JPS60248190A - フオスフイノスリシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フォスフイノスリシン（２−アミノ−４−メ
チル７オスフイノ酪酸）の製造方法に関する。

フォスフイノスリシンは下記のような２−アミノ−４−
メチル７オスフイノ酪酸の構造を有する化合物であり、
その物理学的性質は１ｌｅｌｖ。

Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、、５５巻、２２４頁、１９７２
年に開示されている。

… ＯＨＮＨ２ フォスフイノスリシンは、除草活性を有するフォスフイ
ノスリジルアラニルアラニン（ｐｈｏｓ−ｐｈｌｎｏｔ
ｈｒｉｃｙｌａｌａｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　）の活性本
体であり、グルタミン合成酵素の強力な阻害剤である（
　Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、、５５巻、２２
４頁、１９７２年）。

そして、フォスフイノスリシンも強い除草活性を有する
ことが知られている（特開昭５５−９００３）。

フォスフイノスリシンの製造方法としては、化学合成に
よる方法が知られている（　）（ａｌｖ。

Ｃｈｌｍ、　Ａｃｔａ、、　５５巻、２２４負、１９７
２年および明治聾！Ｌ菓研究年報、１３号、４９頁、１
９７３年）。

さきに本発明者らは、放線菌ＫＡ−３３８株の培養ｆ液
中よりグルタミンと選択的に拮抗する新却５抗生物質フ
オスアヲシン（ｐｈｏｓａｌａｅｉｎｅ　）を単離し、
その構造を決定したのち、このものが植物に対して殺草
効果を発揮することτ、出して、新規抗生物質フォスア
ラジンおよびその製造方法を発明した（特願昭５８−１
４１４０１　）。

るような条件で培養した場合に、フォスフイノスリシン
が培地中に蓄積されるという知見に基いている。

本発明の目的は、発酵法によるフォスフイノスリシンの
製造方法を提供することである。

本発明によるフォスフイノスリシンの製造方法は・フォ
スフイノスリシン生産能力を有するキタサトスポリア属
に属する微生物を培地に好気的に培養して、培養液中に
７オスフイノスリシンを蓄積させ、培養液からこれを単
離することを特徴としている。

化学合成ではラセミ体が得られ活性は半減する。しかし
、本発明の方法では活性型（Ｌ型）の７オスフイノスリ
シンのみが直接培地中に蓄積されるので、ＤＬ分割の必
要はなく、活性型のフォスフイノスリシンを効率よく製
造することができる。

フオスフイノスリシ／を生産する能力を有する限り、ど
のような菌株も本発明の目的に用いることができる。実
施例に記載された菌株は、本発明者によって土壌より分
離された放線菌ＫＡ−３３８株であるが、フォスフイノ
スリシン生産能力を有する限り、この菌株から自然的ま
たは人工的ｌｌ？：Ｗ導された変異株も、７オスフイノ
スリシンの生産に用いることができる。

放線菌ＫＡ−３３８株は、工業技術院微生物工業技術研
究所に１９８３年７月１８日に微工研条寄第３５８号と
して寄託されている。その菌学的性状は次の通りである
。

（１）　形態的性状 栄養菌糸は、各種寒天培地上でよく発達し、通常は隔壁
を有しない。気菌糸は、イースト・麦芽寒天、オートミ
ール寒天で豊富に着生し、ビローＰ状を呈する。顕微鏡
下の観察では、胞子柄は主として直線状（Ｒｅｅｔｕ＋
５−Ｆ１ｅｘｉｂｌ１１＠型）であり、１０個以上の胞
子の連鎖が認められる。胞子の大きさは、０．９　Ｘ　
Ｏ＠９〜１．８μｍで、円筒状であり、胞子表面は平滑
である。

菌核、胞子のうおよび遊走子は観察されない。

（ｎ）　各種寒天培地での性状 イー・ビー・シャーリング（Ｂ、　Ｂ、　Ｓｈｉｒｌｉ
ｎｇ　）とディー・ゴツトリーブ（Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｌ
ｅｂ　）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オ
フ・システィマチイック・バクテリオロジー、１６巻、
３１３頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養
性状を次表に示す。色調は、標ｆ’ＪＡ色トＬテ、カラ
ー・ハーモニー唾マニュアルｔ４４Ｈ（コンテナー・コ
ーポレーション・オフ・アメリカ、シカゴ、１９５８年
）を用いて決定し、色名とともに括弧内にそのコー「を
併せて記した。

以下は、特記しない限シ、２７℃、２週間目の各培地に
おける観察の結果である。

（Ｉｌｌ　生理的諸性状 （１）　メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天　陰性 （ロ）啄プトン・イースト・鉄寒天　陰性（ハ）　トリ
ジトン・イースト液　陰性（２）　チロシナーゼ反応　
陰性 （３）硫化水素の生産　陰性 （４）　硝酸塩の還元　陽性 （５）　ゼラチンの液化　陰性 （６）　スターチの加水分解　陽性 （７）脱脂乳の凝固（３７°Ｃ）　陰性（８）　脱脂乳
のペプトン化（３７°Ｃ）　陽性（９）生育温度範囲　
１５〜４２℃ （１０）炭素源の利用性（シリＰハム・ゴツトリーブ寒
天培地） 利用する＝Ｄ−グルコース、Ｌ−アラ ビノース、Ｄ−キシロース、 Ｌ−ラムノース、ラフイノ ース、シュークロース、Ｄ− フルクトース 利用しない：ｌ−イノシトール、Ｄ− マンニトール （１１）　セルロースの分解　陰性 （ｌＶ３　細胞の化学分解 細胞壁のジアミノピメリン酸は、ＬＬ−型およびｍｏｏ
−型の２種類をともに有し、グリコレート試験は、アセ
チル型であり、リン脂質はｐＩ型であった。

木菌の菌学的性状を要約すると、次のとおりになる。形
態的には、直線状の胞子鎖を形成し、円筒状の胞子の表
面は、平滑である。また、菌核、胞子のりおよび遊走子
は認められない。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は
イエＣ−系の色調を呈し、気菌糸はホワイトからグレー
の色調を持つ。メラニン色素、可溶性色素の生産は認め
られない。このような性状に加え、細胞の化学分析、特
に、Ｔ、Ｌ−型、ｍ＠８０−型の２種類のジアミノピメ
リン酸をともに有する点から、本菌はキタサトスポリア
・セタル／ｌ（Ｋｌｔａｍａｔｏ−１ｏｒｌａ　ｔｒＢ
旦印）（：）ヤーナル・オフ・アンテイノイオテイクス
、３５巻、１０１３頁、１９８２年）に類似する放線菌
と考えられるが、本菌は、Ｄ−フルクトース、シよ糖、
Ｌ−ラムノース、ラフィノースを資化する点、キタサト
スポリア・セタルパとは、明らかに異なる。

本発明の方法において、フォスフイノスリシンを生産す
る培地としては、微生物の培養に常用される炭素源、窒
素源、無機物等を含む各種の培地を使用することができ
る。たとえば、培地の炭素源としては、プｒつ糖、麦芽
糖、乳糖、しよ糖、デンプン、デキストリン、オートミ
ール、グリセリン、水あめ、糖蜜などである。また、窒
素源としては、大豆粉、コーンスチープリカー、綿実温
、ペプトン、肉エキス、乾燥酵母、カゼイン加水分解物
、トマトペースト、アンモニウム塩、硝酸塩などである
。その他、必要に応じて炭酸カルシウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カリウム、リン酸基等の無機塩類を添加するほ
か、菌の発育を助け、フォスフイノスリシンの生産を促
進するような有機および無機物を適当に添加することが
できる。

培養法としては、液体培養法、特に、深部培養法が最も
適している。培養は通常、好気的条件下で行なわれ、通
気攪拌培養が好適である。

培養温度は、１５〜４２℃、たとえば２０〜４０℃であ
る。、ｌ）Ｈは６〜９が好ましい。

ＫＡ−３３８株は培養によシ、下記の構造を有するフォ
スアラジンを生産する。

培養液でフォスアラジンが分解し、７オスフイノスリシ
ンが生成される。培地のｐＨが低いと（たとえば７以下
）著量のフォスアラジンが蓄積されるが、ｐＨが高いと
７オスフイノスリシンの蓄積量が増加する。

培養時間は、種々の条件によって異なるが、通常、３日
〜７日程度で培養液中に蓄積されるフォスフイノスリク
ンが最高力価に達する。

培養終了後、培養液からのフォスフイノスリシンの採取
は、微生物の培養液より類似の抗生物質を分離精製する
公知の手段を単独または組み合わせて行なうことができ
る。

フォスフイノスリインは、主として培養物の液体部分に
存在し、前記の理化学的性質で示すように水溶性の両性
物質であるので、その抽出、精製にあたっては、アンバ
ーライ）ＩＲ−１２０（米国、ローム・アンｒ・ハース
社製）、ダウエックス５０Ｗ（米国、ダウ・ケミカル社
製）等の陽イオン交換樹脂もしくは、アン／層−ライト
ＩＲＡ４００、ＩＲ４５の陰イオン交換樹脂に吸着させ
、これを適当な酸、アルカリもしくは、塩溶液を用いて
溶出することができる。実用的な分離精製法の一例を示
すと次のとおりである。

たとえば、培養Ｐ液から活性炭で７オスアラシンを除去
した後、強酸陽イオン交換樹脂アンノ層−ライトＩＲ−
１２０（Ｈ十型）を充填したカラトを通過させ、有効成
分を吸着させ、これをアンモニア水で溶出する方法は、
フォスフイノスリシンの精製法として有効な手段である
。このような方法で得られたフォスフイノスリシンの粗
物質は、セルロース、シリカゲル、アルミナ、セファデ
ックス（スエーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミ
カルス社製）およびトヨノ？−ル（東洋曹達工業製）等
を使用する公知方法によるクロマトグラフィーなどを行
なうことによシ、さらに純度を高めることができる。こ
うして得られたフォスフイノスリシンは、白色無定形粉
末である。

放線菌ＫＡ−３３８株によって培養の初期に生産される
抗生物質フォスアラジンは、デービスの最少培地上でバ
チルス・ズブチリス（Ｂａａ　ｉ　１１ｕｓｇｕｂｔｉ
ｌｉｓ）に対して強い抗菌活性を示すが、フォスフイノ
スリシンはほとんど抗菌活性を示さないので、抗生物質
フォスアラジンは、デービスの最少培地を用い、検定菌
として／層チルス・ズブチリスを用いるベーノｑ−・デ
ィスク法によって定量することができる。フォスフイノ
スリシンは通常法の方法によって定量される。捷ず、試
料溶液をアン・ｔ−ライトＩＲ−１２０（−Ｈ十型）な
どの強酸性陽イオン交換樹脂の力２ムに通塔して水洗し
た後、吸着されたフォスフイノスリシンを２規定のアン
モニア水で溶出する。この溶出液を濃縮した後、展開溶
媒としてブタノール、酢酸、水（３：１：２）を用いる
セルロース薄層クロマトグラフィーに供し、ニンヒドリ
４８０ｎｍで定量する。

次に本発明の実施例を示すが、この実施例は本発明を限
定するものではない。

実施例 放線菌ＫＡ−３３８株（微工研条寄第３５８号）の斜面
培養（スラント）から１白金耳を種培地（ｘｏｏｍＪｌ
ｃ接種し、２７℃で２日間振とう培養後、３０）容ジャ
ーファーメンター中２０ノの本培地に、１％の割合で接
種し、２７℃、６日間、通気量１０１／分、攪拌２５Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、の条件で通気攪拌培養を行なった。

種培地の組成は、グルコース０．１％、デンプン２．４
チ、はプトン０．３チ、肉エキス０．３％、酵母エキス
０．５　％　、炭酸カルシウム０．４チであり、本培地
の組成は、グルコース０．２％、トマトピユーレ４．０
チ、オートミール１．５チ、リン酸１カリウム０．２　
％　、リン酸２カリウム０．２チ、塩化コバルト（２水
加物）１００μｍ１／ｌで、それぞれｐＨ７，０、ｐＨ
６，０に調整した後、１２１　”Ｃで１５分間滅菌した
。

培養物２０ノをシャープレス型遠心機で遠心分離（１０
０００ｒ、ｐ、ｍ、）　して、培養ｒ液と菌体とに分別
する。ここで得た培養ｒ液を６Ｎ−塩酸でｐｉ−１２，
０に調整した後、活性炭を充填したカラＡ　（ｓｏｏ　
Ｉ！　）を通過させ、フォスアラジンを吸着除去する。

続いて、強酸性陽イオン交換樹脂アンノ七−ライトＩＲ
−１２０（Ｈ＋型）（米国、ローム・アンド・ハース社
製）を充填したカラム（０，５Ａ’　）を通過させて有
効成分を吸着させる。

引き続き水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出し、各５
００１に分画し、分画Ｎｏ、２〜５を集めた。

溶出液を減圧下で濃縮乾固し、粗粉末１３．５　Ｊを得
た。さらに、との粗粉末を、セルロースａｏｏ　ｇとブ
タノール、酢酸、水（１０：１：１）で充填したカラム
を用いるクロマトグラフィーに供した。展開溶媒として
ブタノール、酢酸、水（５：ｌ：２）を用い、２０−ず
つ分画した。

得られた活性画分Ｎｏ、５３〜１２５を合わせて減圧濃
縮した後、凍結乾燥し、１．８ｇの白色粉末を得た。こ
の白色粉末を少量の水に溶解した後、アセトンを添加し
て生じた沈殿をｆ別し、充填乾燥してフォスフイノスリ
シン０．９１／を得た。

本実施例で製造されたフォスフイノスリシンの融点、比
旋光度、元素分析値、薄層クロマトグラフィーにおける
Ｒｆ値は下記の通りであシ、標品の７オスフイノスリシ
ンと完全に一致した。

融点＝２１０〜２１５℃（分解） 比旋光度〔α）　：＋３０°（２規定塩酸中）元素分析
値 実測値：　炭素３２．９チ、水素６．５２係、窒素７．
５４チ 理論値（Ｇ、Ｈ，□Ｎ０４Ｐとして）：炭素３３．１５
チ、水素６．６８％、 窒素７．７３チ セルロース薄層クロマトグラフィーのｎｆ値”。

０．３７　（展開溶媒：ブタノール、 酢酸、水＝３：１：２）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （リ　フォスフイノスリシンを生産する能力を有するキ
   タサトスボリアハに属する微生物を培地に好気的に培養
   し、培養液中にフォスフイノスリシンを蓄積させ、培養
   液からこれを単離することを特徴とする７オスフイノス
   リシンの製造方法。 （２）微生物が放線菌ＫＡ−３３８（微工研条寄第３５
   ８号）株である特許請求の範囲第１項記載の方法。