JPS60176587A - Method for immobilizing alcohol oxidase - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce an immobilized alcohol oxidase, useful mainly for electrodes, easily operable, and having good stability, by incorporating polyethylenimine and glutaraldehyde in specific concentrations in an enzymic solution. CONSTITUTION:1-7vol%, preferably 4-6vol% polyethylenimine and 1-3vol% glutaraldehyde are incorporated in an enzymic solution consisting of a buffer solution of 6-8pH, preferably 7.0-7.5pH used for immobilizing an alcohol oxidase to crosslink and immobilize mutually the alcohol oxidase and glutaraldehyde.

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は、酵素、特にアルコールオキシダーゼの新規な
固定化法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Field of the Invention] The present invention relates to a novel method for immobilizing enzymes, particularly alcohol oxidase.

〔従来技術とその問題点〕[Prior art and its problems]

固定化酵素を応用した酵素電極は、１）高価な酵素を反
復利用できる、２）試料を前処理なしで分析できる、３
）操作が簡単である、４）少量の試料で分析可能である
、５）短時間で測定が終了する、などの数多くの利点を
有し、医療や食品工業などの計測分野への応用が近年さ
かんに検討されている。Enzyme electrodes that use immobilized enzymes have the following advantages: 1) Expensive enzymes can be used repeatedly, 2) Samples can be analyzed without pretreatment, and 3.
) It has many advantages such as easy operation, 4) analysis is possible with a small amount of sample, and 5) measurement can be completed in a short time, and in recent years it has been applied to measurement fields such as medicine and food industry. It is being actively considered.

例えば、発酵工業では発酵プロセスの管理指標としてア
ルコール濃度の測定が重要視されている。For example, in the fermentation industry, measurement of alcohol concentration is considered important as a control index for the fermentation process.

しかし、アルコール濃度の測定は、国税庁所定分析法に
示されているように、蒸留などの操作を伴い、操作が繁
雑で時間を要するために、アルコールの迅速かつ簡便な
測定法が要望されている。However, the measurement of alcohol concentration requires operations such as distillation, which is complicated and time-consuming, as indicated in the National Tax Agency's prescribed analysis method, so there is a need for a quick and simple method for measuring alcohol. .

アルコールを容易に測定する方法の一つとして、酵素電
極法が考えられる。即ち、次式のように、エタノールを
アルコールオキシダーゼで酸化し、この反応で生成する
過酸化水素または消費される酸素の量を測定することに
よりエタノールを定量することが可能となる。Enzyme electrode method can be considered as one method for easily measuring alcohol. That is, as shown in the following equation, ethanol can be quantified by oxidizing ethanol with alcohol oxidase and measuring the amount of hydrogen peroxide produced or oxygen consumed in this reaction.

ＣＨ３０Ｈ２０Ｈ＋０２７′賢にで？竺と！ＳゼＣＨ３
ＣＨＯ＋Ｈ２Ｏ２アルコールオキシダーゼの固定化法と
しては、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ　−Ｎａｎｊｏ　（Ａｎａ
ｌ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　７５　。CH30H20H+027′ Kenni de? With silk! Sze CH3
As a method for immobilizing CHO+H2O2 alcohol oxidase, Guilbault-Nanjo (Ana
l, Chim, Acta 75.

１６９−１８０　、１９７５　）による方法がある。こ
の方法は、牛血清アルブミンとアルコールオキシダーゼ
の混合溶液にグルタルアルデヒドを加え、牛血清アルブ
ミンとアルコールオキソダーゼとグルタルアルデヒドと
を互に架橋反応させてスポンジ状の固定化酵素膜とする
ものである。しかしながら、この固定化酵素膜は、過酸
化水素電極による酵素電極構成においては、酵素活性が
低く、エタノールに対する出力が低いこと、迅速な測定
に要求される応答時間や洗浄時間の短いものが得にくい
こと、さらに酵素活性の安定性の良いものが得にくいこ
と、などの実用上の問題を有していた。169-180, 1975). In this method, glutaraldehyde is added to a mixed solution of bovine serum albumin and alcohol oxidase, and the bovine serum albumin, alcohol oxidase, and glutaraldehyde are crosslinked with each other to form a sponge-like immobilized enzyme membrane. However, in an enzyme electrode configuration using a hydrogen peroxide electrode, this immobilized enzyme membrane has low enzyme activity and low output for ethanol, and it is difficult to obtain a short response time and cleaning time required for rapid measurement. In addition, there were practical problems such as difficulty in obtaining enzymes with good stability of enzyme activity.

〔発明の目的〕[Purpose of the invention]

本発明は、上記のような欠点をなくした、酵素電極への
用途を主とする、操作が簡単でしかも安定ナアルコール
オキシダーゼの固定化法を提供することを目的とする。An object of the present invention is to provide an easy-to-operate and stable method for immobilizing alcohol oxidase, mainly for use in enzyme electrodes, which eliminates the above-mentioned drawbacks.

〔発明の要点〕[Key points of the invention]

前述の目的を達成するため、本発明は、アルコールオキ
７ダーゼの固定化に用いる酵素溶液中にポリエチレンイ
ミンを１〜７％（Ｖ、４）　、好ｔ　Ｌ　＜は４〜６％
（ｖＡ　）　、グルタルアルデヒドを１〜′３％（ＶＡ
）の濃度範囲で含有させることにより、安定にアルコー
ルオキ／ダーゼを固定化できるようにしたことを特徴と
する。In order to achieve the above object, the present invention provides polyethyleneimine in an amount of 1 to 7% (V, 4), preferably t L < 4 to 6%, in an enzyme solution used for immobilization of alcohol oxidase.
(vA), glutaraldehyde from 1 to 3% (VA
) is characterized by being able to stably immobilize alcohol oxidase/dase.

〔発明の実施例〕[Embodiments of the invention]

固定化に用いるアルコールオキシダーゼを溶解する緩衝
液のｐＨは７．０〜７．５が最適である。The optimum pH of the buffer solution used for immobilization to dissolve alcohol oxidase is 7.0 to 7.5.

ｐＨが６．０より低いとポリエチレンイミンとグルタル
アルデヒドとの反応が急激に進行しく１分以内）、ポリ
エチレンイミンの部分的沈殿を生じ、酵素溶液が不均一
になる。また、ｐＨが８．０よりも高いとグルタルアル
デヒドとポリエチレンイミンとの反応速度の極端々低下
や７ソフ塩基のアルカリ側での解離反応が起り、反応条
件として不適当である。If the pH is lower than 6.0, the reaction between polyethyleneimine and glutaraldehyde will proceed rapidly (within 1 minute), resulting in partial precipitation of polyethyleneimine, making the enzyme solution non-uniform. On the other hand, if the pH is higher than 8.0, the reaction rate between glutaraldehyde and polyethyleneimine will be extremely reduced and a dissociation reaction of the 7 soft base will occur on the alkali side, making it inappropriate as a reaction condition.

また、ポリエチレン濃度およびグルタルアルデヒド濃度
と固定化酵素からの電極の安定特性との関係は下記の表
−１のようになる。Further, the relationship between the polyethylene concentration and glutaraldehyde concentration and the stability characteristics of the electrode from the immobilized enzyme is shown in Table 1 below.

表−１ Ｈ１ノち、ポリエチレンイミン護度は１〜７Ｘ（Ｖ／Ｇ
）でも可能であるが、４〜６％（ｎ）が最適である。Table-1 H1, polyethyleneimine protection degree is 1 to 7X (V/G
) is also possible, but 4 to 6% (n) is optimal.

また、グルタルアルデヒド濃度は１〜３％（ＶＡ　）の
濃度範囲が適当である３、 実施例１ ５０％（ｖ／Ｖ）ポリエチレンイミン（分子量３〜４万
）水溶液をＩ）Ｈ７，３の０．Ｂ、ｉりん酸緩衝液にて
希釈し、５％（”Ｈ）ポリエチレンイミン溶液を調製す
る。この溶液０．６ｍｌにアルコールオキシダーゼＣイ
ーリンガ−・マンハイム社製）４０ｍグを溶解させる。In addition, the appropriate concentration range of glutaraldehyde is 1 to 3% (VA). ．． B, i Dilute with phosphate buffer to prepare a 5% ("H) polyethyleneimine solution. 40 mg of alcohol oxidase C (manufactured by Ehlinger Mannheim) is dissolved in 0.6 ml of this solution.

これに１５％（ｖ／ｖ　）グルタルアルデヒド水溶液０
．１ｍｌを加え、混合攪拌し、０−０．５℃で２時間放
置した後、室温下（１５〜２５℃）で、固定化酵素層の
厚さが２〜５μｍになるように成膜、成形し、固定化酵
素膜とした。To this, 15% (v/v) glutaraldehyde aqueous solution 0
．． Add 1 ml, mix and stir, leave at 0-0.5°C for 2 hours, and then form and mold the immobilized enzyme layer at room temperature (15-25°C) to a thickness of 2-5 μm. This was used as an immobilized enzyme membrane.

実施例１で得られた固定化アルコールオキシダーゼ膜を
クラーク型過酸化水素電極に装着して酵素電極とし、１
％（ｎ）エタノール溶液に対する出力の経時変化をめた
。その結果を第１図に示す。固定化アルコールオキ／ダ
ーゼ膜の酵素活性はｉ、０００時間以上にわたって安定
であることが示された。The immobilized alcohol oxidase membrane obtained in Example 1 was attached to a Clark type hydrogen peroxide electrode to form an enzyme electrode.
%(n) ethanol solution was measured over time. The results are shown in FIG. The enzymatic activity of immobilized alcohol oxidase membranes was shown to be stable for over i,000 hours.

次に、上記の固定化アルコールオキシダーゼ膜のポーラ
ログラムをめ、これを第２図に示す。Next, a polarogram of the above immobilized alcohol oxidase membrane was drawn and is shown in FIG.

第２図から、応答に要する時間は；３０秒以内であり、
したがってこの固定化酵素電極によればエタノールの定
置が迅速にできることがわかる。From Figure 2, the time required for response is within 30 seconds,
Therefore, it can be seen that ethanol can be quickly immobilized using this immobilized enzyme electrode.

実施例２ ポリエチレンイミン濃度を変えたことを除いて、実施例
と同様の操作を行って固定化アルコールオキシダーゼ膜
を製造した。Example 2 An immobilized alcohol oxidase membrane was produced in the same manner as in Example except that the polyethyleneimine concentration was changed.

用いたポリエチレンイミン濃度は１％及び６％である。The polyethyleneimine concentrations used were 1% and 6%.

製造された固定化酵素膜を実施例１におけるように酵素
電極として１％（ｖ／ｙ　）アルコール溶液に対する出
力の経時変化をめた。The produced immobilized enzyme membrane was used as an enzyme electrode as in Example 1, and the change in output with respect to a 1% (v/y) alcohol solution was measured over time.

その結果を第３図に示す。曲線１はポリエチレンイミン
濃度１％のもの、曲線２は濃度６％のものを示す。ポリ
エチレンイミン濃度１％の固定化酵素膜も５０時以内で
あれば使用できることがわかる。The results are shown in FIG. Curve 1 shows the polyethyleneimine concentration of 1%, and curve 2 shows the polyethyleneimine concentration of 6%. It can be seen that an immobilized enzyme membrane with a polyethyleneimine concentration of 1% can also be used for up to 50 hours.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

以上の実施例から明らかなように、本発明によれば、ポ
リエチレンイミンによジアルコールオキ７ダーゼを安定
に固定化でき、したがって性能の良好な、即ち長時間に
わたって使用できかつ応答時間の短いアルコール分析用
酵素電極の製作が可能となる。As is clear from the above examples, according to the present invention, dialcohol oxidase can be stably immobilized with polyethyleneimine, and therefore alcohol has good performance, that is, can be used for a long time and has a short response time. It becomes possible to manufacture enzyme electrodes for analysis.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は、実施例１で得た固定化酵素電極の経時安定性
を示すグラフである。 第２図は、実施例１で得た固定化酵素電極のポーラログ
ラムである。 第３図は、実施例２で得た固定化酵素膜の経時安定性を
示すグラフである。 特許出願人　株式会社富士電機総合研究所軽底吟聞、Ｈ ２介 蒔眉、会FIG. 1 is a graph showing the stability over time of the immobilized enzyme electrode obtained in Example 1. FIG. 2 is a polarogram of the immobilized enzyme electrode obtained in Example 1. FIG. 3 is a graph showing the stability over time of the immobilized enzyme membrane obtained in Example 2. Patent applicant: Fuji Electric Research Institute Co., Ltd.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １）アルコールオキシダーゼをポリエチレンイミンとグ
ルタルアルデヒドにより架橋固定化するにあたり、固定
化に用いる酵素溶液がｐＨ６〜８の緩衝液であシ、その
溶液中に１〜７％（Ｖ／Ｇ　′）の濃度のポリエチレン
イミンおよび１〜３％（ｎ）の濃度のグルタルアルデヒ
ドを含有させて互に架橋固定化することを特徴とするア
ルコールオキシダーゼの固定化法。 ２、特許請求の範囲第１項記載のアルコールオキシダー
ゼの固定化法において、酵素溶液がｐＨ７，０〜７．５
　であり、ポリエチレンイミン濃度が４〜６％（ＶＡ　
）であり、グルタルアルデヒド濃度が１〜３％（Ｖいで
あることを特徴とする固定化法。[Scope of Claims] 1) When alcohol oxidase is crosslinked and immobilized with polyethyleneimine and glutaraldehyde, the enzyme solution used for immobilization is a buffer solution with a pH of 6 to 8, and 1 to 7% (V 1. A method for immobilizing alcohol oxidase, which comprises crosslinking and immobilizing each other by containing polyethyleneimine at a concentration of /G') and glutaraldehyde at a concentration of 1 to 3% (n). 2. In the alcohol oxidase immobilization method described in claim 1, the enzyme solution has a pH of 7.0 to 7.5.
and the polyethyleneimine concentration is 4-6% (VA
) and a glutaraldehyde concentration of 1 to 3% (V).