JPS60174725A - Substrate containing regenerated collagen fibril and its preparation - Google Patents
Substrate containing regenerated collagen fibril and its preparationInfo
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- JPS60174725A JPS60174725A JP59031829A JP3182984A JPS60174725A JP S60174725 A JPS60174725 A JP S60174725A JP 59031829 A JP59031829 A JP 59031829A JP 3182984 A JP3182984 A JP 3182984A JP S60174725 A JPS60174725 A JP S60174725A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、再生コラーゲンフィブリルを含有する基質に
関し、詳細には、細胞培養用基質又は血小板の粘着能測
定用担体として有用な前記基質化間するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a substrate containing regenerated collagen fibrils, and in particular to a substrate useful as a substrate for cell culture or a carrier for measuring the adhesion ability of platelets.
動物細胞を大量に培養し、細胞の生産する有用な物質を
大量に分離して利用するための技術は、生物工学の一分
野として注目を浴びている。また、人工臓器の学問領域
でも動物細胞を組み込んだ型の人工臓器の研究が盛んに
なりつつある。これら何れの場合にも、生体から取り出
した細胞を培養することによって、細胞を生理活性を保
持させたまま大量に増殖させることが最も重要となる。Techniques for culturing large quantities of animal cells and separating and utilizing large amounts of useful substances produced by the cells are attracting attention as a field of bioengineering. Furthermore, in the academic field of artificial organs, research into artificial organs that incorporate animal cells is becoming more popular. In any of these cases, it is most important to grow cells in large quantities while retaining their physiological activity by culturing cells taken out from the living body.
コラーゲンは生体中では各臓器及び組織を構成する細胞
の支持物質即ち基質として重要な役割を果している。従
って、現存する物質のうちでは最もすぐれた細胞培養の
基質であるということができる。一般に動物細胞は基質
に粘着して成長増殖するので、有効な基質の存在が細胞
の活性維持ζこは不可欠である。Collagen plays an important role in living organisms as a supporting substance, ie, a matrix, for cells that constitute various organs and tissues. Therefore, it can be said that it is the best substrate for cell culture among the existing substances. Since animal cells generally grow and proliferate by adhering to a substrate, the presence of an effective substrate is essential for maintaining cell activity.
動物細胞を大量に培養増殖させる場合、巨大な基質表面
が必要となるため、基質の形状は平板状であるよりは微
粒子状である方が著しく有利である。そこで、近年、例
えば架橋デキストランを用いたビーズ状微粒子担体が大
量の細胞を培養するビーズ基質として開発され、市販さ
れている（ファルマシア・ジャパン株式会社、カタログ
Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｂｅａｄｅｄ Ｍｉｅｒｏｅａｒｒ
ｌｅｒ ｆｏｒ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅ参照）０前
記の通り生体内で各種細胞の基質の役割を果しているコ
ラーゲンは、これまでも細胞培養の基質として利用され
てきた。しかしながら、従来、コラーゲンはガラスやプ
ラスチックの各種製品の表面に塗布された状態で基質と
して用いられるか、コラーゲン酸性液を生理条件に中和
して得られるコラーゲンゲルの状態で、このゲルの表面
又は内部において細胞を培養するという方法で用いられ
てきたに過ぎない。本発明者らは、コラーゲン基質をビ
ーズ状に形成して細胞が粘着する基質表面を従来の基＊
ｊこ比べて著しく大きくすれば、細胞の大量培養が容易
に行なわれるよう番どなることに着目して鋭意研究の結
果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によって
、不規則にからみ合った太さ１０〜ｘ、ｏｏｏｍμの再
生コラーゲンフィブリルと、前記再生コラーゲンフィブ
リルの間に存在する水溶液とからビーズ形状に構成され
、前記再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．
０１重量％であることを特徴とする再生コラーゲンフィ
ブリルを含有する基質（以下、これをコラーゲンビーズ
たいう）が提供される。When culturing and proliferating animal cells in large quantities, a huge substrate surface is required, so it is significantly advantageous for the substrate to be in the form of fine particles rather than in the form of a flat plate. Therefore, in recent years, bead-like microparticle carriers using, for example, cross-linked dextran have been developed as bead substrates for culturing large amounts of cells and are commercially available (Pharmacia Japan Co., Ltd., catalog Cytodex1, Beaded Mieroearr).
Collagen, which plays the role of a substrate for various cells in living organisms as described above, has been used as a substrate for cell culture. However, conventionally, collagen has been used as a substrate by being applied to the surface of various products such as glass or plastic, or in the form of a collagen gel obtained by neutralizing collagen acidic solution to physiological conditions. It has only been used to cultivate cells internally. The present inventors formed a collagen matrix in the form of beads to replace the surface of the matrix to which cells adhere, compared to the conventional base*.
The present invention has been completed as a result of extensive research, focusing on the fact that if the cell size is made significantly larger than this, it will be possible to easily perform mass culture of cells. That is, according to the present invention, the regenerated collagen fibrils having a thickness of 10 to 000 μm are irregularly intertwined, and the aqueous solution existing between the regenerated collagen fibrils are formed into a bead shape, and the content of the regenerated collagen fibrils is is 20-0.
Provided is a matrix containing regenerated collagen fibrils (hereinafter referred to as collagen beads) characterized in that the amount is 0.1% by weight.
前記コラーゲンビーズは、本発明の方法に従って、中性
のコラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶媒中にθ℃
〜２５℃の温度で多数の小滴として分散させて乳濁液を
形成し、前記乳濁液の温度を３０℃〜４０℃１こ上昇さ
せて前記小滴を固化させることによって得ることができ
る。The collagen beads are prepared by heating a neutral collagen aqueous solution in a water-immiscible organic solvent at θ°C according to the method of the present invention.
It can be obtained by dispersing as a number of droplets at a temperature of ~25°C to form an emulsion and increasing the temperature of said emulsion by 30°C to 40°C to solidify said droplets. .
本発明のコラーゲンビーズは太さ１０〜１ 、０００ｍ
μの再生コラーゲンフィブリルを２０〜０．０１重量％
含有し、この再生コラーゲンフィブリルは不規則にから
み合っていることが走査型電子顕微鏡によって確められ
る。この再生コラーゲンフィブリルの間には水溶液が存
在し、この水溶液は、他の、水と混和しうる液体と置換
可能である。例えば、生理食塩水が再生コラーゲンフィ
ブリルの間に存在するコラーゲンビーズの場合、このコ
ラーゲンビーズを細胞培養用の水性培地に浸漬すると、
前記生理食塩水はこの水性培地化よって置換される。The collagen beads of the present invention have a thickness of 10 to 1,000 m.
20-0.01% by weight of μ regenerated collagen fibrils
It was confirmed by scanning electron microscopy that the regenerated collagen fibrils were irregularly intertwined. An aqueous solution is present between the regenerated collagen fibrils, and this aqueous solution can be replaced with other water-miscible liquids. For example, in the case of collagen beads where saline is present between the regenerated collagen fibrils, when the collagen beads are immersed in an aqueous medium for cell culture,
The saline solution is replaced by this aqueous medium.
本発明において用いられるコラーゲンは、若い動物のコ
ラーゲン組織を、中性塩水溶液及び希酸水溶液でそれぞ
れ抽出して得られる中性塩可溶性；ラーゲン及び酸可溶
性コラーゲンであってよい。The collagen used in the present invention may be neutral salt-soluble collagen and acid-soluble collagen obtained by extracting collagen tissue of a young animal with a neutral salt aqueous solution and a dilute acid aqueous solution, respectively.
又、これらの抽出操作では可溶性を示さない不溶性コラ
ーゲンをペプシンのようなタンパク質加水分解酵素で処
理して可溶性とした酵素溶解コラーゲン（アテロコラー
ゲン）や、同じく不溶性コラーゲンをアルカリ処理によ
り可溶化したコラーゲンを本発明で用いられるコラーゲ
ンとすることができる。ここで、アテロコラーゲン（Ａ
ｔｅｌｏｅｏｌｌｍｇｏｎ）とは、テロ７チドのとれた
コラーゲンに対して比較的最近つけられた名称である。In addition, in these extraction procedures, insoluble collagen that is not soluble is treated with a proteolytic enzyme such as pepsin to make it soluble, and enzyme-dissolved collagen (atelocollagen) is produced.Also, insoluble collagen is solubilized by alkaline treatment. It can be collagen used in the invention. Here, atelocollagen (A
teloeolmgon) is a relatively recent name given to collagen from which teloe7tide has been removed.
前記の不溶性コラーゲンは、分子末端に存在するテロペ
プチドを介し形成″されている分子間架橋によって不溶
性となっている。タンパク質加水分解酵素であるペプシ
ンを不溶性コラーゲンに作用させるとテロペプチドのみ
が消化されて分子間架橋が切断されるので、この不溶性
コラーゲンは可溶化されてアテロコラーゲンが得られる
。アテロコラーゲンは又、希酸や中性塩の水溶液で抽出
された可溶性コラーゲンをペプシン処理しても得られる
。The above-mentioned insoluble collagen is made insoluble due to intermolecular crosslinks formed through telopeptides present at the ends of the molecules. When pepsin, a protein hydrolase, acts on insoluble collagen, only the telopeptides are digested. This insoluble collagen is solubilized and atelocollagen is obtained. Atelocollagen can also be obtained by treating soluble collagen extracted with an aqueous solution of dilute acid or neutral salt with pepsin.
本発明の方法に使用される中性のコラーゲン溶液は、酸
可溶性コラーゲン又はアテロコラーゲンを、例えば重量
浸透圧濃度２００〜４００ ｍ０ｇｍ ／ １でかつｐ
Ｈ６，０〜８．０の緩衝溶液に０３〜２５℃で溶解させ
ることによって調製することができる。The neutral collagen solution used in the method of the invention contains acid-soluble collagen or atelocollagen, for example at an osmolality of 200-400 m0gm/1 and p
It can be prepared by dissolving it in a buffer solution of H6,0-8.0 at 03-25°C.
前記緩衝溶液としてはリン酸塩緩衝溶液が好ましく使用
される。As the buffer solution, a phosphate buffer solution is preferably used.
本発明の方法化使用される、水と混和しない有機溶媒と
して、トルエン、四塩化炭素、クロロホルム、シフ四ヘ
キサン、エーテル、石油エーテル、ペンゾールなどが挙
げられる。これらの有機溶媒を適当に混合して、その比
重を、分散させようとするコラーゲン水溶液の比重にで
きる限り近づけて、コラーゲン水溶液が浮き上ったり、
沈降したりするのを防ぐことが、コラーゲン水溶液を小
滴化分散させるの化好ましい。コラーゲン水溶液を小滴
に分散させて乳濁液を形成するには、水と混を
和しない有機溶媒暑こコラーゲン水溶液〕℃〜２５℃で
加え、攪拌又は振盪するなど、慣用の乳濁液調製法を用
いることができる。分散される小滴の大きさの調節は、
攪拌又は振盪の程度を加減することによって行なうこと
ができる。コラーゲン水溶液の使用量は有機溶媒と等量
又はそれより少ないことが望ましい。コラーゲン水溶液
の濃度はコラーゲン５−以下が望ましく、５チを超すと
粘稠になり過ぎて分散が困難となる。又、形成された乳
濁液の安定性をよくするために、界面活性剤を少量添加
することが好ましい。使用される界面活性剤は非イオン
界面活性剤が好ましく、例えばソルビタン脂肪酸エステ
ルについての米国アトラス・パウダー社の登録商標であ
るスパン（Ｓｐａｎ） 系のもの及びポリオキシエチレ
ンソルビタンの脂肪酸エステルについてのアトラス・パ
ウダー社の登録商標であるトウィーン（Ｔｗｅ ｅ ｎ
）系のものが挙げられる。界面活性剤の使用量は、有機
溶媒とコラーゲン溶液との混合物の重量を基準にしてｏ
、ｉ １以下が好ましい。Examples of water-immiscible organic solvents used in the method of the present invention include toluene, carbon tetrachloride, chloroform, Schiff-tetrahexane, ether, petroleum ether, penzole, and the like. By mixing these organic solvents appropriately and making the specific gravity as close as possible to the specific gravity of the collagen aqueous solution to be dispersed, the collagen aqueous solution will float,
It is preferable to prevent the collagen aqueous solution from settling into small droplets. To form an emulsion by dispersing the collagen aqueous solution into small droplets, use conventional emulsion preparation methods such as adding an immiscible organic solvent to the collagen aqueous solution at ~25°C and stirring or shaking. The law can be used. Adjustment of the size of the dispersed droplets is
This can be done by adjusting the degree of stirring or shaking. It is desirable that the amount of the aqueous collagen solution used is equal to or less than the amount of the organic solvent. The concentration of the aqueous collagen solution is desirably 5 or less collagen, and if it exceeds 5, it becomes too viscous and difficult to disperse. It is also preferred to add a small amount of surfactant to improve the stability of the emulsion formed. The surfactants used are preferably nonionic surfactants, such as Span series, a registered trademark of Atlas Powder Co., USA for sorbitan fatty acid esters and Atlas Powder series for fatty acid esters of polyoxyethylene sorbitan. Tween is a registered trademark of Powder Company.
) series. The amount of surfactant used is o based on the weight of the mixture of organic solvent and collagen solution.
, i is preferably 1 or less.
乳濁液中の中性のコラーゲン水溶液の小滴を固化させる
ため匿、乳濁液の温度を３０℃〜４０℃に上昇させると
、コラーゲン水溶液は凝集してコラーゲンフィブリルを
形成し、こうしてコラーゲンビーズを得ることができる
。To solidify the droplets of neutral collagen aqueous solution in the emulsion, when the temperature of the emulsion is increased to 30°C to 40°C, the collagen aqueous solution aggregates to form collagen fibrils, thus forming collagen beads. can be obtained.
固化したコラーゲンビーズ中のコラーゲンをヘキサメチ
レンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）又はゲルタールア
ルデヒドで架橋させると、コラーゲンビーズの熱耐変性
番と対する安定性が向上し、また貯蔵安定性が良好とな
って、凝集を起こすことがないので好ましい。Cross-linking collagen in solidified collagen beads with hexamethylene diisocyanate (HMDIC) or gel tar aldehyde improves the stability of collagen beads against heat denaturation, improves storage stability, and prevents aggregation. This is preferable because it does not cause any problems.
コラーゲン水溶液の小滴を固化させる際、用いる容器に
予めシリコーンオイルなどを塗布しておくと、固化した
コラーゲンビーズが容器壁に粘着するのを防ぐことがで
きるので好都合である。When solidifying small droplets of an aqueous collagen solution, it is advantageous to apply silicone oil or the like to the container in advance to prevent the solidified collagen beads from sticking to the wall of the container.
固化したコラーゲンビーズは遠心分離又は網でろ別分離
され、メタノール、エタノール、アセトンなどの、水と
混和する有機溶媒で繰り返し洗浄され、次に水でさらに
繰り返し洗浄される。The solidified collagen beads are centrifuged or screened, washed repeatedly with a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, and then repeatedly washed with water.
こうして得られたコラーゲンビーズはその粒度が多少不
揃いなので、ふるい分けにより各メツシュ範囲の両分、
例えば４８メツシユふるい上、４８〜１００メツシュ画
分、１００〜２００メツシユ画分及び２００メツシユふ
るい下のように粒度を揃えることができる。The collagen beads obtained in this way have somewhat irregular particle sizes, so they are sieved to separate both sides of each mesh range.
For example, the particle size can be made uniform, such as on a 48 mesh sieve, in a 48-100 mesh fraction, in a 100-200 mesh fraction, and under a 200 mesh sieve.
本発明のコラーゲンビーズは、前記の逼り不規則にから
み合った再生コラーゲンフィブリルを含み、培養液中に
懸濁した状態で細胞培養の基質として用いると、細胞粘
着に有効な基質表面を太きくすることができ、細胞の大
量培養を容易にする。The collagen beads of the present invention contain the above-mentioned tightly and irregularly intertwined regenerated collagen fibrils, and when used as a substrate for cell culture while suspended in a culture medium, they thicken the surface of the substrate, which is effective for cell adhesion. can facilitate large-scale culture of cells.
コラーゲン水溶液として例えば濃度１９ｇの溶液を使用
した場合、水洗後に最終的に得られるコラーゲンビーズ
のコラーゲン含量は約１ｔｓであり、残り９９チが主と
して水である。従って、このビーズが培ｖ液中で平衡化
すると、ビーズ中の水の大部分は培！液で置換され、ビ
ーズの比重は培養液の比重と殆んど一致するようになり
、培養中もゆるやかな攪拌によってビーズはゆっくり移
動し、ビーズに粘着した細胞を損傷することがない。For example, when a collagen aqueous solution having a concentration of 19 g is used, the collagen content of the collagen beads finally obtained after washing with water is about 1 ts, and the remaining 99 ts is mainly water. Therefore, when these beads are equilibrated in the culture medium, most of the water in the beads is absorbed into the medium! The specific gravity of the beads almost matches that of the culture solution, and during culture, the beads move slowly due to gentle agitation without damaging the cells that adhere to the beads.
本発明のコラーゲンビーズはまた血小板の粘着能測定に
も利用することができる。血小板はコラーゲンフィブリ
ルに粘着し、さらに凝集反応を起こすことが知られてい
る。従って、本発明のコラーゲンビーズをカラムに充て
んし、このカラムに、血小板を含む試料溶液（血液；ク
エン酸ナトリウム、ＥＤＴＡなど血液凝固阻止剤を添加
した血液；又は多血小板血漿など）を通し、カラム内の
コラーゲンビーズに粘着する血小板数を数えることによ
って血小板粘着能を測定することができる。この粘着能
測定値から血液の凝固活性を知ることができ、血液が関
係する病気例えば血栓症の診断の１つとして利用するこ
とができるのである。The collagen beads of the present invention can also be used to measure the adhesion ability of platelets. It is known that platelets adhere to collagen fibrils and further cause an aggregation reaction. Therefore, a column is filled with the collagen beads of the present invention, and a sample solution containing platelets (blood; blood to which a blood coagulation inhibitor such as sodium citrate or EDTA has been added; or platelet-rich plasma, etc.) is passed through the column. Platelet adhesion ability can be measured by counting the number of platelets that adhere to the collagen beads within. The coagulation activity of the blood can be determined from this adhesion measurement value, which can be used as one of the diagnostic methods for blood-related diseases such as thrombosis.
本発明のコラーゲンビーズの製造を無菌条件下で行なう
と無菌のビーズを得るこきができるが、無菌条件下で製
造されなかったコラーゲンビーズは、密封容器に入れ、
γ線を好ましくは０，５〜１．５Ｍｒａｄ 照射するこ
とによって無菌とすることができる。If the collagen beads of the present invention are produced under aseptic conditions, sterile beads can be obtained. However, collagen beads that were not produced under aseptic conditions should be placed in a sealed container.
Sterilization can be achieved by irradiating with gamma rays, preferably 0.5 to 1.5 Mrad.
次に本発明を実施例について詳細に説明する。。Next, the present invention will be described in detail with reference to examples. .
実施例１
取り出した新鮮な修生の真皮をステファン（５ｔｏｐＨ
ａｎ）社製のミクロカッターで微細に粉砕し、この微細
粉を０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液でくり返し洗浄後、
水洗した。次に、水洗後の微細粉を０．５Ｍ酢酸水溶液
を用いて抽出処理を行ない、残渣である不溶性コラーゲ
ンをガラスフィルターでろ別した。Example 1 The freshly repaired dermis taken out was treated with Stephan (5 top pH).
After finely pulverizing the powder using a micro cutter manufactured by An) and washing the fine powder repeatedly with a 0.1M sodium acetate aqueous solution,
Washed with water. Next, the fine powder after washing with water was subjected to extraction treatment using a 0.5M acetic acid aqueous solution, and the residual insoluble collagen was filtered out using a glass filter.
この不溶性コラーゲンを湿潤状態で１００７採取し、こ
れに０．５Ｍ酢酸１１を加え、さらにペプシン０．１１
を加えて、２０℃で３日間攪拌を行なった。この処理化
よって不溶性コラーゲンは溶解して粘稠なペプシン可溶
化コラーゲン（即ちアテロ；ラーゲン）溶液となった。This insoluble collagen was collected in a wet state, 0.5M acetic acid 11 was added thereto, and pepsin 0.11
was added and stirred at 20°C for 3 days. This treatment dissolved the insoluble collagen to form a viscous pepsin-solubilized collagen (ie, atelo; lagen) solution.
このアテロコラーゲン溶液をガラスフィルターでろ通抜
、ろ液に苛性ソーダ水溶液を加えてｐＨ７，５に調節し
たところ、繊維状の沈殿が生成した。この沈殿を遠心分
離機１こよって分離した後、蒸留水で３回洗浄を行ない
、アテロコラーゲンを得た。When this atelocollagen solution was filtered through a glass filter and the filtrate was adjusted to pH 7.5 by adding an aqueous solution of caustic soda, a fibrous precipitate was formed. This precipitate was separated using a centrifuge 1 and washed three times with distilled water to obtain atelocollagen.
このアテロコラーゲンを０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７，３）に１０℃で溶解し、コラーゲン濃度１％の中性
のアテロコラーゲン溶液を調製した。This atelocollagen was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH
7,3) at 10°C to prepare a neutral atelocollagen solution with a collagen concentration of 1%.
一方、容器ニトルエン４００ ｍ／とクロロホルム１１
０ｍ／を入れて混合溶媒を調製した。この混合溶媒の比
重は前記コラーゲン溶液の比重とほぼ等しかった。この
混合溶媒にスパン２０（スパン（Ｓｐａｎ） はソルビ
タンモノラウリン酸エステル系非イオン界面活性剤につ
いてのアトラス・バラタ−社の登録商標）を混合溶媒の
重量の０．１ ％になるよう薔こ加えた後、さらζこ前
記１チ濃度のコラーゲン水溶液１５０＊／を加え、この
混合物を１０℃で激しく攪拌して、コラーゲン水溶液の
小滴を含む乳濁液とした後、直ちに３７℃まで加温し、
この温度に２時間維持し、小滴を固化させて分散状態の
微粒子状アテロコラーゲンビーズを得た。このビーズの
分散液を２００メツシユのステンレス製金網でろ過して
ビーズをろ別した。得られたアテロコラーゲンビーズを
メタノールで洗浄してトルエン及びクロロホルムを除去
し、０．９４ ＮａＣＡ！水溶液中で平衡化させた後、
４８メツシユ、１００メツシユ及び２００メツシユの各
ステンレス製金網で順次ふるい分けを行って粒度分布を
測定し、次の結果を得た（チは重量％である）。Meanwhile, a container containing nitoluene 400 m/cm and chloroform 11
A mixed solvent was prepared by adding 0m/. The specific gravity of this mixed solvent was approximately equal to the specific gravity of the collagen solution. To this mixed solvent, Span 20 (Span is a registered trademark of Atlas Balater Co., Ltd. for sorbitan monolaurate ester nonionic surfactants) was added to make up 0.1% of the weight of the mixed solvent. After that, 150*/ of the collagen aqueous solution with a concentration of 1 was added to the mixture, and the mixture was vigorously stirred at 10°C to form an emulsion containing small droplets of the collagen aqueous solution, and immediately heated to 37°C. ,
This temperature was maintained for 2 hours to solidify the droplets and obtain dispersed microparticulate atelocollagen beads. This bead dispersion was filtered through a 200-mesh stainless steel wire mesh to remove the beads. The resulting atelocollagen beads were washed with methanol to remove toluene and chloroform, resulting in a concentration of 0.94 NaCA! After equilibration in aqueous solution,
Sieving was carried out sequentially using 48 mesh, 100 mesh and 200 mesh stainless wire meshes to measure the particle size distribution, and the following results were obtained (Chi is weight %).
４８メツシユふるい上 約２５チ
４８〜１００メツシユ画分 約６０％
１００〜２００メツシユ画分 約１２％２００メツシユ
ふるい下 約 ３チ
こうして得られたアテロコラーゲンビーズは走査型電子
顕微鏡観察の結果、再生コラーゲンフィブリルからなっ
ていることがわかった。Top of 48 mesh sieve: Approximately 25 pieces 48-100 mesh fraction: Approximately 60% 100-200 mesh fraction: Approx. 12% Below 200 mesh sieve: Approximately 3 pieces It was found that it consists of.
これらの各粒度のビーズを密封ガラス瓶に入札γ線を全
線量で１．０ Ｍｒａｄ 照射して滅菌を行なった。こ
のうち４８〜１００メツシュ画分の粒度のコラーゲンビ
ーズを用いてヒト真皮繊維芽細胞の培養試験を行なった
ところ、細胞は数時間でビーズ上に粘着し、５日間後に
はビーズの表面を完全に覆う程増殖し、このビーズは細
胞の基質としてすぐれたものであることがわかった。These beads of each particle size were sterilized in a sealed glass bottle by irradiation with bid gamma rays at a total dose of 1.0 Mrad. When we conducted a culture test on human dermal fibroblasts using collagen beads with a particle size of 48 to 100 mesh fractions, the cells adhered to the beads within a few hours and completely covered the surface of the beads after 5 days. The more the beads were covered, the more they proliferated, indicating that these beads are an excellent substrate for cells.
実施例２
前記実施例１と同様の手＋１＠で、分散状態の微粒子状
アテロコラーゲンビーズを調製し、２００メツシユのス
テンレス製金網でろ過してヒースヲロ別した彼、このビ
ーズを０．１ ％濃度のへキサメチレンジイソシアネー
トのメタノール溶液に浸漬し、室温で１時間処理してア
テロコラーゲンフィブリルを架橋させた。次いで、ビー
ズをろ別し、メタノールで洗浄後、０．９４ ＮａＣ１
水溶液で平衡化させ、実施例１と同様にふるい分けを行
って、次の結果を得た（％は重量％である）。Example 2 He prepared finely dispersed atelocollagen beads in the same manner as in Example 1, filtered them through a 200-mesh stainless steel wire mesh, and filtered them through a heath cloth. Atelocollagen fibrils were crosslinked by immersing them in a methanol solution of hexamethylene diisocyanate and treating at room temperature for 1 hour. Next, the beads were filtered, washed with methanol, and then diluted with 0.94 NaCl.
Equilibration with aqueous solution and sieving as in Example 1 gave the following results (% is by weight).
４Ｂメツシユふるい上 約２０チ
４８〜１００メツシユ画分 約５０９６１００〜２００
メツシユ画分 約２ｏチ２００メツシユふるい下 約１
ｏチ
この架橋された各両分のビーズにγ線を１．ＯＭ ｒａ
ｄ照射して滅菌を行った。4B mesh sieve top approx. 20 pieces 48-100 mesh fraction approx. 5096100-200
Mesh fraction approx. 200 mesh sieve bottom approx. 1
1. Gamma rays were applied to each of the cross-linked beads on both sides. OM ra
Sterilization was performed by d-irradiation.
こうして得られたコラーゲンビーズは走査型電子顕微鏡
観察の結果、再生コラーゲンフィブリルからなっている
ことがわかり、又、細胞培養試験の結果、すぐれた基質
であることがわかった。The collagen beads thus obtained were found to be composed of regenerated collagen fibrils as a result of observation using a scanning electron microscope, and as a result of a cell culture test, they were found to be an excellent substrate.
代理人 土星 勝 常包芳男 （自発）手続補正書 昭和５９年 ４月 ４日・ 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５９年特Ｗ１願第３１８２９ 号 東京都新宿区下落合３丁目５−１８ 株式会社高 研 ８、補正の自答 （１）、特許請求の範囲を別紙の通り補正する。Agent Saturn Masaru Yoshio Tsuneko (Voluntary) Procedural Amendment April 4, 1980 Commissioner of the Patent Office 1. Display of incident 1981 Special W1 Application No. 31829 3-5-18 Shimoai, Shinjuku-ku, Tokyo Takaken Co., Ltd. 8. Correct self-answer (1) The scope of claims is amended as shown in the attached sheet.
２、特許請求の範囲
１、 不規則にからみ合った太さ１０〜１，０００ｍμ
の再生コラーゲンフィブリルと、ＩＩ′ＩＪ記再生コラ
ーゲンフィブリルの間に存在する水溶液とからビーズ形
状に構成され、前記再生コラーゲンフィブリルの含治碕
が２０〜０．０１重肴チである再生コラーゲンフィブリ
ルを含有する基質。2. Claim 1: Irregularly intertwined thickness of 10 to 1,000 mμ
The regenerated collagen fibrils are formed into a bead shape from the regenerated collagen fibrils of and an aqueous solution existing between the regenerated collagen fibrils described in II'IJ, and the regenerated collagen fibrils have a curing size of 20 to 0.01 times. Substrate containing.
２、 中性のコラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶
媒中にＯＣ〜２５Ｃの渦埼で名数の小滴として分散させ
て乳濁液を老成し、前記乳濁液の温度を３０Ｕ〜４０ｔ
ｌ’に上昇させてｌｉ記小滴を固（１’させ、これｌ（
よって、再生コラーゲンフィブリルと、この再生コラー
ゲンフィブリルの間に存在する水溶液と力１らビーズ形
状に構〕ｊされた再生コラーゲンフィブリルを含有する
基質を製造する方法。2. Aged the emulsion by dispersing the neutral collagen aqueous solution in a water-immiscible organic solvent as small droplets at an OC~25C vortex, and the temperature of the emulsion was adjusted to 30U~40T.
1' to make the droplet harden (1', and this l(
Therefore, a method for producing a matrix containing regenerated collagen fibrils and bead-shaped regenerated collagen fibrils formed from an aqueous solution existing between the regenerated collagen fibrils.
３、前記小滴を固化させ、さらＩ（、ヘキサメチレンジ
イソシアネートとグルタルアルデヒドとからなる群から
選ばれた架橋剤によ−って処理する特許請求の範囲第２
墳記載の方法。3. The droplets are solidified and further treated with a crosslinking agent selected from the group consisting of hexamethylene diisocyanate and glutaraldehyde.
Method of describing burial mounds.
４、 再生コラーゲンフィブリルの含有ＩＴｔか２０〜
０．０１ＪＸ電チである特許請求の範囲第２ＪＡ記載の
方法。4. Regenerated collagen fibril content ITt~20~
The method according to claim 2 JA, which is 0.01 JX electric wire.
Claims (1)
の再生コラーゲンフィブリルと、前記再生コラーゲンフ
ィブリルの間に存在する水溶液とからルを含有する基質
。 ２、 中性のコラーゲン水溶液を水と混和しない有機溶
媒中に０℃〜２５℃の温度で多数の小滴として分散させ
て乳濁液を形成し、前記乳濁液の温度を３０℃〜４０℃
に上昇させて前記小滴を固化させ、これによって、再生
コラーゲンフィブリルと、この再生コラーゲンフィブリ
ルの間に存在する水溶液とからビーズ形状に構成された
再生コラーゲンフィブリルを含有する基質を製造する方
法。 ６、前記小滴を固化させ、さらに、ヘキサメチレンジイ
ソシアネートとグルタルアルデヒドとからなる群から選
ばれた架橋剤によって処理する特許請求の範囲第２項記
載の方法。 ４、再生コラーゲンフィブリルの含有量が２０〜０．０
１重量％である特許請求の範囲第２項記載の方法。[Claims] 1. Irregularly intertwined thickness of 10-1,000 μm
and an aqueous solution present between the regenerated collagen fibrils. 2. Form an emulsion by dispersing a neutral collagen aqueous solution in a water-immiscible organic solvent as a large number of droplets at a temperature of 0°C to 25°C, and reduce the temperature of the emulsion to 30°C to 40°C. ℃
solidifying the droplets, thereby producing a matrix containing regenerated collagen fibrils arranged in bead shapes from the regenerated collagen fibrils and an aqueous solution present between the regenerated collagen fibrils. 6. The method of claim 2, wherein the droplets are solidified and further treated with a crosslinking agent selected from the group consisting of hexamethylene diisocyanate and glutaraldehyde. 4. Content of regenerated collagen fibrils is 20 to 0.0
2. The method of claim 2, wherein the amount is 1% by weight.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59031829A JPS60174725A (en) | 1984-02-22 | 1984-02-22 | Substrate containing regenerated collagen fibril and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59031829A JPS60174725A (en) | 1984-02-22 | 1984-02-22 | Substrate containing regenerated collagen fibril and its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60174725A true JPS60174725A (en) | 1985-09-09 |
Family
ID=12341957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59031829A Pending JPS60174725A (en) | 1984-02-22 | 1984-02-22 | Substrate containing regenerated collagen fibril and its preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60174725A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987004458A1 (en) * | 1986-01-25 | 1987-07-30 | Nitta Gelatin Inc. | Process for cultivating animal cells on a large scale |
| DE4038887C2 (en) * | 1990-12-06 | 1992-10-08 | Lts Lohmann Therapie-Systeme Gmbh & Co. Kg, 5450 Neuwied, De |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5547130A (en) * | 1978-09-28 | 1980-04-03 | Nippi:Kk | Manufacture of collagen bead |
| JPS5928472A (en) * | 1982-08-09 | 1984-02-15 | Koken:Kk | Substrate for cell culture, cultivation and separation of cell using it |
-
1984
- 1984-02-22 JP JP59031829A patent/JPS60174725A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5547130A (en) * | 1978-09-28 | 1980-04-03 | Nippi:Kk | Manufacture of collagen bead |
| JPS5928472A (en) * | 1982-08-09 | 1984-02-15 | Koken:Kk | Substrate for cell culture, cultivation and separation of cell using it |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987004458A1 (en) * | 1986-01-25 | 1987-07-30 | Nitta Gelatin Inc. | Process for cultivating animal cells on a large scale |
| DE4038887C2 (en) * | 1990-12-06 | 1992-10-08 | Lts Lohmann Therapie-Systeme Gmbh & Co. Kg, 5450 Neuwied, De |
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