JPS60160896A - Measuring method of activity of gamma-glutamyl- transpeptidase - Google Patents
Measuring method of activity of gamma-glutamyl- transpeptidaseInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、基質としてＬ−ｒ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリドを用いる、ｒ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性の測定方法に関するＯｒ−グルタミルトランスベ
プチターーゼ（以下、γ−ＧＴＰと略称する。）の酵素
活性の測定は、臨床的には肝胆道疾患の診断、アルコー
ル飲用者のスクリーニングなどに広く利用され、種々の
方法が発表されているが、Ｌ−γ−ｌルタミルーｐ−ニ
トロアニリドを基質とする反応速凝測定法が最も一般的
であり、現在も盛んに行なわれている。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for measuring r-glutamyl transpeptidase activity using L-r-glutamyl-p-nitroanilide as a substrate. Measurement of the enzyme activity of L-γ-l ruta protein is widely used clinically for diagnosis of hepatobiliary tract diseases, screening of alcohol drinkers, etc., and various methods have been published. -The reaction rate coagulation method using nitroanilide as a substrate is the most common and is still actively used.
しかしながら、基質のＬ−γ−グルタミルーｐ−ニトロ
アニリド（以下、本基質という。）は、基質安定化及び
酵素反応の至適ＰＨである中性付近（ｐＨ＝約８．３）
に於て極めて溶解性が悪く、そのため溶解度が比較的高
い低ＰＨ域で予め基質を充分に溶解し２ておき、使用時
、中性付近（ＰＨ＝約８．５）の緩衝液と混合して使用
する酸溶解法が一般的な使用方法である。However, the substrate L-γ-glutamyl-p-nitroanilide (hereinafter referred to as the present substrate) has a pH around neutrality (pH = approximately 8.3), which is the optimum pH for substrate stabilization and enzyme reaction.
Therefore, the substrate should be sufficiently dissolved in advance in a low pH range where solubility is relatively high, and then mixed with a buffer solution near neutrality (PH = about 8.5) before use. The acid dissolution method is commonly used.
このため、本基質は、溶解した強酸により加水分解をう
けて、ブランク値が徐々に上昇し、その製剤の有効期間
は調液後約５時間程度である。Therefore, the substrate is hydrolyzed by the dissolved strong acid, and the blank value gradually increases, and the shelf life of the preparation is about 5 hours after preparation.
そこで、本基質の溶解性の改善が種々試みられており、
次の（１）〜（３）の方法が夫々提案され、実用化され
て、いる。Therefore, various attempts have been made to improve the solubility of this substrate.
The following methods (1) to (3) have been proposed and put into practical use.
（１） カチオン系界面活性剤又はアニオン系界面活性
剤を添加して基質の水に対する溶解性を改善し、これら
イオン系界面活性剤の酵素反応阻害作用をノニオン系界
面活性剤で緩和する方法。(1) A method of improving the solubility of a substrate in water by adding a cationic surfactant or anionic surfactant, and alleviating the enzymatic reaction inhibition effect of these ionic surfactants with a nonionic surfactant.
（２）本基質の−Ｎ０２基の〇−位に−Ｃ０２Ｈ基、−
８ｏ３Ｈ基などの水溶性基を付与し、基質の水に対する
溶解性を改善する方法。(2) -C02H group at the -N02 group 〇-position of this substrate, -
A method of improving the solubility of a substrate in water by adding a water-soluble group such as an 8o3H group.
（３ン シクロデキストリンの包接力を利用して基質の
水に対する溶解性を改善する方法。(A method for improving the solubility of a substrate in water by utilizing the inclusion power of cyclodextrin.
しかしながら、これら従来の方法にも種々の欠点が存在
する。However, these conventional methods also have various drawbacks.
例えば、（１）の界面活性剤を用いる方法では、イオン
系界面活性剤の酵素阻害力が非常に強く、ノニオン系界
面活性剤を添加しても、その回復率は約７０〜８０％で
ある上、界面活性剤の添加によりヘモグロビンの吸収が
経時的に変化し、ｐ−ニトロアニリ／の生成速度を追跡
する４１０ｎｍでのヘモグロビンの吸収が経時的に減少
するため、結果的に、γ−ＧＴＰの酵素活性測定値に負
誤差を与え、（２）の水溶性基を付与する方法では、γ
−ＧＴＰの酵素活性測定値が高く測定されること及び基
質剤調液後数日で基質が変質し、γ−〇ＴＰの酵素活性
測定値の低下が観測され、場合によっては変質による沈
殿が析出する等の間１題を生じ、又、（３）のシフロブ
キストリ／の包接力を利用する方法では、ヘモクロビ／
の影響やγ−ＧＴＰの酵素活性測定値の変動の問題はな
いが、肝心の水に対する溶解性の改善が充分ではなく、
特に、シフロブキストリ／の基質包接化合物を凍結乾燥
する場合は、最終使用数濃度の製剤乃至はその二倍程庫
の龜縮液の製剤の調製が限界でらシ、これら（１）〜（
３）のいずれの方法も、到底、充分に改善された満足す
べき測定方法であるとはいえない現状にある０
かかる状況に於て、本発明者らは、本基質Ｌ−ｒ−グル
タミルーｐ−ニトロアニリドの水溶性を充分満足すべき
程度に改善する方法として、水溶性基で修飾されたシク
ロデキストリンの使用に着目した。For example, in the method (1) using a surfactant, the ionic surfactant has a very strong enzyme inhibiting power, and even if a nonionic surfactant is added, the recovery rate is about 70 to 80%. Above, the addition of a surfactant changes the absorption of hemoglobin over time, and the absorption of hemoglobin at 410 nm, which tracks the production rate of p-nitroanili/, decreases over time, resulting in the decrease of γ-GTP. In the method (2) of adding a water-soluble group by giving a negative error to the enzyme activity measurement value, γ
-GTP enzyme activity measurements are high, and the substrate deteriorates in a few days after preparing the substrate agent, and a decrease in γ-〇TP enzyme activity measurements is observed, and in some cases, precipitates are deposited due to the alteration. In addition, in the method (3) using the inclusion force of cyphrobacterium, hemoclobi
Although there are no problems with the effects of γ-GTP or fluctuations in the measured enzyme activity of γ-GTP, the important improvement in water solubility is not sufficient.
In particular, when freeze-drying substrate clathrates of Schiflobuchis trifolium, it is difficult to prepare a preparation at the final concentration of use or from a condensate solution that is about twice that concentration.
At present, none of the methods described in 3) can be said to be a sufficiently improved and satisfactory measurement method. In such a situation, the present inventors have determined that the present substrate L-r-glutamyl p - As a method for improving the water solubility of nitroanilide to a sufficiently satisfactory degree, we focused on the use of cyclodextrin modified with a water-soluble group.
シクロデキストリン（以下、ＣＤと略称する０）は、Ｄ
−グルコビラノースがα−１，４−グルコシド結合によ
シ環状に結合した環状オリゴ糖同族体であり、結合した
Ｄ−グルコビラノースが、６．７及び８個の、α−ＣＤ
、β−ＣＤ及びγ−ＣＤ、の三種のものがよく知られて
いる。Cyclodextrin (hereinafter abbreviated as CD) is D
- A cyclic oligosaccharide homolog in which glucobylanose is linked in a cycyclic manner through an α-1,4-glucosidic bond, and the linked D-glucobylanose has 6.7 and 8 α-CD
Three types are well known: , β-CD and γ-CD.
これら、一連のＣＤは、水溶液中で有機化合物と混合す
ると速やかに包接体を形成し、製剤の安定化、溶解性の
調節、液状薬品の粉末化、刺激性や悪臭などのマスク、
或いは揮発性の調節等に優れた効果を有する為に、これ
らの用途に広く利用され、その構造は、ＣＤ空洞の一端
の開口部にグルコビラノースの２−及び３−位の−ＯＨ
を有し、他端の開口部に６−位の−ＯＨを有する、疎水
性ＣＤ空洞を有する環状構造でおることが、そのＸ線解
析の結果などから推定されている。These series of CDs quickly form inclusion bodies when mixed with organic compounds in an aqueous solution, which can be used to stabilize formulations, adjust solubility, turn liquid drugs into powder, mask irritation and bad odors, etc.
Alternatively, it is widely used for these purposes because it has an excellent effect on regulating volatility, etc., and its structure is that -OH at the 2- and 3-positions of glucobylanose is placed at the opening at one end of the CD cavity.
It is estimated from the results of its X-ray analysis that it has a cyclic structure with a hydrophobic CD cavity, which has -OH at the 6-position in the opening at the other end.
このＣＤは、でん粉或いはでん粉の加水分解物にＢ Ｍ
Ａ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ ａｒｎｙ
ｌａｓｅ ）を作用させると、α−２β−１γ−の混合
物として得られるが、近年は、β−ＣＤのみを高収率で
与えるＣＤ生成酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅ
ｒｉｕｍやＢａｃｉｌｌｕｓ属の好アルカリ性菌のある
種のものから見出され、β−ＣＤが安価に製造されるよ
うになった為、研究対象としては溶解性が高いα−ＣＤ
を扱ったものが多いが、実用的には、製造、分離精製の
容易なβ−ＣＤが一般に用いられるようになっている。This CD contains starch or starch hydrolyzate.
A (Bacillus macerans arny
When a mixture of α-2β-1γ- is produced by the action of Bacillus megate
Since β-CD is found in certain alkalophilic bacteria of the genus Bacillus and Bacillus and can be produced at low cost, α-CD, which is highly soluble, is the subject of research.
However, in practice, β-CD is generally used because it is easy to produce, separate and purify.
β−ＣＤの水に対する溶解りは、α−ＣＤ、γ−ＣＤの
溶解度に比べて著しく低く、例えば、α−ＣＤが０．５
℃に於て６．８％、γ−ＣＤは同温度に於て９１％溶解
するのに対し、β−ＣＤは僅かに０８％溶解するにすぎ
ず、又、７０℃に於てもα−ＣＤが８７．６％、γ−Ｃ
Ｄは実に１６３．７％溶解するのに対し、β−ＣＤは僅
かに１５．３％溶解するにすきない。The solubility of β-CD in water is significantly lower than that of α-CD and γ-CD, for example, α-CD is 0.5
6.8% at 70°C, and γ-CD dissolves at 91% at the same temperature, whereas β-CD only dissolves at 0.8%, and even at 70°C, α-CD dissolves at 91%. CD is 87.6%, γ-C
D actually dissolves at 163.7%, whereas β-CD dissolves at only 15.3%.
このようなβ−ＣＤの水に対する溶解度をモル濃度に換
算すると、０，５°Ｃに於て７ｍＭ、７０°Ｃに於て１
３５ｍＭとなり、ホスト分子β〜ＣＤによって包接され
た水難溶性ゲスト分子の水溶解性は、当然、とのβ−Ｃ
Ｄの溶解度以下に限られる〇一方、本基質Ｌ−γ−グル
タミル−ｐ−二トロアニリドはＣＤによって色抜され、
本基質単独では、水又は緩衝液に対して、精々４ ｍ
Ｍまでの溶解性しか示さなかったのに対し、ＣＤ ０．
３％（ｖｊ／Ｖ）の添加で１６ｍＭ（４倍以上）という
本基質単独の場合と比べれば、比較的高い溶解度を得る
ことができることが知られている。（特開昭５７−７４
０９９号公報。）
しかしながら、この程度の溶解度では水浴性の改善は充
分ではなく、特に、ＣＤ本基質包接化合物を凍結乾燥す
る場合は、最終使用液濃度の製剤乃至はその二倍程度の
濃縮液の製剤の調製が限界であり、列置、満足すべきも
のではないことは、既に述べたとおりである。When the solubility of β-CD in water is converted into molar concentration, it is 7mM at 0.5°C and 1mM at 70°C.
35mM, and the water solubility of the poorly water-soluble guest molecule clathrated by the host molecule β~CD is naturally
On the other hand, the color of this substrate L-γ-glutamyl-p-nitroanilide is removed by CD,
This substrate alone can be used at most 4 m in water or buffer.
It showed solubility only up to CD 0.
It is known that a relatively high solubility of 16 mM (more than 4 times) can be obtained by adding 3% (vj/V) compared to the case of using the present substrate alone. (Unexamined Japanese Patent Publication No. 57-74
Publication No. 099. ) However, this level of solubility is not sufficient to improve water bathability, and in particular, when freeze-drying CD substrate clathrates, it is necessary to prepare a formulation at the final concentration of the final use solution or a concentrated solution at about twice that concentration. As already mentioned, the preparation is limited and the arrangement is not satisfactory.
そこで、ＣＤに一８Ｏ３Ｈ基、−Ｃ０２Ｈ基のような水
溶性基を導入し、ＣＤの水溶解性を改善することが考え
られる。Therefore, it is possible to improve the water solubility of CD by introducing a water-soluble group such as -8O3H group or -C02H group into CD.
しかしながら、本基質Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロ
アニリドがＣＤによって包接されたからといって、ＣＤ
に一８０３Ｈ基や一〇〇２Ｈ基のような水溶性基を導入
した修飾ＣＤが、本基質を効果的に包接するとはいえな
い。However, even though the present substrate L-γ-glutamyl-p-nitroanilide was included by CD, CD
It cannot be said that a modified CD into which a water-soluble group such as a 1803H group or a 1002H group is introduced effectively includes the present substrate.
即ち、包接体形成機構に関しては、従来から種々の分子
間力の関与が提唱され、ＣＤ包接体形成には分散力、双
極子開力、水素結合、疎水結合、電荷移動力等種々の分
子間力の一部またはすべてが関与している可能性があり
、それ故分子の化学構造か相違すれば、当然、その包接
体形成機構も相違し、又、たとえ包接体が形成されたと
しても、ゲスト分子である本基質り一γ−グルタミルー
ｐ−ニトロアニリド全体が、或いはγ−ＧＴＰとの酵素
反Ｆ６活性部位が、ホスト分子であるＣＤ空洞内に包接
され、酵素反応が抑制されてしまうおそれが存在する。That is, regarding the inclusion body formation mechanism, it has been proposed that various intermolecular forces are involved, and various intermolecular forces such as dispersion force, dipole opening force, hydrogen bond, hydrophobic bond, charge transfer force, etc. are involved in CD inclusion body formation. Some or all of the intermolecular forces may be involved, and therefore, if the chemical structure of the molecules is different, the mechanism of inclusion formation will naturally be different, and even if an inclusion body is not formed, Even if the entire guest molecule, γ-glutamyl-p-nitroanilide, or the enzyme anti-F6 active site with γ-GTP is included in the CD cavity, which is the host molecule, the enzymatic reaction cannot occur. There is a risk that it will be suppressed.
（有機合成化学 第３５巻第２号１１９（３７）頁及び
１２３（４１）頁（１９７７）。）
このような状況に於て、β−ＣＤ （ＯＨ）２１−ｍ（
−０Ｘ）ｍ［：但し、ＣＤはシクロデキストリン残基を
、ＸＶｉＮ０２、ＰＯ３Ｈ，８０３Ｈ１又は式−（ＣＨ
２）ｎＹ （Ｙｔｌ−８０３Ｈ基又は−Ｃ０２Ｈ基を示
し、ｎ ＝ １〜４の整数を示す。）で表わされる基を
示し、ｍ＝１〜５を示す。〕なる特定の修飾ＣＤが、本
基質Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを効果的
に包接し、且つ包接された本基質に対するγ−ＧＴＰの
酵素活性は何ら抑制されることなく、従ってこのような
特定の修飾ＣＤの存在下に、本基質り一γ−グルタミル
ーｐ−ニトロアニリドを基質として用いると、本基質の
水溶性か飛躍的に改善されるばかシでなく、γ−ＧＴＰ
Ｏ酵素活性を容易に定量的に測定することができること
か判明した。(Organic Synthetic Chemistry Vol. 35, No. 2, pp. 119 (37) and 123 (41) (1977).) In this situation, β-CD (OH) 21-m (
-0X)m[: However, CD represents a cyclodextrin residue,
2) Indicates a group represented by nY (indicates a Ytl-803H group or a -C02H group, and n = an integer of 1 to 4), and indicates m = 1 to 5. ] The specific modified CD effectively includes the present substrate L-γ-glutamyl-p-nitroanilide, and the enzymatic activity of γ-GTP toward the included present substrate is not suppressed in any way. When the present substrate γ-glutamyl-p-nitroanilide is used as a substrate in the presence of a specific modified CD such as
It was found that O enzyme activity can be easily and quantitatively measured.
本発明は、上記特定の修飾ＣＤを本基質り一γ−グルタ
、ミル−ｐ−ニトロアニリドと共にγ−ＧＴＰの酵素反
応系に存在させる点に特徴を有する発明であり、ｒ−Ｇ
ＴＰの酵素活性の測定操作自体は、グリシルグリシンな
どのグルタミン酸の受容体の存在下に汎用の緩衝液（ト
リス−塩酸緩＠液など。）中で反応させる一般法に従う
ことで足シる。The present invention is characterized in that the above-described specific modified CD is present in the γ-GTP enzymatic reaction system together with the present substrate γ-gluta and mil-p-nitroanilide.
The procedure for measuring the enzymatic activity of TP can be accomplished by following the general method of reacting in a general-purpose buffer (such as Tris-hydrochloric acid solution) in the presence of a glutamic acid receptor such as glycylglycine.
本発明に用いる特定の修飾ＣＤ、β−ＣＤ（−０Ｈ）２
□−ｍ（−ｏｘ）ｍ（但し、ＣＤはシクロデキストリン
残基を、ＸはＮＯ２、ＰＯ３Ｈ，５Ｏ３Ｈ，又は式（Ｃ
Ｈ２） ｎＹ （Ｙは−５０３Ｈ基又は−ｃＯ２Ｈ基を
示し、ｎ＝１〜４の整数を示す。）で表わされる基を示
し、ｍ＝１〜５を示す。〕に於いて、ｍは通常１〜５、
好ましくは１．５ミ３であり、Ｘ＝（ＣＨ２）ｎＹ の
ときのｎは通常１〜４の整数、好ましくは２又は３であ
り、Ｙで表わされる− ５（Ｊ３Ｈ基及び−Ｃ０２Ｈ基
のＨは、夫々Ｎａ５Ｋ等のアルカリ金属イオン又はＮＨ
，＋に置き換えられていても良い。Specific modified CD used in the present invention, β-CD(-0H)2
□-m(-ox)m (where, CD is a cyclodextrin residue, X is NO2, PO3H, 5O3H, or the formula (C
H2) represents a group represented by nY (Y represents a -503H group or a -cO2H group, and n = an integer of 1 to 4), and m = 1 to 5; ], m is usually 1 to 5,
It is preferably 1.5 mi 3, and when X=(CH2)nY, n is usually an integer of 1 to 4, preferably 2 or 3, and -5 (J3H group and -C02H group) represented by Y H is an alkali metal ion such as Na5K or NH
, + may be substituted.
本発明に用いる特定の修飾ＣＤの代表例を挙けると、例
えば、
β−ＣＤ（−０Ｈ）２１−２（ＯＮＯ２）２、β−ＣＤ
（０Ｈ）２□−１，８（ＯＰＯ３Ｈ）１．８、β−ＣＤ
（−０Ｈ）２□−２（ＯＳＯ３Ｈ） ２、β−ＣＤ （
−ＯＨ） ２□−２，５（−０−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）
２．５、β−ＣＤ（０Ｈ）２□−ｘ、ｒｌ（０−ＣＨ２
ＣＨ２ＣＨ２，５Ｏ３Ｈ）１，７ 、β−ＣＤ（０Ｈ）
２１２．５（０−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２５Ｏ３Ｈ）２，５
、β−ＣＤ（０Ｈ）２１−３．０（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ
２５Ｏ３Ｈ）３，０ 。Representative examples of specific modified CDs used in the present invention include, for example, β-CD(-0H)21-2(ONO2)2, β-CD
(0H)2□-1,8 (OPO3H)1.8, β-CD
(-0H)2□-2(OSO3H) 2, β-CD (
-OH) 2□-2,5(-0-CH2-CO2H)
2.5, β-CD(0H)2□-x, rl(0-CH2
CH2CH2,5O3H)1,7, β-CD(0H)
212.5(0-CH2CH2CH25O3H)2,5
, β-CD(0H)21-3.0(OCH2CH2CH
25O3H)3,0.
等であり、これらは、一般的製造方法によシ容易に製造
することができる。（有機合成化学、第３５巻、第２号
、１２３（４１）〜１２４（４２）頁（１９７７）。）
本基質及びこれら本発明に係る特定の修飾ＣＤを用いる
γ−ＧＴＰの酵素活性の測定値は、従来の酸溶解法の測
定値とよい相関を示しく第１図。）、又、現在実用化さ
れている他の三法（１）、（２）及び（３）の方法と比
較して、ヘモグロビンの影響やγ−ＧＴＰの酵素活性値
の変動の問題もない。本発明に係る特定の修飾ＣＤを用
いることにより、極めて効果的に本基質り一γ−グルタ
ミルーｐ−ニトロアニリドが包接され、飛躍的に基質溶
解性が改善され、且つ溶解後の基質液の安定性も改善さ
れた。又、γ−ＧＴＰの酵素活性は、これにより何らの
抑制をもうけず、容易に定量的にγ−Ｇ Ｔ Ｐの酵素
活性測定値を与え、更に、本基質の基質溶解性が２００
ｍＭ以上と飛躍的に改善されたため、凍結乾燥された基
質製剤の調製も極めて容易となった。（表１参照）
又、本発明の意外な効果としては、本基質Ｌ −γ−グ
ルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質とするγ−ＧＴＰ
の酵素活性測定法に於て、本発明に係る特定の修飾ＣＤ
を存在させることにより、防腐剤として用いるヒドロキ
シ安息香酸エステルの溶解度をも改善し、防腐剤として
の効果を増大させ、試液の安定化に寄与するところ大な
らしめた点である。（表２参照）
即ち、ヒドロキシ安息香酸エステル類は、毒性の少ない
防腐剤として知られ、食品添加物や各種製剤の防腐剤と
して幅広く利用されているが、抗餉力が特に強いといわ
れているエステルの炭素数が３及び４のものは水に対す
る溶解度が低く、必要量、溶解させることが出来ないの
が現状であった（表２に示す如く、例えばプロピルエス
テルの場合、５ｍＭ用いたとすると重量％濃度は０．０
９０％となるが、このものの２０℃及び２５℃に於ける
溶解度は夫々０．０３％及び０．０５％であるから、２
０〜２５°Ｃに於ては必然的に０．０６〜０，０４％相
当分は不溶分として残る。）。然しなから、本発明によ
り、即ち本発明の特定の修飾ＣＤを用いることにより、
その抗菌、防腐作用を何ら阻害せず、又何らの障害も発
生させることなしに、これら水難溶性物質の溶解度を飛
躍的に増大させ、その結果として試液の安定性向上に顕
著な効果をもたらした。etc., and these can be easily manufactured by general manufacturing methods. (Organic Synthetic Chemistry, Vol. 35, No. 2, pp. 123(41) to 124(42) (1977).) Measurement of enzymatic activity of γ-GTP using the present substrate and these specific modified CDs according to the present invention. The values show good correlation with the values measured by the conventional acid dissolution method. ), and compared to the other three methods (1), (2) and (3) currently in practical use, there is no problem of influence of hemoglobin or fluctuation of the enzyme activity value of γ-GTP. By using the specific modified CD according to the present invention, the present substrate is extremely effectively clathrated with -gamma-glutamyl-p-nitroanilide, the substrate solubility is dramatically improved, and the substrate solution after dissolution is Stability has also been improved. Furthermore, the enzymatic activity of γ-GTP is not inhibited in any way, and the enzymatic activity of γ-GTP can easily be measured quantitatively, and furthermore, the substrate solubility of this substrate is 200%.
Since the concentration was dramatically improved to more than mM, it became extremely easy to prepare a freeze-dried substrate preparation. (See Table 1) Furthermore, as an unexpected effect of the present invention, γ-GTP using the present substrate L-γ-glutamyl-p-nitroanilide
In the method for measuring enzyme activity, the specific modified CD according to the present invention
The presence of hydroxybenzoic acid ester also improves the solubility of the hydroxybenzoic acid ester used as a preservative, increasing its effectiveness as a preservative and greatly contributing to the stabilization of the test solution. (See Table 2) In other words, hydroxybenzoic acid esters are known as preservatives with low toxicity and are widely used as preservatives in food additives and various preparations, but they are said to have particularly strong anti-fouling properties. Esters with 3 and 4 carbon atoms have low solubility in water and cannot be dissolved in the required amount (as shown in Table 2, for example, in the case of propyl ester, if 5mM is used, the weight % concentration is 0.0
However, the solubility of this substance at 20°C and 25°C is 0.03% and 0.05%, respectively, so 2
At 0 to 25°C, an amount equivalent to 0.06 to 0.04% remains as insoluble matter. ). However, according to the present invention, i.e. by using certain modified CDs of the present invention,
It dramatically increases the solubility of these poorly water-soluble substances without inhibiting their antibacterial and antiseptic effects or causing any problems, resulting in a remarkable effect on improving the stability of test solutions. .
以上申し述べたとおり、本発明は、現在盛んに行なわれ
ている、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを基
質とするγ−（）ＴＰの酵素活性測定法に於て、本発明
に係る特定の修飾ＣＤを用いることにより、従来の方法
を極めて効果的に改良したものであり、斯業に貢献する
ところ大なるものである。As stated above, the present invention provides a method for measuring the enzymatic activity of γ-()TP using L-γ-glutamyl-p-nitroanilide as a substrate, which is currently being actively carried out. By using a modified CD, this method is a very effective improvement over the conventional method, and will greatly contribute to this industry.
以下に実施例を示す。Examples are shown below.
実施例１゜
（１） 試薬の調製
■ 基質緩衝液
β−ＣＤスルホプロピルエーテル（ｍ＝２．５置換体）
１０ｍＭ、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド５
ｍＭを溶解した０、 １ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，４０）を調製する。Example 1゜(1) Preparation of reagent■ Substrate buffer β-CD sulfopropyl ether (m=2.5 substitution product)
10mM, L-γ-glutamyl-p-nitroanilide 5
0, 1 M Tris-HCl buffer (pH
8,40).
■ グリシルグリシ／溶液
塩酸でｐＨ８，４０に調整したグリシルグリシン１６２
ｍＭ溶液を調製する。■ Glycylglycine/solution Glycylglycine 162 adjusted to pH 8.40 with hydrochloric acid
Prepare an mM solution.
（２）測定操作
試料５０μｔに基質緩衝液の２． ＯｗＬｌを加え、３
７℃で３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液
■０．５ ｍｌを加えてよく混合後、分光光度計で４１
０ ｎｍの吸光度の増加を測定し、活性値を算出する。(2) Measurement procedure 2. Add substrate buffer to 50μt of sample. Add OwLl, 3
Preheat at 7°C for 3 minutes, add 0.5 ml of glycylglycine solution, mix well, and measure 41°C using a spectrophotometer.
Measure the increase in absorbance at 0 nm and calculate the activity value.
（３１活性値
単位時間（１分間）当シの吸光度の増加ＩＥ７ｍｉｎに
相当する活性値（ｍＩＵ）ｉ次式で与えられる。(31 activity value unit time (1 minute) Activity value (mIU) corresponding to the increase in absorbance of the current IE7min) is given by the following equation.
比較例１゜
（１） 試薬の調製
■ 基’Ｘｉ： Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニ
リド１ ｍ Ｍ （２８５１ＲＩ／ ）を０．５Ｎ塩酸
１０罰に溶解し、水で全量５０ｍ１とする。（２０ｍＭ
溶液）
■ 緩衝液ニゲリシルグリシン ４０ｍＭを溶解した０
、 １ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ＰＨ８，４０）を調製
する。Comparative Example 1 (1) Preparation of Reagent Group 'Xi: 1 mM (2851RI/) of L-γ-glutamyl-p-nitroanilide is dissolved in 10 parts of 0.5N hydrochloric acid, and the total volume is made up to 50 ml with water. (20mM
Solution) ■ Buffer solution containing 40mM of nigericylglycine
, prepare 1 M Tris-HCl buffer (PH8,40).
（２）測定操作
試料５０μｔに緩衝液■２．Ｑｍｌを加え、３７℃で３
分間予備加温し、これに基質液■Ｑ、 ５ ｍｌを加え
てよく混合後、分光光度計で４１０ ｎｍの吸光度の増
加を測定する。(2) Measurement procedure 50μt of sample and buffer ■2. Add Qml and incubate at 37°C for 3
After prewarming for a minute, add 5 ml of substrate solution (Q) and mix well, then measure the increase in absorbance at 410 nm with a spectrophotometer.
実施例１． 及び比較例１． の方法により、同一の３
０検体の活性値をめ、それらの相関関係を第１図に示す
。Example 1. and Comparative Example 1. By the method of
Figure 1 shows the correlation between the activity values of the 0 sample and the correlation between them.
第１図から明らかなように、本発明による測定値は、従
来の酸溶解法の測定値とよい相関を示しているｏ（ｒ＝
０．９９８７、Ｙ＝１．０２２Ｘ−２，１２１）
実施例２゜
（１） 試薬の調製
■ 基質緩衝液
β−ＣＤカルボキシメチルエーテル（ｍ＝２．５置換体
）１０ｍＭ、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド
５ｍＭを溶解した０、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
４０）を調製する。As is clear from FIG. 1, the measured values according to the present invention show a good correlation with the measured values of the conventional acid dissolution method.
0.9987, Y = 1.022 0, 1M Tris-HCl buffer (pH 8,
40).
■ グリシルグリシン溶液
塩酸でＰＨ８，４０に調整したグリシルグリシン１６２
ｍＭ溶液を調製する。■ Glycylglycine solution Glycylglycine 162 adjusted to pH 8.40 with hydrochloric acid
Prepare an mM solution.
（２）測定操作
試料５０μｔに基質緩衝液■２．Ｏｍｌを加え、３７℃
で３分間予備加温し、これにグリシルグリシン溶液■０
．５ ｍｔを加えてよく混合後、分光光度計で４１０ｎ
ｍの吸光度の増加を測定し、活性値を算出する。(2) Measurement procedure 50 μt of sample and substrate buffer ■2. Add Oml and heat to 37℃
Preheat for 3 minutes with
．． After adding 5 mt and mixing well, measure 410n using a spectrophotometer.
The increase in absorbance of m is measured and the activity value is calculated.
実施例２． によっても、実施例１． と同様な結果が
得られた。Example 2. Also according to Example 1. Similar results were obtained.
実施例３゜
（１） 試薬の調製
■ 基Ｘ液： Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリ
ド ２００ｍＭ、β−ＣＤカルボキシメチルエーテル（
ｍ＝２゜５置換体）４００ｍＭの混合液を２ＷＬｌずつ
分注し凍結乾燥して基質剤を得る。Example 3゜(1) Preparation of reagent ■ Base X solution: L-γ-glutamyl-p-nitroanilide 200mM, β-CD carboxymethyl ether (
m=2°5 substitution product) A 400mM mixture was dispensed in 2WLl portions and lyophilized to obtain a substrate agent.
これを、使用時、０．１Ｍ）！ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，４０）２０ｓ＋ｌに溶解し、基質液を調製する。When using this, 0.1M)! jsu hydrochloric acid buffer (pH 8
, 40) Dissolve in 20s+l to prepare a substrate solution.
■ 緩衝液ニゲリシルグリシ７４０ｍＭを溶解した０、
１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４０）を調製す
る。■ Buffer solution containing 740mM of nigericylglycyl,
Prepare 1 M) Lis-HCl buffer (pH 8,40).
（２）測定操作
試料５０μｔに緩衝液■２．Ｏｍｌを加え、３７℃で３
分間予備加温し、これに基質液■０．５ ｍｌを加えて
よく混合後、分光光度計で４１０ ｎｍの吸光度の増加
を測定する。(2) Measurement procedure 50μt of sample and buffer ■2. Add Oml and incubate at 37°C for 3
Preheat for 1 minute, add 0.5 ml of substrate solution (1), mix well, and measure the increase in absorbance at 410 nm using a spectrophotometer.
実施例４゜
（１） 試薬の調製
■ 基質ｉ ： Ｌ−γ−グルタミルーｐ−ニトロアニ
リド ２００ｍＭ、β−ＣＤスルホプロピルエーテル（
ｍ ＝ ２．５置換体）４００ｍＭの混合液を２ ｍｌ
ずつ分注し、凍結乾燥して基質剤を得る。Example 4゜(1) Preparation of reagent ■ Substrate i: L-γ-glutamyl-p-nitroanilide 200mM, β-CD sulfopropyl ether (
m = 2.5 substitution product) 2 ml of 400 mM mixture
Dispense the solution into portions and lyophilize to obtain the substrate.
使用時、０．１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４０
）２０１ｎｌに溶解し、基質液を調製する。When used, 0.1 M) lithium-hydrochloric acid buffer (pH 8,40
) Dissolve in 201 nl to prepare a substrate solution.
■ 緩衝液ニゲリシルグリシ７４０ ｍ Ｍを溶解した
０、 １ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４０）を調
製する。(2) Buffer Prepare 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.40) in which 740 mM of nigericylglycide is dissolved.
（２）測定操作
試料５０μｔに緩衝液■２．Ｏｍｌを加え、３７℃で３
分間予備加温し、これに木質液の０．５ ｍｌを加えて
よく混合後、分光光度計で４１０ ｎｍの吸光度の増加
を測定し、活性値を算出する。(2) Measurement procedure 50μt of sample and buffer ■2. Add Oml and incubate at 37°C for 3
After preheating for a minute, add 0.5 ml of woody liquid and mix well. The increase in absorbance at 410 nm is measured using a spectrophotometer, and the activity value is calculated.
実施例３及び４からも明らかなように、本発明の修飾Ｃ
ＤＶｉ、４００ｍＭ以上の非常に高い溶解度を有してい
て、ゲスト分子である本基質γ−グルタミルーｐ−ニト
ロアニリドを、２００ｍＭと、飛躍的に可溶化すること
ができる。As is clear from Examples 3 and 4, modification C of the present invention
DVi has a very high solubility of 400 mM or more, and can dramatically solubilize the guest molecule, γ-glutamyl-p-nitroanilide, to 200 mM.
実施例５．（ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルの可溶化
）
■ 緩衝液＝１を
塩酸でＰＨを９．０に調整する。Example 5. (Solubilization of p-hydroxybenzoic acid ester) (1) Adjust the pH of buffer solution 1 to 9.0 with hydrochloric acid.
本溶液は室温で１年間安定である。This solution is stable for one year at room temperature.
■ 基質緩衝液
り一γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド１ｍＭをｏ：
ｓ Ｎ−Ｈ２ＳＯ，１０ｍｌに溶解し、上記緩衝液の１
９０ｍ１と混合する。■ Add 1 mM of γ-glutamyl-p-nitroanilide to the substrate buffer:
s N-H2SO, 10 ml of the above buffer solution.
Mix with 90ml.
本溶液は２〜１０℃保存で２週間使用可能である０This solution can be used for 2 weeks when stored at 2-10℃.
第１図は、本発明の方法で得られたγ−ＧＴＰの酵素活
性値と従来の酸溶解法で得られたｒ−Ｇ Ｔ Ｉ）の酵
素活性値との相関を表わし、横軸Ｘは酸溶解法の活性値
（ｍ Ｉ Ｕ ）を、縦軸Ｙは本発明の（方法の活性値
（ｍＩＵ）を表わす。
特許出願人 和光純薬工業株式会社
第１図
（
？
（
イ１
ｌ ＱＱ ２００ Ｘ
酸浴解法による酵素活性値（ｍＩＵ）
手続補正書
昭和ｌρ年 夕 月２／７日
１、事件の表示
ｐａｆＦｒＪｔ； ｑ ４−ａＨｒ願４４ ｏ ｔ ｂ
ｔ； ｇ ？ ４λ 発明の名称
３、 補正をする者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 ５４１
連絡装置 ０３−２７０−８５７１
４、補正命令の日付
名 搭
５、補正の対象
明細書の発明の詳細な説明の欄。
６、補正の内容
（１）明細書１２頁表１中に記載の（２）水溶性基法に
於ける基質「Ｌ−γ−Ｇ−ｐ−Ｎ−０−スルホン酸」を
「Ｌ−γ−Ｇ−ｐ−Ｎ−ｍ−スルホン酪」と補正する。
以」二
手続補正書
昭和６０年 ｑ 月 ２λ日
１ 事件の表示
２ 発明の名称
３ 補正をする者
事件との関係 特許出願人
連絡先１１らＬ ０３−２７０−８５７１４ 補正命令
の日付
飽 沁
５、補正の対象
明細書の発明の詳細な説明の欄。
６、 捕■の内容
（１）明細書１２頁表１中に記載の（２）水溶性基法に
於ける基質「Ｌ−γ−Ｇ−ｐ−Ｎ−０−カルボン酸」を
「Ｌ−γ−Ｇ−ｐ −Ｎ −ｍ−力ルホン耐」と補正す
る。
以］−FIG. 1 shows the correlation between the enzyme activity value of γ-GTP obtained by the method of the present invention and the enzyme activity value of r-GTP obtained by the conventional acid dissolution method, and the horizontal axis X is The activity value (mIU) of the acid dissolution method is represented by the activity value (mIU) of the method of the present invention, and the vertical axis Y represents the activity value (mIU) of the method of the present invention.Patent applicant: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 200
t; g? 4λ Title of the invention 3. Relationship with the case of the person making the amendment Patent applicant postal code 541 Communication device 03-270-8571 4. Name of date of amendment order 5. Detailed description of the invention in the specification to be amended . 6. Contents of amendment (1) The substrate "L-γ-G-p-N-0-sulfonic acid" in the (2) water-soluble base method described in Table 1 on page 12 of the specification was replaced with "L-γ-G-p-N-0-sulfonic acid". -G-p-N-m-sulfonebutyro”. 2 Procedural amendments 1985 q Month 2λ day 1 Indication of the case 2 Title of the invention 3 Relationship to the case of the person making the amendment Patent applicant contact information 11 et al. 03-270-85714 Date of amendment order 5 pm , Detailed description of the invention in the specification to be amended. 6. Contents of capture (1) The substrate "L-γ-G-p-N-0-carboxylic acid" in the (2) water-soluble group method described in Table 1 on page 12 of the specification was replaced with "L-γ-G-p-N-0-carboxylic acid". It is corrected as γ-G-p-N-m-force resistance. ]-
Claims (1)
するに当り、β−ＣＤ（ＯＨ）２１−ｍ（０Ｘ）ｒｒ＋
〔但シ、ＣＤはシクロデキストリン残基を、ＸはＮＯ２
、ＰＯ３Ｈ，８０３Ｈ，又は式−（ＣＨ２）ＩＹ（Ｙは
−８０３Ｈ基又は−Ｃｏ２Ｈ基を示し、ｎ＝１〜４の整
数を示す。）で表わされる基を示し、ｍ ＝ １〜５を
示す。 〕なる修修飾シフロブキストリの存在下に、Ｌ−γ−グ
ルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質として用いること
を特徴とする、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活
性の測定方法。[Claims] In measuring the enzymatic activity of γ-glutamyl transpeptidase, β-CD(OH)21-m(0X)rr+
[However, CD is a cyclodextrin residue, and X is NO2
, PO3H, 803H, or a group represented by the formula -(CH2)IY (Y represents a -803H group or a -Co2H group, and n = an integer of 1 to 4), and m = 1 to 5. . ] A method for measuring γ-glutamyl transpeptidase activity, which comprises using L-γ-glutamyl-p-nitroanilide as a substrate in the presence of a modified schiflobuchistri.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1658984A JPS60160896A (en) | 1984-01-31 | 1984-01-31 | Measuring method of activity of gamma-glutamyl- transpeptidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1658984A JPS60160896A (en) | 1984-01-31 | 1984-01-31 | Measuring method of activity of gamma-glutamyl- transpeptidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60160896A true JPS60160896A (en) | 1985-08-22 |
| JPH0516837B2 JPH0516837B2 (en) | 1993-03-05 |
Family
ID=11920461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1658984A Granted JPS60160896A (en) | 1984-01-31 | 1984-01-31 | Measuring method of activity of gamma-glutamyl- transpeptidase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60160896A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0284199A (en) * | 1988-09-20 | 1990-03-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent solution for determination of acidic phosphatase activity |
-
1984
- 1984-01-31 JP JP1658984A patent/JPS60160896A/en active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0284199A (en) * | 1988-09-20 | 1990-03-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent solution for determination of acidic phosphatase activity |
| JP2797102B2 (en) * | 1988-09-20 | 1998-09-17 | 和光純薬工業株式会社 | Acid phosphatase activity reagent |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0516837B2 (en) | 1993-03-05 |
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