JPS60180591A - Dna sequence, plasmid and host of human urokinase - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a DNA sequence coding an amino acid sequence equivalent to urokinase derived from human urine, by using an mRNA obtained from the human kidney cell as template, inserting a vector to the cDNA prepared by using the template, and inserting a plasmid to a host. CONSTITUTION:The urokinase mRNA separated and purified from the human kidney cell is treated with SI nuclease to remove the single stranded fraction. The obtained double stranded fraction is subjected to the sucrose density gradient centrifugation to collect the dcDNA fraction having high molecular weight. About 1/5 of the double stranded cDNA is added with the tail of poly(C). Separately, the tail of poly(G) is added to the plasmid pBR322 of Escherichia coli. Both products are linked together by annealing. The pBR322 plasmid inserted with dscDNA and prepared by the above process is introduced into Escherichia coli to obtain a transformation.

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、ヒトの尿由来のウロキナーゼと同等のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列、当該ＤＮＡを組み込ん
だプラスミド、さらには当該ＤＮＡで形質転換された宿
主に関する。さらに詳しくは、ヒト腎細胞よりｍＲＮＡ
を得、これを基にＣＤＮＡを得、ｃＤＮＡをベクターに
挿入し、さらには宿主にプラスミドの挿入を行い、形質
転換体を得ることに関する。Detailed Description of the Invention [Technical Field] The present invention relates to a DNA sequence encoding an amino acid sequence equivalent to urokinase derived from human urine, a plasmid incorporating the DNA, and a host transformed with the DNA. . For more details, see mRNA from human kidney cells.
It relates to obtaining a transformant by obtaining a cDNA based on the obtained cDNA, inserting the cDNA into a vector, and further inserting a plasmid into a host.

〔従来技術〕[Prior art]

ウロキナーゼは、人尿より得られるプラスミノゲンアク
チヘーターで、各種血栓や塞栓性疾患の治療および制癌
剤との併用療法等に広く用いられており、優れた治療効
果をもたらしている。ウロキナーゼを製造する方法とし
ては、現在人尿からの精製法が主流である（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ、　Ｊ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｂｒ。Urokinase is a plasminogen activator obtained from human urine, and is widely used in the treatment of various thrombotic and embolic diseases, as well as in combination therapy with anticancer drugs, and has excellent therapeutic effects. Currently, the mainstream method for producing urokinase is the purification method from human urine (Willi
ams, J, R, B,, Br.

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、３２．　５３０参照）
。J, Exp, Pathol, 32. 530)
.

これに代わる方法として、細胞培養法による技術開発が
進められ、ヒト腎細胞を分離、継代してこれよりウロキ
ナーゼを製造する方法も第２の主要な方法となりつつあ
る。しかし、近年ＤＮＡ組み換え技術の改良によって、
大腸菌、酵母、枯草菌等の微生物を用い、目的タンパク
質の工業的規模での生産が可能になった（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ、　Ｄ、　ｖ、ｌ　Ｉｔ−ａｋｕｒａ＋　Ｋ、ｌ　ｅ
ｔ　ａｌ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｈ、八ｃａｄ、Ｓｅｔ、
Ｕ、Ｓ。As an alternative method, technological development using cell culture methods is progressing, and the method of separating and passage human kidney cells and producing urokinase therefrom is also becoming the second major method. However, with recent improvements in DNA recombination technology,
It has become possible to produce target proteins on an industrial scale using microorganisms such as Escherichia coli, yeast, and Bacillus subtilis (Goedde
l, D, v, l It-akura+ K, l e
tal+ Proc, Nath, 8cad, Set,
U,S.

八、、７６．１０６　（，１９７９）およびＮａｇａｔ
ａ、　Ｓ、。8, 76.106 (, 1979) and Nagat.
a.S.

Ｔａ１ｒａ、　Ｓ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｉｓｓｍａｒｎ、
　Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、２８↓、１３１６　（１９８０
）参照）。Ta1ra, S, H, and Wissmarn,
C., Nature, 28↓, 1316 (1980
)reference).

そこで、本発明者らは、組み換えＤＮＡ技術を用いてウ
ロキナーゼの産生を行うべく検討を行った結果、ヒト腎
細胞より得たｍＲＮＡｔｌ−鋳型として得られるヒト由
来のウロキナーゼと同等のアミノ酸配列をコードする遺
伝子のクローニングに成功し、そのＤＮＡ塩基配列を決
定することにより、本発明を完成した。Therefore, the present inventors investigated the production of urokinase using recombinant DNA technology, and found that the amino acid sequence encoding the same amino acid sequence as human-derived urokinase obtained as an mRNA Atl-template obtained from human kidney cells was found. The present invention was completed by successfully cloning the gene and determining its DNA base sequence.

〔本発明の概略〕[Outline of the present invention]

ヒト腎細胞より単離精製したウロキナーゼｍＲＮＡを有
するｍＲＮＡ画分（１８ｓ　〜２０ｓ）を用い、ｃＤＮ
Ａの合成を行った。ｍＲＮＡ画分μｇより始め、逆転写
酵素及びＤ　Ｎ　Ａ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ■を用い、
３．３μｇの二本鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓ　ｃＤＮＡ）を合
成した。Ｓ１ヌクレアーゼ処理により一本鎖部分を除去
した後、この二本鎖ｃＤＮＡをショ糖密度勾配遠心にか
け分子量の大きなｄｓ’ｃＤＮＡ画分だけ（７５０ｎｇ
）を集めた。そしてこの二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの１１５
　（１５０ｎｇ）にポリ（Ｃ）のテイルを付加し、また
これとは別に調製した大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２に
はポリ（Ｇ）のテイルを付加し、これら両者をアニーリ
ングにより連結した。次にこのｄｓｃＤＮＡの挿入した
ｐＢＲ３２２プラスミドを大腸菌に導入したところ、約
７０．０００個の形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎ
ｔｓ　）が得られた。そのうち９０％以上は、ｐＢＲ３
２２のＰｓｔ１部位にｃＤＮＡが挿入していることを示
すアンピシリン感受性株であった。Using an mRNA fraction (18s to 20s) containing urokinase mRNA isolated and purified from human kidney cells, cDNA
A was synthesized. Starting from μg of mRNA fraction, using reverse transcriptase and DNA polymerase,
3.3 μg of double-stranded cDNA (ds cDNA) was synthesized. After removing the single-stranded portion by S1 nuclease treatment, this double-stranded cDNA was subjected to sucrose density gradient centrifugation to extract only the large molecular weight ds' cDNA fraction (750 ng
) were collected. And 115 of this double-stranded cDNA
(150 ng) was added with a poly(C) tail, and a separately prepared E. coli plasmid pBR322 was added with a poly(G) tail, and the two were ligated by annealing. Next, when this dscDNA-inserted pBR322 plasmid was introduced into E. coli, approximately 70,000 transformants were obtained.
ts) was obtained. More than 90% of them are pBR3
It was an ampicillin-sensitive strain showing that cDNA was inserted into the Pst1 site of 22.

これら形質転換体のうち１０，０００コロニーについて
、ウロキナーゼｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを選出するためのスクリ
ーニングを行った。ウロキナーゼのアミノ酸配列に基づ
いて１４ｍｅｒのオリゴデオキシリボヌクレオチド、即
ち、 ＮＯ３−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇ
Ｏ，ＯＨ３’　−ＣＴ、７−ＴＡＣ−ＴＴ、”−ＡＡニ
ーＣＴ−５’の８種の混合物を合成し、これをｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｂｅ　（ハイブリダイゼーシ
ョン　プローブ）として用い、ｃｏｌｏｎｙ　ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（コロニー　ハイブリダイゼーシ
ョン）によりウロキナーゼｃＤＮＡのスクリーニングを
行った。その結果、ウロキナーゼのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含
むと考えられる４つの陽性コロニーが得られた。これら
４コロニーよりプラスミドＤＮＡを８周製しくｐ　ＵＫ
　１〜４）、そのｃＤＮＡの大きさを測定−した結果、
ｐＵＫｌは１９００ｂｐ、、ｐＵＫ２は１７０ｂｐ−ｐ
ＵＫ３は１１５０ｂｐ、ｐＵＫ４は１３００ｂｐの大き
さのｃＤＮＡを有していた。次にｐＵＫｌ、３．４につ
いて詳細な制限地図を作成したところ、これらのｃＤＮ
Ａは相互にオーバーラツプした同一の制限地図を示した
（第２図参照）。そこでｐＬＩＫｌとｐＵＫ４の一部分
をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（マクサム−ギルバー
ト法）にてＤＮＡの塩基配列を決めたところ、ｐＵＫｌ
、ｐＵＫ４ともにそのＤＮＡ塩基配列は既知のウロキナ
ーゼのアミノ配列から考えられるＤＮＡ塩基配列と一致
した。ｐＵＫｌは、ウロキナーゼのＮ末端より３８番目
のアミノ酸からＣ末端方向に、３′ノンコーデイング　
リージョンを含むｃＤＮＡを有しており、ｐＵＫ４は、
ウロキナーゼのＮ末端より３８０８０番目ミノ酸からＮ
末端方向に、シグナルペプチド及び５°ノンコーデイン
グ　リージョンを含むｃＤＮＡを有していた。このｐＵ
Ｋｌ、ｐＵＫ４をＢｇｌ１１部位を利用して連結させ、
ウロキナーゼの翻訳領域を全て含むプラスミドを作成し
た。これによりウロキナーゼの翻訳領域すべてとその周
辺のＤＮＡ塩基配列を決定し、さらにその配列よりシグ
ナルペプチドおよび翻訳領域のアミノ酸配列を決定した
（第１図参照）。その結果、ウロキナーゼは２０個のア
ミノ酸からなるシグナルペプチドとそれにツツ＜４１１
１１１ｉ１のアミノ酸より構成されていることが明らか
になった。またウロキナーゼｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列
などからウロキナーゼｍＲＮＡには８０塩基以上の５゛
ノンコーデイング　リージョンと８００塩基以上の３”
ノンコーディングリージョンが存在していることが明ら
かになった（第１図参照）。Of these transformants, 10,000 colonies were screened to select urokinase c DNA. Based on the amino acid sequence of urokinase, a 14-mer oligodeoxyribonucleotide, namely NO3-Glu-Met-Lys-Phe-Glu-G
A mixture of 8 types of O,OH3'-CT, 7-TAC-TT, and "-AAnee CT-5' was synthesized, and this was
Used as an idization probe (hybridization probe), colony hybrid
Urokinase cDNA was screened by colony hybridization. As a result, four positive colonies thought to contain urokinase cDNA were obtained. Plasmid DNA was isolated from these 4 colonies 8 times.UK
1-4), as a result of measuring the size of the cDNA,
pUKl is 1900bp, pUK2 is 170bp-p
UK3 had a cDNA of 1150 bp, and pUK4 had a cDNA of 1300 bp. Next, we created a detailed restriction map for pUKl, 3.4, and found that these cDNAs
A shows the same restriction maps overlapping each other (see Figure 2). Therefore, when we determined the DNA base sequence of pLIKl and part of pUK4 using the Maxam-Gilbert method, we found that pLIKl
The DNA base sequences of both pUK4 and pUK4 matched the DNA base sequences thought from the known amino sequence of urokinase. pUKl contains a 3' non-coding sequence from the 38th amino acid from the N-terminus of urokinase toward the C-terminus.
pUK4 has a cDNA containing the region,
From the 38080th amino acid from the N-terminus of urokinase
It had a cDNA containing a signal peptide and a 5° non-coding region towards the end. This pU
Kl and pUK4 are linked using the Bgl11 site,
A plasmid containing the entire translated region of urokinase was constructed. As a result, the entire translated region of urokinase and its surrounding DNA base sequence was determined, and from this sequence, the signal peptide and the amino acid sequence of the translated region were determined (see Figure 1). As a result, urokinase consists of a signal peptide consisting of 20 amino acids and a tutu<411
It was revealed that it is composed of 111i1 amino acids. Also, based on the DNA base sequence of urokinase cDNA, urokinase mRNA has a 5" non-coding region of 80 bases or more and a 3" region of 800 bases or more.
It became clear that there were non-coding regions (see Figure 1).

〔製造例〕[Manufacturing example]

（ｌ１ｍＲＮＡの単離・精製 （ａｌ使用細胞 ウロキナーゼを産生ずる人腎細胞から全ＲＮＡを抽出す
るため、まずこの細胞を増殖培地を用いて多段式プラソ
チソク培養器およびルーピンにてモルイヤーを形成させ
た後、培地を維持培地に変換し、さらに１０〜１５時間
の培養を行った。(Isolation and purification of l1 mRNA (cells using al) In order to extract total RNA from human kidney cells that produce urokinase, the cells were first incubated with a multistage plastic incubator and lupine using a growth medium. Then, the medium was converted to maintenance medium and cultured for an additional 10 to 15 hours.

この時期の細胞２〜５Ｘ１０’ｌｌｌをトリプシン処理
によって集め、全ＲＮＡ及びポリゾームＲＮＡを抽出し
た。2 to 5 x 10'll of cells at this stage were collected by trypsin treatment, and total RNA and polysomal RNA were extracted.

ｆｂ）ｍＲＮＡの回収 特開昭５８−１４８８９９　（出願人株式会社ミドリ十
字）において開示された方法を用い、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へのインジェクションによりウロキナーゼの
活性がみられた１９〜２０Ｓの大きさのｍＲＮＡを単離
・精製した。fb) Recovery of mRNA Using the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-148899 (applicant: Midori Jujii Co., Ltd.), the size of 19-20S in which urokinase activity was observed was injected into African frog oocytes. mRNA was isolated and purified.

（２）−重鎖ＣＤＮＡの合成 ｃＤＮＡの合成は、主としてＪ、　Ｂｉｏｌ、’Ｃｈｅ
ｍ、＋２５３．２４８３−２４９５　（１９７Ｂ）、Ｍ
ａｒｕｉｎ、Ｐ、Ｗ、ｅｔ　ａｌの報告を基に行った。(2) - Synthesis of heavy chain cDNA Synthesis of cDNA is mainly carried out by J. Biol, 'Che.
m, +253.2483-2495 (197B), M
This was done based on the report by Aruin, P., W. et al.

＋８１表１に示した反応混合液に６５℃、５分間加熱後
氷上にて急冷したウロキナーゼｍＲＮＡを２０μｇ加え
、エソペンドルフチューブ内でよく混ぜた後、氷上に放
置した。+81 To the reaction mixture shown in Table 1 was added 20 μg of urokinase mRNA which had been heated at 65° C. for 5 minutes and then rapidly cooled on ice, mixed well in an Esopendorf tube, and then left on ice.

（以下余白） 表１ （ｂ）　４６℃、１０分〜１２分の反応により、一本鎖
目のｃＤＮＡの合成を行った。(Margin below) Table 1 (b) First-strand cDNA was synthesized by reaction at 46°C for 10 to 12 minutes.

（Ｃ）この反応混合液に０．５ＭＥＤＴ＾、２０μｌを
加えることにより反応を終了させた。(C) The reaction was terminated by adding 20 μl of 0.5 MEDT^ to this reaction mixture.

（ｄ１反応混合液に等量（２００μｌ）のフェノール／
クロロホルム溶液を加え、ポルテックスにて攪拌後、１
０，００（ｌ　ｒｐｍ、３分間の遠心を行い、その上層
を分取した。下層にはさらに等量のｃ−ｉ。(d1 reaction mixture with equal volume (200 μl) of phenol/
After adding chloroform solution and stirring with portex, 1
Centrifugation was performed at 0.00 (l rpm) for 3 minutes, and the upper layer was collected. The lower layer was further divided into an equal amount of c-i.

Ｏ緩衝液（１０ｍＭ）リス−Ｈｅ　ｌ　ｐＨ８，０，１
ｍＭＥＤＴ＾、１００ｍＭ　、ＮａＣ１）を加え、再度
抽出を行った。両者の水層を混合し、この反応液に８０
％グリセリンを６０μβ加えた。O buffer (10mM) Lis-HeI pH8,0,1
mMEDT^, 100mM, NaCl) was added and extraction was performed again. Mix both aqueous layers and add 80% to this reaction solution.
% glycerin was added at 60 μβ.

（ｅｌセファデックスＧ−１００カラムに反応混合・液
をアプライし、Ｇ−１００緩衝液で溶出した。(The reaction mixture/liquid was applied to a Sephadex G-100 column and eluted with G-100 buffer.

溶出液はｌフラクション５滴ずつ分画した。The eluate was fractionated into 5 droplets each.

１０各フラクシヨンをチェレンコフ　カウントで測定し
、放射活性のピーク部分を集めた。10 Each fraction was measured by Cerenkov counting, and the peak portion of radioactivity was collected.

（ｇ＋　１　／　１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、
１０μｇのｔＲＮＡ、２容のエタノールを添加し、−８
０℃で２０分冷却した。(g + 1/10 volumes of 3M sodium acetate buffer,
Add 10 μg of tRNA, 2 volumes of ethanol, -8
Cooled at 0°C for 20 minutes.

ｌｈｌ遠心（１５，００Ｏｒｐｍ、　１０分）にて沈澱
を集め、これを減圧下乾燥した。The precipitate was collected by lhl centrifugation (15.00 rpm, 10 minutes) and dried under reduced pressure.

（１）沈澱を３００ｐＨの０．ＩＮ　ＮａＯＨ熔液に熔
解し、７０℃、２０分間インキュベートした後水冷した
。(1) Precipitate at a pH of 300. It was dissolved in IN NaOH solution, incubated at 70°C for 20 minutes, and then cooled with water.

（ＪＯＩＮ　ＨＣＩ溶液、約３０μβを添加して中和し
た。中和後、２μ！をサンプリングしてその放射活性を
測定した。(About 30 μβ of JOIN HCI solution was added to neutralize it. After neutralization, 2 μ! was sampled and its radioactivity was measured.

ｆｋｌｌｏμｇのｔＲＮＡを添加し、エタノール沈澱を
行った。遠心後沈澱を集め、これを減圧下で乾燥した。fkllo μg of tRNA was added, and ethanol precipitation was performed. After centrifugation, the precipitate was collected and dried under reduced pressure.

（１）かくして−重鎖ｃＤＮＡの合成が完成した。(1) Thus, the synthesis of heavy chain cDNA was completed.

−重鎮ｃＤＮＡの合成量は、−重鎮ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ
ハイブリッドをＧ−１００カラムクロマトグラフイーに
よって回収し、これをアルカリ熱処理してｍ　ＲＮ　Ａ
を分解除去した後求めた。その結果、３．６５μｇのウ
ロキナーゼ−重鎖ｃＤＮＡを得た。-The amount of synthesis of the heavyweight cDNA is: -Heavyweight cDNA-mRNA
The hybrid was collected by G-100 column chromatography and subjected to alkaline heat treatment to mRNA
It was determined after decomposing and removing. As a result, 3.65 μg of urokinase-heavy chain cDNA was obtained.

（３）二本鎖目のＤＮＡの合成 二本鎖目のＤＮＡの合成は、まずＤＮＡポリメラーゼ■
でＤＮＡ合成し、その後逆転写酵素を用い、ＤＮＡ鎖の
延長を行った。(3) Synthesis of second-strand DNA The synthesis of second-strand DNA begins with DNA polymerase ■
DNA was synthesized, and then the DNA chain was elongated using reverse transcriptase.

（ａ）−重鎮ｃＤＮＡ１００μｌの２×反応混合液（表
２）で懸濁した。(a)-Heavyweight cDNA was suspended in 100 μl of 2× reaction mixture (Table 2).

表２ （ｂｌ　６０℃で２分間インキュベートした後、遠心＜
１５．００Ｏｒｐｍ、２．５分）し、上清を取、った。Table 2 (bl After 2 min incubation at 60°C, centrifugation <
15.00 rpm, 2.5 minutes), and the supernatant was collected.

（Ｃ）沈澱に５０μｌの水を加え、ｆｂｌの操作を繰り
返し、両者の上清を混合した。(C) 50 μl of water was added to the precipitate, the fbl operation was repeated, and both supernatants were mixed.

ｆｄｌ　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　クレノーフラグメ
ント５０　ｕｎｉｔｓを添加し、全量を２００μｌとし
た。50 units of fdl DNA polymerase I Klenow fragment was added to bring the total volume to 200 μl.

（ｅ）１５℃で一夜インキユベートした。(e) Incubated overnight at 15°C.

ｌｆｌ　０．２　Ｍ　ＥＤＴ八　（ｐＨ８，０）溶液を
２０μｌ添加して反応を停止した後、等容（２２０μ℃
）のフェノール・クロロホルム溶液を加え、混合し遠心
した。上層を分取し、フェノール層を２２０μρのＴＥ
緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣ１ｐＨ８，０゜１　ｍ　
Ｍ　ＥＤＴ八）で再抽出した。After stopping the reaction by adding 20 μl of lfl 0.2 M EDT8 (pH 8,0) solution, add the same volume (220 μ℃
) was added, mixed and centrifuged. Separate the upper layer and treat the phenol layer with TE of 220μρ.
Buffer (10mM Tris-HC1 pH8, 0°1 m
Re-extracted with MEDT8).

（ｇ１両者の水層を集め、８０％グリセリンを６０μ！
添加した。(g1 Collect both water layers and add 60μ of 80% glycerin!
Added.

（ｈｌセファデックスＧ−１００カラムにアプライし、
Ｇ−１００緩衝液で溶出した。溶出液は、１フラクショ
ン５滴ずつ分画した。(Apply to hl Sephadex G-100 column,
Elution was performed with G-100 buffer. The eluate was fractionated into 5 drops per fraction.

ｆｉｌ各フラクションをチェレンコフカウントで測定し
、放射活性のピーク部分を集めた。この液２μｉをｌＱ
ｍｌのＡＣ３ＩＩに混ぜ、放射活性を測定し、残りの液
に５μｇのｔＲＮＡ、１／ｌＯ容の３Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液を添加し、エタノール沈澱を行った。Each fraction of fil was measured by Cerenkov counting, and the peak portion of radioactivity was collected. 2μi of this solution to 1Q
The mixture was mixed with ml of AC3II, radioactivity was measured, and 5 μg of tRNA and 1/10 volume of 3M sodium acetate buffer were added to the remaining solution, followed by ethanol precipitation.

０１遠心（１５＋００Ｏｒｐｍ、１０分）にて沈澱を集
め、これを減圧下で乾燥し、ｄｓｃＤＮＡを得た。ｄｓ
　ｃＤＮＡの収量は、５，３μｇであった。The precipitate was collected by 01 centrifugation (15+00 Orpm, 10 minutes) and dried under reduced pressure to obtain dscDNA. ds
The yield of cDNA was 5.3 μg.

以下逆転写酵素を用いた２本鎮ＥＪＤ　Ｎ　Ａの合成延
長を行った。The synthesis of the two-stranded EJDNA was extended using reverse transcriptase.

（４）逆転写酵素を用いた２本鎖目ＤＮＡの合成延長（
ａｌ得られたｄｓｃＤＮＡを２０μｌの水にン容かし、
さらに表３の反応混合液３０μｐを加え、両者を混合し
た。(4) Synthetic elongation of second strand DNA using reverse transcriptase (
The obtained dscDNA was poured into 20 μl of water,
Furthermore, 30 μp of the reaction mixture shown in Table 3 was added and both were mixed.

（以下余白） 表３ （ｂｌこの混合液を４２℃で６０分間インキュベートし
た。(Margins below) Table 3 (bl) This mixture was incubated at 42°C for 60 minutes.

（ｃｌ　０．２　Ｍ　ＥＤＴＡ　ｆ４液を５μｌ加え、
反応を終了させた。(Add 5 μl of cl 0.2 M EDTA f4 solution,
The reaction was terminated.

＋ｄ１等量（５５μｌ）のフェノール・クロロホルム溶
液を加え、除蛋白を行った。+d1 equivalent (55 μl) of phenol/chloroform solution was added to remove protein.

ｔｅｌこれ以後ポリメラーゼｌを用いたｄｓｃＤＮＡの
合成と同様〔（ｇ）〜（ｊ）〕の操作を行い、次の５ｈ
ｏｎｋ、　Ｔ、　Ｅ、等に準じたＳ１ヌクレアーゼによ
る１本鎖ＤＮＡ部分の消化処理（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ。After this, the same operations as for dscDNA synthesis using polymerase I [(g) to (j)] were performed, and for the next 5 h
Digestion treatment of single-stranded DNA portion with S1 nuclease according to onk, T, E, etc. (Proc, Natl
, Acad.

Ｓｃｉ、υＳ＾、　７２．９８９　（１９７５）参照〕
へと進んだ。Sci, υS^, 72.989 (1975)]
Proceeded to.

＋５１３１ヌクレアーゼによる１本鎖ＤＮＡ部分の消化 （ａｉｄｓ　ｃＤ　Ｎ　Ａを１００．ｃｌＪの８１ヌク
レアーゼ用緩衝液（０，３Ｍ　ＮａＣ＋、３０ｍＭ酢酸
ナトリウム（ｐｔ１４．５）、３ｍＭ　ＺｎＣｌ２）に
懸濁し、３７℃、３０分間の保温にて完全にｄｓｃＤＮ
Ａを溶かした後、０．５ユニツトの８１ヌクレアーゼ（
ＰＬ社製）を添加した。Digestion of the single-stranded DNA portion with +5131 nuclease (aids cDNA was suspended in 100.clJ of 81 nuclease buffer (0.3M NaC+, 30mM sodium acetate (pt14.5), 3mM ZnCl2) at 37°C. Completely dscDN by incubation for 30 minutes
After dissolving A, add 0.5 units of 81 nuclease (
(manufactured by PL) was added.

（ｂ）３７℃、３０分間の反応後、さらに２ユニツトの
８１ヌクレアーゼを加え、さらに１５分間反応させた。(b) After reaction at 37°C for 30 minutes, two more units of 81 nuclease were added and the reaction was continued for another 15 minutes.

（Ｃ）この反応ではＳ１ヌクレアーゼでのＤＮＡ消化が
殆ど見られなかったので３１ヌクレアーゼ（三共）を０
．０２ユニツト添加し、３７℃でさらに１０分間反応さ
せた。(C) In this reaction, almost no DNA digestion with S1 nuclease was observed, so 31 nuclease (Sankyo) was added to 0.
．． 02 units were added and the reaction was continued at 37°C for an additional 10 minutes.

ｆｄｌ　Ｏ，２Ｍ　ＥＤＴＡ熔液を２０μ！加え反応を
停止し、さらに１２０μｌのフェノール・クロロホルム
溶液を加え、除蛋白を行った。fdl O, 20μ of 2M EDTA solution! The reaction was stopped, and 120 μl of phenol/chloroform solution was added to remove protein.

（ｅ）フェノール層をＴＥ緩衝液を用い再抽出した後、
両者の水層を混合し、エタノール沈澱を行い、ｄｓｃＤ
ＮＡを得た。(e) After re-extracting the phenol layer using TE buffer,
Both aqueous layers were mixed, ethanol precipitated, and dscD
Got NA.

＋６１６ｓ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのシヨ糖密度勾配遠心処理
得られたｄｓｃＤＮＡを次いでショ糖密度勾配遠心（３
８，００Ｏｒｐｍ、　４℃）にかけて分子量の大キナ両
分だけを集めた。図３にウロキナーゼｄｓｃＤＮＡ（図
中・−・で表示した）の超遠心沈降パターンを示した。Sucrose density gradient centrifugation of +616s cDNA The obtained dscDNA was then subjected to sucrose density gradient centrifugation (3
8,000 rpm, 4° C.), and only the large molecular weight components were collected. FIG. 3 shows the ultracentrifugation sedimentation pattern of urokinase dscDNA (indicated by -- in the figure).

同時にマーカーとして、グロビンｄｓｃＤＮＡ　（図中
△−△で表示した）の沈降パターンも示した。グロビン
に比ベウロキナーゼｄｓｃＤＮＡの方がピーク画分がわ
ずかにボトムの方へずれており、またフラクション１１
〜１５付近の大きなｄｓｃＤＮＡもウロキナーゼｄｓｃ
ＤＮＡの方が多かった。そこで、フラクション６〜１５
を集め、これをラージｄｓｃＤＮＡとした。このラージ
ｄｓ　ｃＤＮＡ量は７２２１ｇであった。At the same time, the sedimentation pattern of globin dscDNA (indicated by △-△ in the figure) was also shown as a marker. Compared to globin, the peak fraction of beurokinase dscDNA is slightly shifted toward the bottom, and fraction 11
The large dscDNA around ~15 is also urokinase dsc
There was more DNA. Therefore, fractions 6 to 15
were collected and used as large dscDNA. The amount of this large ds cDNA was 7221 g.

ｆ７１ｄｓ　ｃＤ　Ｎ　Ａへのポリ　（Ｃ）テイルの付
加ウロキナーゼｄｓｃＤＮＡの大きさは平均１　、５０
０ｂｐであると想定し、Ｃ−ティル反応を行った。Ｃ−
テイル反応は、ｄｓｃＤＮ’Ａの３’ＯＨ末端に１５〜
２０個のポリ（Ｃ）ティルが付加されるのが理想である
。我々は、５ユニツトのターミナルトランスフェラーゼ
を用い、３７℃にて反応を行い、その結果約２０個のＣ
−ティルが付加した。Addition of poly(C) tail to f71ds cDNA The average size of urokinase dscDNA is 1.50
A C-til reaction was performed assuming that it was 0 bp. C-
The tail reaction involves the 15-
Ideally, 20 poly(C) tills are added. We performed the reaction at 37°C using 5 units of terminal transferase, resulting in approximately 20 C
-Til added.

別に調製した大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１
部位に同様に約１５個のポリ（Ｇ）ティルを付加した。Pst1 of E. coli plasmid pBR322 prepared separately
Approximately 15 poly(G) tills were similarly added to the site.

さらにこれら両者を等モル混合し、高いイオン強度下で
７０℃から３７℃へ緩やかな冷却によりアニーリングを
行った。Furthermore, both of these were mixed in equimolar amounts and annealed by slow cooling from 70° C. to 37° C. under high ionic strength.

（８）トランスフォーメーション アニーリングしたＤＮＡを大腸菌ＲＲＩ株に導入しトラ
ンスフォーメーションを行った結果、約７０、０００個
のテトラサイタリン耐性株が得られた。(8) Transformation As a result of introducing the annealed DNA into E. coli RRI strain and performing transformation, approximately 70,000 tetracytalline resistant strains were obtained.

表４にトランスフォーメーション効率を示した。Table 4 shows the transformation efficiency.

得られたトランスフォーマントをレプリカ法によりアン
ピシリン感受性について調べた。その結果、全トランス
フォーマントの９０％以上、約６０．０００コロニーが
、ｃＤＮＡが挿入されたと考えられるＡＰｓ、ＴｏＹ′
ヲ示シタ。The obtained transformants were examined for ampicillin sensitivity by the replica method. As a result, more than 90% of all transformants, approximately 60,000 colonies, contained APs, ToY', into which cDNA was thought to have been inserted.
Show me.

このように非常に多数のトランスフォーマントができた
理由としては以下のことが考えられる。The following are possible reasons why so many transformants were created.

０ｍＲＮＡの抽出方法をグアニジンイソチオシアネイト
法に変えたことによりｍ　ＲＮ　Ａに吸着していた蛋白
が完全に除去され、その結果我々が想定した大きさに近
い大きさのｄｓｃＤＮＡができた。By changing the extraction method for 0mRNA to the guanidine isothiocyanate method, the protein adsorbed to mRNA was completely removed, and as a result, dscDNA with a size close to the size we expected was created.

■Ｓｌヌクレアーゼ処理がうまくいき、１本鎖ＤＮＡ部
分が完全に消化され、また２本鎖部分に二ツクもはいら
なかろた。(2) The Sl nuclease treatment was successful, and the single-stranded DNA portion was completely digested, and no two DNA fragments were present in the double-stranded portion.

■Ｃ−テイルが理想通り付加され、その結果効率よくア
ニーリングされた。■C-tail was added as desired, resulting in efficient annealing.

（以下余白） （９）ウロキナーゼ遺伝子のクローニングウロキナーゼ
ｃＤＮＡをクロー丹ングするためウロキナーゼのアミノ
酸に基づいてオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し
、これをハイブリダイゼーションプローブとしてトラン
スフォーマントのスクリーニングを行った。(See margin below) (9) Cloning of urokinase gene In order to clone urokinase cDNA, oligodeoxyribonucleotides were synthesized based on the amino acids of urokinase, and this was used as a hybridization probe to screen for transformants.

＋ａ）合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブ プローブとして用いた１４−塩基の合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチド混合物（以下プローブと呼ぶ）は、日
本ゼオン社より購入した。プローブは購入後水に熔解し
、１００μｇ／ｍｌの濃度（１００ｕｎｉｔ　＝５０μ
ｇとして算出）として分注後凍結乾燥し、使用時まで一
２０℃で保存した。+a) Synthetic oligodeoxyribonucleotide probe The 14-base synthetic oligodeoxyribonucleotide mixture used as the probe (hereinafter referred to as probe) was purchased from Nippon Zeon Co., Ltd. After purchase, the probe was dissolved in water at a concentration of 100 μg/ml (100 units = 50 μg/ml).
After dispensing (calculated as g), it was freeze-dried and stored at -20°C until use.

表５は、用いたプローブの塩基配列とこれに対応するウ
ロキナーゼのアミノ酸配列を示している。Table 5 shows the base sequence of the probe used and the corresponding amino acid sequence of urokinase.

用いたプローブは人尿アミノ酸７３〜７７に対応するプ
ローブＡと、Ｂ鎖のカルボキシル末端に近いアミノ酸２
４６〜２５０に対応するプローブＢの２セントである。The probes used were probe A, which corresponds to human urine amino acids 73 to 77, and amino acid 2, which is close to the carboxyl terminus of chain B.
2 cents for probe B, which corresponds to 46-250.

又、表５から明らかな様にプローブＡは８種、プローブ
Ｂは１６種のオリゴヌクレオチドの混合物である。Further, as is clear from Table 5, probe A is a mixture of 8 types of oligonucleotides and probe B is a mixture of 16 types of oligonucleotides.

表５ ヒトウロキナーゼｃＤＮＡＯ単離用の オリゴヌクレオチドプローブ プローブＡ アミノ酸　７３　７４　７５　７６　７７配列　ＮｌＩ
２−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−ＣＯＯ
ｔｌコ　Ｆ　：／　５’−Ｇｌｌ’ｊ−ＡＵｃ−ＡＡニ
ーｕｕニーＧ牧−３’４−ｍｅｒ ｌ昆合物　３’　−ＣＴｒ−ＴＡＣ−ＴＴ訃ＡＡｇ−Ｃ
Ｔ−５’プローブＢ アミノ酸　２４６２４７２４８２４９２５０配列　Ｎ）
１２−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−へ５ｎ−Ｇｌｙ−ＧＯ
Ｏｆｌコ　トン　５゛−へ′Ａλ−ＧＡλ−ＧＡ鼾へ＾
ズ−ＧＧ５−３”４−ｍｅｒ 混合物　３°−ＴＴＴ−ＣＴｒ−ＣＴ”−ＴＴ”−ＣＧ
−５’ＣＣＣ八 （注）中段にはアミノ酸配列に対応するｍＲＮＡの可能
な全配列を示す。下段はこのｍＲＮＡに相補的なプロー
ブＤＮＡの塩基配列を示す。尚、プローブＡのアミノ酸
７７（Ｇｌｕ）及びプローブＢのアミノ酸２５０（Ｇｌ
ｙ）のコドンのうち、第三塩基はプローブＤＮＡに含ま
れていない。Table 5 Oligonucleotide probes for human urokinase cDNAO isolation Probe A Amino acids 73 74 75 76 77 Sequence NlI
2-Glu-Met-Lys-Phe-Glu-COO
tlko F:/5'-Gll'j-AUc-AAneeuunee Gmaki-3'4-mer lkoncombination thing 3'-CTr-TAC-TT訃AAg-C
T-5' probe B amino acid 246247248249250 sequence N)
5n-Gly-GO to 12-Lys-Glu-Glu-
Ofl Coton 5゛-he'Aλ-GAλ-GA snore^
Zu-GG5-3"4-mer mixture 3°-TTT-CTr-CT"-TT"-CG
-5'CCC8 (Note) The middle row shows all possible sequences of mRNA corresponding to the amino acid sequence. The lower row shows the base sequence of probe DNA complementary to this mRNA. In addition, amino acid 77 (Glu) of probe A and amino acid 250 (Gl) of probe B
Among the codons of y), the third base is not included in the probe DNA.

ｆｂｌ　５　’末端を３２２でラベルしたプローブの調
製２ （イ）プローブ５゛−末端の　Ｐラベルプローブは５′
−ＯＨとして合成されているので２ 〔γ−Ｐ）ＡＴＰ　（アマ−ジャム、ｐＢ３１０２１８
　）と、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼとで５゛末端
を　Ｐでラベルした。ラベル条件は、　Ｐ−ＡＴＰと５
１０Ｈ末端のモル比を５：ｌとして以下の様な反応系で
行った。Preparation 2 of a probe labeled with 322 at the fbl 5' end (a) The P-labeled probe at the 5' end of the probe is 5'
Since it is synthesized as -OH, 2 [γ-P)ATP (Amar-Jam, pB310218
) and T4-polynucleotide kinase, and the 5' end was labeled with P. The label conditions are P-ATP and 5
The reaction was carried out using the following reaction system with a molar ratio of 10H terminals of 5:l.

反応液 プローブＤ　Ｎ　Ａ　８０ｐｍｏｌ　５°−０１目末端
＊ＩＩＱｘキナーゼ緩衝液　２μ１ Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ　１μｌ＊２　（ｒ−
３２Ｐ）ＡＴＰ　５’−ＯＨ末端の５Ｘｍｏｌｌ（２０
総量２０μｌとする量 反応は３７℃で６０〜１２０分行う。反応終了後次項で
述べるＮＡＣ３−５２のミニ−カラムに供する為、１μ
ｌの０．５ＭＥＤＴ＾溶液（ｐｔｌ　８．　Ｏ）１Ｍ塩
化ナトリウム（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液及び１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液中）および１０．５μｌの１ｍｇ／
ｍｌ　ｔＲＮＡ溶液を加えて終量３５μｌとし、７０℃
、３分間の熱処理でポリヌクレオチドキナーゼを失活さ
せてＮＡＣ３−５２のミニ−カラムに供した。Reaction solution probe DNA 80 pmol 5°-01st end*IIQx kinase buffer 2μ1 T4-polynucleotide kinase 1μl*2 (r-
32P) ATP 5Xmol (20
The reaction is carried out in a total volume of 20 μl at 37° C. for 60 to 120 minutes. After the reaction is complete, add 1μ to the NAC3-52 mini column described in the next section
l of 0.5 MEDT^ solution (ptl 8.0) in 1M sodium chloride (10mM) Lis-HCl buffer and 1
in mM EDTA solution) and 10.5 μl of 1 mg/
ml tRNA solution was added to make a final volume of 35 μl, and the mixture was heated at 70°C.
The polynucleotide kinase was inactivated by heat treatment for 3 minutes and applied to a NAC3-52 mini-column.

（ロ）　Ｐ−ラベル化プローブの精製 （イ）項で調製した反応混合物をＮＡＣ３−５２のミニ
−カラムにかけて、　Ｐ−ラベル化プローブを精製した
。(b) Purification of P-labeled probe The reaction mixture prepared in section (a) was applied to a NAC3-52 mini-column to purify the P-labeled probe.

精製したプローブは、その一部（２μｍ、１５ｘ１０　
’　ｃｐｍ　）を０．３　ｗｓｍ厚の２０％ポリアクリ
ルアミド−ウレアゲルで１　、０００　Ｖ、１５分泳動
し、室温で１０〜３０分オートラジオグラフィーを行っ
てラベル状況を確認した。ゲルの組成ならびに泳動条件
は、マキサム−ギルバートのシーフェンシングゲルと同
一である。A portion of the purified probe (2 μm, 15 x 10
'cpm) was run on a 0.3 wsm thick 20% polyacrylamide-urea gel at 1,000 V for 15 minutes, and autoradiography was performed for 10 to 30 minutes at room temperature to confirm the label status. The gel composition and running conditions are the same as the Maxam-Gilbert sea fencing gel.

ラベル効率は、プローブの種類にかかわらずほぼ一定で
カラムからの回収率を８０％とすれば、プローブＤＮＡ
の比活性は約１．ＯＸ　１０　’　ｃｐｍ／μｇ　ＤＮ
Ａとなる。The labeling efficiency is almost constant regardless of the type of probe, and if the recovery rate from the column is 80%, the probe DNA
The specific activity of is about 1. OX 10' cpm/μg DN
It becomes A.

（Ｃｌコロニーハイブリダイゼーション前記作成したプ
ローブを用い、コロニーハイブリダイゼーションにより
ウロキナーゼｃＤＮＡのスクリーニングを行った。(Cl Colony Hybridization Urokinase cDNA was screened by colony hybridization using the probe prepared above.

（イ）試薬及び緩衝液は以下のものを用いた。(b) The following reagents and buffers were used.

Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ　（脱イオン
化ホルムアミド）：ホルムアミド５００ｍ１とＭｉｘｅ
ｄ−ｂｅｄ−ｒｅｓｉｎ　３０ｍｌを混合、４°Ｃ２２
時間攪拌の後、吸引濾過した一８０℃保存。Deionized formamide: Mix with 500ml of formamide
Mix 30ml of d-bed-resin, 4°C22
After stirring for an hour, it was filtered under suction and stored at 80°C.

５０　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液： 除菌濾過後、−２０℃保存。50×Denhardt’s solution: After sterilization filtration, store at -20°C.

２０’Ｘ５ＳＰＥ： ０ＸＳＳＣ ３ｏｎｉｃａｔｅｄｓ　ｓａｌｍａｎ　ｓｐｅｒｍ　Ｄ
　Ｎ　Ａプレハイブリダイゼーション洗浄溶液（以下Ｐ
ＨＷＳ）； プレハイブリダイゼーション溶液： 洗浄用溶液ｌ　（以下ＷＳＩ）： ５　ｘ　Ｓ　Ｓ’　Ｃ 洗浄用溶液■（以下ＷＳ■）： ハイブリダイゼーション溶液（以下Ｈ３）：ｘＳＳＣ Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ　ｔ’　ｓ溶液（ロ）ハイブリ
ダイゼーション ハイブリダイゼーションの処理は、以下の様Ｇこ要約さ
れる。20'X5SPE: 0XSSC 3onicateds salman sperm D
NA prehybridization wash solution (hereinafter referred to as P
HWS); Prehybridization solution: Washing solution l (hereinafter WSI): 5 x S S' C Washing solution ■ (hereinafter WS■): Hybridization solution (hereinafter H3): x SSC I X Denhardt's solution ( b) Hybridization The hybridization process is summarized as follows.

乾燥フィルター ↓ 洗浄（４２℃、１〜２時間、ＰＨＷＳでフィルタプレハ
イブリダイゼーション （４２℃、４〜６時間） ↓ ＷＳＩで２度洗浄 ↓ ハイブリダイゼーション （３２Ｐ−ラベル化プローブを含むＨ３で３７℃、２０
時間行う。） ↓ ＷＳＵで洗浄 （室温３分３回、次いで３７℃３分３回）↓ 風乾後、８０℃減圧乾燥し、−７０℃でオートラジオグ
ラフィーを行う。Dry filter ↓ Washing (42°C, 1-2 hours, filter prehybridization with PHWS (42°C, 4-6 hours) ↓ Washing twice with WSI ↓ Hybridization (37°C with H3 containing P-labeled probe, 20
Do time. ) ↓ Wash with WSU (3 times for 3 minutes at room temperature, then 3 times for 3 minutes at 37°C) ↓ After air drying, dry under reduced pressure at 80°C, and perform autoradiography at -70°C.

３、　ＯＸ　１０８ｃｐｍのＪ２ｐ−ラベル化プローブ
Ａを用いて１０，０００コロニー（１００フイルター）
のスクリーニングを行った。Ｈ３は総量１５０ｍ１、従
ってプローブ濃度は２、ＯＸ　１０６ｃｐｍ　／ｍｌで
あ３７℃で２１時間、時々振とうしながらハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、
室温で３回、次いで３７℃で３回、ＷＳＩ［で洗浄した
。乾燥したフィルターを濾紙（ワットマン３ＭＭ）上に
並べ、−７０℃で２日、オートラジオグラフィーを行っ
た後、現像した。3. 10,000 colonies (100 filters) using J2p-labeled probe A at OX 108 cpm
Screening was conducted. The total amount of H3 was 150 ml, therefore the probe concentration was 2, and the hybridization was carried out at 37°C for 21 hours with occasional shaking at OX 106 cpm/ml. After hybridization,
Washed with WSI[3 times at room temperature and then 3 times at 37°C. The dried filters were placed on filter paper (Whatman 3MM), autoradiography was performed at -70°C for 2 days, and then developed.

その結果、比較的バンクグラウンドが高く、又さまざま
な程度にハイブリダイズしたコロニーが観察され、比較
的強くハイブリダイズしていると思われる６５コロニー
を選び、これらのコロニーをフィルターに再度固定して
再スクリーニングを行った。As a result, colonies with a relatively high bank ground and various degrees of hybridization were observed, and 65 colonies that appeared to be relatively strongly hybridized were selected, and these colonies were refixed on the filter and retransferred. Screening was conducted.

選出した６５コロニーをＬ−アガープレートに並べ、（
ネガティブコントロールとξ７てｐＢＲ３２２を用いた
）、同一のフィルターを４枚作製した。２枚を１組とし
てプローブＡ及びプローブＢでそれぞれハイブリダイゼ
ーションを行った。プローブＡは２．１０Ｘ１０’ｃｐ
ｍ１５ｍｌ、プローブＢは４．６０　Ｘ　１０７ｃｐｍ
　／　５ｍｌ、従ってプローブＤＮＡ一種あたりではい
ずれも５．８　Ｘ　１０５ｃｐｍ／ｍｌ　／５ｐｅｃｉ
ｅｓである。The 65 selected colonies were arranged on an L-agar plate, (
pBR322 was used as a negative control), and four identical filters were prepared. Hybridization was carried out using probe A and probe B, each of which was made into a set of two. Probe A is 2.10X10'cp
ml 15ml, probe B is 4.60 x 107cpm
/ 5ml, therefore, each type of probe DNA is 5.8 x 105cpm/ml /5peci
It is es.

３７℃で２１時間ハイブリダイゼーションを行った後、
ＷＳＵで洗浄し、１枚は３７℃で洗浄後直ちに乾燥し、
他方は更に４２℃、３分、３回の洗浄を行ってＸ線フィ
ルムに感光させた。After hybridization at 37°C for 21 hours,
Washed with WSU, and one piece was dried immediately after washing at 37°C.
The other layer was further washed 3 times at 42° C. for 3 minutes and exposed to X-ray film.

第４図はその結果を示す写真である。プローブＡを用い
てハイブリダイゼーションを行った結果、４つのコロニ
ー（第４図中に矢印で表示）がプローブＤＮＡとハイブ
リダイズしているのが見られた。又、この４つのコロニ
ーは、４２℃での洗浄後も明らかにポジティブコロニー
と認められた。Figure 4 is a photograph showing the results. As a result of hybridization using probe A, four colonies (indicated by arrows in FIG. 4) were found to be hybridizing with the probe DNA. Furthermore, these four colonies were clearly recognized as positive colonies even after washing at 42°C.

一方、プローブＢを用いた場合には、３７℃、４２℃の
フィルター双方とも極めてハックグラウンドが高く、コ
ロニーの判定ができなかった。On the other hand, when probe B was used, the hackground was extremely high in both the 37°C and 42°C filters, making it impossible to determine colonies.

プローブＡで選出された４コロニーについて、ミニプレ
ツブ法でプラスミドＤＮＡ　（各々をｐＵＫｌ、２．３
及び４と命名）を調製し、ｃＤＮＡの大きさを判定した
。ｐＵＫｌは４コロニー中最大のｃＤＮＡを有し、約１
，９００ｂｐであった。ｐＵに３及び４はこれより小さ
く、それぞれ約１．’３００ｂｐと約１，１５０ｂｐで
あった。又、ｐＵＫ２は最少のｃＤＮＡで約１７０ｂｐ
であった。又、ｐＵＫｌ、３及び４は相互にオーバーラ
ツプした同一の制限酵素地図を示すことから、それぞれ
同一のｍＲＮＡの異なる部域をクローニングしているも
のと考えられた。Plasmid DNA (each pUKl, 2.3
and 4) were prepared and the size of the cDNA was determined. pUKl has the largest cDNA among the four colonies, approximately 1
,900bp. pUs of 3 and 4 are smaller, each about 1. '300bp and about 1,150bp. In addition, pUK2 is the smallest cDNA, approximately 170 bp.
Met. Furthermore, since pUKl, 3, and 4 showed the same restriction enzyme maps that overlapped with each other, it was considered that they each cloned different regions of the same mRNA.

ＱＯＩ制限酵素地図の作製 前項で選択した４個のコロニーが保持する各プラスミド
の制限酵素地図を作製し比較検討した。Preparation of QOI restriction enzyme map Restriction enzyme maps of each plasmid carried by the four colonies selected in the previous section were prepared and compared.

プラスミドの調製は、ミニプレツブ法及びクリアードリ
ゼイト法により行った。使用した制限酵素は、Ａｃｃ　
１、Ａｌｕｌ、ＡｖａｌｌＡｖａＩ［、ＢａｍＨＩ、Ｂ
ｅ　１１、Ｂｇｌｌ、Ｂｇｌｌｌ、Ｂｓ　ｔＥＩｌ、Ｃ
１ａｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ　Ｈａｅｌｌｌ、）
（ｉｎｃｌｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｋｐｎ■、Ｎｃｏｌ、
Ｍｌｕｌ、Ｐｓｔｌ、ＰｖｕＩｌ、Ｒｓｕｌ、５ａｃｌ
、Ｓａｌ　Ｉ−，５ａｕ９６１゜Ｓｅａ　Ｉ、Ｓｍａ　
ｌ　５ｔｕｌ、Ｘｂａ　ｌ　Ｘｈｏｆであり、反応時に
使用した各制限酵素の緩衝液を表６に示した。Plasmids were prepared by the miniprep method and clear lysate method. The restriction enzyme used was Acc
1, Allul, AvallAvaI[, BamHI, B
e 11, Bgll, Bglll, Bs tEIl, C
1al, EcoRI, Fnu4HI Haell,)
(incll, Hindll, Kpn■, Ncol,
Mlul, Pstl, PvuIl, Rsul, 5acl
, Sal I-, 5au961°Sea I, Sma
Table 6 shows the buffer solutions of each restriction enzyme used in the reaction.

なお、７１．ｖａ　ＩはＲ８ａＩ緩衝液、５ａｃｌはＫ
ｐｎ緩衝液、５ｔｕｌ、Ｓａｌ、ＸｈｏｌはＢａ　ｍ　
Ｈｌ緩衝液、Ｎｃｏｌ、５ｃａｒは８ｇｌｌｌ緩衝液、
そしてＭ　１　ｕ　ＩはＨ４ｎｄｌｌ＋緩衝液を使用し
た。In addition, 71. va I is R8aI buffer, 5acl is K
pn buffer, 5tul, Sal, and Xhol are Ba m
Hl buffer, Ncol, 5car is 8glll buffer,
And for M 1 u I, H4ndll+ buffer was used.

（以下余白） 表６ １）ＵＫＩ〜４に挿入されているｃＤＮＡの大きさはＭ
ｉｊ述の通り、ｐＵＫｌが最も大きなｃＤＮＡで、その
大きさは１９００ｂｐである。又、ｐＵＫ３、ｐＵＫ４
はそれぞれ１３００ｂｐ、　１１５０ｂｐであり、ｐｕ
Ｋ２は１７０ｂｐとかなり小さなｃＤ、ＮＡである。そ
こでｐＵＫ２を除く他の３つのプラスミドにつき、各ｃ
ＤＮＡの制限酵素地図の作製を行った。まず、各プラス
ミドを種々の制限酵素で切り、その制限部位の数をめた
（表７）。次に各制限酵素部位の距離をめた。各プラス
ミドをＥ（、ＯＲＩで切断すると、ｐＵＫｌとｐＵＫ４
では全く同じ大きさの断片（４２０ｂｐ）が見られ、ま
たＢａｍＨＩとＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩとＰｓｔＩ
の２重消化を行うと、ｐＵＫｌとｐＵＫ３に全く同じ大
きさの断片が見られた。そこでｐＵＫｌとｐＵＫ４にお
いてはＥｃｏＲ１部位を重ねて、またｐｕＫｌとＩ）Ｕ
Ｋ３においてはＢａｍＨ１部位を基準にとって、他の制
限酵素部位を調べていくと、ｐ（ＪＫＩとｐＵＫ３、ｐ
ＵＫ４のｃＤＮＡ上の制限酵素部位の位置がほぼ一致し
た（第５図）。ｐｕに１とｐＵＫ３、ｐＵＫ４のｃＤＮ
Ａが同じと考えると、ｐＵＫＩとｐＵＫ４のｃＤＮＡは
同一方向に、またｐＵＫ３のｃＤＮＡはｐＵＫｌ、ｐＵ
Ｋ４のｃＤＮＡとは逆向きにｐＢＲ３２２に挿入されて
いた。(Margins below) Table 6 1) The size of the cDNA inserted in UKI~4 is M
As mentioned above, pUKl is the largest cDNA, with a size of 1900 bp. Also, pUK3, pUK4
are 1300bp and 1150bp, respectively, and pu
K2 is a fairly small cD and NA of 170 bp. Therefore, for the other three plasmids except pUK2, each c
A DNA restriction enzyme map was constructed. First, each plasmid was cut with various restriction enzymes, and the number of restriction sites was counted (Table 7). Next, the distance between each restriction enzyme site was determined. When each plasmid was cut with E(,ORI), pUKl and pUK4
Fragments of exactly the same size (420 bp) were observed in BamHI and EC0RI, and BamHI and PstI.
When double digestion was performed, fragments of exactly the same size were found in pUKl and pUK3. Therefore, in pUKl and pUK4, the EcoR1 site overlaps, and puKl and I)U
In K3, when we examine other restriction enzyme sites using the BamH1 site as a standard, we find that p(JKI and pUK3, p
The positions of the restriction enzyme sites on the UK4 cDNA were almost identical (Fig. 5). cDNA of pu1, pUK3, and pUK4
Considering that A is the same, the cDNAs of pUKI and pUK4 are in the same direction, and the cDNAs of pUK3 are in the same direction as pUKl and pU.
It was inserted into pBR322 in the opposite direction to the K4 cDNA.

ｐＵＫｌおよびｐＵＫ３、ｐＵＫ’４に挿入されている
ｃＤＮＡが制限酵素部位からみて同一のものである考え
られることから、これら３つのｃＤＮＡはウロキナーゼ
ｃＤＮＡである可能性が非常に高くなった。理由は、ス
クリーニングにおいて１４　ｍｅｒの合成りＮＡを用い
たが、この塩基配列と一致する配列をプラスミド上に持
つ確率が極めて低いにもかかわらず、スクリーニングに
おいてポジティブを示したコロニー４つのうち少なくと
も３つまでが同一のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａであったということ
は、これらポジティブコロニーが有しているｃＤＮＡが
我々が目的としたウロキナーゼの塩基配列をもっている
確率が高いことと、ウロキナーゼｍＲＮＡ上でプローブ
として合成したＤＮＡ塩基配列の位置（第６図）がｐＵ
Ｋｌ、ｐＵＫ３、ｐｕＫ４の重なり合っている場所と一
致したことによる（第２図）。ｐＵＫｌおよびｐＵＫ４
の一部のＤＮＡ塩基配列を決定し、アミノ酸配列を検討
したところ、その配列はウロキナーゼのアミノ酸配列と
一致した。Since the cDNAs inserted into pUKl, pUK3, and pUK'4 are considered to be identical in terms of restriction enzyme sites, it is highly likely that these three cDNAs are urokinase cDNAs. The reason is that although a 14-mer synthetic NA was used in the screening, at least 3 out of 4 colonies that showed positive in the screening, although the probability of having a sequence matching this nucleotide sequence on the plasmid was extremely low. The fact that these cDNAs were the same indicates that there is a high probability that the cDNAs possessed by these positive colonies have the base sequence of urokinase that we were aiming for, and that the cDNAs that were synthesized as probes on urokinase mRNA are highly likely. The position of the DNA base sequence (Figure 6) is pU
This is because it coincides with the overlapping location of Kl, pUK3, and puK4 (Fig. 2). pUKl and pUK4
When we determined the DNA base sequence of a part of the protein and examined the amino acid sequence, the sequence matched the amino acid sequence of urokinase.

我々がクローニングしたウロキナーゼｃＤＮＡとアホソ
ト社がクローニングしたｃＤＮＡ　（第７図）との制限
地図を比較したところ、両者は全く異なっており、異な
った遺伝子と考えられる。また、ウロキナーゼｃＤＮＡ
の制限地図は、ジェネテインク社の報告しているＴＰＡ
のｃＤＮＡの制限地図（第８図）とも当然のことながら
異なっていた。When we compared the restriction maps of the urokinase cDNA that we cloned and the cDNA that was cloned by Ahosoto (Figure 7), the two were completely different and are considered to be different genes. In addition, urokinase cDNA
The restriction map is based on the TPA reported by Genetain Inc.
It was naturally different from the restriction map of the cDNA (Fig. 8).

（以下余白） 表７ （１１）ウロキナーゼｃＤＮＡの塩基配列の決定前項に
よって得られるプラスミドが実際にウロキナーゼのｃＤ
ＮＡを含んでいるかどうかを直接的に検証する目的で、
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ　（マクサム−ギルバート
）法を用いてＤＮＡ塩基配列を決定した。得られたＤＮ
Ａ塩基配列から考えられる可能なアミノ酸配列を既知の
人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列と比較した結果、これ
らのｃＤＮＡがシグナルペプチドを含むウロキナーゼ前
駆体のＣＤＮＡであることが明らかとなった。(Leaving space below) Table 7 (11) Determination of base sequence of urokinase cDNA The plasmid obtained in the previous section is actually the cDNA of urokinase.
For the purpose of directly verifying whether NA is included,
The DNA base sequence was determined using the Maxam-Gilbert method. Obtained DN
As a result of comparing the possible amino acid sequences deduced from the A base sequence with the known amino acid sequences of human urine urokinase, it was revealed that these cDNAs are urokinase precursor cDNAs containing a signal peptide.

ｌａ）用いた材料と方法は以下である。la) The materials and methods used are as follows.

（イ）プラスミドＤＮＡ　： 前記ｐＵＫ１及びｐＵ、に４を用いた。調製したプラス
ミドＤＮＡは水に溶解して使用した。(a) Plasmid DNA: 4 was used for the above pUK1 and pU. The prepared plasmid DNA was dissolved in water and used.

（ロ）制限酵素 ＡｃｃｌｓＢａｍＨＩ、Ｂｇ　ｌ　１．、Ｅｃ　ｏＲＬ
。(b) Restriction enzyme AcclsBamHI, Bg l 1. , EcoRL
.

Ｈｐａｌｌ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ、Ｐｖｕｌｌ、５ａｕ３ＡＩ
。Hpall, Ps t I, Pvull, 5au3AI
.

５ｃａｌ、Ｒｓａｌは宝酒造製、］３ｃｌｌ、ＮＣ０１
ＴａｑｌはＮＥＢ社製を用いた。5cal, Rsal is made by Takara Shuzo, ]3cll, NC01
Taql manufactured by NEB was used.

（ハ）プラスミドＤＮＡの制限酵素地図ｃＤＮＡ挿入プ
ラスミドの制限酵素地図は前項（１０１に従った。(c) Restriction enzyme map of plasmid DNA The restriction enzyme map of the cDNA inserted plasmid was according to the previous section (101).

（ニ）塩基配列の決定に角いるＤＮＡ断片の調製 ｃＤＮＡのＤＮＡ塩基配列の決定は、マクサム−ギルバ
ートのシーフェンシング法（Ｐｒｏｃ、　Ｎ、八。(d) Preparation of DNA fragments useful for base sequence determination The DNA base sequence of cDNA can be determined using the Maxam-Gilbert sea fencing method (Proc. N, 8).

ＳＪＪ、　５６０　（１９７７）、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５＋４９９　（１９８０）
に従って行った。SJJ, 560 (1977), (Methods
in Enzymol, 65+499 (1980)
I followed.

プラスミドＤＮＡをｃＤＮＡ中に存在する適当な制限酵
素を用いて消化し、生じたＤＮＡ断片をエタノール沈綴
で回収した。回収したＤＮＡ断片は、減圧乾燥後水に溶
解し、１／１０容の１０×Ｈ４ｎｄ１［［緩衝液（６０
ｍＭｌ−リス−１１ＣＩ、ｐｌ＋　７．４．０．５Ｍ　
ＮａＣｌ２．６０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６０ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール）と、１μ！のバクテリアルアルカ
リフオスファクーゼ（ＢＡＰ）／８液（ＢＲＬ社製）を
加えて混合後、６５℃で６０分反応させ、５°−末端の
脱リン酸を行った。The plasmid DNA was digested using an appropriate restriction enzyme present in the cDNA, and the resulting DNA fragments were recovered by ethanol precipitation. The recovered DNA fragments were dried under reduced pressure, dissolved in water, and added to 1/10 volume of 10×H4nd1[[buffer (60
mMl-Lis-11CI, pl+ 7.4.0.5M
NaCl2.60mM MgCl2.60mM 2-mercaptoethanol) and 1μ! Bacterial alkaline phosphacose (BAP)/8 solution (manufactured by BRL) was added and mixed, followed by reaction at 65°C for 60 minutes to dephosphorylate the 5°-end.

等量のフェノール・クロロホルム混液を加え、激しく混
合してＢＡＰを失活させた後、１２，０００ｇ、２分の
遠心で水層を回収した。更に２度フェノール抽出を行っ
た後、水層に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ５，５）と２．５容のエタノールを加えてエタノー
ル沈澱を行い、ＤＮＡ断片を回収した。回収した５”−
説すン酸ＤＮ人断片は、減圧乾燥後水に熔解し、ｌ／１
０容の１０×キナーゼ緩衝液（０，５Ｍ）リス−１１ｃ
Ｌ　ｐｌ＋７．６．０．１ＭＭｇＣＩ２．５０ｍＭジチ
オスレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＥＤＴ＾
）、１５〜２０μｅの〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ溶液（５０
００ｃｉ／ｍ　Ｍ。After adding an equal amount of phenol/chloroform mixture and vigorously mixing to inactivate BAP, the aqueous layer was collected by centrifugation at 12,000 g for 2 minutes. After further phenol extraction twice, 1/10 volume of 3M sodium acetate buffer (
pH 5.5) and 2.5 volumes of ethanol were added to perform ethanol precipitation, and DNA fragments were recovered. Recovered 5”-
The proposed phosphoric acid DN human fragments were dried under reduced pressure and then dissolved in water.
0 volumes of 10x Kinase Buffer (0.5M) Lis-11c
L pl+7.6.0.1MMgCI2.50mM dithiothreitol, 1mM spermidine, 1mMEDT^
), 15-20μe of [γ-32P)ATP solution (50
00ci/mM.

ｌ、アマ−ジャム社製）、及び１μβ（ＩＯＶ）のＴ４
−ポリヌクレオチドキナーゼ溶液（ＢＭＹ社製）を加え
、終量２０〜２５μｌとし、３７℃で４５〜６０分間反
応させた。l, manufactured by Amarjam), and T4 of 1 μβ (IOV)
- A polynucleotide kinase solution (manufactured by BMY) was added to make a final volume of 20 to 25 μl, and the mixture was reacted at 37° C. for 45 to 60 minutes.

この反応で脱リン酸されていた５°−末端はリン酸化さ
れ、５°−末端が（Ｐ）でラベルされた。The 5°-end, which had been dephosphorylated in this reaction, was phosphorylated, and the 5°-end was labeled with (P).

このようにして調製されたＤＮＡ断片は、両端の５゛−
末端が（３２Ｐ）でラベルされているので、一方の５゛
−末端のみが（３２Ｐ　）でラベルされたＤＮＡ断片を
得る為に、適当な制限酵素を用いて２度目の消化を行っ
た。消化後ＤＮＡ断片を含む溶液をポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけて、目的のＤＮＡ断片を分離、回収
した。The DNA fragment prepared in this way has 5′-
Since the ends were labeled with (32P), a second digestion was performed using an appropriate restriction enzyme to obtain a DNA fragment in which only one 5'-end was labeled with (32P). After the digestion, the solution containing the DNA fragments was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate and recover the desired DNA fragments.

ポリアクリルアミドゲルからのＤＮＡ断片の回収は、溶
出酢酸緩衝液（ｐＨ８，３、４０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ
、　２０　ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴ＾）中で
電気泳動的に行った。溶出後、チェレンコフカウントを
測定して溶出液に１ＺｌＯ容の３ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５，５）と２０μｌの０゜５ｍｇ／ｍｌ　５
ｏｎｉｃａｔｅｄ　ｓａｌｍａｎ　ｓｐｅｒｍ　Ｄ　Ｎ
　Ａを加え飄フェノール抽出を１回行った後、エタノー
ル沈澱で目的のＤＮＡ断片を回収する。回収されたＤＮ
Ａ断片は、減圧乾燥して約１．ＯＸ　１０６ｃｐｍ／　
３０μ！の濃度で水に溶解し、マクサム−ギルバートの
塩基特異的な限定的化学分解に供した。Recovery of DNA fragments from polyacrylamide gels was performed using elution acetate buffer (pH 8.3, 40mM) Lis-HCl.
, 20mM sodium acetate, 1mM ED T^). After elution, Cerenkov count was measured and the eluate was mixed with 1 ZlO volume of 3 mM sodium acetate buffer (pH 5,5) and 20 μl of 0.5 mg/ml 5
onicated salman sperm DN
After adding A and performing phenol extraction once, the desired DNA fragment is recovered by ethanol precipitation. Recovered DN
Fragment A was dried under reduced pressure for approximately 1. OX 106cpm/
30μ! and subjected to Maxam-Gilbert base-specific limited chemical degradation.

（ホ）ＤＮＡ塩基配列のシーフェンシング（３２ｐ）で
ラベルされたＤＮＡ断片は、マクサム−ギルバードの限
定的化学分解（Ｐｒｏｃ、　Ｎ、Ａ、Ｓ。(e) DNA fragments labeled with DNA base sequence sea fencing (32p) were subjected to Maxam-Gilbert limited chemical degradation (Proc, N, A, S).

７４、５６０　（１９７７）　）　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５゜４９９　（１９８０）
　）を行って審決に従って８％と２０％の７Ｍ尿素−ポ
リアクリルアトゲル電気泳動にかけ、−７０℃で２〜３
日、オートラジオ−グラフィーを行った。74, 560 (1977) ) (Methods
in Enzymol, 65°499 (1980)
) and subjected to 8% and 20% 7M urea-polyacryl attogel electrophoresis in accordance with the trial decision, and incubated at -70℃ for 2 to 3 hours.
Autoradiography was performed on the following day.

（へ）ウロキナーゼのアミノ酸配列 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが真にウロキナーゼｃＤＮＡであるか否
かの判定は、得られた塩基配列からアミノ酸配列をめて
、これを既知の人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列（Ｉｌ
ｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　ｐｈｙｓｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、。(f) To determine whether or not the amino acid sequence cDNA of urokinase is truly urokinase cDNA, the amino acid sequence is determined from the obtained base sequence, and this is compared with the known amino acid sequence of human urine urokinase (Il).
oppe-3eyler's Z, physiol,
Chem.

３６３、１０４３　（１９８２）　）と照合することで
行った。363, 1043 (1982)).

第９図は人尿ウロキナーゼのＡ−及びＢ−鎖の全アミノ
酸配列を示している。Figure 9 shows the complete amino acid sequence of the A- and B-chains of human urine urokinase.

（ＨｃＤＮＡの制限酵素地図とＤＮＡ塩基配列決定のシ
ークエンシンダストラテジーｐＵＫ１とｐＵＫ４は相互
に重なり合う制限酵素地図を示す。一方、Ｎ１ｃｋ−ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　（−１−ｙクトランスレーショ
ン）で（３２Ｐ　）ラベルしたｐＵＫｌの３゛側のＰｓ
ｔｌ／Ｐｓｔｌ断片をハイブリダイゼーションプローブ
として用いたコロニーハイブリダイゼーションで選出し
たｐＵＫｌ８は、同様にｐＵＫｌと重なり合う制限酵素
地図を示す（第１０図）。従って、これらのプラスミド
のｃＤＮＡは同一のｍＲＮＡのそれぞれ異なった部域を
クローニングしていると考えられ、第１１図のように全
長的２２５０　ｂａｓｅ　ｐａｉｒの単一のｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａとして考えることが可能である。そこでシーフェン
シングにあたっては、第１１図のようにストラテジーを
設定して塩基配列を決定した。(Restriction enzyme map of HcDNA and sequencing strategy for DNA sequencing pUK1 and pUK4 show restriction enzyme maps that overlap with each other. On the other hand, N1ck-t
Ps on the 3' side of pUKl labeled (32P) with translation (-1-y translation)
pUKl8, selected by colony hybridization using the tl/Pstl fragment as a hybridization probe, similarly shows a restriction enzyme map that overlaps with pUKl (Figure 10). Therefore, it is thought that the cDNAs of these plasmids are cloned from different regions of the same mRNA, and as shown in Figure 11, a single full-length 2250 base pair cDNA.
It is possible to think of it as A. Therefore, for sea fencing, the base sequence was determined using a strategy as shown in Figure 11.

〔結果〕〔result〕

シーフェンシングによって得られたＤＮＡ塩基配列を人
尿ウロキナーゼのアミノ酸配列（第９図）と比較した結
果、ｐＵＫｌ、４及び１８はいずれもウロキナーゼ前駆
体ｃＤＮＡの一部を含んでいることが明らかとなった。Comparison of the DNA base sequence obtained by sea fencing with the amino acid sequence of human urine urokinase (Figure 9) revealed that pUKl, 4, and 18 all contained part of the urokinase precursor cDNA. Ta.

第１２図は、個々のフラグメントのシーフェンシングの
結果に基づいて作製したウロキナーゼと同等のアミノ酸
配列をコードするｃＤＮＡの５′−末端から３“−ノン
コーディングリージョンまでの全塩基配列を示している
。以下本発明によって得られたウロキナーゼと同等のア
ミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの構造について述べる
。Figure 12 shows the entire base sequence from the 5'-end to the 3''-non-coding region of a cDNA encoding an amino acid sequence equivalent to urokinase, which was prepared based on the results of sea fencing of individual fragments. The structure of the cDNA encoding the amino acid sequence equivalent to urokinase obtained by the present invention will be described below.

（イ）−＝５°−ノンコーディングリージョンとシグナ
ルシーフェンス 第１図から明らかなように、蛋白合成の開始コドンであ
るＡＴＧ　（Ｍｅ　ｔ）の上流には、少なくとも７９ｂ
ａｓｅｓから成る５”−ノンコーディングリージョンが
ある。又、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）から始まる最初の２０アミ
ノ酸は、人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列（第９図）に
は見られないことから、ウロキナーゼ分子の細胞外への
分泌に必要なシグナルペプチドであると判明した。更に
、２１番目のアミノ酸、３ｅｒに始まるアミノ酸配列は
、人尿ウロキナーゼのＡ−鎮のアミノ酸配列に一致した
。(b) -=5°-Non-coding region and signal sea fence As is clear from Figure 1, there is at least a 79b region upstream of ATG (Me t), which is the start codon for protein synthesis.
As the first 20 amino acids starting with Met (ATG) are not found in the amino acid sequence of human urine urokinase (Figure 9), the extracellular region of the urokinase molecule Furthermore, the amino acid sequence starting from the 21st amino acid, 3er, matched the amino acid sequence of human urine urokinase A-tin.

このことから、今回得られたｃＤＮＡは、２０アミノ酸
から成るシグナルペプチドを有するウロキナーゼ前駆体
をコードするものであることが明らかである。From this, it is clear that the cDNA obtained this time encodes a urokinase precursor having a signal peptide consisting of 20 amino acids.

（ロ）ウロキナーゼ前駆体の開裂部位 人尿ウロキナーゼは、八−及びＢ−鎖の２本鎖であるが
、これは当初ウロキナーゼ前駆体とじて合成されたウロ
キナーゼ前駆体分子が細胞外へ分泌された後、プロテア
ーゼなどの作用によって２次的に２本鎖へ開裂するもの
と考えられる。ｐ［ＪＫｌのｃＤＮＡのシーフェンシン
グによりこのことが確かめられた。(b) Cleavage site of urokinase precursor Human urine urokinase has two chains, eight-chain and B-chain, but this is because the urokinase precursor molecule originally synthesized as urokinase precursor was secreted outside the cell. It is thought that the strands are then secondarily cleaved into double strands by the action of protease or the like. This was confirmed by sea fencing of the p[JKl cDNA.

第１図において、人尿ウロキナーゼのＡ鎖のカルボキシ
ル末端のアミノ酸配列（第１図の１５７番目のアミノ酸
であるＰｈｅ）に続いてＬｙｓが存在し、更にＢ−鎖の
アミノ末端であるｌ１ｅ−１１ｅ−Ｇｌｙ−ｃｌｙ−−
−のアミノ酸配列が認められる。In Figure 1, Lys is present following the carboxyl terminal amino acid sequence of the A chain of human urine urokinase (Phe, which is the 157th amino acid in Figure 1), and L1e-11e is the amino terminal of the B-chain. -Gly-cly--
− amino acid sequence is recognized.

このことは、人尿ウロキナーゼが当初はＬｙｓを介して
八−及びＢ−鎖の結合した１本鎖のウロキナーゼとして
合成され、Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−１１ｅ−１１ｅ部
で開裂すること、開裂に際してＬｙｓは欠失することを
示しＣいる。This indicates that human urine urokinase is initially synthesized as a single-chain urokinase with eight- and B-chains linked via Lys, and is cleaved at the Arg-Phe-Lys-11e-11e site, and that during cleavage, Lys C indicates deletion.

（ハ）カルボキシル末端とｃＤＮＡの３”−ノンコープ
イングリ−シロン 第１図には本発明より得たｃＤＮＡのコーディングリー
ジョンの末端部及び３゛−ノンコーディングリージョン
の一部を示している。図に示すように、この塩基配列で
はＧｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕといった人尿ウロ
キナーゼロー鎖のカルボキシル末端に一致するアミノ酸
配列が読み取られ、その下流に蛋白合成終止コドンであ
るＴＧＡが存在する。従って、人尿ウロキナーゼのカル
ボキシル末端と本発明によって得られたそれは同一で、
プロセシングにより欠失されるようなポリペプチドは存
在しないと考えられた。(c) Carboxyl terminus and 3''-noncoding region of cDNA Figure 1 shows the terminal end of the coding region and part of the 3''-noncoding region of the cDNA obtained according to the present invention. As shown, in this base sequence, an amino acid sequence corresponding to the carboxyl terminus of human urine urokinase low chain such as Gly-Leu-Ala-Leu is read, and TGA, which is a protein synthesis stop codon, is present downstream of this sequence. The carboxyl terminus of human urine urokinase and that obtained by the present invention are identical,
It was thought that there were no polypeptides that would be deleted due to processing.

一方、３゛−ノンコーディングリージョンは制限酵素地
図から考えて、長大と思われる。３゛−ノンコーディン
グリージョンについてはそのごく一部しかシーフェンシ
ングを行っていないが、ｐｔＪＫ１８で調べた結果、現
在得られている３゛−ノンコーディングリージョンは約
８５０ｂρである。しかし、ｐＵＫｌＢには真核生物の
ｍＲＮＡの３゛−末端に特徴的なｐｏｌｙ　（Ａ）配列
が含まれていないことから、３゛−ノンコーディングリ
ージョンはもっと長大であると考えられる。On the other hand, the 3'-non-coding region seems to be long considering the restriction enzyme map. Sea fencing has only been performed on a small portion of the 3'-non-coding region, but as a result of an investigation using ptJK18, the currently obtained 3'-non-coding region is about 850 bρ. However, since pUKlB does not contain the characteristic poly(A) sequence at the 3'-end of eukaryotic mRNA, the 3'-non-coding region is thought to be much longer.

（１２）ウロキナーゼコーディングリージョンを含むプ
ラスミドの作成 ｐＵＫｌおよびｐＵＫ４を制限酵素ＨｉｎｄＩ［、Ｂｇ
ｌＩＩで消化した。Ｈｉｎｄｌｌ及びＢｇｌｌＩの反応
条件は、ＱＯＩ項表によって３７℃、１〜２時間反応さ
せた。ｐＵＫｌからは約５．３ｋｂの断片を単離し、一
方ｐＵＫ４からは約１．３ｋｂの断片を単離した。次に
リガーゼ反応ｉ衝液（２０ｍＭトリスＨＣＩ　ｐｌ＋７
．５．　１０ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ　２．１０ｍＭジチオス
レイトール、０．５ｍＭ　ＡＴＰ）と１０ユニツトのＴ
４ＤＮＡリガーゼ中で前記の断片を２０℃で２時間反応
させｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｌ／た。以上の工程は第１３図
に示した。第１３図に於いて、ＥはＥｃｏＲＩを、Ｈは
１Ｉｉｎｄｌ［ｌを、ＢはＢａｍ　ｔｌｌを表す。(12) Construction of plasmid containing urokinase coding region pUKl and pUK4 were combined with restriction enzymes HindI [, Bg
Digested with lII. The reaction conditions for Hindll and BgllI were as follows: 37° C. for 1 to 2 hours according to the QOI table. An approximately 5.3 kb fragment was isolated from pUKl, while an approximately 1.3 kb fragment was isolated from pUK4. Next, ligase reaction solution (20mM Tris-HCI pl+7
．． 5. 10mM MgCI, 2.10mM dithiothreitol, 0.5mM ATP) and 10 units of T.
The above fragment was reacted in 4 DNA ligase at 20° C. for 2 hours to obtain ligation L/L. The above steps are shown in FIG. In FIG. 13, E represents EcoRI, H represents 1Iindl[l, and B represents Bam tll.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図　ウロキナーゼと同等のアミノ酸配列をコードす
るｃＤＮＡ塩基配列とアミノ酸配列。 第２図　ｃＤＮＡの制限酵素地図。 第３図　ｃＤＮＡの超遠心沈降パターン。 第４図　プローブＡを用いたコロニーハイブリダイゼー
ション。 ・ａ；３７℃で洗浄したフィルター ｂ：４２℃で洗浄したフィルター ☆−☆及び△−へは、ネガティブコン トロールとして並べたｐＢＲ３２２の コロニー。 ・ａで４コロニー（矢印）が明瞭にプローブとハイブリ
ダイズしているのが観 られる。これらの４コロニーは４２℃ での洗浄（ｂ）後も明らかにポジティ ブコロニーとして認められる。 第５図　ｐＵＫｌ、ｐＵＫ３．ｐＵＫ４の制限酵素地図
の比較。 第６図　ウロキナーゼｍＲＮＡの構造と使用した合成り
ＮＡプローブの位置。 第７図　アボット社発表のウロキナーゼｃＤＮＡ第８図
　ＴＰＡの制限酵素地図。 第９図　人尿ウロキナーゼＡ−鎖及びＢ−鎖の全アミノ
酸配列。 第１０図　ｐＵＫｌ、４及び１８の制限酵素地図。 ｐＵＫｌは約Ｌ９００ｂｐ　、　ｐ　Ｕ　Ｋ　４は約１
゜３０００ｂ、、そしてｐＵＫｌ８は約１　、４５０ｂ
ｐのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを有しており、それぞれの制限酵素
地図は相互にオーバーランプする。 第１１図　ｃＤＮＡの制限酵素地図。 第１０図に基づいてｃＤＮＡの制限酵素地図を一本にま
とめた。★、×及び○印は１３２Ｐ）でラベルした部位
、矢印はシーフェンシングの方向を示している。なお、
★はｐＵＫｌを、×はｐＵＫ４を、そして○はｐＵＫｌ
８を用いてシーフェンシングを行ったことを意味してい
る。 第１２図　ｃＤＮＡ塩基配列。 第１３図　ｐＵＫｌとｐＵＫ４のｌｉｇａｔｉｏｎ　（
リゲーション）のフローシート。ｆｆ１１３図に於いて
、Ｅは１ｉｃｏＲＩを、Ｈはｌｌ１ｎｄＩ［ｌを、Ｂは
Ｂａｍ旧を表す。 剃図 第１３図 手続補正書（瞳 件の表示 昭和５９年特許願第３７１、発 明の名称 ヒトウロキナーゼのＤＮＡ配列、プラスミド、宿主 正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 理人　■５４１ 住　所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライ
フ平野町４０６号 電話（０６）　２２７−１１５６ ６、補正の内容 （１）明細書第７頁、第１１行の［及びポリゾームＲＮ
ＡＪを削除する。 （２）同書第２１頁、第３行の「アミノ酸」の次に「配
列」を加入する。 （３）同書第２１頁、第１７行の「人尿」の次に「ウロ
キナーゼＢ鎖の」を加入する。 （４）同書第２１頁、第１８行の「Ｂ鎮の」を削除する
。 （５）同書第２３頁、第１６行のｒ　８０ｐｍｏｌ　Ｊ
の前に「６〜」を加入する。 （６）同書第２４頁、第９行のｒ　（ｐＨ８，０）　Ｊ
の次に「、３５ｄの」を加入する。 （７）同書第２６頁、第８行のｒ　Ｓｏｎｉｃａｔｅｄ
ｓｓａｌｍａｎＪをｒｓｏｎｉｃａｔｅｄ　ｓａｌｍｏ
ｎＪに訂正する。 （８）同書第２７頁、第２〜５行の ｒ　５ｘｓｓｃ に訂正する。 （９）同書第２７頁、第１０〜１４行の　ｒ　５ｘＳＳ
Ｃ Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液 に訂正する。 （ｌＯ）同書第２９頁、第８〜ｌｏ行の「比較的ハ・７
クグラウンドが高く、又さまざまな程度にハイブリダイ
スしたコロニーが観察され、」を削除する。 （１１）同書第４０頁、第１１行（７１ｒｌＯＶＪを「
１０Ｕ」に訂正する。 （１２）同書第４１頁、第５行の１酢酸」を削除する。 （１３）同書第４１頁、第１０行の［Ｓａｌｍａｎ　Ｊ
をｒ　Ｓａｌｍｏｎ　Ｊに訂正する。 （１４）同書第４７頁、第６行のｒ　１．３　Ｊをｒ　
１．２　Ｊに訂正する。 （１５）同書第４８頁、第１２行のｒｐ　ＵＫ　４　Ｊ
の次に［中に挿入されている各ｃＤＮＡＪを加入する。 （１６）第１．２．５．６．７．１０．１１．１２図を
、それぞれ別紙のとおりに訂正する。 手続補正書印釦 ■、事件の表示 昭和５９年特許願第３７１１９号 ２、発明の名称 ヒトウロキナーゼのＤＮＡ配列、プラスミド、宿主 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人　■５４１ 住　所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライ
フ平野町４０６号 電話（０６）　２２７−１１５６ 「図面」 昭和６０年１り十日 昭和５９年特許願第３７１１９号 ２、発明の名称 ヒトウロキナーゼのＤＮＡ配列、 プラスミド、宿主 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人■５４１ 住所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライフ
平野町４０６号 商品国際特許事務所　’ｈ　（０６）　２２７−１１５
６、補正の内容 ＋１１明細書第６頁、第１３行の「第１図」を１第１図
及び表８」に訂正する。 （２）同書第７頁、第１行の「第１図」を「第１図及び
表８」に訂正する。 （３）同書第４３頁、第１４行の「第１２図」を「第１
２図及び表９」に訂正する。 （４）同書第４４頁、第３行の「第１図」を　。 「第１図及び表８」に訂正する。 （５）同書第４５頁、第６行の「第１図」を「第１図及
び表８」に訂正する。 （６）同書第４５頁、第７行の「第１図」を「第１図及
び表８」に訂正する。 （７）同書第４５頁、第１９行の「第１図」を「第１図
及び表８」に訂正する。 （８）同書第４６頁、第１行の「図」を「第１図及び表
８」に訂正する。 （９）同書第４７頁、第１３行と第１４行の間次 に側御６記載を加入する。 鵠　′ ４ツ　−０１＋＜　のＬ）　輻→Ｌｗ　ｉ＝←　リＱ　
巾←　リ←　コロ　リ１ＪＬ５ＪコーＩ＋Ｏ＋−１□−
コく−Φ０−０υ−り■−−Ｕ−の←−＋ｔＪ　＋１Ｉ
ＩＩＣＪ川−←ｏ　Ｏｏ　Ｑ　Ｏｏ　Ｏ 要　−１、Ｃｏ−５・　ω≦・　ヌｉ・　♀５・　９ρ
・　替ｉ・　９８・鴨　０ 手続補正書（自制 昭和６０年２月１５日 昭和５９年特許願第３７１１９号 ２、発明の名称 ヒトウロキナーゼのＤＮＡ配列、 プラスミド、宿主 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人■５４１ 住所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューラ４フ
平野町４０６号 電話（０６）、　２２７−１１５６ ５、補正の対象 明細書の「発明の名称」の欄、明細書の「発明の詳細な
説明」の欄、明細書の 「図面の簡単な説明」の欄及び「図面」６、補正の内容 （１）明細書第１頁の発明の名称を「ヒトウロキナーゼ
のＤＮＡ配列、プラスミド、宿主」に訂正する。 （２）　同書第４７頁、第１４行に「４、図面の簡単な
説明」とあるを下記の通りに訂正する。 ｒ　（１３）動物細胞におけるウロキナーゼの産生（ａ
）動物細胞における発現用ベクターの作製原料プラスミ
ドとして、Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　（Ｍｏ
−１ｅｃ、　ａｎｄ　ｃｅｌｌ、旧ｏ１．．　３　、２
８０−２８９　＜１９８３　））によって創作されたｐ
ｃＤＶ、及びＰＬ、（第１４図）を用いて、ｐＳＶ　Ｇ
＋　（第１５図）を作成した。ｐｃＤＶ＋　とＰＬ、は
、ｐＢＲ３２２ＤＮＡと５Ｖ４０ＤＮＡとのハイブリッ
ドプラスミドであり、Ｐ　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社より入手した。これら
プラスミドへのウロキナーゼをコードするＤＮＡの挿入
を容易にするため、ｐＣＤＶＩのＨ’１ｎｄｌｌＩ−Ｋ
ｐｎ１部位にＰＬ、のＨｉ　ｎ　ｄｍ−Ｐｓｔｌ断片を
挿入しｐｓＶＧ＋を作製した。 すなわち、ＰＬＩ４ＰｇをＰｓｔｌで消化後、突・出す
る３′−末端をＴ４−　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏｌｙｔｎｅｒ
ａｓｅで削ってｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　（平滑末端）に変
更した。その際の反応は反応混合液Ｎ−，ｏ、１　（ｐ
　Ｌ＋　４／１ｇ、１０　ＸＴ、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
　ｂｕｆｆｅｒ　８　ｐ１２＋　２ｍＭｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ
：容液４．０パ、ｄＨｚＯ）　７６ｐ＃を６５℃、３分
間、加熱後急冷した後、Ｔａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ４
ｐ＃　（１０［１）を加え、ＮＷｋ８ｏ、ａとし、３７
℃で５分間反応させた。反応終了後０．２５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ　（ｐＨ８，０）　８パとｄ　Ｈｔｏ　８０　ｐＨを
加え、フェノール処理を１回行った後、水層を回収した
。エタノール沈澱で、ＤＮＡを回収し、減圧乾燥して、
Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　ｌｉｎｋｅｒｌｉｇａｔｉｏｎに供し
た＊　Ｉｉｇａｔｉｏｎ反応は、反応混合液Ｎａ　２　
（ｄｒｉｅｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ　４ｐｇ、５°−Ｐ　Ｋ　ｐ
　ｎ　Ｉ　ｌ１ｎｋｅｒ２ｐＨ（２ｐｇ）、１０　Ｘｌ
ｉｇａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ　２．Ｏｐ（ｔ＋　ｄＨｚＯ
）　１８μを６５℃、３分間加熱後徐冷し、Ｔ４１パｇ
ａｓｅ　２ｐｇ　（５Ｕ）を加えて、１６℃で一夜反応
させた。反応終了後Ｋｐｎ１ついでＨｉｎｄｌ［ｌによ
る消化を行い、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
Ｐ’ＡＧＥ）にかけて約６００ｂｐのＤＮＡ断片を回収
した。 一方、Ｈ３ｎｄｌｌｌとＫＪ）１１１でｐｃＤＶ、を消
化し、１％Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌで、約２．７ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を調製し、そのうち１１００ｎを前記ｐＬ
＋由来の約６００ｂｐＤＮＡ断片とｌｉｇａｔｉｏｎ　
Ｌ／た。１　ｉｇａ−ｔｉｏｎ反応は、反応混合液Ｎ１
５（ｐＬ＋断片ＤＮＡ１５０ｎｇ、ｐｃ　ＤＶ、断片Ｄ
ＮＡ　１００ｎｇ、１０ＸＴａ　ｌｉｇａｓｅ　ｂｕｆ
ｆｅｒ　、１．ＯｐＬ　ｄ　Ｈ＊Ｏ）　８ｐｅにＴ４−
１パｇａｓｅ２ｐｌ　（５，６Ｕ）を加え、１６℃で一
夜反応させた。反応液の１／２景を用いてＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩの形質転換を行った。 得られた形質転換体のうち１２コロニーを用いてｍ１ｎ
ｉ−ｐｒｅｐ法でプラスミドＤＮＡを調製し、各種制限
酵素で消化して調べたところ、いずれも目的のプラスミ
ドを含んでいる事がわかったので、そのうち１株からプ
ラスミドＤＮＡ５を大量調製してｐｓｖ−ｃ、とじ、そ
の制限酵素地図の作製（第１５図）、ならびにＳａｌ’
１−ＢｃｌＩ断片のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行った〔下
記配列（Ｖ）参照〕。この結果、得られたｐｓＶＧ＋　
は、Ｋｐｎ１部位をクローニング部位として上流にｅａ
ｒｌｙ　Ｕｎｈａｎｃｅｒ／　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｌ
ｅ＋ｎｅｎｔおよび１ａｔｅ　５’−ｓｐｌｉｃｉｎｇ
ｊｕｎｃｔｉｏｎが、下流には１ａｔｅ　ｐｏｌｙ（Ａ
）　ｓｉｇｎａｌとｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ　がそれぞれ
配列し、動物細胞中での機能的な１ＩＩＲＮＡの合成に
関与する諸要素が欠失なく配列されていると判定できた
。 （以下余白） （ｂ）ベクターへのウロキナーゼＤＮＡ配列の挿入 ａａで得たｐＵＫ３３　（全長約２．２Ｋｂｐのウロキ
ナーゼｃＤＮＡを含む）をＰｓｔＩで部分消化し、１．
７Ｋｂｐ断片を単離してｐｓｖ−ｃ、に挿入′した。 この際の反応は、反応混合液Ｎａ４　（１）ＵＫ３３１
０Ｊ’ｇ、ｌ　０ＸＰｓ　ｔｌ緩衝液１０Ｐｉｌ！、Ｐ
ｓｔｌｌパ（６Ｕ）、ｄＨ２０１００パ〕を用い３７℃
で行い、０．　５．　１０．　１５．　２０．　４０．
　６０分後にサンプリングした。ついで１．５％アガロ
ースで泳動し、１．７Ｋｂｐ断片を単離した。次いで、
反応混合液Ｎ１１５　（ｐＵＫ３３　１（Ｄｇ、１０Ｘ
Ｐｓ　ｔＩ　ｂｕｆｆｅｒ　５０ｐｅ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ　
１０ｐＬ　（６００）。 ｄＨｚｏ）５００パを、３７℃に保ち、反応開始後、１
０分、１５分および２０分で、それぞれ約１６０ｄサン
プリングし、６５℃、５分間加熱処理後、それぞれの、
反応液を混合して、１％アガロースゲルにて電気泳動に
かけ、１．７Ｋｂｐ断片を約ｌｏｐｇ回収した。回収さ
れた約１．７Ｋｂｐの約５Ｈを用い、Ｔ４−ポリメラー
ゼ処理で切断末端をｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　（平滑末端）
にかえＫ　ｐ　ｎ　Ｉ　ｌ１ｎｋｅｒで）ｉｇａｔｉｏ
ｎ　Ｌ／た。その後Ｋｐｎ　Ｉで消化したｐＳＶ−Ｇ、
とＩｉｇａｔｉｏｎ　Ｌ／て、Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｈａ　１
０１を形質転換して、ｐＳＶ−Ｇ、−ｐｒｅＴＪＫ　（
第１６図）を得た。 ｐｓ、Ｖ−Ｇ＋　−ｐｒｅＵＫは、第１７図に示す様に
、５Ｖ−４０，０）ｍＲＮＡ転写調節域の下流にｐｒｅ
ＵＫｃＤＮＡの５　’−ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇ
ｉｏｎ＋ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ及び３’−ｎ
ｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎが挿入されており、
適当な受容細胞へＤＮＡを導入することでヒト−ｐｒｅ
−υｒｏｋｉｎａｓｅの産生を行いうる。 （ｃ）　Ｄｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍａ
ｒｋｅｒを含むプラスミドＤＮＡの調製 上記ｐＳＶ−Ｇ、を用いて培養細胞を形質転換する際の
口ｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍａｒｋｅｒ
　として用いるプラスミドであるｐＳＶ−Ｇ＋−Ｎｅｏ
’は、以下の様にして作製した。 Ｔｎ５由来のＮｅｏゝｇｅｎｅがクローニングされてい
るプラスミドｐＮＥｏ　（５ｏｕｔｈｅｒｎ＋　Ｐ、　
Ｊ。 ａｎｄ　Ｐ、Ｂｅｒｇ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、ａｎｄ　／１
ｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ。 １．３２７−３４１　（１９８２）　を１３ａｍＨＩと
Ｈ１ｎｄ■でｄｉ＋ｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ後、
エタノール沈澱してＤＮＡ断片を回収した。回収したＤ
ＮＡは４ｄＮＴＰ存在下でＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　−
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｌ。 ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ　）で切断末端を平滑末端に変更した。ｂｌ
ｕｎｔ　ｅｎｄｅｄ　１．５ｋ　ｂ　ＤＮ　Ａ　ｆｒａ
ｇｍｅｎｔはＡｇａｒａｓｅ　ｇｅｌ電気泳動で分離回
収し、次にＴａ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅによる反応でそ
の末端に前述の様にしてＫ　ｐ　ｎ　Ｉ　ｔｉｎｋｅｒ
を付加した。 Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　１ｉｎｋｅｒ　Ｉｉｇａｔｉｏｎ後、
Ｋｐｎ１６ＵでＤＮＡ断片を完全に消化し、１ｉｋｅｒ
の付加された目的の約１．５　ｋｂのＮｅｏ’断片を回
収した。 回収したＤＮＡ断片は、そのうち１５ｎｇを前述の様に
してＫｐｎｌで切断したｐ　Ｓ　Ｖ　Ｇ１２０ｎｇとｌ
ｉｇａｔｅ　Ｌ、、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩを形質
転換して目的のプラスミドｐｓｖ　ｃ、Ｎｅｏ’を得た
（第１６図）。 ｆｄｌ受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｅｌｌ　）の
調製受容細胞として、ｃｈｊｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ
卵巣細胞〔ＣＨＯ−に＋　、　ＡＴＣＣＣＣＬ６１（Ｆ
ｌｏｗ−Ｌａｂｏ。 Ｉｎｃ、より購入）〕を用い、細胞の培養を、１０％Ｆ
　ＣＳ　（Ｆｅｔａｌ　ｃａｒｆ　Ｓｅｒｕｍ）（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｍｈｅｉｍ社製）を含むＨａ　
ｍ’ｓＦ　−１２（Ｇｉｂｃｏ社製）で行った。細胞は
ファルコン３０２８フラスコで継代維持した。形質転換
に用いる細胞は、接種後２日の５ｕｂ−ｃｏｎｆＩｕｅ
ｎｔ　（単層）なものを用いた。トリプシン処理で細胞
を集め、前記培養液に懸濁後、ファルコン＃３００３　
（１００ｍｍ）培養シャーレに５Ｘ１０’ｃｅ１１ｓ／
１０ｍ１／１００ｍｍシャーレで１ｎｏｃｕｌａｔｅ　
Ｌ、た。２時間５％ｃｏ□−９ｓ％ａｉｒのＣＯ２−１
ｎｃｕｂａｔｏｒで培養後、形質転換に用いた。この時
シャーレあたりの細胞数は、７．　Ｏｘｔｏｓ　ｃｅｌ
ｌｓであった。 ｔｅｌ形質転換 長円等の方法（蛋白質核酸・酵素、２８　（１４）。 １５６９〜１５８１．１９８３　）に準じて調製したプ
ラスミドＤＮＡ　（ｐＳＶ−Ｇ＋　−ｐｒｅＵＫ及びＮ
ｅｏ’ｇｅｎｅを担持するｐＳＶ−Ｇ＋　−Ｎｅｏ　（
混合比率は１００：１））をＤＮＡ量として２．ＯＮ／
ｍｌおよびｃａｒｒｉｅｒ　Ｄ　Ｎ　ＡとしてＳａｌｍ
ｏｎ　ｓｐｅｒｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　）を２０ｐｇ／ｎ＋１含有するＤＮＡ−Ｃａ
ＰＯ，微小沈澱液をｌｄｌで調製したシャーレあたりｌ
ｌｌ１ｌづつ加えた。シャーレを十字に動がして静置し
、Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃａ　Ｐ　Ｏａ微小沈澱液を細胞に吸着
させた後、再び１ｎｃｕｂａｔｏｒで培養を開始した。 １８時間後培地交換を行い、さらに４８時間以上培養し
て、形質転換細胞の選別を行った。 ｆｆ）形質転換細胞の選別 ウロキナーゼ遺伝子は、自身では５ｅｌｅｃｔａｂｊｅ
ではないため、真核細胞において、Ｇ−４１８耐性を与
えるＴｎ５由来のＮ　ｅ　ｏ’　ｇｅｎｅをｄｏｍｉｎ
ａｎｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒとして用い（
前述のｐＳＶＧ＋＝Ｎ　ｅ　ｏ　）　５ｏｕｔｈｅｒｎ
　等の方法（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ＾１）Ｉｌｌ
ｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、、１．　３２７−３４１．１９８
２　）に準して細胞をＧ−４１８含有培地（４０’ＯＰ
ｇ／ｍｌ）で培養することによってトランスフェクンし
た細胞との選別を行った。なお、（、−４１８はＧｉｂ
ｃｏ社製（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、　Ｇｉｂｃｏ、　ｌｏ
ｔ　Ｎｏ、７５　Ｋ６０４３及び７４Ｎ８０４０　）を
用いた。 ４日おきに培地を交換し、Ｇ−４１８耐性コロニーを順
次ｃｌｏｎｉｎｇして生育させ、１０日計重８３コロニ
ー（Ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を得た。得られたコロニーをヒ
トーウロキナーゼＲＰＨＡ試薬（ミドリ十字社製）及び
フィブリン平板ａｓｓａｙでウロキナーゼの産生を調べ
た。ＲＰＨＡ試薬で、第一次のスクリーニングを行った
結果、Ｃ，−４１８耐性株のうち約２５％で凝集がみら
れ、ヒト−ウロキナーゼ様物質が産生されていると推定
できた。 凝集のみられた１５株をフィブリン平板ａｓｓａｙによ
ってｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ活性
を調べたところ培養上清に活性が認められ、しかもこの
活性は、ウロキナーゼ抗原カラムで精製して抗とトーウ
ロキナーゼ抗体で中和された。スクリーニングによって
得たウロキナーゼ様物質の産生量の高いと思われるＣＨ
Ｏ−Ｋｌ　−Ｃ６８を選び、低密度培養によるクローニ
ングを行って、Ｃ−６８−５３とＣ−６８−６１の２株
を得た。 これらのクローンの培養上清を用いて、合成・分泌され
たヒトーＵｒｏｋｉｎａｓｅ様蛋白の性状を検討した。 なお、（、−６８−５３とＣ−６８−６１の両クローン
は、１００日以上にわたって安定にさらに構成的に培地
中にヒトＵｒｏｋｉｎａｓｅ様蛋白を分泌した。 ＋ｇ）　ＣＨＯ−Ｋ　＋細胞によって合成されるヒトー
Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ様蛋白の性状 クローニングした２クローンについて、培地中に分泌さ
れるヒトーＵｒｏｋｉｎａｓｅ様蛋白の性状を調べた。 はじめに、これら２クローンのヒト−ウロキナーゼ様蛋
白の産生量をめた。２５ｃ＋ｆｌの培養フラスコ（Ｆａ
ｌｃｏｎ＃３０１３）に５　ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／
１０ｍ１／ｆｌａｓｋで両クローンを１ｎｏｃｕ　ｌａ
　ｔｅ　シ、３日培養後ｃｏｎｆｌｕｅｎｔとなった時
点で培地を１％ＦＣ５を含むＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　
Ｍｅｄｉｕｍ　５ｍｌ／ｆｉａｓｋに交換する。 Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍ中で２４時間培
養後・その上清中のｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉ
ｖａｔｏｒ活性を測定したＯ人尿高分子Ｕｒｏｋｉｎａ
ｓｅをｒｅｆｅｒｅｎｃｅとしたフィブリン平板法によ
る活性測定の結果、いずれのクローンでも約２００１Ｖ
／ｎ＋１／ｄａｙの産生量が示された。 しかも、これらの活性は、抗ヒト−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ
のモノクローナル抗体で特異的に中和された。 次にこれらのクローンの産生ずるヒト−１ｌｒｏｋｉ−
ｎａｓｅ様蛋白の分子量を以下の様にして測定した。 Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍで２４時間培養
した培養上清を１２．５％５０５−ＰＡＧＥにより泳動
後、蛋白ｂａｎｄを２５ｍＭトリス−１９２ｍＭ　ｇｌ
ｙｃｉｎ　（ｐＨ８，３）／２０％ｍｅｔｈａｎｏｌ中
で電気泳動的にｎ１ｔｒｏ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｆｉ
ｌｔｅｒに吸着させ、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇを行った。 Ｆ　ｉ　ｌ　ｔｅｒは、その後３％ｇｅｌａｔｉｎを含
む２０ｍＭトリス−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）／　５０
０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ中室温、６０分でｂｌｏｃｋした
後、−次抗体としてヒト−Ｕｒｏｋ　１ｎａｓｅ抗原ｃ
ｏｌｕｍｎ及びｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　５ｅｐｈａ−ｒｏ
ｓｅで精製した抗ヒト−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　Ｒａｂｂ
ｉｔ　Ｉ　ｇ　Ｇを用いた間接法で、ＨＲＰ　（Ｈｏｒ
ｓｅ−Ｒａｄｉｓｈ　Ｐｅａｘｉ−ｄａｓｅ　）を用い
たｉｍｍｕｎｏ−Ｂｌｏｔ　”　ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔ
ｅｍ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によりヒト−Ｕｒｏｋｉ
ｎａｓｅのｂａｎｄを特異的に染色した。 ２−メルカプトエタノールによる還元処理を行った試料
を用いた場合、両クローンの培養上清では、分子１１５
４にのｍａｉｎ−ｂａｎｄと分子量３４Ｋ及び２ＯＫの
５ｕｂ−ｂａｎｄの３本のｂａｎｄが認められた。 ｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして、人尿二本鎖高分子ＵＫおよ
びｐ　ｒ　ｏ−ＵＫ産生ヒト−胎児腎細胞の培養上清を
同時に泳動したところ、５４に、３４におよび２０にの
ｂａｎｄｓはそれぞれヒト天然型−木鎖ｐ、ｒｏ−ＵＫ
（５４Ｋ）及び二本鎖高分子ＵＫの３４Ｋ及び２０にの
ｂａｕｄｓと分子量的にも抗ＵＫＩｇＧに対する反応性
のいずれにおいても一致し、区別できなかった（　・第
１８図参照）。これらの結果は、両クローンでは、当該
天然型と同様に！！鎖が付加された分子量５４にの一本
鎖のｐｒｏ−ＵＫが合成・分泌され、その一部が培養液
中で二次的に二本鎖へ転換している事を示唆していると
考えられた。 そこで、次にＣｏｎＡ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ
　、（ファルマシア社製）によるｃｏｌｕｍｎ−ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを行って、両クローンによって
合成・分泌されるヒト−Ｄｒｏｋｉｎａｓｅの糖鎖の有
無を調べた。 クローンをｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで培養し、ダル
ベツコのＰＢＳ（＋）にラス４社製）で２回洗う。その
後ＰＢＳ　（＋）に対して透析したＦｅ２を１％含み、
ｐｒｏｌｉｎｅを加えたＭ　ｅ　ｔ　−ｆｒｅｅのＭＥ
Ｍ培地培地５中ｌ中　００　μｃｉ／ｍｌ　ｏｆ　（”
Ｓ　）−Ｍｅｔｉｏｎｉｎｅとともに２０時間培養した
。 （”Ｓ　）　１ａｂｅｌｌｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｌ
ｕｉｄは５ｍｌの抗−ヒト−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅのモノ
クローン抗体カラムにアプライした。カラムを０．０４
ＭＮａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８，
０）１０．０３　ＭＮａＣＩで充分洗浄した後、ｇｌｙ
ｃｉｎ＋１ＣＩ（ｐＨ７，５）でｅｌｕｔｅＬ、”Ｓ−
１ａｂｅｌｌｅｄ組換えヒト−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅを回
収した。溶出した”Ｓ−１ａｂｅｆｌｅｄヒト−Ｕｒｏ
ｋｉｎａｓｅはＩＭ）リスで中和後、２０ｍＭ　Ｎａ−
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ７，４／１５
０ｍＭＮ　ａ　Ｃ１２に対して透析し、同ｂｕｆｆｅｒ
で平衡化したＣｏｎＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ
　（ファルマシア）カラムにアプライした。□ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、０．１　Ｍ　Ｍｅｔｈｙ＋
−α−Ｄ　−Ｍａｎｎｏｓｉｄｅを含むＮａ−ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７，４）で溶出した
。その結果、抗−ＵＫモノクローナル抗体カラムで溶出
されたｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙのうち殆どがＣｏｎ
　Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅに吸着し、ｍａｎｎｏｓｉ
ｄｅで特異的に溶出された。 これらの結果は、両クローンによって合成・分泌される
組換えＵｒｏｋｉｎａｓｅが抗ヒト−〇ｒＯｋｉｎａｓ
ｅモノクローナル抗体カラムで精製可能な糖蛋白である
ことを示している。 以上の結果は、ｃＨｏ−に＋に導入したヒト−ｐｒｅ−
Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが正常に転写され
、天然型と同等の分子量及びモノクローナル抗体に対す
る反応性を有する糖蛋白として合成・分泌される事を示
している。 ４、図面の簡単な説明　」 （３）同書第４９頁、第１７行の「ＢはＢａｍ１ｌｌを
表す。」を下記の通りに訂正する。 「　ＢはＢａｍＨＩ　、を表す。 第１４図　ｐｃＤＶ＋とｐＬ＋とのＩｉｇａｔｉｏｎ（
リゲーション）フローシート。 第１５図　ｐｓｖ、ｃｌ制限酵素地図。 第１６図　ｐｓＶ、−Ｇ−ｐｒｏＵＫ制限酵素地図。 第１７図　ｐｓｖ、−ｃ−１）ｒ　ｏＵＫのｐｒｏＵＫ
・ｃＤＮＡ近辺の構造。 Ｎ　Ｃ：　ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎＳ　Ｓ
　：　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅＳ　Ｊ　：　ｓ
ｐｌｉｃｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ第１８図　培養上清
中のウロキナーゼ様蛋白の分子量測定のための５ＤＳ−
ＰＡＧＥのバンド。 レーン（ｌａｎｅ）　１．６ 尿由来ウロキナーゼ レーン（ｌａｎｅ）　２ 大賢由来株化細胞の培養上清 （分子量５４にのバンドが見られる。）レーン（ｌａｎ
ｅ）　３．４．５ ＣＨＯ−に＋’、Ｃ−６８およびＣ− ６１細胞の培養上清（分子量３４Ｋ。 ２０にのバンドが見られる。）　」 （４）別紙の通り、第１４図〜第１８図を追加する。 以上 第１δ図 １　２ ３４５６Figure 1: cDNA base sequence and amino acid sequence encoding an amino acid sequence equivalent to urokinase. Figure 2: Restriction enzyme map of cDNA. Figure 3 Ultracentrifugation sedimentation pattern of cDNA. Figure 4 Colony hybridization using probe A. - a; Filter b washed at 37°C: Filters ☆-☆ and Δ- washed at 42°C had pBR322 colonies arranged as a negative control.・In a, 4 colonies (arrows) can be clearly seen hybridizing with the probe. These 4 colonies are clearly recognized as positive colonies even after washing at 42°C (b). Figure 5 pUKl, pUK3. Comparison of restriction enzyme maps of pUK4. Figure 6: Structure of urokinase mRNA and location of the synthetic NA probe used. Figure 7 Urokinase cDNA published by Abbott Figure 8 Restriction enzyme map of TPA. Figure 9. Complete amino acid sequence of human urine urokinase A-chain and B-chain. Figure 10. Restriction enzyme map of pUKl, 4 and 18. pUKl is about L900bp, pUK4 is about 1
゜3000b, and pUKl8 is about 1,450b
p cDNA, and their respective restriction enzyme maps overlap with each other. Figure 11: Restriction enzyme map of cDNA. The cDNA restriction enzyme map was compiled into one based on Figure 10. The ★, ×, and ○ marks indicate the parts labeled with 132P), and the arrows indicate the direction of sea fencing. In addition,
★ is pUKl, × is pUK4, and ○ is pUKl
This means that sea fencing was performed using 8. Figure 12 cDNA base sequence. Figure 13. Ligation of pUKl and pUK4 (
flow sheet for ligation). In the ff113 diagram, E represents 1icoRI, H represents ll1ndI[l, and B represents Bam old. Shaved diagram Figure 13 Procedural amendment (indication of Hitomi matter Patent application No. 371 of 1988, name of the invention Human urokinase DNA sequence, plasmid, relationship with the host case) Name of patent applicant (name) Co., Ltd. Midori Juji Rijin ■541 Address 406-3 New Life Hirano-cho, Higashi-ku, Osaka Telephone: (06) 227-1156 6. Contents of the amendment (1) [[] on page 7, line 11 of the specification. and polysomal RN
Delete AJ. (2) Add "sequence" next to "amino acid" on page 21 of the same book, line 3. (3) Add "Urokinase B chain" next to "Human urine" on page 21, line 17 of the same book. (4) Delete "B Chin no" on page 21, line 18 of the same book. (5) r 80 pmol J on page 23, line 16 of the same book
Add "6~" before . (6) r (pH 8,0) J on page 24, line 9 of the same book
Next to ``, 35d'' is added. (7) r Sonicated on page 26, line 8 of the same book.
salmo rsonicated ssalmanJ
Corrected to nJ. (8) Corrected r 5xssc on page 27, lines 2 to 5 of the same book. (9) r 5xSS on page 27 of the same book, lines 10-14
Correct to C I X Denhardt's solution. (lO) p. 29 of the same book, lines 8 to lo, “Comparatively Ha・7
The background was high, and colonies with various degrees of hybridization were observed. (11) Same book, page 40, line 11 (71rlOVJ is “
Corrected to ``10U''. (12) Delete "1 acetic acid" on page 41, line 5 of the same book. (13) Ibid., page 41, line 10 [Salman J.
Correct to r Salmon J. (14) Same book, page 47, line 6, r 1.3 J to r
1.2 Correct to J. (15) rp UK 4 J on page 48, line 12 of the same book
Next, add each cDNAJ inserted in [. (16) Figures 1.2.5.6.7.10.11.12 are corrected as shown in the attached sheets. Procedural amendment stamp button ■, Indication of case Patent application No. 37119 of 1982 2, Name of invention DNA sequence of human urokinase, plasmid, host 3, Person making amendment Relationship to case Name of patent applicant Stocks Company: Midori Juji 4, Agent ■541 Address: 406 New Life Hirano-cho, 4-53-3 Hirano-cho, Higashi-ku, Osaka Telephone: (06) 227-1156 ``Drawings'' January 11, 1985 Patent Application No. 37119 No. 2, Name of the invention DNA sequence of human urokinase, plasmid, host 3, Relationship with the case of the person making the amendment Name of patent applicant Midori Juji Co., Ltd. 4, Agent 541 Address 4 Hirano-cho, Higashi-ku, Osaka 53-3 New Life Hiranocho 406 Product International Patent Office 'h (06) 227-115
6. Contents of amendment +11 "Figure 1" on page 6, line 13 of the specification is corrected to 1 "Figure 1 and Table 8." (2) "Figure 1" in the first line of page 7 of the same book is corrected to "Figure 1 and Table 8." (3) “Figure 12” on page 43, line 14 of the same book
Figure 2 and Table 9 have been corrected. (4) "Figure 1" on page 44, line 3 of the same book. Corrected to “Figure 1 and Table 8.” (5) "Figure 1" in line 6 on page 45 of the same book is corrected to "Figure 1 and Table 8." (6) On page 45 of the same book, line 7, "Figure 1" is corrected to "Figure 1 and Table 8." (7) "Figure 1" on page 45, line 19 of the same book is corrected to "Figure 1 and Table 8." (8) On page 46 of the same book, "Figure" in the first line is corrected to "Figure 1 and Table 8." (9) On page 47 of the same book, between lines 13 and 14, the following statement is added: 6.鵠 ′ 4tsu -01+< L) 輻→Lw i=← ReQ
Width ← Ri ← Color Ri 1 JL 5 J Ko I + O + - 1 □ -
Koku-Φ0-0υ-ri■--U-←-+tJ +1I
IICJ river-←o Oo Q Oo O Kaname-1, Co-5・ω≦・nui・♀5・9ρ
・Replacement i・98・Kamo 0 Procedural amendment (self-imposed February 15, 1985 Patent Application No. 37119 2, title of invention: DNA sequence of human urokinase, plasmid, host 3, person making amendment case) Relationship Patent applicant name: Midori Juji Co., Ltd. 4, Agent ■541 Address: 4-53, Hirano-cho, Higashi-ku, Osaka-shi, 4-406 Hirano-cho, 3 New Ra, Higashi-ku, Osaka Telephone: (06), 227-1156 5. Subject of amendment "Title of the invention" column of the specification, "Detailed description of the invention" column of the specification, "Brief explanation of drawings" column of the specification and "Drawings" 6, Contents of amendment (1) Description The title of the invention on page 1 is corrected to "DNA sequence, plasmid, and host of human urokinase." (2) On page 47 of the same book, line 14, "4. Brief explanation of the drawings" is replaced with the following: (13) Production of urokinase in animal cells (a
) Okayama and Berg (Mo
-1ec, and cell, old o1. ．． 3, 2
80-289 <1983 ))
Using cDV and PL (Figure 14), pSV G
+ (Figure 15) was created. pcDV+ and PL are hybrid plasmids of pBR322 DNA and 5V40 DNA, and PL, Biochemica
ls (Pharmacia). To facilitate the insertion of DNA encoding urokinase into these plasmids, H'1ndllI-K of pCDVI
A Hin dm-Pstl fragment of PL was inserted into the pn1 site to create psVG+. That is, after PLI4Pg was digested with Pstl, the protruding 3'-end was digested with T4-DNA polytner.
I changed it to a blunt end by scraping it with aze. The reaction at that time is the reaction mixture N-, o, 1 (p
L+ 4/1g, 10XT, polymerase
buffer 8 p12+ 2mMd NTP
: Liquid volume 4.0 Pa, dHzO) After heating 76p# at 65°C for 3 minutes and rapidly cooling, Ta polymerase 4
Add p# (10[1) and make NWk8o, a, 37
The reaction was carried out at ℃ for 5 minutes. 0.25M EDT after completion of reaction
A (pH 8,0) 8 pH and d Hto 80 pH were added, and after phenol treatment was performed once, the aqueous layer was collected. DNA was collected by ethanol precipitation, dried under reduced pressure,
K p n I linker ligation *Iigation reaction is performed using reaction mixture Na 2
(dried D N A 4pg, 5°-PKp
n I l1nker2pH (2 pg), 10 Xl
igase buffer 2. Op(t+ dHzO
) 18μ was heated at 65°C for 3 minutes, then slowly cooled, and T41
2 pg (5 U) of ase was added, and the mixture was allowed to react at 16° C. overnight. After the reaction was completed, Kpn1 was then digested with Hindl[l, and subjected to 5% polyacrylamide gel electrophoresis (
P'AGE) and a DNA fragment of approximately 600 bp was recovered. Meanwhile, pcDV was digested with H3ndlll and KJ) 111, and approximately 2.7 kbp was digested with 1% Agarose gel.
DNA fragments were prepared, and 1100n of them were added to the pL
Approximately 600bp DNA fragment derived from + and ligation
L/ta. 1 iga-tion reaction, reaction mixture N1
5 (pL + fragment DNA 150ng, pc DV, fragment D
NA 100ng, 10XTa ligase buf
fer, 1. OpL d H*O) T4- to 8pe
1 pgase 2 pl (5,6 U) was added, and the mixture was allowed to react at 16° C. overnight. Using 1/2 of the reaction solution, extract E. coli.
Transformation of HBOI was performed. Among the obtained transformants, 12 colonies were used for m1n
Plasmid DNA was prepared using the i-prep method, and when examined by digestion with various restriction enzymes, it was found that all of them contained the desired plasmid, so a large amount of plasmid DNA 5 was prepared from one of the strains and psv- c. Binding, preparation of the restriction enzyme map (Fig. 15), and Sal'
1-BclI fragment was sequenced [see sequence (V) below]. As a result, the obtained psVG+
The Kpn1 site is used as the cloning site and the ea
rly Unhancer/promoter el
e+nent and 1ate 5'-splicing
The junction is downstream of 1ate poly(A
) The signal and terminator were each arranged, and it was determined that the various elements involved in the synthesis of functional 1I RNA in animal cells were arranged without any deletions. (Blank below) (b) Insertion of urokinase DNA sequence into vector pUK33 obtained in step aa (containing urokinase cDNA with a full length of approximately 2.2 Kbp) was partially digested with PstI, and 1.
A 7 Kbp fragment was isolated and inserted into psv-c. In this case, the reaction mixture Na4 (1) UK331
0J'g, l 0XPs tl buffer 10Pil! , P
37℃ using dH20100pa]
0. 5. 10. 15. 20. 40.
Samples were taken after 60 minutes. Subsequently, electrophoresis was performed on 1.5% agarose, and a 1.7 Kbp fragment was isolated. Then,
Reaction mixture N115 (pUK33 1(Dg, 10X
Ps tI buffer 50pe, Ps tI
10 pL (600). dHzo) at 37°C, and after starting the reaction,
Samples were taken for about 160 d at 0 minutes, 15 minutes, and 20 minutes, and after heat treatment at 65°C for 5 minutes, each
The reaction solution was mixed and subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and about 1 lopg of a 1.7 Kbp fragment was recovered. Using approximately 1.7 Kbp of recovered 5H, the cut ends were blunt-ended by T4-polymerase treatment.
igatio
n L/ta. pSV-G, which was then digested with Kpn I;
and Iigation L/te, E, colt Ha 1
01 was transformed into pSV-G, -preTJK (
Fig. 16) was obtained. ps, V-G+ -preUK, as shown in Figure 17, pre
5'-non coding reg of UK cDNA
ion+signal 5equence and 3'-n
on coding region is inserted,
By introducing the DNA into suitable recipient cells, human-pre
- υrokinase can be produced. (c) Dominant 5elective Ma
Preparation of plasmid DNA containing pSV-G.
pSV-G+-Neo, a plasmid used as
' was produced as follows. Plasmid pNEo (5outhern+P,
J. and P., Berg, J., Molec, and /1.
pplied Genet. After di+uble digestion of 1.327-341 (1982) with 13amHI and H1nd■,
DNA fragments were recovered by ethanol precipitation. Recovered D
NA in the presence of 4dNTP, E.coli DNA-
polymerase l. large fragment
gment) to change the cut end to a blunt end. bl
unt ended 1.5k b DN A fra
The gment was separated and recovered by agarase gel electrophoresis, and then K p n I tinker was added to the end by Ta DNA ligase reaction as described above.
Added. After K p n I 1inker induction,
Completely digest the DNA fragment with Kpn16U and
The desired Neo' fragment of approximately 1.5 kb with the addition of was recovered. Of the recovered DNA fragments, 15 ng of them were combined with 120 ng of pSV G cut with Kpnl as described above.
igate L, E, colt HBIOI was transformed to obtain the target plasmid psvc, Neo' (Fig. 16). Preparation of fdl recipient cells Chjnese hamster as recipient cells
Ovarian cells [CHO-+, ATCCCCL61 (F
low-Labo. The cells were cultured using 10% F
CS (Fetal calf Serum) (Bo
ehringer Mamheim)
m'sF-12 (manufactured by Gibco) was used. Cells were maintained for passage in Falcon 3028 flasks. The cells used for transformation were 5ub-confIue 2 days after inoculation.
nt (single layer) was used. Cells were collected by trypsin treatment, suspended in the above culture medium, and then transferred to Falcon #3003.
(100mm) 5X10'ce11s/in culture dish
Noculate in 10m1/100mm Petri dish
L, ta. 2 hours 5% co□-9s% air CO2-1
After culturing in an incubator, it was used for transformation. At this time, the number of cells per petri dish was 7. Oxtos cel
It was ls. Plasmid DNA (pSV-G+-preUK and N
pSV-G+-Neo (
The mixing ratio is 100:1)) as the amount of DNA.2. ON/
Salm as ml and carrier DNA
on sperm DNA (PL-Biochem)
DNA-Ca containing 20 pg/n+1
PO, microprecipitate solution per Petri dish prepared with ldl
Added 11 liters at a time. After moving the Petri dish in a crosswise motion and allowing it to stand, the DNA Ca P Oa microprecipitate was adsorbed onto the cells, and then culture was started again in 1 incubator. After 18 hours, the medium was replaced, and the cells were further cultured for 48 hours or more, and transformed cells were selected. ff) Selection of transformed cells The urokinase gene itself is 5electabje
Therefore, in eukaryotic cells, the Tn5-derived Neo' gene that confers G-418 resistance is dominated.
Used as an antselection marker (
The aforementioned pSVG+=N e o ) 5outhern
Methods such as (J, Mo1ec, and^1)Ill
ied Genet, 1. 327-341.198
2), cells were cultured in G-418-containing medium (40'OP
The transfected cells were sorted by culturing the transfected cells (g/ml). In addition, (, -418 is Gib
Manufactured by Geneticin, Gibco, lo
t No., 75K6043 and 74N8040) were used. The medium was replaced every 4 days, and G-418-resistant colonies were sequentially cloned and grown to obtain a total of 83 colonies weighed in 10 days. The obtained colonies were examined for urokinase production using a human-urokinase RPHA reagent (manufactured by Midori Juji Co., Ltd.) and a fibrin plate assay. As a result of the first screening using the RPHA reagent, agglutination was observed in approximately 25% of the C,-418-resistant strains, and it was assumed that a human-urokinase-like substance was produced. When the plasminogen activator activity of the 15 aggregated strains was examined by fibrin plate assay, activity was observed in the culture supernatant, and this activity was purified with a urokinase antigen column and neutralized with anti- and urokinase antibodies. CHs that appear to produce a high amount of urokinase-like substances obtained through screening
O-Kl-C68 was selected and cloned by low-density culture to obtain two strains, C-68-53 and C-68-61. Using the culture supernatants of these clones, the properties of the synthesized and secreted human Urokinase-like protein were investigated. Furthermore, both clones (,-68-53 and C-68-61 secreted human Urokinase-like protein into the culture medium stably and constitutively for over 100 days. The properties of the human Urokinase-like protein secreted into the culture medium were investigated for the two cloned clones. First, the amount of human urokinase-like protein produced by these two clones was determined. 25c+fl culture flask (Fa
5 x 10' cells/
1 nocu la of both clones at 10m1/flask
After 3 days of culture, at the point when it became confluent, the medium was treated with maintenance containing 1% FC5.
Replace with Medium 5ml/fiask. After 24 hours of culture in Maintenance Medium, plasminogen Acti in the supernatant
Human urine polymer Urokina measured vator activity
As a result of activity measurement by fibrin plate method using se as a reference, all clones had approximately 2001V.
/n+1/day production amount was shown. Moreover, these activities are similar to those of anti-human Urokinase.
was specifically neutralized with a monoclonal antibody. Next, these clones are produced by human-1lroki-
The molecular weight of the nase-like protein was measured as follows. After 24 hours of culture in Maintenance Medium, the culture supernatant was run on 12.5% 505-PAGE, and the protein band was separated using 25mM Tris-192mM GL.
Cellulose fi electrophoretically in ycin (pH 8,3)/20% methanol.
Western Blottin
I did g. Filter was then mixed with 20mM Tris-HCj! containing 3% gelatin. (pH7,5)/50
After blocking for 60 min at room temperature in 0mM NaCl, human-Urok 1nase antigen c was used as the next antibody.
olumn and protein A 5epha-ro
Anti-human-Urokinase Rabb purified with se
HRP (Hor
immuno-Blot” assay system using se-Radish Peaxi-dase)
human-Uroki by em (manufactured by Bio-Rad)
The nase band was specifically stained. When using samples subjected to reduction treatment with 2-mercaptoethanol, in the culture supernatants of both clones, molecules 115
Three bands were observed: a main band of No. 4 and a 5 ub-band of molecular weights 34K and 2OK. As a reference, when culture supernatants of human urine double-stranded polymer UK and pro-UK-producing human-embryonic kidney cells were simultaneously electrophoresed, bands 54, 34, and 20 were human natural-type kidney cells, respectively. Chain p, ro-UK
(54K) and double-stranded polymer UK bauds at 34K and 20, both in terms of molecular weight and reactivity to anti-UK IgG, and could not be distinguished (see Figure 18). These results are similar to the natural type for both clones! ! This suggests that single-stranded pro-UK with a molecular weight of 54 is synthesized and secreted, and a portion of it is secondarily converted into double-stranded pro-UK in the culture medium. It was done. So, next, ConA-3epharose 4B
column-chr by (manufactured by Pharmacia)
Omatography was performed to examine the presence or absence of human-Drokinase sugar chains synthesized and secreted by both clones. The clones are cultured until confluent and washed twice with Dulbecco's PBS (+) (manufactured by Russ 4). Contains 1% Fe2, which was then dialyzed against PBS (+),
Met-free ME with proline added
00 μci/ml in M medium 5 ml of (”
S)-Metionine was cultured for 20 hours. (”S) 1 abelled culture fl
uid was applied to a 5 ml anti-human-Urokinase monoclonal antibody column. column to 0.04
MNa-phosphate buffer (pH 8,
0) After washing thoroughly with 10.03 MNaCI, gly
eluteL with cin+1CI (pH 7,5), “S-
1 labeled recombinant human-Urokinase was recovered. Eluted “S-1abefled human-Uro”
Kinase was neutralized with IM) 20mM Na-
Phosphate buffer pH7, 4/15
Dialyzed against 0mM Na C12 and diluted with the same buffer.
ConA-5epharose 4B equilibrated with
(Pharmacia) column. □ After washing with buffer, add 0.1 M Methy+
Na-phos containing -α-D-Mannoside
It was eluted with phate buffer (pH 7,4). As a result, most of the radioactivity eluted with the anti-UK monoclonal antibody column was Con.
Adsorbed to A-5epharose, mannosi
specifically eluted with de. These results indicate that the recombinant Urokinase synthesized and secreted by both clones is anti-human-〇rOkinase.
e This shows that it is a glycoprotein that can be purified using a monoclonal antibody column. The above results indicate that human-pre- introduced + into cHo-
This shows that Urokinase c DNA is normally transcribed and synthesized and secreted as a glycoprotein having the same molecular weight as the natural type and reactivity to monoclonal antibodies. 4. Brief explanation of the drawings” (3) “B stands for Bam1ll” on page 49, line 17 of the same book is corrected as follows. "B represents BamHI." Figure 14 Iigation of pcDV+ and pL+ (
ligation) flow sheet. Figure 15 psv, cl restriction enzyme map. Figure 16 psV, -G-proUK restriction enzyme map. Figure 17 psv, -c-1) proUK of r oUK
・Structure near cDNA. NC: non-coding regionS
: signal 5equenceS J : s
plicing junction Figure 18 5DS- for measuring the molecular weight of urokinase-like protein in culture supernatant
PAGE band. Lane (lane) 1.6 Urine-derived urokinase lane (lane) 2 Culture supernatant of Daiken-derived cell line (a band with a molecular weight of 54 is seen) Lane (lan)
e) 3.4.5 Culture supernatant of CHO-+', C-68 and C-61 cells (molecular weight 34K. A band at 20 is seen.) (4) As shown in the attached sheet, Fig. 14~ Add Figure 18. Above is the first δ figure 1 2 3456

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１１ヒト腎細胞より得たｍＲＮＡを鋳型として得られ
るヒトの尿由来のウロキナーゼと同等のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列。 （２）第１図に示す塩基配列において、ＡＧＣの塩基配
列にはじまり、ＣＴＣの塩基配列におわる１２３３ＤＮ
Ａ配列である特許請求の範囲第（１１項記載のＤＮＡ配
列。 （３）第１図に示す塩基配列を含む特許請求の範囲第（
１）項記載のＤＮＡ配列。 （４）特許請求の範囲第（１）、（２）又は（３）項記
載のＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミド。 （５）特許請求の範囲第（１）、（２）又は（３）項記
載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主。[Claims] (11) A DNA sequence encoding an amino acid sequence equivalent to human urine-derived urokinase obtained using mRNA obtained from human kidney cells as a template. (2) In the base sequence shown in FIG. 1233DN starting from the base sequence of CTC and ending with the base sequence of CTC.
A sequence, which is the DNA sequence according to claim 11. (3) Claim No. 1, which includes the base sequence shown in FIG.
1) DNA sequence described in section 1). (4) A plasmid into which the DNA sequence described in claim No. (1), (2), or (3) is integrated. (5) A host transformed with the DNA sequence according to claim No. (1), (2) or (3).