JPS60207060A - 毒素ａおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、シー・デイフイシル（Ｃ，ｄｉｆｆｉｃｉｌ
ｅ）、さらに詳しくはシー・デイフイシルの毒素に対す
る抗体の生成、毒素の精製およびシー・ディフイゾル毒
素の検出におけるその使用に関する。

嫌気性細菌であるクロストリジウム・デイフイシル（Ｃ
０ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は抗生物質関連偽膜性大腸炎と
関連して２つ、そのため、ヒトの便の標本中のシー・デ
イフインル（Ｃ，ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原の存在を確
かめるための試験が開発されている。

そうした試験の一つには、ヒトの糞便の培養が宮まれと
れには特別な設備と長い時間が必要である。この試験で
はまた毒素を産生じないノー・ディフィブル菌株も検出
され、このため誤った陽性の結果が出る。

もう一つの試験にはカウンター免疫電気泳動法を包含す
るが、しかしながら、今日使用されているこの試験は、
毒素を検出するのに十分なほど敏感ではなく、多くの誤
った陽性反応を与える。

さらに別の試験には、酵素免疫アッセイが包含される；
しかしながら今日使用されているこのような試験は、毒
性菌株と無毒性菌株の間に差異を認めず、その結果とし
て、この試験は誤った結果を与えるであろう。

本発明はシー・デイフイシルの毒素に対する抗体、シー
・デイフイシルの毒素、および毒素生産性シー・ディフ
インルについての検出を目的とする。

本発明の一つの観点に従えば、シー・ティフィ提供され
る。

本発明の別の観点に従えば、シー・ディフィシルの毒素
Ｂに対する単一特異性抗体、２よび固体支持体上に支持
されたそうした単一特異性抗体が提供でれる。

本発明のさらに別の観点に従えば、シー・ディのような
毒素が得られる。

本発明のさらにもう一つの観点に従えば、毒素Ａに対す
る単一特異性抗体を用いる、シー・デイフイシルの毒素
Ａについての検出法が提供される。

本発明のさらに別の観点に従えば、毒素生産性シー・デ
イフイシルについての検出法が提供される。

本明細書中で用いられるとき、「毒素Ａに対する単一特
異性抗体」とは毒素Ａに対する以外に、シー・デイフイ
ンルのいかなる抗原決定部に対する結合性をも有してい
ない抗体を意味している。

本明細書中で用いられるとき、「毒素Ｂに対する単一特
異性抗体」とは、毒素Ｂに対する以外に、シー・デイフ
イフルの抗原に対するいかなる結合性をも有していない
抗体を意味している。

本明細書中で用いられる単一特異性抗体には単クローン
性の抗体が包含される。

毒素Ａおよび／または毒素Ｂに対する単一特異性抗体は
、その抗体がシー・デイフインルの別の抗原決定部位に
対する結合性を有していない限り、シー・デイフインル
以外の細菌からでも産生されうることは理解されねばな
らない。

シー・デイフィンル抗体またはシー・デイフィシルに対
する抗体とは単一特異的ではない抗体を意味し、すなわ
ち、複数の抗体の混合物より成り、シー・デイフイシル
の毒素に対する抗体（毒素Ａｋ対する抗体および毒素Ｂ
に対する抗体）およびシー・デイフイシルの非毒素に対
する抗体を含有するものである。

毒素生産性シー・デイフィシルに対する抗体またはシー
・デイフイ／ルの毒素に対して特異的な抗体とは、毒素
Ａおよび毒素Ｂ以外の７−　・デイフイシルの抗原に対
する結合部位を崩していない抗体（毒素Ａに対してのみ
特異的な抗体と毒素Ｂに対してのみ特異的な抗体との混
合物）を意味する。

毒素Ａは、一般にエンテロトキシンと呼ばれる５、５を
有し、検出し得る炭水化１勿または燐を含有せず、しか
も検出し得る蛋白分解酵素活性を示さない。このものは
、ｐＨ２，０で不活性化し、ｐＨ１０，０で安定である
。毒素Ａは０．１６Ａ／のＮａ１ｌを含有する緩衝液に
よってＤＥＡＥから溶離される。

毒素Ｂは、一般にシー・ディフィシルの細胞毒素と呼ば
れる・／−・ディフイシル毒素である。毒いカーごく少
量の炭水化物を含有しくこれは夾雑物の可能性もある）
、しかも検出し得る蛋白分解酵素活性を示さない。毒素
Ｂは２．０より低いｐＨと１０．０を越えるｐｌｉによ
り不活性化され、塩濃度０．４Ｍでり、ＥＡＥカラムか
ら溶離される。

毒素Ａはエンテロトキシンと呼ばれるが、しかしながら
この毒素Ａは細胞樗性も有していることは理解嘔れねば
ならない。

本発明の一つの観点に従えば、毒素Ｂからの分離によっ
て部分精製されしかもまだ少量の非毒性蛋白質を含んで
いる毒素Ａは、さらに精製されて純粋な毒素Ａが生成さ
れる。本発明のこの観点によれば、毒素Ａの水浴液の７
）ＨＳよびモル濃度が残りの蛋白質を沈殿きせることな
く毒素Ａを沈殿させるように調整され、これによって純
粋な毒素Ａが回収される。

さらに詳細には、この水溶液のｐｌ７は、６．０より小
さいｐＨＫｍＷＡ整され、このｐＨで毒素Ａは他の蛋白
質の沈殿捷たは該毒素の変性なしに沈殿し、そしてこの
水溶液のモル濃度は０．ＩＭより低く調整され、この濃
度で毒素Ａは、他の蛋白質が沈殿することなしに沈殿す
る。一般に、ｐｌ−１は少なくとも５．０であり１．Ｈ
は好適には５．３から５．７までであり、最良の結果は
ｐＨ５，５で達成される。

浴液のモル濃度は一般に少なくとも０．００１Ａ／であ
って、最良の結果は０．ＯＩＭで達成される。

このモル濃度およびｐＨは、適当な塩類緩衝剤；例えば
酢酸す）　ＩＩウム緩衝剤、を用いることにより達成す
ることができる。モル濃度のＮＡ整は、その他の方法も
適用し得るけれども、透析によって行なうのが便利であ
る。

沈殿した純粋な毒素Ａはこの水溶液から回収され、緩衝
化されたｐＨ約７．５で水に溶解することができる。

本発明に従って精製して純粋な毒素を得るための部分精
製された毒素Ａは、当技術分野で一般に公知の方法によ
って回収す丞ことができる。例えば、毒素生産性シー・
デイフイシル菌株の培養物の上澄を、大きな分子（分子
量１００，０００以上）のみを保持する限外濾ボ膜を用
いて濃縮し、そして膜上に保持された物質をクロマトグ
ラフ・イーカラムにかける。次いでカラムＣＤＥＡＥ’
）を塩化ナトリウムの勾配（第一の勾配は最後に０．３
ＭＮａＣ１による洗浄をともなう０．０５〜０．２５Ｍ
ＮｃＬＣｔであり、第二の勾配は０．３〜０．６Ｍ　Ｎ
ａＣ１である）で溶離１−るカ瓢第−の勾配は毒素Ａを
溶離し、第二の勾配は毒素Ｂを溶離する。

ここで用いられる「純粋な毒素Ａ」とは、当技術分野で
公知の種々の高分解能の分析技術で検査したとき、毒素
ＡＪＪ！！剤が夾雑物質を含１ない（毒素Ａのみが存在
する）ことを示している。この中で用いられる「部分精
製された」とは、すべてではなく、一部の夾雑物が除去
されたことを示す。

上記の方法により製造したときの純粋な１４素Ａは、次
の判定基準ニゲル一本〔ディヴイス（Ｄａυｉｓ）、Ｓ
ＤＳ、２よび勾配ゲル〕あたり１００μＩの蛋白質を用
いて行ったときのアクリルアミドゲル電気泳動で単一バ
ンドを示す；シー・ディフィシル抗原の完全な混合物に
対して作られた抗血清を用いる交叉免疫電気泳動プレー
ト上で単一の免疫沈降線を示す；により純粋であり、そ
して動物に注入されたとき純粋な毒素Ａは毒素Ａに対す
る単一特異性抗体の産生を誘発する。

ン−・デイフイシルの毒素Ａに対する単一特異性抗体お
よびシー・ディフィフルの成木Ｂに対する単一特異性抗
体は、いくつかの異なった方法によって製造することか
できる。

一つの方法によれば、公知の培養法により産生されたシ
ー・ディフィシル培養物の上澄液を沸騰させてすべての
熱に対して不安定な蛋白質抗原（毒素および非毒素抗原
）を破壊し、これによってシー・ディフイシルの熱安定
性抗原のみを含有する物質を得る。この後、これらの抗
原を臭化シアンにより活性化した第一のセファローズ（
５ｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上に支持させる。

各々上に述べたようにＤＥＡＥクロマトグラフィーカラ
ムから溶離して得た、部分精製された毒素Ａｇよび部分
精製された毒素Ｂを、各々第二および第三の臭化シアン
活性化セファローズカラムに結合させる。

粗製のシー・デイフイシル抗原毒素（このような毒素は
この細菌により産生きれた多くの他の抗原とともに毒素
Ａと毒素Ｂとの両方を含む）に対する抗体は、適当な動
物；例えば山羊で産生湯れ、そして誘発された抗体はシ
ー・デイフインル抗原に対する抗体の混合物（このよう
な抗体混合物は熱に安定な抗原に対する抗体を含む非毒
性抗原に対する抗体と共に毒素Ａおよび毒素Ｂに対する
抗体を含有する）より成っている。非毎素抗体（非毒性
熱安定性抗原に対する抗体を除く）は、抗体混合物をシ
ー・デイフイシルの無毒性菌株の全菌体と接触させて、
それによって無毒性の熱安定性抗原に対する抗体を除く
非毒素に対する抗体を結合させることにより、抗体混合
物から除去される。

続いて、この抗体混合物（この段階において毒素に対す
る抗体Ｓよび非毒性の熱安定性抗原に対する抗体を含有
している）を、熱に安定なシー・デイフイシルの抗原が
支持はれた第一〇カラムに適用すると、それによって熱
安定性抗原に対する糖抗体はカラムに結合される。

熱安定性抗原に対する抗体を含まず、毒素ＡおよびＢに
対する抗体を含有する混合物は、この後、２つの部分に
分けられる。その１つは純粋な毒素Ａを支持した第二の
カラムに適用されそして他方は部分精製された毒素Ｂを
支持した第三〇カラムに適用されて、これにより第二カ
ラムでは毒素Ａに対する抗体がカラム中に支持された毒
素Ａに選択的に結合され、そして第三カラムでは、毒素
Ｂに対する抗体がカラム中に支持された毒素Ｂに選択的
に結合される。

毒素Ａに対する抗体および毒素Ｂに対する抗体は、各々
続いて、第二および第三〇カラムから、例えばチオシア
ン酸カリウムを用いて溶離され、それによって各々毒素
Ａに対する単一特異性抗体および毒素Ｂに対する単一特
異性抗体が得られる。

本明細書中で後に述べるいくつかの場合には、毒素Ａに
対する抗体と毒素Ｂに対する抗体との混合物は、無毒性
抗原の除去後、各々の毒素に対する単一特異性抗体に分
離することなく、例えば有毒素性ノー・デイフイシルの
検出に使用することができる。

別法として、毒素Ａに対する単一特異性抗体は、粗製の
シーーデイフィンル抗体を、固定した純粋な毒素Ａを有
するカラム支持体上に適用することによって生成するこ
とができる。非毒素Ａ抗体は充分な洗浄によってカラム
から除去され、毒素Ａに結合した残りの抗体はチオシア
ン酸カリウムを用いて溶離される。

これに代えて、毒素Ａに対する単一特異性抗体は、先に
述べたようにして製造した精製された毒素Ａから、適当
な動物、例えば山羊に毒素Ａ（多少のホルムアルデヒド
と混合して、抗原性を壊すことなく毒性を減少させるか
または抗体で中和したもの）を注射することによって産
生させることができる。毒素Ａに対する単一特異性抗体
はその後、前記の方法によって回収される。

本発明の単−特異性抗体Ｅよび毒素は、ノー・ディフイ
ンルの検出に用いるために固体支持体上に支持させるこ
とができる。または、このような抗体および毒素は支持
されない形でこうした検出に用いることもできる。

固体支持体を用いる場合には、この同体支持体は多種の
固体のいづれであってもよく、非常に多くの形態のいず
れか、例えば板、皿、粒状物、管、ノート等、で使用す
ることができる。

適当な支持体の代表例としては、ポリスチレン、ポリプ
ロピレン、置換ポリスチレン（例えばアミン化またはカ
ルボキシル化ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ポ
リアミド、ポリ塩化ビニルなどのような合成重合体支持
体；ガラスピーズ、アガロースなどが挙げられる。これ
らの支持体は、その支持体に直接結合させることができ
るように反応基、例えばカルボキシル化、アミン基など
を含有することができる。

本発明の種々の抗体および毒素は、種々の方法：例えば
、吸着、共有結合、適当な支持体の蛋白質Ａを用いる活
性化などによって固体支持体上に支持させることができ
る。

適当なカップ１ｊング剤の代表例としては、ジアルデヒ
ド類、例えばダルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド
、マロンアルデヒドなど；不飽和アルデヒド、例えばア
クロレイン、メタアクロレイン、クロトンアルデヒドな
ど；カルボジイミド類、ジイン／アン酸塩類；ジメチル
アジピメート；塩化シアヌルなどが挙げられる。適当な
カップリンダ剤の選定は、この明細書の記載から当分前
に習熟した人々には明白である筈である。

同様に、抗原は適当な支持体の活性化；例えば臭化シア
ン活性化アガロースによって支持される。

本発明の観点に従って、本発明の抗体２よび壽累は、シ
ー・デイフイ／ルの毒素Ａまたは霊累Ｂのどちらか、ま
たけ毒素生産性シー・ディフイシル（毒素Ａ８よび毒素
Ｂの両方）の検出に使用することができる。　。

こうした検出のある場合においては、−筐たけそれ以上
の反応に関与する物質は「標識をつけた」あるいは「札
つき」の形で使用され、このような標識または札は検出
に使用するのに当技術分野で公知の型のものである。従
って、例えば標識または札は、放射性沃素、放射性コバ
ルト、トリチウムなどのような放射性物質；酵素；螢光
物質；化学発光物質などであることができる。

標識は、当技術分野で一般に実施されているような方法
によって種々の物質に加えることができる。同様に、標
識または札は当技術分野で公知の方法；例えば、放射性
標識用針Ｍ器、酵素の比色検出、によって検出すること
ができる。

本発明の抗体および毒素は、シー・デイフィシルの検出
に支持きれた形ぢよび／または支持されない形で使用す
ることができる。

本発明の一具体化によれば、毒素Ａに対する単一特異性
抗体の使用によるシー・ディフイシルの毒素Ａに対する
検出法が得られる。

この具体化の一観点に従えば、シー・デイフイシルに対
する抗体は固体支持体；例えばマイクロタイタープレー
ト上に支持される。次に、支持された７−・デイフイン
ル抗体を、患者の糞便の希釈物のような分析されるべき
試料（分析物）と接触させ、そしてこの接触の結果とし
て、他のシー・デイフイシルの抗原と共にこの分析物中
に存在するすべての毒素Ａが、支持されたシー・デイフ
イ／ル抗体に結合される。続いて、結合した分析物をシ
ー・デイフイシルの毒素Ａに対する単一特異性抗体〔ノ
ー・デイフイシル抗体を作成した動物とは別の動物で作
成したもの〕と接触させ、そしてこの単一特異性抗体は
、結合した分析物中に毒素Ａが存在する場合にのみこの
毒素Ａにより結合される。

この単一特異性抗体はそれ自体、先に記載したような酵
素螢光物質または放射性物質で標識付けされてよく、そ
して毒素Ａの存在は、この標識の存在を検出することに
より決定することができる。

これに代えて、毒素Ａに結合された単一特異性抗体は、
単一特異性抗体が生じた動物の抗体に対して特異的な標
識された抗体を用いることによって検出することができ
；このものは毒素Ａに結びついた単一特異性抗体に結合
する。この方法は、当技術分野では二重抗体サンドイッ
チ型のＥＬＩＳＡ検定法と呼ばれる。

分析物中の毒素Ａの存在は、検定におけるその、単一特
異性毒素Ａ抗体との相互作用によって決定することがで
きる。

上記の方法は、また、毒素Ａに対する単一特異性抗体の
代りに毒素Ｂに対する単一特異性抗体を用いることによ
り分析物中の毒素Ｂの決定にも用いることができる。

シー・デイフイフルの毒素Ａに対するもう一つの検出法
では、毒素Ａに対する単一特異性抗体を固体支持体、例
えばマイクロタイタープレート上に支持させ、この支持
された毒素Ａに対する単一特異性抗体を、毒素Ａを含有
すると思われる分析物と接触させると、これによって試
料中に存在するすべての毒素、４（Ｌかも毒素Ａのみ）
が、支持された単一特異性抗体に結合されることになる
。

結合した毒素Ａの存否８よび／または量は、その後結合
した毒素Ａを標識された形の７−・ディフイシル抗体と
接触させることによって決定することができるが、この
ときこうした標識抗体はすべての結合された毒素Ａによ
り結合される。次に分析物中に存在する毒素Ａの存否お
よび／または量は、結合された標識抗体の存否および／
″または量の決定によって決定される。

上記の方法はまた、毒素Ａに対する単一特異性抗体を毒
素Ｂに対する単−考異性抗体で置き換えることにより、
毒素Ｂについての検出に用いることができる。

毒素Ａについてのさらに別の検出法に従えば毒素Ａを含
有するか筐たは含有が疑われる分析物をマイクロタイタ
ープレートのような固体支持体と接触させ、それによっ
て少なくとも分析物中の毒素Ａを固体支持体上に支持式
せる。次いでこの毒素Ａの存在を毒素Ａに対する単一特
異性抗体によって検出する。支持された毒素Ａは選択的
に毒素Ａに対する単一特異性抗体のみを結合する。すな
わち、単一特異性抗体は、支持された分析物の毒素Ａを
介して固体支持体上に支持される。この抗体は、その検
出を可能にするために結合した酵素のような標識を有す
ることができ、あるいは、毒素Ａに結合したこの抗体と
反応する椰識伺けした別の抗体を使用することができる
（サンドインチＥＬＩＳＡ法）、結合した標識抗体の存
否および／または量は、分析物中の毒素Ａの存否または
量の尺度である。

さらに別の検出法によれば、毒素Ａを凝集反応法によっ
て検出することができる。このような方法に従えば、毒
素Ａに対する羊−特異性抗体で感作された固体粒子を、
毒素Ａを富有するかまたは富有すると思われる分析物と
接触させる。毒素Ａが存在すると粒子の凝集がおこる。

この凝集反応による検出はまた毒素Ａに対する単一特異
性抗体の代りに毒素Ｂに対・する単一特異性抗体を用い
ることにより、毒素Ｂの検出にも適する。

さらに別の検出法に従えば、毒素Ａは精製した毒素Ａで
感作した（または毒素Ａを苫む、粗製シー・ディフィシ
ル毒素で感作した）固体粒子を、毒素Ａを含有するかま
たは含有すると思われる分析物とシー・デイフイシルの
毒素Ａに対する単一特異性抗体との両方と接触させるこ
とによる凝集阻止法により決定することができる。この
とき分析物中に毒素Ａが存在すれば単一特異性抗体によ
り感作された粒子の凝集が阻止される。このような方法
はまた、粗製毒素で粒子を感作し、毒素Ｂに対する単一
特異性抗体を使用することにより、毒素Ｂの決定に使用
することもできる。

さらに別の変形としては、この検出法は、有毒性シー・
デイフイシルに対する抗体（無毒性抗原に対する結合部
位を有していない、毒素Ａに対する単一特異性抗体と毒
素Ｂに対する単一特異性抗体との混合物）を用いること
により毒素生産性シー・デイフイシル（毒素Ａおよび／
または毒素Ｂ）の決定に使用することができる。このよ
うな二種の単一特異性抗体の混合物を使用することによ
り、試料中の毒素Ａかまたは毒素Ｂの存在を決定するこ
とが可能である。

本発明につき、下記の実施例によりさらに説明する。し
かしながら、本発明の範凹は実施例のみに限定されるも
のではない。

実施例Ｉ 毒素Ａに対する単一特異性抗体、および毒素Ｂに対する
単一特異性抗体の調製 液透析管フラスコ（ｂｒａｉｎ　ｈｅａｒｔ　１ｎｆｕ
ｓｉｏｎｄｉａｌｙｓｉｓ　ｔｒｔ、ｂｅ　ｆｌａｓｋ
）に、／−・デイフイシルＶＰＩ菌株１１１８６（毒素
非生産性）３よびシー・デイフイシルＶＰＩ菌株１０４
６３（毒素生産性）の活発に増殖中の培養物０．１コを
接種し、これらのフラスコを３７℃で３日間培養した。

内容物の遠心分離（９，０００Ｘｇ、１５分〕によって
菌体を透析袋の内側に得た。

（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　、　毒素Ａ　（ＴｏｚＡ　
）　ニー１７　ｏ　二／、菌株１０４６Ｂの分離菌体（
１２本のフラ′スコから得た約１５ｍＡりを、０．　Ｉ
　Ａｆ　ＮａＨＣＯｓ　０．５　ＡｆＮａｃｔ、　ｐＨ
８で３回（１回の洗浄あたり３Ｑ＋＋ｔｌ）洗浄した。

菌体先浄液を集めて１５分間１００℃に加熱した。沈殿
した菌体を遠心分離（１２，０００Ｘｊｊ３０分間）に
よって除去し、上澄液（９Ｑｍｌ？ニｖｉ白質約３４１
ｎ９）を、１８ｇのＣＮＢｒで活性化された６０ｒｎｌ
のセファローズ４Ｂ〔スウェーデン、ウプサラ、ファル
マンア・ファイン・ケミカルズ（ｐｈａｒｎｖＬｃｉａ
　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ、１ｃａｌｓ）　）に加えた。こ
の懸濁液を４℃で一夜静かに撹拌し、結合しない９勿質
を、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３−０，５Ａｆ　ＮａＣ
ｔベッド容°計でこのゲルを洗浄することによって除去
した。洗浄液を蛋白質分析すると、このゲル調製物は、
ゲル１ｍｌあたり約ｏ、５ｒｎｙの蛋白質を含有してい
ることが示された。セファローズゲル上の残存活性基を
１ベツド容量の１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８、を加え
て、ゲルを４℃で一夜撹拌することによって封鎖こだ。

ＢＣＷ−セファローズと命名したこのゲルを交互に’０
．１Ｍ１１１′ｌ−酸ナトリウＡ−０，５Ａｒ　ＮａＣ
Ｌ、　ｐＨ４Ｘ１６よび０；　Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｆＣＯｓ
−０，５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ８、（１回の洗浄につき２
ベツド容量〕で４回洗浄した。

部分精製した毒素Ａ′ｊ６よび毒素Ｂを、実施例■に記
載したＤＥＡＥセファローズＣＬ−６Ｂ〔ファルマシア
・ファイン・ケミカルス（ＰｈａｒｎｍｃｉａＦｉｎｅ
　ＣｈｅｎＬｉｃａｌｓ）上のイオン交換クロ’？トゲ
ラフイーにより製造し、各調製物を０．１　Ｍ、　Ｎａ
ＨＣＯ。

−０，５Ｍ　ＮａＣ１に対して４℃で一夜透析した。

毒素ＡＣ２０ｍｌ中約３．　ｓ　ｍｇの蛋白質および毒
素ＢＣ２０ｍｌ中約１．１巾約の蛋白−〕を各々、ＢＣ
Ｗ−セファローズについて記載したように、７ｇのＣＮ
Ｂ　ｒで活性化したセファローズ４Ｂ２ｏｍｌに結合さ
せて、洗浄液の蛋白分析により、毒素Ａにセファローズ
２よび毒素Ｂ−セファローズは各々ゲル１　ｍｌあたり
蛋白質１７０μｇ２よび蛋白質５４μＩを富有すること
が示された。

毒素ＡおよびＢに対する単一特異性抗血清の精毒素Ａお
よびＢを含有する粗製の７−・ディフイ・／ル調製物に
対する山羊抗血清は、冷蔵したポルムアルデヒドを用い
て文献記載の方法で製造した〔エーリッヒＣＥｈｒｉｃ
ｈ）、エム（Ｍ）、アール・エル・ファン・タセル（Ｒ
，Ｌ、ＶＣＬｎ　Ｔａ５ｓｅｌＬ）、ジエイ・エム・リ
ビー（Ｊ、Ｍ、Ｌｉｂｂｙ）、およびティー・ディ〜・
ウィルキンス（Ｔ、Ｄ、ＷｉＬｋｉｎｓ）、１９８０、
プロダクション・オブ・クロストリジウム・ディフィン
ル・アンティトキシンＣＰｒｏｄｕｃ−ｔｉｏｎ　ｏｆ
　Ｃ；１ｏｓｔｒｉｃｌｉ１１．ｎＬｄｉｆｆｉｃｉｌ
ｅ　ａｎｔｉｔｏｘｉｎ）、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｖ、
ｎ、　２８　：１０４１−１０４８）。

菌株１１１８６菌体の懸濁液（３ｍ７！のｏ、８５％Ｎ
ａＣ１中１．５献の遠心分離菌体に抗血清（５ｍｌ）を
加えて、混合物をボッター・エルヴエジャム（Ｐｏｔｔ
ｅｒ　ＥｌｔＩｅｈｊａｍ　）組織破砕機で靜かに均質
化してから、室温で２時間回転させた。続いて菌体を遠
心分離（１’２，０００Ｘｆｊ　３０分間）ニよッて除
去し、上澄液を０．４５μｍの膜を通し、ミニコン（姐
ルｉｃｏル）−ＢＩ３濃ｍ機ｃマサチューセソッ州、レ
キ／ントン、アミコン社（ルル１ｃｏｎＣｏｒｐ、）　
）でＩＸまで濃縮した。菌株１１１８６菌体で吸収した
抗血清（４，１ｍ１）をＢＣＷ−セファローズのカラム
（１，５ｘ　８１．４　ｃｒｎ　）に適用して吸着され
ない物質を室温で２ベツド容量の０．ＩＭＮａＨＣＯｓ
　０．５’ＮａＣ１，ｐＨ８、を用いて流量４０ｍ１／
ｈで溶離した。溶離液を、ＰＭ１０膜〔アミコン社（Ａ
ｒｎ１ｃｏｎ　Ｃａｒｐ、　）　：］を備えた撹拌セル
中での限外濾過によりＩＸまで濃縮した。ＢＣＷ−セフ
ァローズ溶離液（４，１ｍ１）を２等分し、各々ヲＴｏ
ｘＡ−セファローズおよびＴｏｘＢ−セファローズのカ
ラム（ＩＸ２５ｃｍ）にかけた。吸着されない物質を流
量４０ｍ１／ｈで、２ベツド容量の０、　Ｉ　Ａｆ　Ｎ
ａ１ｉＣＯ３−０，５Ｍ　ＮａＣ１，７）ＩＩＢを用い
て、室温で各カラム−から溶離した。溶離液を限外過に
よってＩＸまで濃縮した。

ＴｏｘＡ−セファローズおよび７’ｏｘＢ−セファロー
ズからの未吸着物質を溶離した後、これらのカラムを、
２８０　ｎｍにおける測定し得る吸光がなくなるまで、
０．ＩＭ　ＮａＨＣＯ３−０，５Ａ／　ＮａＣ１゜ｐＨ
８・で洗浄した。これらのゲルに結合した抗体を、各カ
ラムに５ｍｌの８．５ＭＫＳＣＮ、　ｐｌｉ６．８を用
い、０．１　Ａｒ　ＮａＨＣＯ３−０，５Ａｒ　ＮａＣ
Ｌで洗浄することによって溶離した。はぼ２ベツド容量
を各カラムから集めた。溶離液を４℃で一夜、０．１Ｍ
硼酸塩−緩衝化塩溶ｔｉ　ｐＨ８，５，４ｔに対して透
析し、限外濾過によりＩＡ’ｔで濃縮した。

ＴｏｘＡ−セファロースカラムから溶離した抗体は、シ
ー・ディフィシルの毒素Ａに対する単一特異性抗体であ
り、ＴｏｚＢ−セファローズカラムから溶離した抗体は
シー・ディフィノルの毒素Ｂに対する単一特異性抗体で
ある。

１、Ｇ分画の精製 ＴａｘＡ−セファローズおよび’ｆ’ｏｘ　Ｂ−セファ
ロースカラムかう溶離した抗体を、ウサギのＩｙＧの精
製について製造業者により推奨されるＤＥＡＥＡｆｆｉ
　−Ｇｅ　ｌ　Ｂｌｕｅ　（＝　ニー　ヨーク州、ロッ
クビルセンター、パイオーラッド・ラボラトリーズＣＢ
ｉｏ　−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））上のク
ロマトグラフィーによって精製した。抗血清試料（２ｍ
Ａりを、ＤＥＡＥ　Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｂｌｖ、ｅのカ
ラム（Ｉ　Ｘ　３１．８ｃＩｒＬ）にかけて、流量２０
ｍ１７ｈで溶離した。精櫃されたＩ、Ｇを含有する分画
（２ｍｌ　）を集めて、限外濾過によってＩＸまで濃縮
した。

実施例■ シー・デイフイシルの純粋な毒素Ａの調製細菌菌株クロ
ストリジウム・デイフイシルＶＰＩ菌株１０４６３を、
２リツトルの刷上臓浸出液ＣＢＩ−１１）透析フラスコ
中で、３７℃で７２時間増殖させた。８，０００　Ｘｇ
で１０分間遠心分離し、０．４５μｍ、のメンブランフ
ィルタ−〔マサチューセッツ州、ベッドフォード、ミリ
ポア社ＣＭｉ　ｌ　１ｉｐｏｒｅＣｏｒｐ、）’）を通
して濾過した後、培養上澄（約７５０ｍ１　）を、薄溝
（シンチャネル）型濃縮磯でＸＭ−１００メンブランフ
ィルタ−〔マサチューセソッ州、レキシントン、アミコ
ン社（Ａｒｎ１ｃｏｎ　Ｃｏｒ７）−）〕を用いて４℃
での限外濾過によって５９＋＋＋１！まで濃縮した。残
留物を、５０　ｍＭ　）　’Ｊスス−−１ｃｔ緩衝液、
ｐＨ’１．５（４℃）、１５００＋＋＋Ａ’で洗浄し、
最終容積４Ｏ−５Ｑ＋ｎＡ！まで濃縮した。これによっ
て多くの分子量の小さい夾雑物が除かれた。濃縮した上
澄を、５０　ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５で平
衡させた２、５Ｘ１０ｃｍのＤＥＡＥセファローズＣＬ
−６Ｂカラム上に適用した。試料を適用した後、とのカ
ラムを、０．０５ＡｆのＮａＣＬを含有する５０ｍＭの
トリス−１１ＣＬ、ｐＨ７，５，２００ｍＡ！で洗浄し
た。この試料を最初に３００ｍ１の、５０　ｍＭ　トリ
ス−ＨＣ１緩衝液中の直線ＮαＣｔ勾配（０，０５−０
，２５Ｍ　ＮａＣ１）で溶離し、次いで０．３ＭのＮ　
ａ　Ｃｔを官有する５　０　ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７，５，１５０ｍ／を使用して洗浄した。この０．３
ＭＮ　ａ　ＣＬ洗浄の後に、同一緩衝液８００ｍ１中の
第２の直線勾配（０，３−０，６Ｍ　ＮａＣ１）を用い
た。

カラムの流量は、４℃で毎時５５−６０　ｍｌで重力に
より行なった。分画Ｃ４，２ｍ１）を果めて、ＣＨＯ−
Ｋｔ　細胞を用いて細胞毒性について検定を行なった。

最も高い細胞毒力価を含む分画を集めて、読過滅菌し、
４℃で貯蔵した。第１およびε■２のＮａＣＬ勾配中に
溶出した毒素は各々毒素ＡおよびＢと命名され、これら
は各々部分精製された毒素ＡおよびＢである。

第１のＤＥＡＥ勾配からの毒性分画５ないしｌ　Ｑ　ｒ
ｎｌ　（毒素Ａ）を、１リツトルのＯ，’０１　Ｍ酢酸
す）　ＩＪウム緩衝液７ｙｌ−１５，５に対し、４℃で
１８−２４時間透析した。この透析物を１６９　Ｘｇで
１０分間遠心分離して沈殿を回収した後、同じ酸１俊塩
緩衝液５ｍｌで洗浄し、再び遠心分離した。沈殿を、０
．０５ＭのＮａ’ＣＬを含有する５　０　ｒｎＡ（）リ
スーノＩＣＬ、ｐＨ７，５，５−５−１Ｏ甲に溶）祥し
、精製した毒素Ａの溶液を濾過滅菌して４℃で貯蔵した
。

実施例■ 下記の緩衝液を毒素Ａ２よびＢの検出に使用する。炭酸
塩緩衝液（コーティング緩衝剤）１．５９．！１７＃α
２ＣＯ３ ２，９３ｇ’　Ｎ　ａｌｉ’ｃ　Ｏ３ ０、２０ｇ　ＮａＮ５ ｄ　ｌｌ２Ｑを用いて１リツトルとする；　ｐ＃９．６
　；室温で貯える（２週間以内に使用すること）燐酸塩
−緩衝化塩溶液−ソイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０ＣＰ
ＢＳ−Ｔ） ８．０ｇ　ＮａＣＬ ０．２　ｇＫＨ２ＰＯ４ ２，９ｇ　Ｎα２ＨＯＰ４・１２Ｈ２０（２，２，９Ｎ
α２ＨＯＰ４・７＃２Ｑ） ０、２．９　ＫＣｌ Ｑ、５ｍｌツイーンＣＴＵｅｅｎ）２０　（ポリオキシ
エチレンノルビクンモノラウレ−１・） ０、２　、ｌｉ’　１ＶａＮ３ ｄＨ２０を用いて１リツトルとし、ｐＨ７，４とする ジェタノールアミン緩衝液（アルカリホスファターゼの
基質用） ９７　ｎｒｌ　ジェタノールアミン ８００ａｔ　ｄＩＩ２゜ ０、２　ｇＮａＮ３ １ｏｄａｇＭｙＣｔ２・６１１２０ １ＡＩＨＣ１を滴加してｐＨ９，８とし、ｄＨ２０で体
積を１リツトルとする；室温で褐色びんに貯蔵する；基
質溶液用には、緩衝液１　’ｍｌあたり基質ＩＩｎｇを
加える。

クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの検出 １）ダイナチクイムロンＣｆ）’／ｎａｔｅｃｈ　Ｊｍ
ｎｔｕｌｏｎ）２型マイクロタイタープレートの各ウェ
ルに、ウサギの抗血清〔シー・ディフィシルに対する抗
体〕の×。、ｏｏｏ希釈物（炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６
、中）２００μｔを加える。４℃で一夜インキユベート
する。

２）プレートを空にして、各ウェルに０．５％の牛血清
アルブミンを富有するＰＢＳ−Ｔ２００μｔを加える。

プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。

３）プレートを空にして、谷ウェルにＰＢＳ−Ｔ２００
μｔを加える。プレートを室温で５分間インキュベート
する。

４）フレートを空にして、ウェルに、ＰＢＳ−Ｔ中の試
料希釈物または毒素希釈物（１：２）を２００＋＋＋ｌ
加える。プレートを３７℃で１時間かまたは室温で一夜
インキユベートスる。

５）プレートを空にして各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗
浄する。

６ン　各ウェルに毒素Ａまたは毒素Ｂのどちらかに対す
る単一特異性抗体のＰＢＳ−Ｔ甲のに。ｏｏ　希釈物を
２００１１ｔ加える。プレートを３７℃で１時間インキ
ュベー１・する。

７）プレートを空にして、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回
洗浄する。

８）各ウェルに、アルカリホスファターゼと結合させた
ウサギの抗山羊ＩｆＧの４゜。希釈物ＣＰＢＳ−Ｔ中）
を２００μを加える。プレートを３７℃で１時間インキ
ュベートする。

９）プレートを空にして、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回
洗浄する。

１０）各ウェルに２００μｔのｐ−ニトロフェニルホス
−ｙｘ　−）　（ｌｒｎｇ／ｖｔジェタノールアミン緩
衝液中）を加える。プレートを室温で１時間インキュベ
ートする。

■）各ウェルに２０μｔの５　Ｎ　Ｎａ　０１１を加え
て反応を停止させる。

１２）谷ウェルの内容物を０．８ｍｌのｄ　Ｈ２０と混
合しく検定混合物の全容量的１　ｍｌ）、４０５　ｎｍ
での吸光度を測定する。

本発明は、シー・デイフイシルの毒素のみに特異的な抗
体を生成することが可能であることにおいて特に有利で
ある。結果としてシー・デイフインル自体でなくこれら
の毒素の存否を決定するだめの検出法が得られ、そのた
めこの方法は誤った陽性結果を減少させるかまたは避け
ることを可能とする。

その上、本発明はこれらの毒素のどちらか一方または両
方の毒素のいづれを目的とすることもできる検出法を与
えるという利点がある。

本発明による毒素の検出法は迅速で、しかも従来の検出
法よりも費用がかからない。上記の開示により、本発明
の多くの改良および変形が可能であり、そのため特許請
求の範囲を逸脱することなく本発明は詳細に記載したも
のとは異なる態様で実施することもできる。

特許出願人　ベクトン・デイノキンノン・アンド・カン
ノマ二一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　クロストリジウム・ディフィノル（Ｃ１ｏｓｔ
   ｒｉ−ｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の精製された毒
   素Ａ０（２）夾雑蛋白質を含有する毒素Ａの水性溶液の
   ｐＨ−ｊ６よび塩のモル濃度を、夾雑蛋白質の沈殿を生
   ずることなく毒素Ａを該溶液から沈殿させるために、夾
   雑蛋白質の沈殿も毒素Ａの変性も生ずることなく毒素Ａ
   が該溶液から沈殿する６より低いｐＨ−Ｊ６よび夾雑蛋
   白質の沈殿を生ずることなく毒素Ａが沈殿する０、１Ｍ
   より低い塩濃度になるよう調節し、そして沈殿した毒素
   Ａを精製毒素Ａとして回収することよりなる、夾雑蛋白
   質を含有する部分ａ製されにクロストリジウム・ディフ
   ィンルの毒素Ａの精製方法。 （Ｂ）　ｐＨが５以上であり、塩のモル濃度が０．００
   １Ｍ以上である特許請求の範囲第２項記載の方法。 （４）　ｐＨが５．３ないし５．７である特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 （５）　ｐＨが５．５であり塩のモル濃度が０．０ＩＡ
   ｆである特許請求の範囲第４項記載の方法。