇ腹腔内
に投与し、７日日でＤＥ５０値をめた。結果を表１０に
表した。試験例１で強く予防効果をましだ各々のモノク
ローナル抗１ 体の治療効果は丁から苗に低下するものの治療効果も認
められた。A group of 5 BALB/C female mice aged 10 weeks were intraperitoneally challenged with 1 x 106 bacteria that react with each seclonal antibody in the same manner as in Test Example 1. Two hours later, the above monoclonal antibody 1100n ~ lomg was administered intraperitoneally, and the DE50 value was reached on the 7th day. The results are shown in Table 10. Although the therapeutic effect of each monoclonal anti-1 antibody, which had a strong preventive effect in Test Example 1, decreased from seedlings to seedlings, a therapeutic effect was also observed.

試験例４　血清各型緑膿菌特異ヒトモノクローナル抗体
を利用した治療効果 試験例２で予防効果の認められたモノクローナル抗体Ｎ
ｏ、　３、■、Ａ、Ｘにつき、試験例３と全く同様に治
療実験を行なった。結果を表１１に示す。試験例２で強
い予防効果を示した各々のモノクローナル抗体の治療効
果は約１／ｌｏに低下するものの治療効果も認められた
。Test Example 4 Therapeutic effect using human monoclonal antibodies specific to each serum type of Pseudomonas aeruginosa Monoclonal antibody N that was found to have a preventive effect in Test Example 2
Treatment experiments were conducted in exactly the same manner as in Test Example 3 for cases o, 3, ■, A, and X. The results are shown in Table 11. Although the therapeutic effect of each of the monoclonal antibodies that showed a strong preventive effect in Test Example 2 was reduced to about 1/10, therapeutic effects were also observed.

第２表 Ｉ　ＩｇＧ　＋　１０ｏ〜２０Ｄｎｇ ２　ｘｇＭ＋　＞１．５り ５　ＩｇＧ　）７００μｇ ４　ＩｇＧ　＋　３０１］ｎｇ ５　ＩｇＧ　＋　１００００−２００ ｎ工ｇＧ〉１０ｑ ※ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスｉｇＧ抗体および
同標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（カッベル社〕を用いた
ＤＩＢＡ法により測定した。Table 2 I IgG + 10o-20Dng 2 xgM+ >1.5 5 IgG) 700 μg 4 IgG + 301] ng 5 IgG + 10000-200 ngG>10q *Peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody and the same labeled goat anti- It was measured by the DIBA method using a mouse IgM antibody (Kabbell).

第３表 ■ＩｇＧ　＋　３００ｎｇ ＩＩ　ＩｇＧ　＋　４００ｎｇ ｉｌｌ　Ｉｇｏ　８００μｇ ＩＶ　■ｇＧ−＋、ｓ岬 ※第２表に同じ 第４表 ＢＩｇＧ＋１ｏｏ〜２ｏｏｎｇ ０　１ｇＭ　−１−１，０岬 ＤＩｇＧ〉７ｏｏμｇ 第５表 ｙ　ＩｇＧ　＋　、１００〜２００ｎｇ第６表 ２　Ｉｇｏ　−）０．７〜 ３　ＩｇＧ　＋　４００ｎｇ ※ペルオキシダーゼが標識ヤギ抗ヒ）ＩｇＧ杭体および
同標識ヤギ抗ヒトエｇＭ抗体（カッベル社）を用いてＤ
ＩＢＡ法により測定しＴへ。Table 3 ■IgG + 300ng II IgG + 400ng ill Igo 800μg IV ■gG-+, s Misaki *Same as Table 2 Table 4 BIgG+1oo~2oong 0 1gM -1-1,0MisakiDIgG>7ooμg Table 5 y IgG + , 100-200 ng Table 6 2 Igo -) 0.7-3 IgG + 400 ng *Peroxidase was detected using a labeled goat anti-human IgG pile and the same labeled goat anti-human egM antibody (Cubbell).
Measured by IBA method and sent to T.

第７表 Ｉ　ＩｇＭ＋　ｓ　ｏ　ｏ　ｐｇ ＩＩＩｇＭ−２，０〜 ］［Ｉｇｏ　＋　１０１０ｎ−２００ ｎ’ｌｌ　ｒｇ、ａ　＋　６００ｎｇ 第８表 第９表 ｘ　ＩｇＧ　＋　１ｏμｇ Ｙ　工ｇＭ　＋２．０Ｋｇ ※第６表に同じ 第１０表 ０８ １９ ５　０．９ １　２、Ｏ ｎ　’　２．５ Ｂ　１６ Ｅ　、３．０ Ｘ４．５ Ｙ　’　１．３ 第１１表 ！ｌ３８ Ｎ　６．Ｉ Ａ　９．Ｏ Ｘ　１０．０Table 7 I IgM + s o o pg IIIgM-2,0~ ] [Igo + 1010n-200 n'll rg, a + 600ng Table 8 Table 9 x IgG + 1oμg Y engineering gM +2.0Kg *Same as Table 6 Table 10 08 19 5 0.9 1 2, O n’2.5 B16 E, 3.0 X4.5 Y’　1.3 Table 11 ! l38 N 6. I A9. O X 10.0

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １緑膿菌の血清型別抗原に対して特異的な、親和性を有
し、かつ緑膿菌菌体に対して直接凝集活性を持つ、グロ
ブリンクラスがＩｇＧであるモノクローナル抗体を少な
（とも１種含有する緑膿菌減染症の予防治療剤。 ２、モノクローナル抗体がマウス由来である特許請求の
範囲第１項記載の緑膿菌減染症の予防治療剤。 ３、モノクローナル抗体がヒト由来である特許請求の範
囲第１項記載の緑膿菌減染症に対する予防治療剤。[Scope of Claims] 1. A monoclonal monoclonal whose globulin class is IgG, which has specific affinity for the serotype antigen of Pseudomonas aeruginosa and has direct agglutination activity against Pseudomonas aeruginosa cells. 2. A prophylactic and therapeutic agent for Pseudomonas aeruginosa hypostaining disease containing a small number of antibodies. The prophylactic and therapeutic agent for Pseudomonas aeruginosa hyposmosis according to claim 1, wherein the monoclonal antibody is of human origin.