JPS60185155A - グルコ−ス分析法 - Google Patents
グルコ−ス分析法Info
- Publication number
- JPS60185155A JPS60185155A JP59040181A JP4018184A JPS60185155A JP S60185155 A JPS60185155 A JP S60185155A JP 59040181 A JP59040181 A JP 59040181A JP 4018184 A JP4018184 A JP 4018184A JP S60185155 A JPS60185155 A JP S60185155A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucose
- electrode
- enzyme
- hydrogen peroxide
- membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
この発明は、酵素電極を用いて試料中のグルコースを分
離・稀釈操作を行なわないで測定できる分析方法に関す
る。この種の物質の定量は、臨床検査分野において糖尿
病などの疾患の診断・治療に欠くことのできない検査で
あり、また発酵・食品分野ではプロセス管理上きわめて
重要な測定項目であり、簡便かつ迅速に定量できる方法
が強（要請されている。
離・稀釈操作を行なわないで測定できる分析方法に関す
る。この種の物質の定量は、臨床検査分野において糖尿
病などの疾患の診断・治療に欠くことのできない検査で
あり、また発酵・食品分野ではプロセス管理上きわめて
重要な測定項目であり、簡便かつ迅速に定量できる方法
が強（要請されている。
グルコースの測定法は、還元法、縮合法および酵素法な
どが知られている。還元法は目的とするグルコース以外
の還元性物質の影響を受けるので特異性に欠け、かつ操
作が煩雑である。縮合法は還元法と同様に特異性に欠け
、１００”Ｃの加熱、強酸を使用するなど試薬の取り扱
いに注意を要する。
どが知られている。還元法は目的とするグルコース以外
の還元性物質の影響を受けるので特異性に欠け、かつ操
作が煩雑である。縮合法は還元法と同様に特異性に欠け
、１００”Ｃの加熱、強酸を使用するなど試薬の取り扱
いに注意を要する。
上述した方法に比べ、酵素法は特異性が高く、温和な条
件で反応させることができるため、その有用性が広く認
められている。酵素法は、定量手法として比色法と電極
法が知られている。比色定量法はいくつか知られている
が、定量に使用する高価な酵素を使いすてる、酵素液が
不安定である、生体液など着色試料をそのまま使用でき
ないといった共通の欠点を有する。このような背景から
酵素、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１，ｌ、 ３．４
）を固定化することにより安定なものとし、反復使用で
きる固定化酵素が開発され、電極と組み合せた酵素電極
と呼ばれる定量手法が注目されており、実用化の段階に
達している。特に酵素電極法は、試料が血液の場合、全
血のままで測定できる特長を有するため緊急検査に適し
ているとされている。
件で反応させることができるため、その有用性が広く認
められている。酵素法は、定量手法として比色法と電極
法が知られている。比色定量法はいくつか知られている
が、定量に使用する高価な酵素を使いすてる、酵素液が
不安定である、生体液など着色試料をそのまま使用でき
ないといった共通の欠点を有する。このような背景から
酵素、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１，ｌ、 ３．４
）を固定化することにより安定なものとし、反復使用で
きる固定化酵素が開発され、電極と組み合せた酵素電極
と呼ばれる定量手法が注目されており、実用化の段階に
達している。特に酵素電極法は、試料が血液の場合、全
血のままで測定できる特長を有するため緊急検査に適し
ているとされている。
しかし、従来の酵素電極法によるグルコースの定量にお
いては、専用ピペットを用いて一定の試料を一定容積を
有する測定セル内に注入するなどの操作により、試料を
１０〜４０倍に稀釈して測定するものであり、このため
、試料を正確に採取しなければならない、正確Ｉこ稀釈
する器具と装置および測定セルが必要である、稀釈した
のち混合操作が必要であるといった次点があった。さら
に試料を直接酵素電極に接触させると、おおむねグルコ
ース濃度５０ｗｃｌ１以上の試料では酵素反応が飽和し
、正確なグルコース量が分析できないといった問題点が
あった。
いては、専用ピペットを用いて一定の試料を一定容積を
有する測定セル内に注入するなどの操作により、試料を
１０〜４０倍に稀釈して測定するものであり、このため
、試料を正確に採取しなければならない、正確Ｉこ稀釈
する器具と装置および測定セルが必要である、稀釈した
のち混合操作が必要であるといった次点があった。さら
に試料を直接酵素電極に接触させると、おおむねグルコ
ース濃度５０ｗｃｌ１以上の試料では酵素反応が飽和し
、正確なグルコース量が分析できないといった問題点が
あった。
この発明は上述の欠点を除去し、試料の稀釈操作を必要
とせずかつ採取試料量に測定値が左右されない、酵素電
極法によるグルコースの簡易分析法を提供することを目
的とする。
とせずかつ採取試料量に測定値が左右されない、酵素電
極法によるグルコースの簡易分析法を提供することを目
的とする。
固定化グルコースオキシダーゼ膜を過酸化水素電極の電
極表面ｌこ装着して構成される酵素電極法によるグルコ
ースの定量は、以下の測定原理に基づく。
極表面ｌこ装着して構成される酵素電極法によるグルコ
ースの定量は、以下の測定原理に基づく。
グルコースは固定化されているグルコースオキシダーゼ
により、（１）式で示されるようにグルコン酸と過酸化
水素に分解される。
により、（１）式で示されるようにグルコン酸と過酸化
水素に分解される。
（１）
生成した過酸化水素は白金−電極からなる過酸化水素電
極で酸化され、グルコース濃度に比例した酸化電流を与
えるため、この酸化電流値を測定１−ることによりグル
コースを定量することができる。
極で酸化され、グルコース濃度に比例した酸化電流を与
えるため、この酸化電流値を測定１−ることによりグル
コースを定量することができる。
この発明は、固定化グル」−スオキシダーゼ膜と過酸化
水素電極からなる酵素電極の機能を、固定化グルコース
オキシダーゼ膜のもつ酵素活性と選択透過性および過酸
化水素電極のもつ電極活性に分離し、それぞれあ詳細に
検討した結果、固定化グルコースオキシダーゼ膜の活性
を従来の約鴇に下げ酸素不足などに基づく酵素反応の飽
和を防ぎ、かつ血球、タンパク質などの高分子物質排除
性を高め、かつ過酸化水素の選択透過性を改良し、さら
に過酸化水素電極の電極活性を高めることにより達成さ
れることが判明した。すなわち、固定化クルコースオキ
シダーゼ膜の活性を下げることにより、高濃度のグルコ
ースとの酵素反応により引き起こされる酸素不足を解消
し、固定化グルコースオキシダーゼ膜の高分子物質排除
膜の孔径を小さくすることにより膜表面の汚染を防止し
、かつ選択透過性膜の膜厚を制御することにより共存物
質の影響を受けずに過酸化水素のみを選択的に検出でき
、ひいては試料の稀釈操作を必要としないグルコースの
分析ができるとの考え方に基づいている。
水素電極からなる酵素電極の機能を、固定化グルコース
オキシダーゼ膜のもつ酵素活性と選択透過性および過酸
化水素電極のもつ電極活性に分離し、それぞれあ詳細に
検討した結果、固定化グルコースオキシダーゼ膜の活性
を従来の約鴇に下げ酸素不足などに基づく酵素反応の飽
和を防ぎ、かつ血球、タンパク質などの高分子物質排除
性を高め、かつ過酸化水素の選択透過性を改良し、さら
に過酸化水素電極の電極活性を高めることにより達成さ
れることが判明した。すなわち、固定化クルコースオキ
シダーゼ膜の活性を下げることにより、高濃度のグルコ
ースとの酵素反応により引き起こされる酸素不足を解消
し、固定化グルコースオキシダーゼ膜の高分子物質排除
膜の孔径を小さくすることにより膜表面の汚染を防止し
、かつ選択透過性膜の膜厚を制御することにより共存物
質の影響を受けずに過酸化水素のみを選択的に検出でき
、ひいては試料の稀釈操作を必要としないグルコースの
分析ができるとの考え方に基づいている。
第１図に固定化グルコースオキシダーゼ膜ト過酸化水素
電極からなる酵素電極８の横断面図を示す。ここで１は
アノードとしての白金極、２はカソードとしての電極、
３は両電極を絶縁保持する絶縁層、４はＯ＋）フグ保持
用ガイド、５はＯリング、６は固定化グルコースオキシ
ダーゼ膜であり、白金極１と電極２かもなる過酸化水素
電極７０表面に密着した状態で保持されている。白金極
ｌには電極２に対して過酸化水素が酸化電流を与える０
、４〜０８ｖの範囲の一定電位を印加しておく。
電極からなる酵素電極８の横断面図を示す。ここで１は
アノードとしての白金極、２はカソードとしての電極、
３は両電極を絶縁保持する絶縁層、４はＯ＋）フグ保持
用ガイド、５はＯリング、６は固定化グルコースオキシ
ダーゼ膜であり、白金極１と電極２かもなる過酸化水素
電極７０表面に密着した状態で保持されている。白金極
ｌには電極２に対して過酸化水素が酸化電流を与える０
、４〜０８ｖの範囲の一定電位を印加しておく。
第２図に本発明によるグルコースを分析する装置の系統
図を示す。ここで１０は無稀釈の試料、１１は酵素電極
８の白金極ｌのリード、１２は電極２のリード、１３は
過酸化水素電極７に一定電位を印加し酸化電流を計測す
るためのポーラログラフ装置、１４はポーラログラフ装
置１３の表示部あるいは記録部である。
図を示す。ここで１０は無稀釈の試料、１１は酵素電極
８の白金極ｌのリード、１２は電極２のリード、１３は
過酸化水素電極７に一定電位を印加し酸化電流を計測す
るためのポーラログラフ装置、１４はポーラログラフ装
置１３の表示部あるいは記録部である。
以下本発明に基づ〈実施例を図面を参照しながら説明す
る。
る。
ｅＬｔ４に、Ａ口１１
第１図中の固定化グルコースオキシダーゼ膜６の酵素膜
活仕を０．００３ Ｌｌ、４’に調製し、該固定化膜を
過酸化水素電極７の電極表面に密着させて酵素電極を構
ｔ；’ｉ、 シた。使用した酵素膜は厚さ７μｍのポリ
カーボネート膜と６μｍのセルロースアセテート膜を備
え、試料側は多孔性で高分子物質排除能を有し、電極ｆ
１１！Ｉはち密で過酸化水素の選択透過能を有する構造
であり、この分野で周知のいかなる構造のものを用いて
もよい。酵素の固定化はこの分野で周知のいかなる手法
を用いてもよいが、酵素活性は０．００１〜０．００９
Ｕ／ｒｙｒｔｔの範囲に調製１−ることが肝要である
。
活仕を０．００３ Ｌｌ、４’に調製し、該固定化膜を
過酸化水素電極７の電極表面に密着させて酵素電極を構
ｔ；’ｉ、 シた。使用した酵素膜は厚さ７μｍのポリ
カーボネート膜と６μｍのセルロースアセテート膜を備
え、試料側は多孔性で高分子物質排除能を有し、電極ｆ
１１！Ｉはち密で過酸化水素の選択透過能を有する構造
であり、この分野で周知のいかなる構造のものを用いて
もよい。酵素の固定化はこの分野で周知のいかなる手法
を用いてもよいが、酵素活性は０．００１〜０．００９
Ｕ／ｒｙｒｔｔの範囲に調製１−ることが肝要である
。
このように構成した酵素Ｎ極をグルコース標準液と接触
させ、刃秒後のグルコース濃度と得られる反応出力との
関係を検討した。第３図は上述した操作で得られた検量
線である。
させ、刃秒後のグルコース濃度と得られる反応出力との
関係を検討した。第３図は上述した操作で得られた検量
線である。
第１図から酵素活性を制（ｄすることにより広範囲にわ
たってグルコース濃度に対応した出力が得られることが
解る。酵素活性が０．０１しり以上であるとグルコース
約１５０ｍ９７ｄｉ以上で反応が飽和し、グルコース濃
度との対応が認められなくなり、一方０．００１Ｕ〜以
下であると反応電流が小さくなり測定積置を上げるには
検出系に工夫を要する。
たってグルコース濃度に対応した出力が得られることが
解る。酵素活性が０．０１しり以上であるとグルコース
約１５０ｍ９７ｄｉ以上で反応が飽和し、グルコース濃
度との対応が認められなくなり、一方０．００１Ｕ〜以
下であると反応電流が小さくなり測定積置を上げるには
検出系に工夫を要する。
実施例２
実施例１で記載した酵素電極を用いてグルコース１５０
７１＋１７／包の溶液に連続して１０回浸し同時再現性
を検討した。得られたＣ０■、値は１．５％であり、酵
素電極を直接グルコース溶液と接触させる操作で精度よ
い測定が行なえることがわかる。
７１＋１７／包の溶液に連続して１０回浸し同時再現性
を検討した。得られたＣ０■、値は１．５％であり、酵
素電極を直接グルコース溶液と接触させる操作で精度よ
い測定が行なえることがわかる。
実施例３
実施例１で記載した酵素電極を、一般に妨害物質として
知られているアスコルビン酸、尿酸の各溶液に接触させ
た。アスコルビン酸２０ ｍ９／ｄｌ 、尿酸１０ ｍ
９／ｄｉの各溶液とも出力は認められず、酵素電極は妨
害物質を選択的に排除していることがわかる。なおセル
ロースアセテート膜の厚さが１μｍでは妨害物質の影響
を受け、また８μ７１１以上では応答性が悪くなった。
知られているアスコルビン酸、尿酸の各溶液に接触させ
た。アスコルビン酸２０ ｍ９／ｄｌ 、尿酸１０ ｍ
９／ｄｉの各溶液とも出力は認められず、酵素電極は妨
害物質を選択的に排除していることがわかる。なおセル
ロースアセテート膜の厚さが１μｍでは妨害物質の影響
を受け、また８μ７１１以上では応答性が悪くなった。
実施例４
実施例１で記載した電極を、血清と血しょうを試料とし
、その特性を検討した。従来法で９５ Ｉｎ９／ｄｉの
値が得られ−た血清を酵素電極に接触させ９８ ｍｑＡ
ｕを得た。また従来法で５Ｑ Ｉｎ９／ｄｉの血しよう
を酵素電極に接触さぜ、５８ ｍｌ／／ｄｉを得た。こ
のことから血清９皿しようとも自す素電極に直接接触さ
せるだけでグルコース量がめられろ。
、その特性を検討した。従来法で９５ Ｉｎ９／ｄｉの
値が得られ−た血清を酵素電極に接触させ９８ ｍｑＡ
ｕを得た。また従来法で５Ｑ Ｉｎ９／ｄｉの血しよう
を酵素電極に接触さぜ、５８ ｍｌ／／ｄｉを得た。こ
のことから血清９皿しようとも自す素電極に直接接触さ
せるだけでグルコース量がめられろ。
実施例５
酵素活性を０．００３ Ｕ／１ｙｔｒ？に調製し、力１
つ固定化グルコースオキシダーゼ膜のポリカーボネート
膜の孔径をそれぞれ０．０１５．０．０３．０．１１１
ｍに選定した固定化グルコースオキシダーゼ膜を製作し
た。
つ固定化グルコースオキシダーゼ膜のポリカーボネート
膜の孔径をそれぞれ０．０１５．０．０３．０．１１１
ｍに選定した固定化グルコースオキシダーゼ膜を製作し
た。
この酵素電極上に全血試料を（２）μＬ程滴下し、接触
させた。用いた全血中のグルコース濃度は、稀釈した後
幽定する従来法で９１７ｎ９／ｄｉ“であった。全血を
接触させて得られた値は孔径０．０ ］、 ５．０．０
３゜０．１μｍの場合、それぞれ９４．５６．１０ ｍ
９７ｄｉであった。
させた。用いた全血中のグルコース濃度は、稀釈した後
幽定する従来法で９１７ｎ９／ｄｉ“であった。全血を
接触させて得られた値は孔径０．０ ］、 ５．０．０
３゜０．１μｍの場合、それぞれ９４．５６．１０ ｍ
９７ｄｉであった。
この結果をもとに、孔径０．０１５μｍから０．０３μ
ｍの間についてざらに横側を加えた結果、孔径０．０２
μ７ｎ以下に２いて、精度のよい測定結果が得られるこ
とを確認した。−例として孔径０．０１５μ？Ｗの固定
化酵素膜を用いて従来法で７１ 、７０ ｍ９Ａｉｚの
値が得られた全血を測定し、それぞれ７２． ｃｒ７ｍ
ｑ／ｄｌがまった。
ｍの間についてざらに横側を加えた結果、孔径０．０２
μ７ｎ以下に２いて、精度のよい測定結果が得られるこ
とを確認した。−例として孔径０．０１５μ？Ｗの固定
化酵素膜を用いて従来法で７１ 、７０ ｍ９Ａｉｚの
値が得られた全血を測定し、それぞれ７２． ｃｒ７ｍ
ｑ／ｄｌがまった。
この発明によれば、固定化酵素膜の活性を下げてグルコ
ースを含む試料をそのまま便って測定できるようにした
ため、稀釈操作が不要でかつ採取する試料量に測距値が
影響されずにグルコースの分析が行なえる。竹に全血を
対象とした場合は高分子物質排除膜の孔径を０．０２μ
ｍあるいはそれ以下に設建することにより血清分離の操
作を省くことができ、全血を一滴位固定化酵飄膜上に滴
らすことにより測定できるため、簡便な操作でグルコー
スの分析が行なえる。
ースを含む試料をそのまま便って測定できるようにした
ため、稀釈操作が不要でかつ採取する試料量に測距値が
影響されずにグルコースの分析が行なえる。竹に全血を
対象とした場合は高分子物質排除膜の孔径を０．０２μ
ｍあるいはそれ以下に設建することにより血清分離の操
作を省くことができ、全血を一滴位固定化酵飄膜上に滴
らすことにより測定できるため、簡便な操作でグルコー
スの分析が行なえる。
さらに、上述したポリカーボネート膜と厚さ４〜８μ情
のセルロースアセテート膜を備えた固定化酵素膜と過酸
化水素電極を組み合わせた検出部を構成したため、血液
中の高分子あるいは低分子物質による妨害を受けないで
定量できる。また過酸化水素電極を用いているため、酸
素電極を用いた場合に問題となる酸緊と血球成分との相
互作用の影響を受けない。
のセルロースアセテート膜を備えた固定化酵素膜と過酸
化水素電極を組み合わせた検出部を構成したため、血液
中の高分子あるいは低分子物質による妨害を受けないで
定量できる。また過酸化水素電極を用いているため、酸
素電極を用いた場合に問題となる酸緊と血球成分との相
互作用の影響を受けない。
ｄＳ１図は本発明によるグルコース検出部の横断面図、
第２図は本発明によるグルコース分析装置の系統図、第
３図はグルコース濃反トポーラログラフ装註の出力の関
係を示す線図である。 １・・・白金極、２・・・銀嶺、６・・・固定化グルコ
ースオキシダーゼ膜、７・・・過酸化水素′成極、８・
・・解素電極、１０・・・無稀釈試料、１３・・・ポー
ラログラフ装置。 第１図 １υ 才？ 図
第２図は本発明によるグルコース分析装置の系統図、第
３図はグルコース濃反トポーラログラフ装註の出力の関
係を示す線図である。 １・・・白金極、２・・・銀嶺、６・・・固定化グルコ
ースオキシダーゼ膜、７・・・過酸化水素′成極、８・
・・解素電極、１０・・・無稀釈試料、１３・・・ポー
ラログラフ装置。 第１図 １υ 才？ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）酵素電極を用いたグルコースの分析法において、グ
ルコースオキシダーゼを固定化した酵素膜を過酸化水素
電極の感応面に装着し、該酵素電極にグルコースを含む
無稀釈試料を接触させ、該酵素電極の反応電流より試料
中のグルコース濃度をめることを特徴とするグルコース
分析法。 ２、特許請求の範囲第１項記載の方法において、酵素膜
は孔径０．０２μｍ以下のポリカーボネート膜と厚さ４
〜８μｍのセルロースアセテート膜ヲ備え、酵素膜活性
が０．００１〜０．００９Ｕβの範囲に調製されている
ことを特徴とするグルコース分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59040181A JPS60185155A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | グルコ−ス分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59040181A JPS60185155A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | グルコ−ス分析法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60185155A true JPS60185155A (ja) | 1985-09-20 |
Family
ID=12573609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59040181A Pending JPS60185155A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | グルコ−ス分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60185155A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5437973A (en) * | 1985-09-16 | 1995-08-01 | The Victoria University Of Manchester | Enzyme-electrode sensor |
-
1984
- 1984-03-02 JP JP59040181A patent/JPS60185155A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5437973A (en) * | 1985-09-16 | 1995-08-01 | The Victoria University Of Manchester | Enzyme-electrode sensor |
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