JPS60184399A - Method of enzymatic determination of n-acetylneuraminic acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To carry out determination of N-acetylneuraminic acid in high accuracy by a simple operation without being influenced by endogenous pyruvic acid, by treating a specimen of N-acetylneuraminic acid with an enzyme such as neuraminate aldolase, acylglucosamine 2-epimerase, etc. CONSTITUTION:N-Acetylneuraminic acid is decomposed with neuraminate aldolase into N-acetylmannosamine and pyruvic acid. Prepared N-acetylmannosamine is treated with AG-epimerase, etc., to prepare N-acetylglucosamine. Then, this N-acetylglucosamine is treated with N-acetylhexosamine oxidase in the presence of O2 and water, to give N-acetylglucosaminic acid and H2O2. Any of N2O2, N- acetylglucosaminic acid and consumed O2 is measured, to determine N-acetylneuraminic acid.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＮ−アセチルノイラミン酸の酵素的定量方法に
関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for enzymatic determination of N-acetylneuraminic acid.

生体内にはＮ−アセチルノイラミン酸の糖複合床検査の
分野において急性および慢性炎症、シック、外傷、心筋
梗塞、糖尿病、肝疾患、各種癌等で変動することが見い
出されており、シアル酸測定が診断に重要な役割を示め
している。In vivo, N-acetylneuraminic acid has been found to fluctuate in the field of glycoconjugate testing, including acute and chronic inflammation, illness, trauma, myocardial infarction, diabetes, liver disease, and various cancers. Measurement is showing an important role in diagnosis.

このシアル酸測定には化学法であるＥｈｒｌｉｃｈ法、
オルシノール法、レゾルシノール法、過ヨウ素酸レゾシ
ノール法、チオバルビッール酸法等が知られているが、
特異性に問題があったり、中には強酸を使用しなけ九ば
ならないもの、加熱操作を必要とする等、操作が繁雑で
あるという欠点があったＯ 酵素的測定法としてシアル酸をノイラミ鼾ダーゼでＮ−
アセチルノイラミン酸を遊離させ、ノイラミン酸アルド
ラーゼによりピルビンｗ″ｆ、生成し、このピルビン酸
を乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＮＡＤＨ系で反応
させ定量する方法、ピルビン酸にピルビン酸オーキシダ
ーゼを作用させ生ずる過酸化水素を定量する方法がるる
か、これらの測定法は内因性ピルビン酸の影響を受ける
という欠点がある。For this sialic acid measurement, the Ehrlich method, which is a chemical method,
Orcinol method, resorcinol method, periodate resorcinol method, thiobarbic acid method, etc. are known.
There were problems with specificity, some cases required the use of strong acids, some required heating operations, and other disadvantages, such as complicated operations. Dase de N-
A method in which acetylneuraminic acid is liberated, pyruvate w″f is produced by neuraminic acid aldolase, and this pyruvate is reacted with lactate dehydrogenase (LDH) and an NADH system to quantify it, and pyruvate is reacted with pyruvate oxidase. Although there are methods for quantifying hydrogen peroxide, these methods have the disadvantage of being influenced by endogenous pyruvate.

本発明者らは操作が簡単で、しかも内因性ピルビン酸の
影響を受けない正確性の高いＮ−アセチルノイラミン酸
測定法を種々鋭意検討したところ、試料にノイラミン酸
アルドラーゼ、アシルグルコサミン−２−エピメラーゼ
Ｃ以下ＡＧ−エピメラーゼと略す）、Ｎ−アセチルへキ
ソザミンオキシダーゼ（以下ＮＡＨＯＤと略す）の酵素
を作用させることにより、上記の目的が達成されること
を見い出し１本発明に到達した。The present inventors have intensively investigated various methods for measuring N-acetylneuraminic acid that are easy to operate and are not affected by endogenous pyruvate and have found that neuraminic acid aldolase, acylglucosamine-2- The present inventors have discovered that the above objects can be achieved by acting on enzymes such as epimerase C (hereinafter abbreviated as AG-epimerase) and N-acetylhexozamine oxidase (hereinafter abbreviated as NAHOD).

すなわち不発明はＮ−アセチルノイラミン酸の試料にノ
イラミン酸アルドラーゼ、アシルゲルコサミニ／−２−
エピメラーゼ（ＡＧ−エピメラーゼ）およびＮ−アセチ
ルへキソサミンオキシダーゼ（ＮＡＨＯＤ　）’ｅ作用
させて生成する過酸化水素又はＮ−アセチルグルコサミ
ン酸又は消費される酵素を測定することを特徴とするＮ
−アセチルノイラミン酸の酵素的定量方法である。In other words, the non-invention is to add neuraminic acid aldolase and acylgelcosamini/-2- to a sample of N-acetylneuraminic acid.
epimerase (AG-epimerase) and N-acetylhexosamine oxidase (NAHOD)'e to produce hydrogen peroxide or N-acetylglucosamic acid or to measure the consumed enzyme.
- An enzymatic method for quantifying acetylneuraminic acid.

本発明の測定原理は下記に示す通りである。The measurement principle of the present invention is as shown below.

（４）酵素反応 Ｎ−アセチルノイラミン酸　／　＜　５　ｉ　：ｙ＠７
ｙｖ　）”９ニオ−Ｎ−アセチルマンノサミン　＋　ピ
ルビン酸、ＡＧ−エピメラーゼ Ｎ−アセチルマンノサ（ン　Ｎ−アセ チルグルコサミン すなわちＮ−アセチルノイラミン酸をノイラミン酸アル
ドラーゼによってＮ−アセチルマンノサミンとピルビン
酸ＶＣ分解し、生じたＮ−アセチルマンノサミンＫＡＧ
−エピメラーゼ會作用させ、Ｎ−アセナルグルコサミン
を生成せしめる。このＮ　−アセチルグルコサミンに散
素と水の共存下、ＮＡＨＯＤを作用させることにより、
Ｎ−アセチルグルコサミン酸と過酸化水素會生じさせる
。測定方法はこの時生じる過酸化水素も１．りはＮ−ア
セチルグルコサミン酸もしぐは消費される酸素のいずれ
かを測定することを特徴としている。(4) Enzyme reaction N-acetylneuraminic acid / < 5 i:y@7
yv)"9Nio-N-acetylmannosamine + pyruvate, AG-epimerase N-acetylmannosamine (n) N-acetylmannosamine KAG produced by acid VC decomposition
- Activate epimerase interaction to produce N-acenalglucosamine. By allowing NAHOD to act on this N-acetylglucosamine in the coexistence of dust and water,
N-acetylglucosaminic acid and hydrogen peroxide are combined to form. The measurement method is 1. Hydrogen peroxide generated at this time is also measured. The method is characterized by measuring either N-acetylglucosaminic acid or consumed oxygen.

本発明に用いるノイラミン酸アルドラーゼとしてはニジ
エリシア・コリ、ラットの肝、脳等から精製されるもの
があり、いずれの起源によるものでも良いが、特にニジ
エリシア・コリ由来のものが好ましい。The neuraminic acid aldolase used in the present invention includes those purified from N. coli, rat liver, brain, etc., and may be derived from any source, but one derived from N. coli is particularly preferred.

本発明に用いるＡＧ−エピメラーゼもいかなる起源のも
のでも良いが、例えばゴーシュ、ロイゼマンによる「ジ
ャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー」第２
４巻第４号第１５３頁に記載されているブタの腎臓から
精製したＡＧ−エビメがある。このＡＧ−エピメラーゼ
の反応を促進させるためにはＡＴＰ’ｅ添加【、でも良
い。The AG-epimerase used in the present invention may be of any origin, but for example,
There is AG-prawn purified from pig kidney, which is described in Vol. 4, No. 4, p. 153. In order to promote this AG-epimerase reaction, ATP'e may be added.

本発明に用いるＮＡＨＯＤもいかなる起源のものでも良
いが、例えば欄内による日本農芸化学会昭和５８年度大
会講演要要旨用１７３頁に記載されているシュードモナ
ス属由来のＮＡＨＯＤがある。The NAHOD used in the present invention may be of any origin, but for example, there is NAHOD derived from the genus Pseudomonas, which is described on page 173 of the Japanese Agricultural Chemistry Society 1988 Conference Abstracts.

さらにノイラミ〜ダーゼを作用させシアル酸を測定する
場合に使用するソイラミ１ダーゼは、いかなる起源のも
ので゛も良いが、クロストリジウム属、アルスロバクタ
−属、コリネバクテリウム属。Furthermore, the soyramidase used to measure sialic acid by the action of neuramidase may be of any origin, but may be of any origin, such as those of the genus Clostridium, Arthrobacter, and Corynebacterium.

ストレプトコツカス属等に属する微生物から産生ずるも
のがある。Some are produced by microorganisms belonging to the genus Streptococcus.

本発明で試料とは血清や血しょう、さらにはシアル酸會
含む試料にノイラミ［ダーゼを作用させ生成し九Ｎ−ア
セチルノイラミン＊’ｅ含むものをいう。In the present invention, a sample refers to serum, plasma, or a sample containing 9N-acetylneuramine*'e produced by reacting neurami[dase] to a sample containing sialic acid.

本発明で生成される過酸化水素の定量はいかなる方法を
用いても良いが、例えばペルオキシダーゼ、あるいはカ
タラーゼによる酵素法によって比色定量する方法、直接
電極による定量方法などがある。Any method may be used to quantify hydrogen peroxide produced in the present invention, including a colorimetric assay using an enzymatic method using peroxidase or catalase, and a method using a direct electrode.

ペルオキシダーゼを用いる方法とし、では、例えばＮ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ソルフォプロビル
）　−ｍ　−）ルイジンナトリウム塩ｃ以下Ｅｕ５ｐＴ
と略す）と４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）の共存
下、過酸化水素にペルオキシダーゼを作用させ、キノン
色素を生成【、７．５５０ｎｍの吸光度を測定する方法
がある。この方法では高ビリルビン血清、溶血血清にお
いてブランク値が高くなり、正確な濃度測定ができ々い
ことがある。A method using peroxidase, for example, N-
Ethyl-N-(2-hydroxy-3-solfoprovir)-m-)luidine sodium salt cEu5pT
There is a method in which a quinone dye is produced by reacting hydrogen peroxide with peroxidase in the coexistence of 4-aminoantipyrine (4-AA) and 4-aminoantipyrine (4-AA), and measuring the absorbance at 7.550 nm. With this method, the blank value may be high for high bilirubin serum or hemolyzed serum, and accurate concentration measurement may not be possible.

このようなときはＮ−エチル−Ｎ−ソルフォピロビルー
３．５−ジメトキシアニリンを用い、５９５ｎｍの吸光
度を測定すれば、血清ブランクの必要なしに測定するこ
とができる。In such a case, by using N-ethyl-N-solfopyrrobyl-3,5-dimethoxyaniline and measuring the absorbance at 595 nm, the measurement can be performed without the need for a serum blank.

カタラーゼを用いる方法と１２では、過酸化水素６− とメタノールにカタラーゼを作用させ、生成り、たホル
ムアルデヒドをアンモニアの存在下、アセチルアセトン
と縮合させ、４１２ｎｍの吸光度を測定する方法がある
。この方法は検体ブランクをとるこ極を甲いて定１・す
る方法がある。Method 12 uses catalase, and there is a method in which hydrogen peroxide 6- and methanol are treated with catalase, the resulting formaldehyde is condensed with acetylacetone in the presence of ammonia, and the absorbance at 412 nm is measured. For this method, there is a method for determining the amount by taking a sample blank.

又、本発明では過酸化水素の発色管妨害する検体中のア
スコルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳ
Ｏと略記する）を作用させ、乙ことにより除去すること
もできる。この場合、ＡＳＯは他の酵素反応に先だって
作用させても、また他の酵素反応と共役させて同時に作
用させて除去してもよい。ＡＳＯは微生物又は植物白米
のものがあるが、好ましくはカポチャ、キュウリ由来の
ものがめる。In addition, in the present invention, ascorbic acid in the specimen, which interferes with hydrogen peroxide in the color tube, is treated with ascorbic acid oxidase (hereinafter referred to as AS).
(abbreviated as O) can also be removed. In this case, ASO may be removed by acting prior to other enzymatic reactions, or by being conjugated with and simultaneously acting with other enzymatic reactions. ASO may be derived from microorganisms or vegetable white rice, but preferably one derived from kapocha or cucumber.

本発明による試薬１１ｔｐＨ３〜ＩＯＫ緩衝した組成物
であり、本発明による試薬ケ用いＮ−アセチルノイラさ
ン酸を測定する場合の反応温度は約４〜５０℃である。The reagent according to the present invention is a pH 3-IOK buffered composition, and the reaction temperature when measuring N-acetylneurasanoic acid using the reagent according to the present invention is about 4-50°C.

本発明によるＮ−アセチルノ・ｆラミン酸測定用組成物
はノイラミン酸アル叛ラーゼ、ＡＧ−エピメラーゼ、Ｎ
ＡＨＯＤの酵素類、生成される過酸化水素またはＮ−ア
セチルグルコサミン酸量（グ消費さ九る酸素ケだ号する
ための酵素類捷たに試薬類を適当に組み合わせることに
より成る。この試薬類、酵素類（性液剤、固型剤も１．
りけ凍結乾燥剤と１１、必要に応じて使用前に緩衝液を
添加１．て測定用試薬とする。The composition for measuring N-acetylno-f-lamic acid according to the present invention includes neuraminic acid alkylase, AG-epimerase,
AHOD enzymes, the amount of hydrogen peroxide or N-acetylglucosamic acid produced (the amount of oxygen consumed), and the enzymes and reagents are appropriately combined. These reagents, Enzymes (liquid and solid preparations are also included in 1.
Rike lyophilizer and 11, add buffer before use if necessary1. and use it as a measurement reagent.

測定方法は試料にまず第１試薬のノイラミン酸アルドラ
ーゼ、ＡＧ−エピメラーゼを含む試薬全作用させ、Ｎ−
アセチルノイラミン酸’（ｒＮ−アセチルマンノサミン
ｒＣ２さらＫ　Ｎ−アセチルグルコザミンとする。次（
Ｃ第２試薬とし、てＮ　Ａ　Ｔ（ＯＤおよび生成される
過酸化水素を測定する試薬を添加することにより過酸化
水素全測定する。本発明では上記２試薬系の測定方法で
も、また上記試薬を混合して１試薬にする１試薬系の測
定方法でも良く、さらには何試薬系で測定Ｌ７でも良い
。The measurement method is to first apply the first reagent containing neuraminic acid aldolase and AG-epimerase to the sample, and then
Acetylneuraminic acid' (rN-acetylmannosamine rC2 further referred to as K N-acetylglucosamine. Next (
The total amount of hydrogen peroxide is measured by adding a reagent for measuring NAT(OD) and generated hydrogen peroxide as the second reagent.In the present invention, the above two-reagent system measurement method also A one-reagent system measurement method may be used, in which the two reagents are mixed to make one reagent, or moreover, any number of reagent systems may be used for measurement L7.

本発明では、試料に、７′イラミン酸アルドラーゼ。In the present invention, the sample contains 7' ilamate aldolase.

ＡＧ−エピメラーゼおよびＮＡＨＯＤｆ−作用させるこ
とにより、操作が簡単で、しかも内因性ピルビン酸の影
響を受けない正確性の高いＮ−アセチルノイラミン酸ｙ
−Ｈが可能となり、シアル酸の臨床検査の診断分骨にお
いてもきわめて石意義である。By acting on AG-epimerase and NAHODf, N-acetylneuraminic acid y is easy to operate and highly accurate and is not affected by endogenous pyruvate.
-H becomes possible, which is of great significance in the diagnostic field of clinical tests for sialic acid.

次に本発明を実施例により説明する。Next, the present invention will be explained by examples.

実施例１ ｆｉ？ｆｆｌ中のＮ−アセチルノイラミン酸の濃度を下
記試薬を用い、下記方法により定１した。Example 1 fi? The concentration of N-acetylneuraminic acid in ffl was determined by the following method using the following reagent.

１試　薬 ノイラミン酸アルドラーゼ　４０単位 ＡＧ−エピメラーゼ　３００μ４ ＮＡＴ（ＣＩＤ　４単位 ４−ＡＡ　Ｏ，５ｎ−ｒ９ ＥＨ８ＰＴ　２ｍｆ ＡＴＰ　６０．５３ｍｇ ｏ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐ’Ｈ７，（１）　全量１０ｍ
１２、測定方法 試料２０μｅを試験管にとり、これに上記試薬３ｍｌ　
ｆ添加Ｌ、３７℃　２０分間反応させた後、波長５５０
ｎｍで吸光度Ｉｌｌ定した。この試料のＮ　−９− アセチルノイラミン酸の濃度は既知濃度のＮ　−アセチ
ルノイラミン酸と比較することによりめた。第１図に検
量線を示す。1 reagent Neuramic acid aldolase 40 units AG-epimerase 300μ4 NAT (CID 4 units 4-AA O,5n-r9 EH8PT 2mf ATP 60.53mg o, 1M phosphate buffer (p'H7, (1) Total volume 10m
12.Measurement method Take 20 μe of the sample in a test tube and add 3 ml of the above reagent to it.
f addition L, after reacting for 20 minutes at 37°C, wavelength 550
Absorbance was determined at nm. The concentration of N-9-acetylneuraminic acid in this sample was determined by comparing it with a known concentration of N-acetylneuraminic acid. Figure 1 shows the calibration curve.

実施例２ 血清中のシアル酸量全下記試薬を用い、下記方法によシ
定量した。Example 2 Amount of sialic acid in serum The amount of sialic acid in serum was determined using the following reagents and the following method.

本発明の詳細な説明するため、次のように試験を行なっ
た。血清中のシアル酸にノイラミ「ダーゼｆ作用させ、
Ｎ−アセチルノイラミン酸にし、本発明の定量方法によ
って測定する方法をＡ法とする。血清中のシアル酸をノ
イラミ「り−ゼでノイラミン酸にし、ノイラミン酸アル
ドラーゼによりピルビン酸を生成し、このピルビン酸に
ピルビン酸オキシダーゼを作用させ、生ずる過酸化水素
を定量する方法ｆｔＢ法とする。Ａ、Ｂの方法で血清中
のシアル酸量を定量［、た。さらに同一の血清中に存在
するピルビン酸１１？ピルビン酸にピルビン酸オキシダ
ー４１作用させ、生成する過酸化水素を測定する方法を
用い定量した。In order to explain the present invention in detail, tests were conducted as follows. Neurami'dase f acts on sialic acid in serum,
Method A is a method in which N-acetylneuraminic acid is converted into N-acetylneuraminic acid and measured by the quantitative method of the present invention. The ftB method is a method in which sialic acid in serum is converted to neuraminic acid by neuramilyase, pyruvic acid is produced by neuraminic acid aldolase, pyruvate oxidase is applied to this pyruvic acid, and the resulting hydrogen peroxide is quantified. The amount of sialic acid in serum was determined using the methods described in A and B. In addition, a method was developed in which pyruvate oxidizer 41 was applied to pyruvate 11?pyruvic acid present in the same serum and the hydrogen peroxide produced was measured. It was quantified using

Ａ法 １０− １、試　薬 ソイラミｌダーゼ（牛丼化学製〕　１０単位ノイラミン
酸アルドラーゼ（牛丼化学製）　４０単位ＡＧ−エピメ
ラーゼ　０．３ｍ１ ＮＡＨＯＤ　１単位 ４−ＡＡ　Ｏ，５ｍｆ ＴＯＯ８２ｍｆ ＡＴＰ　６０．５３ｍｆ Ｏ０ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　全量１０ｍｊ？
２、測定方法 血清を２０μｌ試験管に取り、上記試薬３ｍＡ”ｆ：添
加１１．３７℃２０分反応させた後、波長５５０ｎｍで
吸光度測定した。血清中のシアル酸量は既知濃度のシア
ル酸を比較することによりめた。Method A 10-1, Reagents Soyramidase (Gyudon Kagaku) 10 units Neuramic acid aldolase (Gyudon Kagaku) 40 units AG-epimerase 0.3 ml NAHOD 1 unit 4-AA O, 5 mf TOO 82 mf ATP 60.53 mf O0IM phosphate buffer (pH 7,0) total volume 10mj?
2.Measurement method: Take 20 μl of serum into a test tube, add 3 mA of the above reagent, react for 20 minutes at 37°C, and then measure the absorbance at a wavelength of 550 nm. Determined by comparison.

Ｂ法 スガワラ等による「クリニカヒミカアクタ　」第１０８
巻第４９３〜４９８頁に記載されている方法で測定し７
’ｍ。“Clinic Himika Acta” No. 108 by B-ho Sugawara et al.
Measured by the method described in Vol. 493-498 7
'm.

１、試　薬 試薬Ｂｌ ソイラミｌダーゼ（牛丼化学製）　２単位ノイラミン酸
アルドラーゼ（牛丼化学製）　１０単位６ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６，８）　全量１０ｍ１試薬Ｂｌ　下記の試
薬ＢＩ［−■　Ｂ１１−■を容量比５：２の割合に混合
する。1. Reagents Reagent Bl Soyramidase (Gyudon Chemical Co., Ltd.) 2 units Neuramic acid aldolase (Gyudon Chemical Co., Ltd.) 10 units 6mM phosphate buffer (pH 6,8) Total volume 10ml 1 Reagent Bl The following reagent BI [-■ B11 -■ are mixed in a volume ratio of 5:2.

ＢＴＩ−■ ピルビン酸オキシダーゼ　１００単位 ＴＰＰ　１４μｍｏｌｅ ＦＡＤ　Ｏ，３６μｍｏｌｅ ｐ−クロロフェノール　５７μｍｏ　ｌｅＭｆＩＣＪｌ
　１５０μｍ０１８ ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）全量１５ｍＡ’Ｂ
１１−■ ＰＯＤ　５５０単位 ４−ＡＡ８９μｍｏｌｅ ＮａＮ１　１　、５５ｍｍｏｌｅ ４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　５０ｍ１試薬ＢＩ
［［ ＥＤＴＡ　５０ｍｍｏｌｅ Ｎａ　＠ＭＰ０．　０　、１　ｍｏ　ｌ　ｅクエン酸ナ
トリウム　０．１ｍｏｌｅ トリトンＸ−４０５３Ｆ イオン交換水　全量　１１ ２、測定方法 血清’！１−５０μｌ試験管にとり、これに試薬Ｂ１０
．５ｍ１ｋ添加し、４５℃３０分間インキュベートした
後、試薬ＢＩ［１ｍｌを添加し、さらに１５分間インキ
ュベートし、試薬１３１１（３，５ｍＡ’　？添加し室
温で１０分間放置した後、波長５０５ｎｍで吸光度を測
定した。血清中のシアル酸量は既知濃度のシアル酸と比
較することによってめた。BTI-■ Pyruvate oxidase 100 units TPP 14 μmole FADO, 36 μmole p-chlorophenol 57 μmole MfICJl
150μm018 20mM phosphate buffer (pH 7,4) total volume 15mA'B
11-■ POD 550 units 4-AA89μmole NaN1 1 , 55mmole 4mM phosphate buffer (pH 7,0) 50ml Reagent BI
[[EDTA 50mmole Na @MP0. 0, 1 mole Sodium citrate 0.1 mole Triton X-4053F Ion exchange water Total amount 11 2, Measurement method Serum'! Transfer 1-50 μl into a test tube and add reagent B10 to it.
．． After adding 5ml of 1k and incubating at 45°C for 30 minutes, adding 1ml of reagent BI and incubating for another 15 minutes, adding reagent 1311 (3.5mA'?) and leaving it at room temperature for 10 minutes, then measuring the absorbance at a wavelength of 505nm. The amount of sialic acid in serum was estimated by comparing with known concentrations of sialic acid.

ピルビン酸濃度測定 １試　薬 試薬ＣＩ　下記の試薬Ｃ■−■　Ｃ■−■を容量比５：
２の割合に混合する。Pyruvate concentration measurement 1 reagent Reagent CI The following reagents C■-■ C■-■ were mixed in a volume ratio of 5:
Mix in 2 parts.

試薬Ｃ■−■ ノイラミをダーゼ（牛丼化学製）　２単位ノイラミン酸
アルドラーゼ（牛丼化学製）１ｍ位６ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６，８）　全量１０ｍ１１３− 試薬ＣＩ−■ ＰＯＤ　５５０単位 ４−ＡＡ８９μｍｏ　ｌ　ｅ ＮａＮ１　１．５ｍ　ｍｏｌｅ ４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　５０ｍＡ！試薬Ｃ
■ ＥＤＴＡ　５０ｍＭ ＮａＮｔＨＰＯ＋　０．１ｍｍｏｌｅ クエン酸ナトリウム　０．１．ｍｏｌｅトリ　トンＸ−
４０５３ｆ イオン交換水　全量１１ ２、測定方法 血清５０μｌを試験管にとり、これに試薬Ｃ１１ｍＡ！
！添加し３７℃１５分間インキュベート１−１た後−試
薬ＣＩＩ　３．５ｍＮ　’ｅ添加し室温で１０分間放置
Ｉ−た後、波長５０５　ｎｍで吸光度を測定した。Reagent C■-■ Neurami wo Dase (manufactured by Gyudon Kagaku) 2 units Neuramic acid aldolase (manufactured by Gyudon Kagaku) 1 m 6mM phosphate buffer (pH 6,8) Total volume 10ml 113- Reagent CI-■ POD 550 units 4-AA89μmo l e NaN1 1.5m mole 4mM phosphate buffer (pH 7,0) 50mA! Reagent C
■ EDTA 50mM NaNtHPO+ 0.1mmole Sodium citrate 0.1. mole triton X-
4053f Ion-exchanged water Total amount 11 2. Measurement method: Take 50μl of serum into a test tube and add reagent C11mA!
! After adding and incubating at 37° C. for 15 minutes, 3.5 mN'e of reagent CII was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After that, the absorbance was measured at a wavelength of 505 nm.

血清中のピルビン酸濃度は既知濃度のピルビン酸と比較
することによってめた。Pyruvate concentration in serum was determined by comparing with known concentrations of pyruvate.

血清中のシアル酸濃度、ピルビン酸濃度の測定値を第１
表に示す。The measured values of sialic acid concentration and pyruvate concentration in serum are
Shown in the table.

１４− 第１表には血清中のピルビン酸量をシアル酸濃度に換算
１．た値も記載する。14- Table 1 shows the amount of pyruvate in serum converted to sialic acid concentration1. Also record the value.

第　１　表 第１表から明らか表ように、従来法（Ｂ法）では血清中
に存在するピルビン酸の影響を受け、シアルＷｌを過剰
に定量するが、本発明ではピルビン酸の影響を受けるこ
となく、正確にシアル酸濃度を定量することができる。Table 1 As is clear from Table 1, the conventional method (method B) is affected by pyruvate present in serum and excessively quantifies Sial Wl, but the present invention is not affected by pyruvate. The concentration of sialic acid can be determined accurately.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は実施例１の検量線を示す。 特許出願人　東洋紡績椋氏会社 −Ｌ）− 〇Ｄ　５５０ｎｍ Ｎ−アｔ＋ルノイラミン曲爽量（ｍｇ／ｄ１）　１６− 手　続　補　正　書　（自発） □昭和５９年４月槽１日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 Ｌ　事件の表示 昭和５９年特許願第３９２’ｌＢ号 ２　発明の名称 Ｎ−アセチルノイラミン酸の酵素的定置方法８、　補正
をする者 事件との関係　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 生　補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ｇ　祐工の力宛　ｌで、 「ニジエリシア・コリ１」の次に「クロストリディウム
属」を挿入する。 （２）同第４貴下から第２行目 「ニジエリシア・コリ由来」を１微生物由来」に訂正す
る。 （８）同第５頁第１１行目 「ＮＡＨＯＤがある。」の次に「必要があれば鴬を挿入
する。 ＜４）　同第６頁第７〜１９行目 「例えばＮ−エチル−・・・・・することができる。」
を［色原体として４−アミノアンチピリンと７エノール
またはその誘導体１４−アミノアンチピリンとアニリン
またはその誘導体、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノ
ンヒドラゾンとアニリンまたはその誘導体などを用いる
方法がある。）−１−／−ルｔｊ４体トＬ／では、ｐ−
クロロフェノール、２．４−ジクロロフェノール１ｐ−
ブロモフェノール、ｏ−クロロフェノール、ｍ−クロロ
フェノール）２，６−ジクロロフェノール１２，３−ジ
クロロフェノールなどがある。またアニリン誘導体とし
てはＨ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニ
リン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジンｚ　Ｎ、Ｎ−
ジメチル−ｍ−アニシジン１Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メ
チルフェニル）−ソーアセチルエチレンジアミン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジ
ンＸＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジン（以下１１ｔＨ８ＰＴと略す
）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−）ルイジン
１Ｎ−エチルーＮ−スルホプロピル−３，５−ジメトキ
シアニリン、に−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）　−３，５−ジメトキシアニリン１Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン等があ
る。」に訂正する。 （５）同第８頁第９行目 「第１試薬の」を削除する。 （６）同第８頁第１０行目 「含む試薬」を削除する。 （１）同第８頁第１３行目 「第２試薬として」を削除する。 （８）同第８頁第１４行目 「添加す」を「作用させ」に訂正する。 （９）同第８頁第１６〜１７行目 に訂正する。 四　同第１１頁第７行目 「ＴｏＯ８」を［ｉｌｔ　ＨＳ　Ｐ　ＴＪに訂正する。FIG. 1 shows the calibration curve of Example 1. Patent applicant: Toyo Boseki Co., Ltd. - L) - 〇D 550nm N-at+Lunouriramine composition amount (mg/d1) 16- Procedural amendment (voluntary) □ April 1, 1980 Commissioner of the Patent Office Kazuo Wakasugi L Case indication Patent application No. 392'lB 2 of 1980 Name of the invention Enzymatic emplacement method of N-acetylneuraminic acid 8 Relationship with the amended person's case Patent applicant Osaka City Kita Dojimahama 2-2-8, Ward, ``Detailed explanation of the invention'' section of the specification to be amended g To Yuko Chikara l, after ``Nigierisia coli 1'', ``Clostridium genus'' was added. insert. (2) From No. 4 of the same, in the second line, ``Derived from N. coli'' is corrected to ``Derived from 1 microorganism.'' (8) On page 5, line 11, ``There is NAHOD.'' Next to ``If necessary, insert a tsumugi.''<4) On page 6, lines 7 to 19, ``For example, N-ethyl. ····can do."
[There is a method of using 4-aminoantipyrine and 7 enol or a derivative thereof, 14-aminoantipyrine and aniline or a derivative thereof, 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone and aniline or a derivative thereof, etc. as chromogens. )-1-/-ru tj4 body tL/, p-
Chlorophenol, 2,4-dichlorophenol 1p-
Bromophenol, o-chlorophenol, m-chlorophenol) 2,6-dichlorophenol, 12,3-dichlorophenol, and the like. In addition, examples of aniline derivatives include H,N-dimethylaniline, N,N-diethylaniline, N,N-diethyl-m-)luidinez N,N-
Dimethyl-m-anisidine 1N-ethyl-N-(3-methylphenyl)-soacetylethylenediamine, N-
Ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-m-toluidine m-) luidine 1N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, di-ethyl-N-(2-hydroxy-3-
sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline 1N
-ethyl-N-sulfopropyl-m-anisidine and the like. ” is corrected. (5) Delete "of the first reagent" on page 8, line 9. (6) Delete "Containing reagents" on page 8, line 10. (1) Delete "As a second reagent" on page 8, line 13. (8) On page 8, line 14, ``add'' is corrected to ``act.'' (9) Corrected page 8, lines 16-17. 4. Correct “ToO8” on page 11, line 7 to [ilt HS P TJ.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] Ｎ−アセチルノイラミン酸試料にノイラミン酸アルドラ
ーゼ、アシルグルコサミン−２−エピメラーゼおよびＮ
−アセチルへキンサミンオキシダーゼを作用させて、生
成する過酸化水素又はＮ−アセチルグルコサミン酸又は
消費される酸素を測定することを特徴とするＮ−アセチ
ルノイラミン酸の酵素的定量方法。N-acetylneuraminic acid samples contained neuraminic acid aldolase, acylglucosamine-2-epimerase and N-acetylneuraminic acid samples.
- An enzymatic method for quantifying N-acetylneuraminic acid, which comprises measuring hydrogen peroxide or N-acetylglucosamic acid produced or oxygen consumed by the action of acetylhexamine oxidase.