JPS60199385A - プラスミドベクタ−ｐＴＰ２０−１０ - Google Patents
プラスミドベクタ−ｐＴＰ２０−１０Info
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- JPS60199385A JPS60199385A JP59054975A JP5497584A JPS60199385A JP S60199385 A JPS60199385 A JP S60199385A JP 59054975 A JP59054975 A JP 59054975A JP 5497584 A JP5497584 A JP 5497584A JP S60199385 A JPS60199385 A JP S60199385A
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- plasmid vector
- resistance
- ptp20
- plasmid
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- Biochemistry (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、宿主菌に導入した場合、宿主菌がアンピシリ
ン、テトラサイクリン及びトリメトプリムに苅して耐性
を役得することができるプラスミドｐＴＰ２０−１０
（以下ｐ’ｒｐ ２０−１０と略す）に関するものであ
る。
ン、テトラサイクリン及びトリメトプリムに苅して耐性
を役得することができるプラスミドｐＴＰ２０−１０
（以下ｐ’ｒｐ ２０−１０と略す）に関するものであ
る。
近年、分子生物学及び遺伝子工学の発展を背景に組替え
ＤＮＡ手法を用いて有用な物質を生み出す方法、例えば
大腸菌などの細菌に異種ＤＮＡを導入し、その遺伝子を
発現させるなどの手法によって有用な物質を生み出す方
法が脚光を浴びつつあり、最近ではこの遺伝子組替え手
法に、より、インターフェロン、インシュリン、成長ホ
ルモン等極めて有用な物質の実用化に向けて研究開発が
行なわれている。
ＤＮＡ手法を用いて有用な物質を生み出す方法、例えば
大腸菌などの細菌に異種ＤＮＡを導入し、その遺伝子を
発現させるなどの手法によって有用な物質を生み出す方
法が脚光を浴びつつあり、最近ではこの遺伝子組替え手
法に、より、インターフェロン、インシュリン、成長ホ
ルモン等極めて有用な物質の実用化に向けて研究開発が
行なわれている。
上記の異種ＤＮＡを導入し、その遺伝子を発現させるた
めの手段として一般にプラスミドベクターと呼ばれるも
のが利用される。プラスミドベクターは、宿主に導入さ
れた場合、導入されていない宿主と容易に識別しうるよ
うに宿主に薬剤などに対する抵抗性を与える遺伝子、す
なわち遺伝標識（以下マーカーと略す）を有することが
必要である。例えば、プラスミドベクターｐＢＲ３２２
はテトラサイクリン（以下Ｔｃと略す）耐性及びアンピ
シリン（以下んと略す）耐性を、ｐ ＡＣＹＣ１８４は
クロラムフェニコール耐性及びん耐性をマーカ−として
有している。
めの手段として一般にプラスミドベクターと呼ばれるも
のが利用される。プラスミドベクターは、宿主に導入さ
れた場合、導入されていない宿主と容易に識別しうるよ
うに宿主に薬剤などに対する抵抗性を与える遺伝子、す
なわち遺伝標識（以下マーカーと略す）を有することが
必要である。例えば、プラスミドベクターｐＢＲ３２２
はテトラサイクリン（以下Ｔｃと略す）耐性及びアンピ
シリン（以下んと略す）耐性を、ｐ ＡＣＹＣ１８４は
クロラムフェニコール耐性及びん耐性をマーカ−として
有している。
プラスミドベクターに異種遺伝子を挿入する方法として
、適当な制限酵素によってプラスミドベクターを切断し
、この切断に用いた制限酵素の切断によって得られるの
と同一の末端構造を有する異種ＤＮＡ （一般には、プ
ラスミドベクターの切断に使用した制限酵素を用いた切
断によって得られるＤＮＡ断片を用いる）とを、ＤＮＡ
ＩＪガーゼという酵素を用いて連結して再び連状化する
方法が、普通に行なわれる。このようにして作られる組
換えプラスミドを宿主に導入し、目的のプラスミドが導
入された宿主菌を増殖させ、挿入された異種ＤＮＡに暗
号化されたタンパク質の生産を行うのである。ところが
、組換えプラスミドを作成する過程において、プラスミ
ドベクターのみが再選状化したものが得られ、異種ＤＮ
Ａが挿入されたプラスミドを有する宿主を見いだすのが
困難となることがある。このことを防ぐために異種ＤＮ
Ａが、プラスミドベクターの特定の部位に挿入された場
合、特定のマーカーが不活性化するようにプラスミドベ
クターを構築することが行なわれる。
、適当な制限酵素によってプラスミドベクターを切断し
、この切断に用いた制限酵素の切断によって得られるの
と同一の末端構造を有する異種ＤＮＡ （一般には、プ
ラスミドベクターの切断に使用した制限酵素を用いた切
断によって得られるＤＮＡ断片を用いる）とを、ＤＮＡ
ＩＪガーゼという酵素を用いて連結して再び連状化する
方法が、普通に行なわれる。このようにして作られる組
換えプラスミドを宿主に導入し、目的のプラスミドが導
入された宿主菌を増殖させ、挿入された異種ＤＮＡに暗
号化されたタンパク質の生産を行うのである。ところが
、組換えプラスミドを作成する過程において、プラスミ
ドベクターのみが再選状化したものが得られ、異種ＤＮ
Ａが挿入されたプラスミドを有する宿主を見いだすのが
困難となることがある。このことを防ぐために異種ＤＮ
Ａが、プラスミドベクターの特定の部位に挿入された場
合、特定のマーカーが不活性化するようにプラスミドベ
クターを構築することが行なわれる。
例えば、前出のプラスミドベクターｐＢＲ３２２におけ
る制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位へ異種ＤＮＡを挿入す
ることにより、Ｔｃ耐性マーカーが不活性化される。こ
のような部位は挿入失活部位と呼ばれる。挿入失活部位
へ異種ＤＮＡを挿入すればマーカーが１個失なわれるこ
とになる。したがって、プラスミドベクターは、なるべ
く多くの種類のマーカーを有することが望ましい。
る制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位へ異種ＤＮＡを挿入す
ることにより、Ｔｃ耐性マーカーが不活性化される。こ
のような部位は挿入失活部位と呼ばれる。挿入失活部位
へ異種ＤＮＡを挿入すればマーカーが１個失なわれるこ
とになる。したがって、プラスミドベクターは、なるべ
く多くの種類のマーカーを有することが望ましい。
また、異種ＤＮＡを挿入する部位としては、特定の制限
酵素によって切断される部位を利用するのであるから、
切断される部位はプラスミドベクターにつき一ケ所であ
ることが必要である。
酵素によって切断される部位を利用するのであるから、
切断される部位はプラスミドベクターにつき一ケ所であ
ることが必要である。
最近、種々の制限酵素が開発されてきているので、なる
べく多（の制限酵素を利用できるようにプラスミドの構
築をすることが望ましい。すなわち、なるべ（多くの制
限酵素によって、各々−ケ所ずつ切断されるような部位
を有するプラスミドベクターの構築が望ましい。
べく多（の制限酵素を利用できるようにプラスミドの構
築をすることが望ましい。すなわち、なるべ（多くの制
限酵素によって、各々−ケ所ずつ切断されるような部位
を有するプラスミドベクターの構築が望ましい。
さらに、挿入したＤＮＡ中の遺伝子の発現が期待される
ことから、効率よく遺伝子発現をも行うことができるよ
うにプラスミドベクターを構築することが望ましい。
ことから、効率よく遺伝子発現をも行うことができるよ
うにプラスミドベクターを構築することが望ましい。
本発明者らは、このような事情に鑑み、多種のマーカー
を有し、多種の異種ＤＮＡの挿入部位を有しくすなわち
、プラスミドベクターを一ケ所のみ切断する制限酵素の
数が多いこと）、かつ、挿入したＤＮＡ中の遺伝子の発
現を効率よく行なわしめるプラスミドベクターを得るべ
く鋭意研究を重ねた結果、すでに本発明者らが構築して
いるプラスミドベクターｐＴＰ３０−５（特開昭５８−
４６１００号公報に記載。以下、ｐＴＰ３０−５と略す
）が、Ｔｃ耐性、Ａｐ耐性及びトリメトプリム（発下Ｔ
ｐと略す）耐性の３種のマーカーを有するが、制限酵素
３ａｌ Ｉ及びｐｓｔＩ部位が、各々２ケ所以上あると
いう欠点を有すること、また、プラスミドｐＴＰ６−１
０（特願昭５８−９７３叫こ記載。以下ｐ’ｒｐ６−１
０と略す）において、Ｔｐ耐性マーカーであるジヒドロ
葉酵還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す）遺伝子の発現効
率が非常に高く、ｐＴＰ６−１０を有する宿主は、ＤＨ
ＦＲが全可溶性タンパク質の約９．３％におよぶまで生
産されるが、Ａｐ耐性とＴｐ耐性の２種のマーカーしか
有していないという欠点に着目し、両者の特長を有し、
欠点を排除したプラスミドベクターを構築することを種
々検討し、プラスミドベクターｐＢＲ３２２△Ｅｃｏ（
特開昭５７−１９２４００号公報に記載。以下ｐＢＲ３
２２△Ｅｃｏと略す）の一部と、ｐ’ｒｐ ６−１０の
一部とが結合した組換えプラスミドの作製方法を考案す
るに至り、その作製方法に従い組換えプラスミドを作製
し、本発明を完成するに至ったのである。
を有し、多種の異種ＤＮＡの挿入部位を有しくすなわち
、プラスミドベクターを一ケ所のみ切断する制限酵素の
数が多いこと）、かつ、挿入したＤＮＡ中の遺伝子の発
現を効率よく行なわしめるプラスミドベクターを得るべ
く鋭意研究を重ねた結果、すでに本発明者らが構築して
いるプラスミドベクターｐＴＰ３０−５（特開昭５８−
４６１００号公報に記載。以下、ｐＴＰ３０−５と略す
）が、Ｔｃ耐性、Ａｐ耐性及びトリメトプリム（発下Ｔ
ｐと略す）耐性の３種のマーカーを有するが、制限酵素
３ａｌ Ｉ及びｐｓｔＩ部位が、各々２ケ所以上あると
いう欠点を有すること、また、プラスミドｐＴＰ６−１
０（特願昭５８−９７３叫こ記載。以下ｐ’ｒｐ６−１
０と略す）において、Ｔｐ耐性マーカーであるジヒドロ
葉酵還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す）遺伝子の発現効
率が非常に高く、ｐＴＰ６−１０を有する宿主は、ＤＨ
ＦＲが全可溶性タンパク質の約９．３％におよぶまで生
産されるが、Ａｐ耐性とＴｐ耐性の２種のマーカーしか
有していないという欠点に着目し、両者の特長を有し、
欠点を排除したプラスミドベクターを構築することを種
々検討し、プラスミドベクターｐＢＲ３２２△Ｅｃｏ（
特開昭５７−１９２４００号公報に記載。以下ｐＢＲ３
２２△Ｅｃｏと略す）の一部と、ｐ’ｒｐ ６−１０の
一部とが結合した組換えプラスミドの作製方法を考案す
るに至り、その作製方法に従い組換えプラスミドを作製
し、本発明を完成するに至ったのである。
本発明のｐ’ｌ’ｐ２０−１０は分子量が約５．６キロ
塩基対であり、制限酵素ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂａｌ
Ｉ 、、 ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈ４ｎｄＩＩＩ
、５ａｌＩ、Ｐｖｕ Ｉ 、 ＰｖｕＩＩ、及びＰｓｔ
■によってそれぞれ一ケ所ずつ切断され、Ａｐ耐性、Ｔ
ｃ耐性及びＴｐ耐性マーカーを有し、かつ第１図に示さ
れる制限酵素開裂地図を有するプラスミドベクターであ
る。さらに、ｐＴＰ２０−１０を有する宿主は、約１．
８７ｊ−ニット／ｒｎ９タンパクのＤＨＦＲを生産する
こと、すなわち、全可溶性タンパク質の約４６９６にお
よぶまでＤＨＦＲを生産できるのである。
塩基対であり、制限酵素ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂａｌ
Ｉ 、、 ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈ４ｎｄＩＩＩ
、５ａｌＩ、Ｐｖｕ Ｉ 、 ＰｖｕＩＩ、及びＰｓｔ
■によってそれぞれ一ケ所ずつ切断され、Ａｐ耐性、Ｔ
ｃ耐性及びＴｐ耐性マーカーを有し、かつ第１図に示さ
れる制限酵素開裂地図を有するプラスミドベクターであ
る。さらに、ｐＴＰ２０−１０を有する宿主は、約１．
８７ｊ−ニット／ｒｎ９タンパクのＤＨＦＲを生産する
こと、すなわち、全可溶性タンパク質の約４６９６にお
よぶまでＤＨＦＲを生産できるのである。
本発明のｐＴＰ２０−１０の創成方法は後述の実施例に
述べる通りであるが、ｐＴＰ２０−１０は、全く新規な
プラスミドベクターである。そして、ｐＴＰ２０−１０
は、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６００株に導入されて
安定状態に保たれ、ｐＴＰ２０−１０を含有するＥ、
ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株は微工研にＦＥＲＭＰ−と
して寄託されている。
述べる通りであるが、ｐＴＰ２０−１０は、全く新規な
プラスミドベクターである。そして、ｐＴＰ２０−１０
は、Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６００株に導入されて
安定状態に保たれ、ｐＴＰ２０−１０を含有するＥ、
ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株は微工研にＦＥＲＭＰ−と
して寄託されている。
第１図は本発明のｐＴＰ２０−１０ （約５．６キロ塩
基対）の制限酵素開裂地図を示している。Ａ、Ｂｍ、Ｂ
＋、ＲＩ−ＲＶ、Ｈ２、Ｈ３、Ｓ、Ｐｖｌ、Ｐｖ２及び
Ｐは、それぞれ制限酵素Ａｖａ Ｌ ＢａｍＨＬ Ｂａ
ｔ Ｉ、ＥｃｏＲＩ。
基対）の制限酵素開裂地図を示している。Ａ、Ｂｍ、Ｂ
＋、ＲＩ−ＲＶ、Ｈ２、Ｈ３、Ｓ、Ｐｖｌ、Ｐｖ２及び
Ｐは、それぞれ制限酵素Ａｖａ Ｌ ＢａｍＨＬ Ｂａ
ｔ Ｉ、ＥｃｏＲＩ。
ＥｃｏＲＩ、 ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｎｃ ＩＩ 、Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩ、５ａｌＩ、ＰｖｕＩ。
ｄ ＩＩＩ、５ａｌＩ、ＰｖｕＩ。
Ｐｖｕ ｎ及びＰｓｔ Ｉの切断部位を示し、ｔｅｔ、
ａｍｐ 及びｆｏｌはそれぞれＴｃ耐性遺伝子、Ａｐ
耐性遺伝子及び１耐性遺伝子を意味し、その矢印は発現
方向を現わしている。
ａｍｐ 及びｆｏｌはそれぞれＴｃ耐性遺伝子、Ａｐ
耐性遺伝子及び１耐性遺伝子を意味し、その矢印は発現
方向を現わしている。
本発明のｐＴＰ２０−１０には、７ケ所の挿入失活部位
が存在する。制限酵素部位ＢａｍＨＩ 、 ＥｃｏＲＶ
・ＨｉｎｄＩＩ［及びＳａｔ ＩはＴｃ耐性の挿入失活
部位であり、制限酵素部位ｐｖｕ Ｉ及びＰｓｔ Ｉは
Ａｐ耐性の挿入失活部位であり、また、制限酵素部位Ｅ
ｃｏＲＩは邦耐性の挿入失活部位である。
が存在する。制限酵素部位ＢａｍＨＩ 、 ＥｃｏＲＶ
・ＨｉｎｄＩＩ［及びＳａｔ ＩはＴｃ耐性の挿入失活
部位であり、制限酵素部位ｐｖｕ Ｉ及びＰｓｔ Ｉは
Ａｐ耐性の挿入失活部位であり、また、制限酵素部位Ｅ
ｃｏＲＩは邦耐性の挿入失活部位である。
本発明のｐＴＰ２０−１０には、発現効率の高まったｂ
耐性遺伝子が存在する。Ｔｐ耐性遺伝子の産物であるＤ
ＨＦＲの生産量は、すでに本発明者らが創成しているｐ
ＴＰ３０−５を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２０６
００株のＤＨＦＲの生産量、０．２１５ユニツト／〜タ
ンパクの約１０倍近くの値である。この性質を利用する
と、ｐ’ｒＰ２０−１０中のＴ９耐性遺伝子上に存在す
る制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に異種遺伝子を挿入すること
により、挿入した遺伝子の発現を効率的に行うことが期
待できる。すなわち、“物質生産用プラスミドベクター
”として利用できることが期待されるのである。
耐性遺伝子が存在する。Ｔｐ耐性遺伝子の産物であるＤ
ＨＦＲの生産量は、すでに本発明者らが創成しているｐ
ＴＰ３０−５を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２０６
００株のＤＨＦＲの生産量、０．２１５ユニツト／〜タ
ンパクの約１０倍近くの値である。この性質を利用する
と、ｐ’ｒＰ２０−１０中のＴ９耐性遺伝子上に存在す
る制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に異種遺伝子を挿入すること
により、挿入した遺伝子の発現を効率的に行うことが期
待できる。すなわち、“物質生産用プラスミドベクター
”として利用できることが期待されるのである。
次に本発明の実施例を示す。なお、実施例における菌体
からのプラスミドの分離は、Ｔａｎａｋａ及びＷｅｉｓ
ｂｌｕｍの方法［Ｔ、 Ｔａｎａｋａ、 Ｂ、 Ｗｅｉ
ｓｂｌｕｍ ； Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。
からのプラスミドの分離は、Ｔａｎａｋａ及びＷｅｉｓ
ｂｌｕｍの方法［Ｔ、 Ｔａｎａｋａ、 Ｂ、 Ｗｅｉ
ｓｂｌｕｍ ； Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。
１２１．３５４ （１９７５））に、またプラスミドＤ
ＮＡの宿主への導入は、Ｎｏｖｇａｒｄらの方法（Ｍ、
ＶＮｏｖｇａｒｃ％に、Ｋｅｅ＋ｎ、Ｊ、Ｊ、Ｍｏｎ
ａｈａｎ：Ｑｅｎｅ、３． ２７９ （１９７９））
ｌこ従った。
ＮＡの宿主への導入は、Ｎｏｖｇａｒｄらの方法（Ｍ、
ＶＮｏｖｇａｒｃ％に、Ｋｅｅ＋ｎ、Ｊ、Ｊ、Ｍｏｎ
ａｈａｎ：Ｑｅｎｅ、３． ２７９ （１９７９））
ｌこ従った。
実施ＩＰＪ １
ｐ’ｒＰ２０−１０の作製。
ｐＢＲ３２２△Ｅｃｏ （特開昭５７−１９２４００号
公報に記載）約５ ｔｒｇを４００ ａｌの反応液Ｉ
（７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＦＩｃｅ、 ｐＨ７，４、７ｍＭ
ＭｇＣｌ２． ７ ｒｒＭ ２−メルカプトエタノー
ル、６０ ｍＭ ＮａＣ１）中で、１０ユニツトの制限
酵素ｐｓｔ Ｉを用いて３７°Ｃ】時間ＤＮＡ切断反応
を行った後、８パｌのＩ Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、 ｐ
Ｈ８，０，４μｍのＩ Ｍ Ｍｇ ＣＩ２．５μｍのＩ
Ｍ ＣａＣｌ２． ８ ／１１の５ＭＮａＣ１及び１
！、＋の０．２５ Ｍエチレンジアミン四酢酸、ｐｌ−
Ｉ８（以下ＥＤＴＡと略す）、を加えて２５°Ｃ１こ保
った。この反応液に、２ユニツトのエキソヌクレアーゼ
ＢＡＬ ３１ を加え、４分間反応を行なわせた。反応
は、４００μｌの水飽和フェノールを加え撹拌した後、
遠心分離を行い水層とフェノール層とに分け、水層を取
り、これを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４に
透析した。
公報に記載）約５ ｔｒｇを４００ ａｌの反応液Ｉ
（７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＦＩｃｅ、 ｐＨ７，４、７ｍＭ
ＭｇＣｌ２． ７ ｒｒＭ ２−メルカプトエタノー
ル、６０ ｍＭ ＮａＣ１）中で、１０ユニツトの制限
酵素ｐｓｔ Ｉを用いて３７°Ｃ】時間ＤＮＡ切断反応
を行った後、８パｌのＩ Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、 ｐ
Ｈ８，０，４μｍのＩ Ｍ Ｍｇ ＣＩ２．５μｍのＩ
Ｍ ＣａＣｌ２． ８ ／１１の５ＭＮａＣ１及び１
！、＋の０．２５ Ｍエチレンジアミン四酢酸、ｐｌ−
Ｉ８（以下ＥＤＴＡと略す）、を加えて２５°Ｃ１こ保
った。この反応液に、２ユニツトのエキソヌクレアーゼ
ＢＡＬ ３１ を加え、４分間反応を行なわせた。反応
は、４００μｌの水飽和フェノールを加え撹拌した後、
遠心分離を行い水層とフェノール層とに分け、水層を取
り、これを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４に
透析した。
次に、ｐ’ｒｐ ６−１０ （特願昭５８−９７３５に
記載）約５μｇを４００／Ｉ＋の反応液中で１．１０ユ
ニツトの制限酵素Ｐｖｕ ｎを用いて３７℃１時間ＤＮ
Ａ切断反応を行った後、８μｍのＩＭＴｒｉｓ ＨＣＩ
、 ｐＨ８，０，４μｍのＩ Ｍ Ｍｇ ＣＩ２．５μ
ｍのＩＭ ＣａＣ１ｚ、８すｌの５ＭＮａＣｌ及び１μ
ｍのＥＤＴＡを加えて２５°Ｃに保った。この反応液に
、２ユニツトのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を加え、
１０分間反応を行なわせた。反応は、４００μｍの水飽
和フェノールを加え撹拌した後、遠心分離を行い水層と
フェノール層とに分け、水層を取り、これを５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，４に透析した。このよう
にして得られた液から５０μｍを取り、これに前述のｐ
ＢＲ３２２△Ｅｃｏを処理しで得られる透析後の液から
５０７Ｉ＋取り両者を混ぜ、これに３００ ／１１のエ
タノールを加え、−２０°Ｃで一晩放置すること１こよ
り、含まれるＤＮＡを沈でんさせた。ＤＮＡ沈でんを遠
心分離により集め、エタノール液をすてた後、真空デシ
ケータ中でＤＮＡを乾燥した。
記載）約５μｇを４００／Ｉ＋の反応液中で１．１０ユ
ニツトの制限酵素Ｐｖｕ ｎを用いて３７℃１時間ＤＮ
Ａ切断反応を行った後、８μｍのＩＭＴｒｉｓ ＨＣＩ
、 ｐＨ８，０，４μｍのＩ Ｍ Ｍｇ ＣＩ２．５μ
ｍのＩＭ ＣａＣ１ｚ、８すｌの５ＭＮａＣｌ及び１μ
ｍのＥＤＴＡを加えて２５°Ｃに保った。この反応液に
、２ユニツトのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を加え、
１０分間反応を行なわせた。反応は、４００μｍの水飽
和フェノールを加え撹拌した後、遠心分離を行い水層と
フェノール層とに分け、水層を取り、これを５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，４に透析した。このよう
にして得られた液から５０μｍを取り、これに前述のｐ
ＢＲ３２２△Ｅｃｏを処理しで得られる透析後の液から
５０７Ｉ＋取り両者を混ぜ、これに３００ ／１１のエ
タノールを加え、−２０°Ｃで一晩放置すること１こよ
り、含まれるＤＮＡを沈でんさせた。ＤＮＡ沈でんを遠
心分離により集め、エタノール液をすてた後、真空デシ
ケータ中でＤＮＡを乾燥した。
このようにして得られたＤＮＡを２０μｍのリガーゼ反
応液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ、 ｐＨ７，４，７
ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオトレイトール、５ｍＭ
ＡＴＰ）に溶解した。
応液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ、 ｐＨ７，４，７
ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオトレイトール、５ｍＭ
ＡＴＰ）に溶解した。
これに５ユニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｉガーゼを加え、１６
°Ｃで１２時間連結反応を行った。この連結混合物を、
Ｎｏｒｇａｒｄらの方法に従ってＥ、 ｃｏｔ ｉ Ｋ
１２ Ｃ６００株に取り込ませた。この処理菌体を、
５０μｇ／ｌｎｌのアンピシリンナトリウム、１０／Ｊ
ｇ／ｌｎｌの塩酸テトラサイクリン及び５０μｇ／ｌｎ
ｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地上に塗布し、３
７°Ｃで２４時間放置することにより、６個のコロニー
を得ることができた。このうちから適当ｉこ１個のコロ
ニーを選び、Ｔａｎａｋａ及びＷｅｉｓｂｌｕｍの方法
１こ従って、菌体からプラスミドを調整し、これをｐ’
ｒｐ ２０−１０と名付けた。
°Ｃで１２時間連結反応を行った。この連結混合物を、
Ｎｏｒｇａｒｄらの方法に従ってＥ、 ｃｏｔ ｉ Ｋ
１２ Ｃ６００株に取り込ませた。この処理菌体を、
５０μｇ／ｌｎｌのアンピシリンナトリウム、１０／Ｊ
ｇ／ｌｎｌの塩酸テトラサイクリン及び５０μｇ／ｌｎ
ｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地上に塗布し、３
７°Ｃで２４時間放置することにより、６個のコロニー
を得ることができた。このうちから適当ｉこ１個のコロ
ニーを選び、Ｔａｎａｋａ及びＷｅｉｓｂｌｕｍの方法
１こ従って、菌体からプラスミドを調整し、これをｐ’
ｒｐ ２０−１０と名付けた。
ｐ’ｒｐ ２０−１０を再度Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２
Ｃ６００株に導入したところ、約１０５／μｇプラス
ミドの頻度で、Ｔｃ耐性、へｐ耐性でかつＴｐ耐性に形
質を転換させることができた。
Ｃ６００株に導入したところ、約１０５／μｇプラス
ミドの頻度で、Ｔｃ耐性、へｐ耐性でかつＴｐ耐性に形
質を転換させることができた。
実施例２
ｐＴＰ２０−１０の構造。
実施例１において得られたｐ’ｒｐ２０−１０の制限酵
素開裂地図を決定するために、表に示す制限酵素による
切断を行い、これをアガロースゲル電気泳動法により分
析し、λフアージＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩ切断
によって得られるＤＮＡ断片を分子サイズのマーカーと
して、各切断によって得られるＤＮＡ断片の分子サイズ
を決定したところ以下の表に示す結果が得られた。
素開裂地図を決定するために、表に示す制限酵素による
切断を行い、これをアガロースゲル電気泳動法により分
析し、λフアージＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩ切断
によって得られるＤＮＡ断片を分子サイズのマーカーと
して、各切断によって得られるＤＮＡ断片の分子サイズ
を決定したところ以下の表に示す結果が得られた。
ＡｖａＩ ５．６
Ｂａｍ ＨＩ ５．６
Ｂａｔ Ｉ ５．６
Ｅｃｏ ＲＩ ５．６
ＥｃｏＲＶ ５．６
Ｈｉｎｃ ＩＩ ３．２＋１．３＋１．１Ｈｉｎｄ ｍ
５．６ Ｓａｌ Ｉ ５．６ Ｐｖｕ Ｉ ５．６ Ｐｖｕ ｎ ５．６ Ｐｓｔ Ｉ ５．６ Ｅｃｏ Ｒ１＋ Ａｖａ Ｉ ３．３ ＋２．３Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｂａｍ ＨＩ ４．４ ＋ １．２Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｂａｌ Ｉ ３．３ ＋ ２．３Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｅｃｏ ＲＶ ４．６ ＋１．０Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ＋Ｈｉｎｃｎ ３．２ ＋ １．３＋０．９＋０６２
Ｅｃｏ ＲＩ ＋ＨｉｎｄＩＩｌ ４．７ ＋ ０．９
Ｅｃｏ ＲＩ ＋ Ｓａｌ Ｉ ４．１ ＋ １．５Ｅ
ｃｏ ＲＩ ＋ Ｐｖｕ Ｉ ４．５ ＋１．１Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｐｖｕｎ ２．９＋２．７ＥｃｏＲＩ ＋Ｐ
ｓｔ Ｉ ４．４＋１．２Ｉ（ｉｎｄ ＩＩＩ 十Ａｖ
ａ Ｉ ４．２ ＋ １．４Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ ＋ Ｂ
ａｍＨＩ ５．３ ＋０．３Ｈｉｎｄ ｍ ＋Ｂａｌ
Ｉ ４．２ ＋１．４ＨｉｎｄＩ［Ｉ→−Ｅｃｏ ＲＶ
５．５ ＋ ０．１Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ ＋Ｈｉｎｃ
ｎ ３．２＋ １．１ ＋０．７＋０．６ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ −ト ５ａｌＩ ５．Ｏ＋０．６Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
＋ Ｐ ｖｕ Ｉ ３．６ ＋２．０ＨｉｎｄＩ［十
Ｆｌｕ ＩＩ ３．６＋２．０ＨｉｎｄＩＩＩ＋ Ｒｔ
Ｉ ３．５＋２．１ＰｖｕＩＩ ＋ ＡｖａＩ ５．
０＋０．６Ｐｖｕｌ［＋ ＢａｍＨＩ ３．９＋ １．
７Ｐｖｕｎ ＋ Ｂａｌ Ｉ ５．１ ＋０．５Ｐｖｕ
ＩＩ ＋ ＥｃｏＲＶ ３．７＋１．９ＰｖｕＩｒ −
ト Ｈｉｎｃ Ｉｆ １．８ ＋ １．４ ＋ １．３
＋ １．１Ｐｖｕｎ ＋ ５ａｌＩ ４．２＋１．４
Ｐｖｕｌ［＋ Ｐｖｕｌ ４．Ｏ＋１．６Ｐｖｕｎ ＋
ＰｓｉＩ ４．１＋１．５この表に示された結果より
、第１図に示す制限酵素開裂地図を決定した。
５．６ Ｓａｌ Ｉ ５．６ Ｐｖｕ Ｉ ５．６ Ｐｖｕ ｎ ５．６ Ｐｓｔ Ｉ ５．６ Ｅｃｏ Ｒ１＋ Ａｖａ Ｉ ３．３ ＋２．３Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｂａｍ ＨＩ ４．４ ＋ １．２Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｂａｌ Ｉ ３．３ ＋ ２．３Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｅｃｏ ＲＶ ４．６ ＋１．０Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ＋Ｈｉｎｃｎ ３．２ ＋ １．３＋０．９＋０６２
Ｅｃｏ ＲＩ ＋ＨｉｎｄＩＩｌ ４．７ ＋ ０．９
Ｅｃｏ ＲＩ ＋ Ｓａｌ Ｉ ４．１ ＋ １．５Ｅ
ｃｏ ＲＩ ＋ Ｐｖｕ Ｉ ４．５ ＋１．１Ｅｃｏ
ＲＩ ＋ Ｐｖｕｎ ２．９＋２．７ＥｃｏＲＩ ＋Ｐ
ｓｔ Ｉ ４．４＋１．２Ｉ（ｉｎｄ ＩＩＩ 十Ａｖ
ａ Ｉ ４．２ ＋ １．４Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ ＋ Ｂ
ａｍＨＩ ５．３ ＋０．３Ｈｉｎｄ ｍ ＋Ｂａｌ
Ｉ ４．２ ＋１．４ＨｉｎｄＩ［Ｉ→−Ｅｃｏ ＲＶ
５．５ ＋ ０．１Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ ＋Ｈｉｎｃ
ｎ ３．２＋ １．１ ＋０．７＋０．６ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ −ト ５ａｌＩ ５．Ｏ＋０．６Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
＋ Ｐ ｖｕ Ｉ ３．６ ＋２．０ＨｉｎｄＩ［十
Ｆｌｕ ＩＩ ３．６＋２．０ＨｉｎｄＩＩＩ＋ Ｒｔ
Ｉ ３．５＋２．１ＰｖｕＩＩ ＋ ＡｖａＩ ５．
０＋０．６Ｐｖｕｌ［＋ ＢａｍＨＩ ３．９＋ １．
７Ｐｖｕｎ ＋ Ｂａｌ Ｉ ５．１ ＋０．５Ｐｖｕ
ＩＩ ＋ ＥｃｏＲＶ ３．７＋１．９ＰｖｕＩｒ −
ト Ｈｉｎｃ Ｉｆ １．８ ＋ １．４ ＋ １．３
＋ １．１Ｐｖｕｎ ＋ ５ａｌＩ ４．２＋１．４
Ｐｖｕｌ［＋ Ｐｖｕｌ ４．Ｏ＋１．６Ｐｖｕｎ ＋
ＰｓｉＩ ４．１＋１．５この表に示された結果より
、第１図に示す制限酵素開裂地図を決定した。
実施例３
ｐ ＴＰ ２０−１０を含有するＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２
Ｃ６００株のＤＨＦＲＨＦ性。
Ｃ６００株のＤＨＦＲＨＦ性。
ｐ Ｔ Ｐ ２０−１０を含有するＥ、 ｃｏ！ ｉ
Ｋ１２ Ｃ６００株（以下、ｐ’ｒｐ ２０−１０株と
略す）を、４０ゴのＳＴ十Ａｐ培地Ｃ２ｇ／ｌのグルコ
ース、Ｉｇ／ｌのに２ ＨＰＯ４、５ｇ／ｌのイースト
エキス、５ ｇ／ｌのポリペプトン及び５０Ｗ／ｌのア
ンピシリンナトリウムの組成を有する培地）中で、好気
的に３７℃で、タレットユニットが１２０になるまで培
養した。菌体を遠心分離により集め、５０ ｍＭのリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０） （以下ＫＰＢと略す
）で洗った後、２ゴのＫＰＢにけんだ（し、２分間音波
破砕を行い２００００回転１時間の遠心分離を行い、得
られた上清について、ＤＨＦＲの活性及びタンパク濃度
の測定を行った。ＤＨＦＲの活性の値は、３７°Ｃにお
いて１３．８ユニツ） ／ ｍｌの値であり、用いた上
清のタンパク濃度は７．３８ ｍ９ ／ ｍｌの値であ
った。これから比活性を計算すると、１．８７ユニツト
／タタンパクという値が得られた。すでに本発明者らが
明らかにしているように（特願昭５８−９７３５に記載
）完全に精製されたＤＨＦＲの比活性は４０７ユニツ）
／ｍｒタンパクであるので、上記の結果は、ｐＴＰ２０
−１０株から得られた音波破砕遠心分離上清、すなわち
、可溶性タンパクの約４，６％がＤＨＦＲであることを
示している。同様の測定を、プラスミドを含有しないＥ
、 ｃｏｌｉ Ｋ］２ Ｃ６００株について行ったとこ
ろ、ＤＨＦＲの比活性は、０、０１０ ユニット／ダタ
ンパクという値であり、この菌株においては、可溶性タ
ンパクの約００２５％がＤＨＦＲであることが示された
。
Ｋ１２ Ｃ６００株（以下、ｐ’ｒｐ ２０−１０株と
略す）を、４０ゴのＳＴ十Ａｐ培地Ｃ２ｇ／ｌのグルコ
ース、Ｉｇ／ｌのに２ ＨＰＯ４、５ｇ／ｌのイースト
エキス、５ ｇ／ｌのポリペプトン及び５０Ｗ／ｌのア
ンピシリンナトリウムの組成を有する培地）中で、好気
的に３７℃で、タレットユニットが１２０になるまで培
養した。菌体を遠心分離により集め、５０ ｍＭのリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０） （以下ＫＰＢと略す
）で洗った後、２ゴのＫＰＢにけんだ（し、２分間音波
破砕を行い２００００回転１時間の遠心分離を行い、得
られた上清について、ＤＨＦＲの活性及びタンパク濃度
の測定を行った。ＤＨＦＲの活性の値は、３７°Ｃにお
いて１３．８ユニツ） ／ ｍｌの値であり、用いた上
清のタンパク濃度は７．３８ ｍ９ ／ ｍｌの値であ
った。これから比活性を計算すると、１．８７ユニツト
／タタンパクという値が得られた。すでに本発明者らが
明らかにしているように（特願昭５８−９７３５に記載
）完全に精製されたＤＨＦＲの比活性は４０７ユニツ）
／ｍｒタンパクであるので、上記の結果は、ｐＴＰ２０
−１０株から得られた音波破砕遠心分離上清、すなわち
、可溶性タンパクの約４，６％がＤＨＦＲであることを
示している。同様の測定を、プラスミドを含有しないＥ
、 ｃｏｌｉ Ｋ］２ Ｃ６００株について行ったとこ
ろ、ＤＨＦＲの比活性は、０、０１０ ユニット／ダタ
ンパクという値であり、この菌株においては、可溶性タ
ンパクの約００２５％がＤＨＦＲであることが示された
。
第１図は、ｐ’ｒｐ２０−１０の制限酵素開裂地図であ
り、図中符号は制限酵素及び各耐性マーカー遺伝子を表
わし、Ａ、Ｂｍ、Ｂｌ 、ＲＩ、ＲＶ、Ｈ２、Ｈ３、Ｓ
、Ｐｖｌ、Ｐｖ２及びＰは、それぞれ制限酵素ＡｖａＩ
。 ＢａｍＨＩ 、 Ｂｏｌ Ｉ、 ＥｃｏＲＩ、 Ｅｃｏ
ＲＶ、 ＨｉｎｃｌＩ、ＨｉｎｄｌＩ［、Ｓａｔ ｌ５
ＰｖｕＩ 、 Ｐｖｕｎ及びＰｓｔ Ｉを示し、ｔｅｔ
、 ａｍｐ及びｆｏｌは、それぞれＴｃ耐性遺伝子、Ａ
ｐ耐性遺伝子及びＴｐ耐性遺伝子を示している。また、
数字の単位はキロ塩基対を示している。
り、図中符号は制限酵素及び各耐性マーカー遺伝子を表
わし、Ａ、Ｂｍ、Ｂｌ 、ＲＩ、ＲＶ、Ｈ２、Ｈ３、Ｓ
、Ｐｖｌ、Ｐｖ２及びＰは、それぞれ制限酵素ＡｖａＩ
。 ＢａｍＨＩ 、 Ｂｏｌ Ｉ、 ＥｃｏＲＩ、 Ｅｃｏ
ＲＶ、 ＨｉｎｃｌＩ、ＨｉｎｄｌＩ［、Ｓａｔ ｌ５
ＰｖｕＩ 、 Ｐｖｕｎ及びＰｓｔ Ｉを示し、ｔｅｔ
、 ａｍｐ及びｆｏｌは、それぞれＴｃ耐性遺伝子、Ａ
ｐ耐性遺伝子及びＴｐ耐性遺伝子を示している。また、
数字の単位はキロ塩基対を示している。
Claims (2)
- （１）分子量が５．６キロ塩基対であり、宿主にアンピ
シリン耐性、テトラサイクリン耐性及びトリメトプリム
耐性を与えることができ、かつ、第１図に示される制限
酵素開裂地図を有するプラスミドベクターｐＴＰ２０ｉ
０゜ - （２）プラスミドベクターｐＴＰ２０−１０を含有する
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌ）ｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６０
０株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59054975A JPS60199385A (ja) | 1984-03-22 | 1984-03-22 | プラスミドベクタ−ｐＴＰ２０−１０ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59054975A JPS60199385A (ja) | 1984-03-22 | 1984-03-22 | プラスミドベクタ−ｐＴＰ２０−１０ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60199385A true JPS60199385A (ja) | 1985-10-08 |
| JPH0147998B2 JPH0147998B2 (ja) | 1989-10-17 |
Family
ID=12985650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59054975A Granted JPS60199385A (ja) | 1984-03-22 | 1984-03-22 | プラスミドベクタ−ｐＴＰ２０−１０ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60199385A (ja) |
-
1984
- 1984-03-22 JP JP59054975A patent/JPS60199385A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0147998B2 (ja) | 1989-10-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |