JPS602195A - Microbiological production of polysaccharide - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、バクテリアの粘着集落ラミゲラ（Ｚｏｏｇ
ｌｏｅａ　ｒｏｍｉｇｅｒａ　）　、菌種１ｌ５によシ
多糖類（Ｐ○ｌｙｓａｃｃｈａｒｊ．ｃｌｅ　）の微生
物による製造方法に関するものである。[Detailed Description of the Invention] This invention is directed to the bacterial sticky colony Lamigera (Zoog
The present invention relates to a method for producing polysaccharide (P○lysaccharj.cle) using microorganisms using microorganisms such as P. loea romigera) and bacterial species 1l5.

バクテリアの粘着集落ラミゲラ、菌種ｉｌ５によって実
験室規模で多糖類を製造する方法は既に文献にも示され
ており、周知のことである。しかしながら非常に長い培
養時間を必要としだ。さらに、高重合体濃度を得ること
′は不可能であった。また培養基の粘度が高いことに伴
なう問題もあった。A method for producing polysaccharides on a laboratory scale using the bacterial adherent colony Lamigera, species il5 has already been described in the literature and is well known. However, it requires a very long culture time. Furthermore, it was not possible to obtain high polymer concentrations. There were also problems associated with the high viscosity of the culture medium.

培養時間が長いという欠点があるため、例えば培養器に
悪影響を与え、生産性も低くなる。The drawback is that the culture time is long, which has a negative impact on the culture vessel, for example, and reduces productivity.

従来の方法により得られた低重合体濃度により例えば回
収費用も高くなる。培養基が高濃度であると、特にバク
テリアに酸素を送シ込むことが非常に困難になるという
結果が生ずる。本願発明のバクテリアは好気的代謝をも
っているので、このことは特に重要である。The low polymer concentrations obtained by conventional methods also result in high recovery costs, for example. A high concentration of the culture medium has the consequence that, in particular, it is very difficult to deliver oxygen to the bacteria. This is particularly important since the bacteria of the present invention have an aerobic metabolism.

従来から知られていた方法には上述のような欠点があっ
た為、バクテリアの粘着集落ラミゲラ、菌種１１５を用
いて多糖類を工場規模で生産するととを一層不可能なも
のとしていた。The previously known methods had the above-mentioned drawbacks, which made it even more impossible to produce polysaccharides on a factory scale using the bacterial adherent colony Lamigera, species 115.

〈発明の概要〉 この発明によれば、従来公知の方法に関する上述のよう
な欠点を驚異的に解消することができ、バクテリアの粘
着集落ラミゲラ、菌種１１５によって多糖類を細菌によ
り生産する方法を提供することができる。この発明の方
法は、（〜　ブドウ糖、澱粉、馬鈴薯のような炭素源、
塩化アンモニ・ノム、硝酸アンモニウムあるいは硝酸カ
リウムのような窒素源、燐酸塩、硫酸塩のような養素塩
、０・１５乃至４５■／ｅ（１リットル当り０．１５乃
至４５ミリグラム）、好丑しくは０．５乃至５　ｒｎｇ
／　（１　（　１リッ１−　／ｌ’　当す０．５乃至５
ミリグラム）、のｉＪＩＷのＦｅ−ｃｌ３あるいはＦｅ
２（ＳＣ２）３のような鉄の塩を含む無菌水性培養基中
で粘着集落ラミゲラを増殖させ、それによって上記バク
テリアの濃縮懸濁液が得られる。（Ｂ）　上記の懸濁液
を上記の組成をもった無菌水性媒体を含む発酵槽中に送
り込む。この発酵槽中において、約１０乃至５０ｇ／ｌ
（１リットル当り約３０乃至５０グラム）の初期濃度で
添加された殆んど全ての炭素源を使い尽すように、バク
テリアを約２０乃至６０時間、好ましくは３０乃至５０
時間維持する。それによって、３０乃至５０ｇ　／　（
１　（　ｌリットル当り３０乃至５０グラム）のカプセ
ルの形で存在する重合体を含む低粘度生成物が得られる
うこの発明によって使用されるバクテリアの粘着集落ラ
ミゲラの周知の菌種１１５はアメリカ合衆国のジ　アメ
リカン　タイプ　力ルチャ　コレクション（　Ｔｈｅ　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ　）にＡＴＣＣ２５９３．５として寄託
されている。<Summary of the Invention> According to the present invention, the above-mentioned drawbacks of conventionally known methods can be surprisingly overcome, and a method for producing polysaccharides by bacteria using the adhesive colony of bacteria Lamigera, species 115 has been developed. can be provided. The method of this invention comprises (~ carbon sources such as glucose, starch, potatoes,
Nitrogen sources such as ammonium chloride, ammonium nitrate or potassium nitrate, nutrient salts such as phosphates, sulfates, 0.15 to 45 mg/e (0.15 to 45 milligrams per liter), preferably 0.5 to 5 rng
/ (1 (1 liter 1-/l') corresponding 0.5 to 5
milligrams), iJIW's Fe-cl3 or Fe
Adhesive colonies of Lamigera are grown in a sterile aqueous culture medium containing iron salts such as 2(SC2)3, thereby obtaining a concentrated suspension of the bacteria. (B) Pour the above suspension into a fermenter containing a sterile aqueous medium with the above composition. In this fermenter, about 10 to 50 g/l
The bacteria are incubated for about 20 to 60 hours, preferably 30 to 50 grams per liter, to deplete almost all of the added carbon source at an initial concentration of about 30 to 50 grams per liter.
Keep time. Thereby, 30 to 50g/(
1 (30 to 50 grams per liter) of the polymer present in the form of capsules. American Type Lucha Collection (The
American Type Culture Col.
2593.5).

この発明による方法によって生成された多糖類は、通常
、特にブドウ糖、ガラクトースおよびジアヌル酸から造
られる。The polysaccharides produced by the method according to the invention are usually made from glucose, galactose and dianuric acid, among others.

培養基に鉄の塩を添加することによウ、バクテリアの成
長速度が著しく増加することが認められた。無菌の濾過
された鉄溶液を使用することが好ましい。Ｆｅ　として
計算された鉄の塩の量は、培養基１リットル当り少なく
とも０．１５］Ｔｌｇ、最大４５ｍｇ，　好ましくはｌ
リットル当シ最少０．５ｍｇ。It was observed that the growth rate of corrugated bacteria was significantly increased by adding iron salts to the culture medium. Preferably, a sterile, filtered iron solution is used. The amount of iron salts, calculated as Fe, is at least 0.15] Tlg, maximum 45 mg, preferably l
Minimum 0.5mg per liter.

最大５ｍｇである。培養基のＰＨは通常は少なくとも６
．０で、８．０を超過すべきではなく、好ましくは６．
５乃至７．５である４、 最初の媒養段階の期間中、バクテリアの成長が刺戟され
る。窒素は成長を制御膜する素子であるので、最初に添
加された窒素の量が消費され尽すと成長は停止する。培
養の次の段階は、バクテリアを包囲する多量のカプセル
の形で蓄積される多糖類を生産することである。多糖類
の生産特に培養基中に炭素源が存在することが必要であ
シ・これは一部は有機物に対して多糖類中に含まれる構
体ブロックに変換される出発材料として働き、一部はバ
クテリアが必要とするエネルギとなるものである。The maximum amount is 5 mg. The pH of the culture medium is usually at least 6.
．． 0 and should not exceed 8.0, preferably 6.0.
5 to 7.5.4 During the initial incubation stage, bacterial growth is stimulated. Since nitrogen is an element that controls growth, growth stops when the amount of nitrogen initially added is consumed. The next step in culturing is to produce polysaccharides, which accumulate in the form of a voluminous capsule that surrounds the bacteria. Production of polysaccharides requires the presence of a carbon source, especially in the culture medium; this serves partly as a starting material for organic matter to be converted into the building blocks contained in the polysaccharides, and partly for bacteria This is the energy needed by

この発明の１つの実施例によれば、上述の工程出から得
られた低粘度生成物の重合体の濃度は、後続する工程（
町において、さらに炭素源を連続的Ｖこ制御しつ＼添加
することによってさらに高くなる。According to one embodiment of the invention, the concentration of polymer in the low viscosity product obtained from the above-mentioned process step (
It is further increased by continuously controlled addition of carbon sources in the town.

この発明の他の実施例によれば、上述の工程（Ｂ）から
得られた低粘度生成物の重合体の濃度は、後後する工程
（Ｇ）において、さらに炭素源および窒素源を連続的に
制御しつ＼添加することによってさらに高くなる。According to another embodiment of the invention, the concentration of the polymer in the low viscosity product obtained from step (B) as described above may be further reduced by continuously adding a carbon source and a nitrogen source in a subsequent step (G). It becomes even higher by controlling and adding.

工程出で最初に添加された炭素源が消費されると、ＣＯ
２分析器からの信号で制御されるポンプによって、工程
（Ｆおよび（Ｇ）における炭素源が別々の容器からさら
に適量添加される。発酵槽の出口からのガス中のＣＯ２
の含有量は分析器によって連続的にモニタされる。Once the carbon source initially added at the start of the process is consumed, CO
The carbon sources in steps (F and (G) are added in further quantities from separate containers by pumps controlled by signals from the two analyzers. The CO2 in the gas from the fermentor outlet is
The content of is continuously monitored by an analyzer.

培養基へ炭素が添加されると、発酵槽の出口からのガス
中のＣＯ２の含有量は、ポンプにより発酵槽に送９込ま
れた基礎炭素源の量が消費されるまで増加する。ＣＯ２
の含有量が急速に減少すると、炭素源がくり返し添加さ
れる。この独特の方法により、多糖類の合成イ゛目の所
望の期間中、炭素源の濃度が維持されるように、炭素源
の添加を制御することができる。好ましいＣＯ２のレベ
ルは少なくとも０．２％、多くても３．０％、好ましく
は０．７乃至１．３％である。When carbon is added to the culture medium, the content of CO2 in the gas from the fermentor outlet increases until the amount of basal carbon source pumped into the fermentor by the pump is consumed. CO2
When the content of carbon decreases rapidly, the carbon source is added repeatedly. This unique method allows the addition of the carbon source to be controlled so that the concentration of the carbon source is maintained during the desired period of the first step of polysaccharide synthesis. Preferred CO2 levels are at least 0.2%, at most 3.0%, preferably 0.7 to 1.3%.

より多くの炭素源、およびより多くの炭華源と窒素源と
がそれぞれ添加される工程（巧および（（））からなる
上記の各実施例において、工程（、Ｂ　＋　（Ｆ）、お
よび日子（Ｇ）における各々の炭素源の総量は１リツト
ル当シ１５乃至７５ｇ（１５乃至７５ｇ／ｌ）、好７Ｌ
シくは１リツト／Ｌ／当シ２０乃至５０ｇ（２０乃至５
ｏｇｙｇ）である。In each of the above examples consisting of steps (Takumi and ()) in which more carbon sources and more anthracite sources and nitrogen sources are added, respectively, steps (, B + (F), and Hiko The total amount of each carbon source in (G) is 15 to 75 g per liter (15 to 75 g/l), preferably 7 L.
1 liter/L/20 to 50 g (20 to 5
ogyg).

工程（賜および（Ｇ）における炭素源としては、例えば
ラクトース、ぶどう糖、澱粉、あるいは馬鈴薯が使用さ
れる。As the carbon source in the step (G), for example, lactose, glucose, starch, or potato is used.

工程（烏＋（Ｆｌ、（Ｂ）　十（Ｇ）はそれぞれ３０乃
至４８時間以内で完了することが望ましい。It is desirable that each of the steps (Fl, (B) and (G) be completed within 30 to 48 hours.

工程（Ｇｌにおいて、炭素源と窒素源とを組合わせて添
加することにより、工程（Ｇ）の期間中に均一で高品質
の多糖類生成品が得られるという別の効果がある。The combined addition of carbon and nitrogen sources in step (Gl) has the additional advantage of providing a uniform and high quality polysaccharide product during step (G).

この発明のある奸才しい実施例では、炭素源として澱粉
が使用され、窒素源として塩化アンモニワムが使用され
、鉄の塩としてＦｅ（３１３が使用される。In one clever embodiment of the invention, starch is used as the carbon source, ammonium chloride is used as the nitrogen source, and Fe(313) is used as the iron salt.

通常は、工程（Ｃ）における多糖類およびバクテリアの
回収は、エチルアルコールあるいはイソプロパツールの
ようなアルコールを加えることによって沈澱させて行な
われる。好捷しくけ得られた沈澱物は工程（Ｄ）で遠心
分離器によって集められ、工程（目で通常は乾燥されて
最終生成品となる。しかしながら、工程（Ｃｌ、（ＤＪ
、および（国は、例えば最終生成品の使用によってそ肛
自体は周知の他の方法によって行なうこともできる。Usually, recovery of polysaccharides and bacteria in step (C) is carried out by precipitation by adding an alcohol such as ethyl alcohol or isopropanol. The precipitate obtained in step (D) is collected by a centrifuge in step (D) and dried, usually in the step (D), to give the final product.
, and (the production itself can also be carried out by other methods known in the art, for example by using the final product).

〈実施例の説明〉 以下、この発明を添付の図面を参照しつ＼詳細に説明す
る。<Description of Embodiments> Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

以下の実施例で、例１乃至５はこの発明に含まれない比
較試験に関するものであり、例６乃至１１はこの発明に
含まれる方法に関するものである。。In the following Examples, Examples 1 to 5 relate to comparative tests not included in this invention, and Examples 6 to 11 relate to methods included in this invention. .

１枚の図面にこの発明に含まれる３つの実施例が示され
ており、図面中の各文字は次の意味をもっている。Three embodiments included in the present invention are shown in one drawing, and each letter in the drawing has the following meaning.

Ａ、炭素源、窒素源、栄養塩および鉄の塩を含むこの発
明による水性培養基中でバクテリアを成長させる増瑣工
程を示す。A shows an enlargement process for growing bacteria in an aqueous culture medium according to the invention containing a carbon source, a nitrogen source, nutrient salts and iron salts.

Ｂ、多糖類の生産が行なわれる発酵槽培養工程を示す。B shows the fermentor culture process in which polysaccharide production takes place.

Ｃ０多糖類およびバクテリアが沈澱される例えば沈澱工
程からなる回収工程を示す。Figure 3 shows a recovery step consisting of, for example, a precipitation step in which the C0 polysaccharide and bacteria are precipitated.

Ｄ、沈澱された生成物が集められる遠心分離王手′ごを
示す。D. Shows the centrifuge where the precipitated product is collected.

Ｅ、乾燥工程を示す。E shows the drying process.

Ｆ８炭素源がさらに連続的に添加される発酵槽培養工程
を示す。Figure 2 shows a fermentor culture process in which an F8 carbon source is further added continuously.

Ｇ、炭素源および窒素源がさらに連続して添加される発
酵槽培養工程を示す。G, depicts a fermentor culture step in which a carbon source and a nitrogen source are further added sequentially.

例　１ バクテリア粘着集落ラミゲラ、菌種］４１５の集落がか
んでん培養基より２５０　：Ｅ　！ｌクラムの無菌媒体
を含む２リツトル　バフルド　Ｅフラスコへ移される（
〜。無菌媒体は次の成分からなる。Example 1 Bacterial adhesive colony Lamigera, bacterial species] 415 colonies were collected from Kanden culture medium at 250:E! Transfer to a 2 liter baffled E-flask containing 1 crumb of sterile medium (
~. The sterile medium consists of the following ingredients:

水溶液１リットル中 ぶどう糖　２５　ｇ Ｋ２ＨＰ０４２ｇ Ｋ［（２ＰＯ４，Ｉｇ ＨＣ１ ４１ｇ Ｍｇ５Ｏ４Ｘ　７　Ｅ（２００・２ｇ 酵母菌エキス（ティフコ：Ｄｉ、ｆｃｏ）　０．０１ｇ
次いでフラスコは２６°Ｃの温度の回転攪拌器（毎分１
００乃至３００回転）中で１８時間攪拌される。これに
よって得られたバクテリアｌ［濁液は発酵４：Ｑ９中の
滅菌培養基に供給される（Ｂ。この培養基は上記と同じ
組成をもっている。培養基１リットル当り毎分０・５リ
ツトルの空気が毎分約８００回転で攪拌される発酵槽中
に送シ込まれる。発酵槽の温度は２６°Ｃ，培養基のＰ
Ｈは１ｑａｏＨの自動滴定によって７．０に調整されて
いる。９５時間の培養後にぶどう糖は消費され、多糖類
の濃度は１１．５ｇ／７であった。Glucose in 1 liter of aqueous solution 25 g K2HP042g K[(2PO4,Ig HC1 41g Mg5O4X 7 E (200.2g) Yeast extract (Tifco: Di, fco) 0.01g
The flask was then heated on a rotary stirrer (1 minute per minute) at a temperature of 26 °C.
00-300 rpm) for 18 hours. The bacterial suspension thus obtained is fed to a sterile culture medium in fermentation 4:Q9 (B). This culture medium has the same composition as above. 0.5 liters of air per minute per liter of culture medium are It is fed into a fermenter that is stirred at about 800 revolutions per minute.The temperature of the fermenter is 26°C, and the P of the culture medium is
H was adjusted to 7.0 by automatic titration of 1qaoH. After 95 hours of cultivation, the glucose was consumed and the polysaccharide concentration was 11.5 g/7.

例　？ 工程ＣＢ＋における培養基にＣａｃｌ□溶液が添加され
るという違いがあるが、例１によるプロセスがくシ返さ
れる。添加されるカルシウムの総量は培養基１リツ）／
し当５３ｍｇである。９５時間後にぶどう糖は消費され
、多糖類の濃度は１０．１ｇ／ｌ　であった。example ? The process according to Example 1 is repeated, with the difference that Cacl□ solution is added to the culture medium in step CB+. The total amount of calcium added is 1 liter of culture medium)/
The amount is 53 mg. After 95 hours the glucose was consumed and the polysaccharide concentration was 10.1 g/l.

例　３ 工程（ａにおける培養基にＩψｎＳＯ４溶液が添加され
るという違いがあるが、例１によるプロセスがくシ返さ
れる。添加されるマンガンの総量は培養基１リットル当
ｐｓｍｇである。８５時間後にぶどう糖は消費され、多
糖類の濃度は１０．２　ｇ　／　（Ｊであった。Example 3 The process according to Example 1 is repeated with the difference that IψSO4 solution is added to the culture medium in step (a). The total amount of manganese added is psmg per liter of culture medium. After 85 hours the glucose is consumed. and the polysaccharide concentration was 10.2 g/(J).

例　４ 工程（Ｂ）　においてＣｖ　ｃ１４溶液が添加されると
いう違いがあるが、例１によるプロセスがくり返される
。添加される銅の総量は培養基１リットル当り３ｍｇで
ある。８５時間後にぶどう糖は消費され、多糖類の濃度
は１１．０　ｇ　／　ｌであった。Example 4 The process according to Example 1 is repeated, with the difference that in step (B) Cv c14 solution is added. The total amount of copper added is 3 mg per liter of culture medium. After 85 hours the glucose was consumed and the polysaccharide concentration was 11.0 g/l.

例　５ 工程（Ｂ）においてｚｕＣ１２溶液が添加されるという
違いがあるが、例１によるプロセスがくシ返される。添
加される亜鉛の総量は培養基１リットル当Ｐ）３ｍｇ、
である。９０時間後にぶどう糖は消費され、多糖類の濃
度は９−＃、／ｌとなった。、例　６ 工程（Ａ）および（Ｂ）における培養基にＦｅａ上、溶
液妙Ｓ添加されるという違いがあるが、例１によるプロ
セスがくり返される。添加される鉄の総量は培養基１リ
ットル当り３ｍｇである。４５時間後にぶどう糖は完全
に消費されており、多糖類の濃度は１３．２　ｇ　／　
ｌであった。また粘度は４００ｐであった。Example 5 The process according to Example 1 is repeated, with the difference that in step (B) zuC12 solution is added. The total amount of zinc added was 3 mg (P) per liter of culture medium;
It is. After 90 hours, the glucose was consumed and the polysaccharide concentration was 9-#,/l. , Example 6 The process according to Example 1 is repeated with the difference that FEA and solution S are added to the culture medium in steps (A) and (B). The total amount of iron added is 3 mg per liter of culture medium. After 45 hours, the glucose was completely consumed and the polysaccharide concentration was 13.2 g/
It was l. Further, the viscosity was 400p.

例　７ 粘着集落ラミゲラ、菌種１１５により細胞外多糖類を生
成するための培養基の最適Ｃ／Ｎ比は、供給することな
く各別のバッチ培養において設定さＫる。試験では約２
５ｇ／ｎの濃度のぶどう糖が使用された。それぞれの培
養において培養基に添加される窒素源の量を変えて（１
リットル当、Ｑ　ＮＥ（４Ｑｌを０．２５乃至４ｇの範
囲で変える）試験した結果、通常、ＮＥ（４Ｑβ　が１
リットル当り０．５乃至４ｇのときに添加されたぶどう
糖から多糖類が最適生産率で得られることが判った。全
培養時間は３０乃至６０時間であった。Example 7 The optimal C/N ratio of the culture medium for the production of extracellular polysaccharides by adherent colonies of Lamigera, species 115 is established in each separate batch culture without feeding. Approximately 2 in the exam
Dextrose at a concentration of 5 g/n was used. The amount of nitrogen source added to the culture medium was varied in each culture (1
As a result of the test (4Ql is varied in the range of 0.25 to 4g) per liter, the NE (4Qβ is 1
It has been found that optimum production rates of polysaccharides can be obtained from glucose added between 0.5 and 4 g per liter. Total culture time was 30-60 hours.

例　８ ぶどう糖を加えることによシ、さらに多量の炭素源を供
給することによってバッチ装置において多糖類が粘着集
落ラミゲラ、菌種１１５によって生成されるときの培養
基の最適Ｃ／　Ｎ比は通常１０乃至２５となるように設
定されている。初期バッチ・プロセス期間中に窒素の含
有量をより高くすることによって、通常よシも大きな細
胞集団が生成される。最初に加えられたぶどう糖が消費
されると、ぶどう糖の添加が開始される。存在する細胞
集団が実効的に添加されたぶどう糖を重合体に変換する
。ぶどう糖の量は、発酵槽の出口からのガス中に含まれ
るＣＤ２の含有量を測定するＣＯ２分析器からの信号の
大きさによって自動的に制御される。Example 8 When polysaccharides are produced by the adherent colony Lamigera, species 115 in a batch apparatus by adding glucose and also by supplying a large amount of carbon source, the optimum C/N ratio of the culture medium is usually between 10 and 115. It is set to be 25. Higher nitrogen content during the initial batch process typically produces larger cell populations. Once the initially added glucose has been consumed, glucose addition begins. The cell population present effectively converts the added glucose into a polymer. The amount of glucose is automatically controlled by the magnitude of the signal from the CO2 analyzer, which measures the content of CD2 in the gas from the fermenter outlet.

この信号が予め設定さ八た値以下に減少したときにぶど
う糖の供給が開始される。必要とする培養時間は通常約
３６乃至５４時間であった。Glucose delivery begins when this signal decreases below a preset value. The required culture time was usually about 36-54 hours.

例　９ 粘着集落ラミゲラ、菌種１１５をもった培養基中に溶解
される０２の最適量はバッチ培養中で設定される。それ
ぞれの試験でエアレーション率が変化された。溶解され
る０２の含有量に影響を与える攪拌は毎分８０’Ｑ回転
の一定に維持された。発酵槽を通じて供給される空気が
帆２５乃至１．５　ｖｖｍ　（単位培養基、毎分当りの
空気のよ）のときに、ぶどう糖を重合体に変換する最適
の条件が得られた。Example 9 The optimal amount of 02 to be dissolved in a culture medium with adherent colonies of Lamigera, species 115 is established during batch cultivation. The aeration rate was varied in each test. The stirring, which influences the content of dissolved 02, was kept constant at 80'Q revolutions per minute. Optimal conditions for converting glucose to polymer were obtained when the air supplied through the fermentor was between 25 and 1.5 vvm (unit culture medium, air per minute).

試験結果（Ｃよれば、ぶどう糖を良好に重合体に変換さ
せるだめには、溶解された０２の値は飽和値の２０％以
下にはならないことが判った。According to the test results (C), it was found that the value of dissolved 02 should not be less than 20% of the saturation value in order to successfully convert glucose into a polymer.

例　１０ この発明によれば、鉄は１．粘着集落ラミゲラを使用し
て重合体を有効に生成するために必要な微量元素（生育
に必要な極微化学元素）となることが判った。鉄はバク
テリアの成長段階期間中に添加されるべきである。培養
の開始時に発酵槽の培養基中に鉄溶液（約ｏ、ｏＩＭ　
）を添加することによυ、これを行なうことが望ましい
。発酵槽の培養基中における鉄の塩の含有量は、鉄とし
て計算して１リットル当す０．１５乃至４５ｍｇ、好ま
しくはｌリットル当９０．５乃至５ｍｇである。上述の
例７乃至９では、発酵槽中の培養基１リットル当シ２・
５ｍｇの濃度でＦｅ（３工、溶液の形で培養基中に鉄が
添加される。鉄を添加することにより、全処理時間が通
常約１００時間から約３６乃至６０時間に短縮された。Example 10 According to this invention, iron is 1. It has been found that this is a trace element (microscopic chemical element necessary for growth) for effectively producing a polymer using adhesive colony Lamigera. Iron should be added during the growth phase of the bacteria. Add an iron solution (approx. oIM
), it is desirable to do this by adding υ. The content of iron salts in the culture medium of the fermenter is from 0.15 to 45 mg per liter, preferably from 90.5 to 5 mg per liter, calculated as iron. In Examples 7 to 9 above, 1 liter of culture medium in the fermenter
Iron is added in the culture medium in solution form at a concentration of 5 mg Fe (3 steps). By adding iron, the total treatment time was reduced from the usual about 100 hours to about 36-60 hours.

例　１１ 最適のＣ／　Ｎ比が得られるようにぶどう糖を供給して
培養したときの試験、 試験ｌ 初期添加ぶどう糖の濃度は”５ｇ　／　５１窒素の濃度
は０．２６　ｇ　／　（ｌである。さらに培養基中には
次の成分が含丑れている。Example 11 Test when culturing was carried out by supplying glucose so as to obtain the optimum C/N ratio, Test 1 The concentration of initially added glucose was 5 g/51, and the concentration of nitrogen was 0.26 g/(l). Furthermore, the following components are contained in the culture medium.

Ｋ２Ｈ，ＰＯ４２ｇ　／　１ ＫＨ２Ｐ０４１　ｇ　／　１ Ｍｇ５○４Ｘ’７［（２００，２ｇ／／Ｊ酵母菌エキｙ
、　（Ｄｉｆｃｏ　）　０．０１　ｇ　／　１２．５　
ｍｇ／ｌ　（７）　Ｆｅ　ｃ１３Ｘ　６　Ｈ２Ｏが添加
された。最初に添加されたぶどう糖は５０時間以内で消
費された。発酵槽の培養基中にさらに多量のぶどう糖（
５ｇ＃）を加えると、重合体の濃度は高くなるが、重合
体の合成は遅くなる。K2H,PO42g/1 KH2P041 g/1 Mg5○4X'7 [(200,2g//J yeast
, (Difco) 0.01 g/12.5
mg/l (7) Fe c13X 6 H2O was added. The initially added glucose was consumed within 50 hours. A larger amount of glucose (
Adding 5 g #) increases the concentration of the polymer but slows down the synthesis of the polymer.

最終重合体濃度は１８　ｇ／Ｖ 最終細胞集団は２．３　ｇ／ｌ 粘度は２５．ＯＣ。Final polymer concentration is 18 g/V Final cell population is 2.3 g/l The viscosity is 25. O.C.

試験？ 培養基中の窒素の濃度は０．５２ｇ／ｊ！、他は試験１
と同様である。細胞集団の生成は１４時間後に停止した
。初期添加ぶどう糖ｔ／′ｉ２２時間後に消費した。test? The concentration of nitrogen in the culture medium is 0.52g/j! , others are test 1
It is similar to Generation of cell populations ceased after 14 hours. The initial addition of glucose t/'i was consumed 22 hours later.

新しいぶどう糖を添加することにより、ぶどう糖から重
合体への変換が速くなった。培養終了時（４８時間）に
、重合体濃度は３２４：／ｌであった。細胞集団の濃度
は４・３　ｇ、／ｌ、粘度は２２５Ｃｐ、であった。By adding fresh glucose, the conversion of glucose to polymer became faster. At the end of the culture (48 hours), the polymer concentration was 324:/l. The concentration of the cell population was 4.3 g/l, and the viscosity was 225 Cp.

試験３ 培養基中の窒素の濃度はｌ−０４ｇ／＃、Ｌがし他の条
件は試験ｌと同様である１、細胞集団の生成は１８時間
後に停止した。最初に添加されたぶどう糖は２０時間後
に消費された。新しいぶどう糖を添加することによりぶ
どうＮｉｈら重合体−＼の変換は極めて速くなったが、
大量のぶどう糖がＣＯ□として失なわれた。培養の終了
時（４５時間）に重合体の濃度は２５ｇ／ＩＩであった
。細胞集団は９．８　ｇ／（１゜粘度は２３０Ｕｐ、で
あった。Test 3 The concentration of nitrogen in the culture medium was 1-04 g/#, and the other conditions were the same as in test 1. The production of cell populations stopped after 18 hours. The initially added glucose was consumed after 20 hours. By adding fresh glucose, the conversion of Grape Nih et al. polymer became extremely fast; however,
A large amount of glucose was lost as CO□. At the end of the culture (45 hours) the concentration of polymer was 25 g/II. The cell population was 9.8 g/(1° viscosity 230Up).

上述の実施例は、培養基中に鉄が存在しないか、あるい
はカルシウムの塩、マンガンの塩、銅の塩、亜鉛の塩の
ような他の金属の塩を使用すると、特定の量の鉄の塩や
使用したこの発明による方法における培養時間よりも遥
かに長い培養時間を要することを示している。The above-mentioned examples demonstrate that the presence of iron in the culture medium or the use of salts of other metals such as calcium salts, manganese salts, copper salts, zinc salts, and the use of certain amounts of iron salts This shows that the culture time required is much longer than that in the method according to the present invention used in the present invention.

この発明は説明した実施例に限定されるものではなくこ
の発明の要旨によって表わされる範囲内で種々の方法で
変形が可能なことは言う迄もない。It goes without saying that this invention is not limited to the embodiments described, but can be modified in various ways within the scope of the gist of the invention.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

図はこの発明による多糖類の微生物による製造方法の１
乃至３の実施例の工程を示す図である。 Ａ・・・粘着集落ラミゲラ菌種１１５を無菌水性培養基
中で培養増殖させる工程、Ｂ・・・バクテリアの濃懸濁
液を発酵槽に移す工程、Ｃ・・・生成物の回収工程、Ｄ
・・・分離工程、Ｅ・・・乾燥工程、Ｆ・・・重合体濃
度を高める工程、Ｇ・・・重合体濃度を高める工程。The figure shows a method for producing polysaccharides using microorganisms according to the present invention.
It is a figure which shows the process of 3rd Example. A... Step of culturing and propagating adhesive colonies of Lamigera species 115 in a sterile aqueous culture medium, B... Step of transferring a concentrated suspension of bacteria to a fermenter, C... Step of collecting the product, D
... Separation step, E... Drying step, F... Step of increasing polymer concentration, G... Step of increasing polymer concentration.

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）粘着集落ラミゲラを、ぶどう糖、澱粉あるいは馬
鈴薯のような炭素源、塩化アンモニウム、窒化アンモニ
ウムあるいは窒化カリウムのような窒素源、燐酸塩およ
び硝酸塩のような栄養塩、および０・１５乃至４５ｍｇ
／ｌ、好ましくは０．５乃至５ｍｇ／ｌの濃度のＦｅ　
Ｃ（ｌ　ａ　６　ルイはＦｅ２（ＳＯ４）３のような鉄
の塩を含む無菌水性培養基中で増殖させ、上記バクテリ
アの濃懸濁液を得る工程（八と、上記の組成をもった無
菌水性培養基を含む発酵槽中に上記懸濁液を送り込み、
この発酵槽中にバクテリアを約２０乃至６０時間、好−
ましくは３０乃至５０時間維持して１リットル当り約１
０乃至５０ｇの炭素源の初期濃度で添加された殆んど全
炭素源を消費させ、それによって１０乃至３５　ｇ　７
’　（ｌのカプセルの形で存在する重合体を含む低粘度
の生成物を得る工程（ａと、 からなるバクテリア粘着集落ラミゲラ、菌種１１５によ
る多糖類の微生物製造方法。(1) Sticky colony Lamigera is treated with a carbon source such as glucose, starch or potato, a nitrogen source such as ammonium chloride, ammonium nitride or potassium nitride, a nutrient salt such as phosphate and nitrate, and 0.15 to 45 mg.
Fe/l, preferably at a concentration of 0.5 to 5 mg/l
C(l a 6 Louis is grown in a sterile aqueous culture medium containing an iron salt such as Fe2(SO4)3 to obtain a concentrated suspension of the bacteria (8) and a sterile aqueous culture medium with the above composition. Pour the suspension into a fermenter containing a culture medium,
Bacteria are incubated in this fermenter for about 20 to 60 hours.
Preferably, about 1 per liter for 30 to 50 hours.
An initial concentration of 0 to 50 g of carbon source consumes almost all of the added carbon source, thereby consuming 10 to 35 g of carbon source.
(a) A process for the microbial production of polysaccharides by the bacterial adhesive colony Lamigera, species 115, consisting of (a) （２）上記工程（Ｂ）で得られる生成物を、例えばエチ
ルアルコールあるいはインプロパツールのアルコールで
沈澱させて回収する工程（Ｃ）と、得られた沈澱物を実
収するだめの遠・ｕＯ離を含む分隘工程（Ｄｉと、分離
された生成物を好ましくは乾燥させて最終生成物を得る
工程（ｍとを含む、 特許請求の範囲（１）記載の多糖類の微生物製造方法。(2) A step (C) of recovering the product obtained in the above step (B) by precipitation with ethyl alcohol or impropatul alcohol, and a step (C) of recovering the product obtained in step (B); A method for microbial production of polysaccharides according to claim (1), comprising a division step (Di) and a step (m) of preferably drying the separated product to obtain a final product. （３）　炭素源を連続的に制御して添加することによシ
上記工程（ａで得られた低粘度生成物の重合体濃度をさ
らに高くする工程（町を含む、 特許請求の範囲（１）または（２）記載の多糖類の微生
物製造方法。(3) A step of further increasing the polymer concentration of the low viscosity product obtained in the above step (a) by continuously controlled addition of a carbon source (Claims (1) ) or the microbial method for producing polysaccharides according to (2). （４）炭素源と窒素源とを連続的に制御して添加するこ
とにより上記工程（ａで得られた低粘度生成物の重合体
濃度をさらに高くする工程０を含む、特許請求の範囲（
１）または（２）記載の多糖類の微生物製造方法。(4) The scope of claims (
The microbial method for producing polysaccharides according to 1) or (2). （５）炭素源として澱粉を使用し、窒素源として塩化ア
ンモニウムを使用し、鉄の塩としてＦｅＣ１！３を使用
することを特徴とする特許請求の範囲（１）乃至（４）
記載の多糖類の微生物製造方法。(5) Claims (1) to (4) characterized in that starch is used as the carbon source, ammonium chloride is used as the nitrogen source, and FeC1!3 is used as the iron salt.
The microbial production method of the polysaccharide described. （６）工程（ａおよび（Ｆ＋は合計３０乃至４８時間で
終了することを特徴とする特許請求の範囲（３）記載の
多糖類の微生物製造方法。(6) The method for microbial production of polysaccharides according to claim (3), characterized in that steps (a and (F+) are completed in a total of 30 to 48 hours. （７）　工程（Ｂｌおよび（Ｇ）は合計３０乃至４８時
間で終了することを特徴とする特許請求の範囲（４）記
載の多糖類の微生物製造方法。(7) The method for microbial production of polysaccharides according to claim (4), wherein steps (Bl and (G)) are completed in a total of 30 to 48 hours. （８）工程（巧および（Ｇｌにおいて、それぞれ炭素源
としてラクトースが添加されることを特徴とする特許請
求の頗囲（３）または（４）記載の多糖類の微生物製造
方法。(8) The method for microbial production of polysaccharides according to claim (3) or (4), characterized in that lactose is added as a carbon source in each of the steps (Takumi and (Gl)). （９）　工程（巧およびＣＧ＋における炭素源の〜引続
く添加（は、ＣＯ２分析器からの信号によって制御され
ることを特徴とする特許請求の範囲（３）または（４）
記載の多糖類の微生物製造方法。(9) Claim (3) or (4) characterized in that the step (~subsequent addition of carbon source in Takumi and CG+) is controlled by a signal from a CO2 analyzer.
The microbial production method of the polysaccharide described.