JPS6015312B2 - Novel lipase production method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を培
養することによりアルカリ側に至適ｐＨをもち胆汁酸塩
により活性化され、かつコレステロールと脂肪酸のェス
テル（以下コレステロールヱステルと略記する）を分解
する能力を有する新規なりパーゼを製造する方法に関す
るものである。Detailed Description of the Invention The present invention cultivates a lipase-producing bacterium belonging to the genus Alcaligenes, which has an optimal pH on the alkaline side, is activated by bile salts, and produces esters of cholesterol and fatty acids (hereinafter referred to as cholesterol esters). The present invention relates to a method for producing a novel pase having the ability to decompose (abbreviated).

微生物、特にバクテリアを用いたりパーゼの製造法とし
ては、シュードモナス属、クロモバクテリァ属、アクロ
モバクテリァ属、スタフィロコッカス属、プロピオバク
テリウム属、コリネバクテリウム属などに属する菌を利
用する方法が知られている。Examples of methods for producing pase using microorganisms, particularly bacteria, include methods that utilize bacteria belonging to the genera Pseudomonas, Chromobacteria, Achromobacteria, Staphylococcus, Propiobacterium, Corynebacterium, etc. Are known.

しかし、従来アルカリゲネス属に属する微生物がアルカ
リ側に至適ｐＨをもち胆汁酸塩により大中に賦活され、
かつコレステロールェステルを分解する能力を有するリ
パーゼを培地中に生産する事実は未だ見出されていない
。本発明者等は、このようなりバーゼ生産菌を見出すべ
く広く自然界より微生物を分離した結果、東京都下の土
壌より分離したアルカリゲネス属に属する菌である名糖
ＰＬ−６７９号がこのような新規なりパーゼを生産する
ことを発見した。このリパーゼ生産菌名槍串Ｌ−６７９
号は次のような菌学的性質を有する。However, conventionally, microorganisms belonging to the genus Alcaligenes have an optimal pH on the alkaline side and are activated by bile salts,
Moreover, the fact that a lipase having the ability to decompose cholesterol esters is produced in a culture medium has not yet been found. The present inventors isolated microorganisms widely from the natural world in order to find such a base-producing bacterium, and as a result, Meito PL-679, a bacterium belonging to the genus Alcaligenes isolated from the soil in the lower part of Tokyo, was found to be a new species. It was discovered that Naripase can be produced. The name of this lipase producing bacterium is Yarikushi L-679.
The number has the following mycological properties.

Ａ形態 ■ 肉汁寒天培地および肉汁液体塔地に生育した菌の形
態は棒状であり、０．５〜０．７×１〜４ｒの大きさで
、多くの場合単独であるが、まれに２〜４蓮をなす。Form A ■ The morphology of the bacteria grown on the meat juice agar medium and the meat juice liquid tower is rod-shaped, with a size of 0.5 to 0.7 x 1 to 4 r, often singly, but rarely 2 to 4 4 Forms a lotus.

■ 細胞の多形性はない。■ No cellular pleomorphism.

■ 運動性あり、鞭毛は周毛で１〜６本。■ It is motile, with 1 to 6 flagella peritial.

■ 胞子形成なし。■ No sporulation.

■ グラム染色性は陰性。■ Gram staining is negative.

クリスタルバイオレット寒天塔地によく生育し、赤色集
落を形成する■ 抗酸性は陰性。Grows well on crystal violet agar towers and forms red colonies■ Anti-acidity is negative.

Ｂ．生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養 半透明黄褐色又は褐色で、中心部ほど色が濃く、円形の
コロニーを生ずる。B. Growth condition ■ Cultured on broth agar plate Translucent yellowish brown or brown, the color is darker towards the center, producing round colonies.

表面はやや粗造で、周縁は不規則な波形状で、明瞭な拡
散性色素は生産しない。■ 肉汁寒天斜面培養 拡布状又はし、ぽ状に生育し、生育部分はオレンジ色又
は黄褐色で、光をあてると半透明、樹脂様色をなす。The surface is rather rough, the margins are irregularly wavy, and no distinct diffusible pigments are produced. ■ Juicy agar slant culture Grows in a spread shape or in a pock shape, and the growing part is orange or yellowish brown, and when exposed to light, becomes translucent and resinous in color.

■ 肉汁液体培養 極めて生育良く、培地は濁って黄褐色を呈する。■ Meat juice liquid culture It grows very well, and the medium is cloudy and yellow-brown in color.

大量の菌体を生ずると共に上層に膜を生ずる■ 肉汁ゼ
ラチン穿刺培養 総状に生育し、培地表面は黄褐色を呈し、よく生育する
が、ゼラチンを液化しない。Produces a large number of bacterial cells and a membrane on the upper layer ■ Meat juice gelatin puncture culture Grows in a raceme, the surface of the medium is yellowish brown, and grows well, but does not liquefy gelatin.

■リトマスミルク 培養と共にｐＨはゆっくりアルカリ性となる。■Litmus milk As the culture progresses, the pH slowly becomes alkaline.

べプトン化、液化はおこらない。■ ジャガイモ培地 ジャガイモ上によく生育する。Beptonization and liquefaction do not occur. ■ Potato medium Grows well on potatoes.

生育と共に順次オレンジ色、濃いオレンジ色、明るい茶
色と変化するＣ．生理学的性質 ■ 硝酸塩の還元：＋ ■ 脱窒素反応：− ■ Ｍ旧テスト：一 ■ ＶＲテスト：一 ■ インドールの生成：一 ■ 硫化水素の生成：＋ ■ デンプンの加水分解：− ■ クエン酸の利用：コーザ−の培地＋ クリステンゼンの培地十 ■ 無機窒素源の利用：硝酸塩＋ アンモニウム塩＋ ■ 色素の生成： キングＡ塔地及びッアベツクドックス塔地にうすし、褐
色、又キングＢ培地にはうすし、黄褐色水熔性の色素を
生産する。C. which changes color sequentially from orange to dark orange to light brown as it grows. Physiological properties ■ Nitrate reduction: + ■ Denitrification reaction: - ■ M old test: 1 ■ VR test: 1 ■ Indole formation: 1 ■ Hydrogen sulfide formation: + ■ Starch hydrolysis: - ■ Citric acid Utilization: Koser's medium + Christensen's medium 10 ■ Use of inorganic nitrogen source: Nitrate + ammonium salt + ■ Pigment production: Light and brown on King A and Beck Dox, and King B medium It produces a yellow-brown water-soluble pigment.

肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ポテトデキストロース培地で
は明瞭な水溶性色素の生成は認められない。■ ウレア
ーゼ：一■オキシダーゼ：＋ ■ カタラーゼ：＋ ■ 生育の範囲： ｐＨ５．５〜１１．０の範囲で生育する。No clear formation of water-soluble pigments was observed in the broth agar, broth gelatin, and potato dextrose media. ■ Urease: - Oxidase: + ■ Catalase: + ■ Growth range: Grows in the pH range of 5.5 to 11.0.

ｐＨ５．０以下及びｐＨ１２．０以上では生育しない。
生育温度は５〜４０℃であり、特に１５〜３５℃で最も
よく生育する。■ 好気性及び嫌気性：好気性 ■ ＯＦテスト：ブドウ糖分解陰性。It does not grow at pH below 5.0 and above pH 12.0.
The growth temperature is 5 to 40°C, and it grows best at 15 to 35°C. ■ Aerobic and anaerobic: Aerobic ■ OF test: Glucose degradation negative.

ガスの発生はない。No gas is generated.

■ 糖の利用： ヒューライフソンの培地を用いて糖の利用を調でた。■ Use of sugar: Sugar utilization was investigated using Hugh Lifeson's medium.

いずれの糖でもガスを発生せず、酸の生成は次の通りで
ある。Ｌーアラビノース−麦芽糖 Ｄ−キシロース ーショ糖 Ｄーグルコース ー乳 糖 Ｄーマンノ−ス ートレハロース Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ソルビトール ー（遅延性
） マンニトールＤ−ガラクトース ー 可
溶性澱粉 イノシトー′レ グリセリン 十 （遅延性） Ｄ．その他の性質 ■ リパーゼを菌体外に多量に分泌する。Neither sugar produces gas and acid production is as follows. L-arabinose - maltose D-xylose - sucrose D-glucose - lactose D-mannose - trehalose D-fructose + D-sorbitol - (delayed) Mannitol D-galactose - soluble starch inosito' reglycerin 10 (delayed) D. Other properties■ Secretes a large amount of lipase outside the bacterial body.

■ ３−ケトラクトースの生成：− ■ アンモニアの生成：＋ ■ Ｇ，Ｃ含量：６６．７％ 上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上の位置をパー
ジェィのマニュアル・オブ・ディターミナティブ・バク
テリオロジィ第８版（１９７仏軍）を参照して検討する
と、本菌はグラム陰性の局毛を有する樟状細菌であるこ
とからコリネバクテリウム属、シュードモナス属ではな
い。■ Production of 3-ketolactose: - ■ Production of ammonia: + ■ G, C content: 66.7% The taxonomic position of this bacterium with the above mycological properties is determined according to Pagel's Manual of Determinus. When examined with reference to Tib Bacteriology, 8th edition (197 French Army), this bacterium is a camphoriform bacterium with gram-negative local hairs, and therefore does not belong to the genus Corynebacterium or Pseudomonas.

又、３−ケトラクトースを生成せず、アミノ酸、硝酸態
、アンモニア態窒素を利用するのでアグロバクテリウム
属に属さない。クエン酸を利用するのでリゾビウム属で
はない。更に本菌は好気的に生育し、嫌気的には生育せ
ず、顕著な色素を生成しないので、フラボバクテリウム
、クロモバクテリウム属にも属さず、ＯＦテスト、糖の
資化性、リトマスミルクの結果からアルカリゲネス属に
属するものと判定される。なお本菌は工業技術院微生物
工業技術研究所に徴工研菌寄第３７８３号（ＦＥＲＭ−
Ｐ 肺．３７８３）として寄託されている。Moreover, it does not belong to the genus Agrobacterium because it does not produce 3-ketolactose and uses amino acids, nitrate, and ammonia nitrogen. It is not Rhizobium because it uses citric acid. Furthermore, this bacterium grows aerobically, does not grow anaerobically, and does not produce significant pigments, so it does not belong to the genus Flavobacterium or Chromobacterium, and has been tested for OF tests, sugar assimilation, and litmus tests. Based on the milk results, it is determined that it belongs to the genus Alcaligenes. This bacterium has been submitted to the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology, as part of the National Institute of Industrial Science and Technology, No. 3783 (FERM-
P lungs. 3783).

本発明者等は、さらに研究の結果、アルカリゲネス属に
属するリパーゼ生産菌を培養する際、非イオン界面活性
剤を添加した培地を用いて培養を行うと上記りパーゼの
生産が層よくなることを発見した。As a result of further research, the present inventors discovered that when culturing lipase-producing bacteria belonging to the genus Alcaligenes, the production of the above-mentioned pase was improved when cultured using a medium supplemented with a nonionic surfactant. did.

本発明はこれらの知見にもとずし、て完成されたもので
、本発明はアルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を
培地に培養し、この培養物からアルカリ側に至適ｐＨを
もち胆汁酸塩により活性化され、かつコレステロールェ
ステルを分解する能力を有するリパーゼを採取すること
を特徴とする新規なりパーゼの製造法であり、また本発
明はアルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を非イオ
ン界面活性剤を添加した培地に培養し、この培養物から
アルカリ側に至薄ｐＨをもち胆汁酸塩により活性化され
、かつコレスチロールェステルを分解する能力を有する
リパーゼを採取することを特徴とする新規なりパーゼの
製造法である。The present invention was completed based on these findings, and the present invention involves culturing lipase-producing bacteria belonging to the genus Alcaligenes in a medium, and extracting bile salts from this culture with an optimal pH on the alkaline side. The present invention is a novel method for producing lipase, which is characterized by collecting lipase that is activated by lipase and has the ability to decompose cholesterol esters. A novel product characterized by culturing in a medium supplemented with and collecting from this culture a lipase that has an extremely low pH on the alkaline side, is activated by bile salts, and has the ability to degrade cholesterol esters. This is a method for producing pase.

本発明における使用菌としては、例えば上記のアルカリ
ゲネス属に属する名糖ＰＬ−６７計号が挙げられるが、
この菌の他にもアルカリゲネス属に属し、この新規なり
バーゼを生産する菌はすべて本発明において使用するこ
とができる。Examples of the bacteria used in the present invention include the above-mentioned Meito PL-67 belonging to the genus Alcaligenes.
In addition to this bacterium, any bacterium that belongs to the genus Alcaligenes and produces this novel Naburase can be used in the present invention.

本発明方法を実施するにあたっては、アルカリゲネス属
に属するリパーゼ生産菌を培地に培養する。In carrying out the method of the present invention, lipase-producing bacteria belonging to the genus Alcaligenes are cultured in a medium.

培地の栄養源としては、微生物の倍義に通常用いられる
ものが向く用い得る。As the nutrient source for the culture medium, those commonly used for supplementing microorganisms can be used.

すなわち炭素源としては、同化可能な炭素化合物または
これを含有するものであればよく、例えばブドウ糖、麦
芽糖、可溶性澱粉、澱粉、デキストリン、糠蜜、グリセ
リン、油脂、小麦ふすま、糖などが用いられる。窒素源
としては、同化可能な窒素化合物もしくはこれを含有す
るものであればよく、例えば大豆粉、脱脂大豆粉、綿実
粕、ナタネ粕、ベブトン、肉エキス、酵母エキス、グル
ーテン、コーンステイープリカー、カザミノ酸、尿素、
アンモニウム塩、硝酸塩など有機、無機の窒素化合物ま
たはこれを含有するものが用いられる。又、無機塩とし
ては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリ
ウム、カルシウムなどの塩類が使用される。そしてさら
に必要に応じて菌の生育、あるいは酵素生産に必要な各
種の有機物や無機物、例えばシリコン油、消泡剤、ビタ
ミン類、燐脂質等を培地に添加することができる。上述
の如く、本発明にしたがいアルカリゲネス庫に属するリ
パーゼ生産菌を培地に培養して新規なりパーゼを生産さ
せる場合、培地に非イオン界面活性剤を添加して培養す
ると、この新規なりパーゼの生産は一層良くなる。That is, the carbon source may be any assimilable carbon compound or one containing it, such as glucose, maltose, soluble starch, starch, dextrin, bran syrup, glycerin, fats and oils, wheat bran, sugar, and the like. The nitrogen source may be any assimilable nitrogen compound or one containing it, such as soybean flour, defatted soybean flour, cottonseed meal, rapeseed meal, Bebutone, meat extract, yeast extract, gluten, and cornstarch liquor. , casamino acids, urea,
Organic or inorganic nitrogen compounds, such as ammonium salts and nitrates, or compounds containing them are used. Further, as the inorganic salt, various salts such as phosphate, magnesium, potassium, sodium, calcium, etc. are used. Furthermore, various organic and inorganic substances necessary for bacterial growth or enzyme production, such as silicone oil, antifoaming agents, vitamins, phospholipids, etc., can be added to the medium as necessary. As mentioned above, when culturing lipase-producing bacteria belonging to Alcaligenes in a medium to produce a new pase according to the present invention, if a nonionic surfactant is added to the medium and cultured, the production of this new pase will be reduced. It gets even better.

この培地に添加する非イオン界面活性剤としては、例え
ばソルビタンアルキルェステル、ポリオキシエチレンソ
ルビタンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテ
ル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレンポリマー、脂肪酸モノグ
リセライドなどがあげられる。これらの界面活性剤の添
加量はその適当量を選んで培地に添加されるが、通常塔
地に対し約０．０１〜２％添加するのが好適である。更
に、塩化鉄、硫酸鉄などの鉄イオンと酢酸ナトリウムや
クエン酸ナトリウムを培地に添加して培養を行ってもこ
の新規なりパーゼの生産は良くなる。Nonionic surfactants to be added to this medium include, for example, sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl allyl ether, polyoxyethylene alkyl ester, polyoxyethylene polyoxy Examples include propylene polymer and fatty acid monoglyceride. These surfactants are added to the medium by selecting an appropriate amount, but it is usually preferable to add about 0.01 to 2% of the surfactant. Furthermore, the production of this novel pase is improved even if the culture is carried out by adding iron ions such as iron chloride or iron sulfate, and sodium acetate or sodium citrate to the medium.

本発明において、培養の形態は液体培養でも固体培養で
もよいが、通常は液体培養が好適であり、工業的には深
部通気蝿梓培養を行なうのが有利である。In the present invention, the form of culture may be either liquid culture or solid culture, but liquid culture is usually preferred, and from an industrial perspective, it is advantageous to perform deep aeration fly culture.

培養に当っては、本培養に先だって小規模な前培養を行
ない、得られた培養物を本塔地に接種して行なう方法が
望ましい。本発明における培養条件は使用する菌株、培
地組成等により多少異るが、生産の目的物であるリパー
ゼの生産に最も有利な条件を適当に選択、調節して行な
う。When culturing, it is desirable to carry out a small-scale preculture prior to main culture, and inoculate the resulting culture into the main culture. The culture conditions in the present invention vary somewhat depending on the strain used, medium composition, etc., but the conditions most advantageous for the production of lipase, which is the target product, are appropriately selected and adjusted.

培養温度は１０〜４０ＣＯの範囲内で適宜変更すること
ができるが、特に好ましいのは２０〜３０ｏｏである。
培養期間は条件によって異るが、１〜４日程度であって
リパーゼが最高蓄積量に達する時期に培養を終了すれば
よい。培地のｐＨは、培地調整時に弱酸性から弱アルカ
リ性にあればよく、通常の場合特に調節の必要はないが
、望ましくはｐＨ６〜１０、特に望ましくはｐＨ７〜１
の寸近に調節しておけばリパーゼ生産に好適である。こ
のようにして得られた培養物からのＩＪパーゼの採取は
、リバーゼを分離、精製する常法に従って実施できる。
すなわち団体培養の場合は公知のように水その他の抽出
剤などで抽出を行なって柚出液を得、また液体培養の場
合には例えば炉過法、遠心分離法などのような公知の適
当な方法により菌体や培地固形物を分離して抽出液、あ
るいは炉液を得ることができる。これら抽出液あるいは
炉液を濃縮し、または濃縮することなく、このものに可
溶性塩類（例えば食塩、硫安、硫酸ナトリウムなどのよ
うな）または親水性有機溶剤（例えばエタノール、メタ
ノール、アセトンなどのような）を添加する沈澱法、あ
るいは安定補助剤（例えばマルトデキストリン、乳糖、
カルポキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール
、スキムミルク、カゼイン、ソルビツト、食塩などのよ
うな）を添加して噴霧乾燥する方法、あるいは凍結乾燥
法、あるいはイオン交予期樹脂、リン酸カルシウムゲル
、アルミナ、ベントナィト等による吸着および脱離法、
あるいはセフアデックス、セフアロース、バイオゲル等
を用いる分子ふるい法、あるいはセルローズ、セフアデ
ツクスィオン交換体を用いるクロマトグラフィー法、蛋
白沈澱剤（例えばタンニン、カルシウム塩などのような
）による沈澱法、等霞沈澱法、透析法、亀気泳動法によ
る不純物の分離法などの精製手段を単独であるいは適宜
組合わせて適用することによってリパーゼ力価を有する
任意純度のリパーゼ製品を採取することができる。本発
明で製造されるリパーゼの性質は次の通りである。Although the culture temperature can be changed as appropriate within the range of 10 to 40 CO, particularly preferred is 20 to 30 CO.
Although the culture period varies depending on the conditions, the culture may be completed for about 1 to 4 days when the maximum amount of lipase is accumulated. The pH of the culture medium only needs to be weakly acidic to weakly alkaline when adjusting the culture medium, and usually there is no need to adjust it, but it is preferably pH 6 to 10, particularly preferably pH 7 to 1.
It is suitable for lipase production if it is adjusted close to . Collection of IJpase from the culture thus obtained can be carried out according to a conventional method for separating and purifying reverse.
In other words, in the case of group culture, extraction is carried out with water or other extractants as is known in the art, and in the case of liquid culture, a well-known suitable method such as filtration method or centrifugation method is used. Depending on the method, bacterial cells and medium solids can be separated to obtain an extract or fermentation liquid. These extracts or filtrate can be concentrated, or without concentration, treated with soluble salts (such as common salt, ammonium sulfate, sodium sulfate, etc.) or hydrophilic organic solvents (such as ethanol, methanol, acetone, etc.). ), or stabilization aids (e.g. maltodextrin, lactose,
(such as carboxymethyl cellulose, polyethylene glycol, skim milk, casein, sorbitate, salt, etc.), or freeze drying, or adsorption and desorption using ion exchange resins, calcium phosphate gel, alumina, bentonite, etc. divorce,
Alternatively, a molecular sieve method using Cephadex, Sepharose, biogel, etc., a chromatography method using cellulose, a Cephadex ion exchanger, a precipitation method using a protein precipitant (such as tannin, calcium salt, etc.), or a chromatography method using a protein precipitant (such as tannin, calcium salt, etc.), or a chromatography method using a protein precipitant (such as tannin, calcium salt, etc.). A lipase product of any purity having a lipase titer can be obtained by applying purification methods such as dialysis, dialysis, and impurity separation methods by turtle electrophoresis alone or in appropriate combinations. The properties of the lipase produced in the present invention are as follows.

■作用本リパーゼは油脂を加水分解し、グリセリンと脂
肪酸にする酵素であり、ディグリセライド、モノグリセ
ィドを分解中間体として生成する。■ Function Lipase is an enzyme that hydrolyzes fats and oils into glycerin and fatty acids, and produces diglyceride and monoglyceride as decomposition intermediates.

■ 基質特異性 油脂及び各種のェステルを基質とした際のりパーゼの活
性を、オリーブ油を基質とした際の活性を１００％とし
た相対活性値で示すと、第１表に示す通りである。(2) Substrate specificity The activity of gluepase when fats and oils and various esters are used as substrates is shown in Table 1 as relative activity values, taking the activity when olive oil as a substrate as 100%.

第 １ 表 基質特異性 第１表より明らかな如く、本リパーゼの基質特異性は天
然油脂の如き高級脂肪酸のグリセリンエステルのみなら
ず、ツウイーン８５のような水溶性ェステルにも作用す
る。Table 1 Substrate Specificity As is clear from Table 1, the substrate specificity of this lipase acts not only on glycerin esters of higher fatty acids such as natural oils and fats, but also on water-soluble esters such as Tween 85.

又、本リパーゼはコレステロールと脂肪酸のェステルに
も作用して脂肪酸とコレステロールに分解する。This lipase also acts on cholesterol and fatty acid esters, decomposing them into fatty acids and cholesterol.

なおコレステロールェステルの分解はしシュロウ等の方
法（広ｓｃｈｒｏｕｅｅｔａｌ．：Ｚ．Ｋ１ｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｋ１ｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２巻４０３頁１９
７仏王）に従って測定し、人血清の凍結乾燥砧品または
コレステロールリノレートを基質として用いた。両基質
に含まれるコレステロールェステルは共に良く分解され
たが、コレステロールリノレートは３７０で急速に分解
された。更に又、斉木等の方法（Ａ亀．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．３２巻１４５９頁１９総年）に従って調製したり
ポプロティンにも作用して脂肪酸を遊離する。■ 至薄
ｐＨおよび安全ｐＨ範囲 本リパーゼの至適ｐＨは第１図に示す通りでｐＨ８５〜
９．の寸近に最大活性を有する。In addition, the method of decomposition of cholesterol esters by Schrou et al.
em. K1in. Biochem. Volume 12, page 403, 19
7), and freeze-dried human serum or cholesterol linoleate was used as the substrate. Cholesterol esters contained in both substrates were both well degraded, but cholesterol linoleate was rapidly degraded at 370. Furthermore, the method of Saiki et al.
em. Vol. 32, p. 1459, p. 19, 2013), it also acts on poprotein to release fatty acids. ■ Extremely low pH and safe pH range The optimal pH for this lipase is as shown in Figure 1, and is from pH 85 to
9. It has maximum activity near .

種々のｐＨの緩衝液中で本リパーゼを５℃、２岬時間保
持したときの残存リパーゼ活性は第２図に示す通りであ
り、ｐＨ６．５〜１０．５の範囲ではぼ安定である。■
作用適温の範囲 本リパーゼの作用適温は第３図に示す通りであり、４０
〜４８００付近に作用適温がある。The residual lipase activity when this lipase is maintained at 5° C. for 2 hours in buffer solutions of various pHs is as shown in FIG. 2, and is almost stable in the pH range of 6.5 to 10.5. ■
Range of suitable temperature for action The suitable temperature for action of this lipase is as shown in Figure 3.
The optimum temperature for action is around ~4800.

■ ｐＨ、温度などによる失活の条件本リパーゼを４単
位／の‘の濃度に水にとかし、７０ｏｏ及び８０℃の温
度に保持し、その活性の経時変化を調べた結果は第４図
に示す通りであり、８０ｑｏ、３０分の熱処理でほとん
ど全部の活性が失活する。■ Conditions for inactivation due to pH, temperature, etc. This lipase was dissolved in water to a concentration of 4 units/cm' and kept at a temperature of 70°C and 80°C, and the change in activity over time was investigated. The results are shown in Figure 4. This is true, and almost all the activity is deactivated by heat treatment at 80 qo for 30 minutes.

Ｚ又、本リパーゼを３７
０でｐＨ３．０又はｐＨ１２．０に保持すると、ｐＨ３
．０で１０分又はｐＨ１２．０で１２０分でほぼ完全に
失活する■阻害 本リパーゼを３７０で１０分間、各種の金属塩とＺ接触
させた後、リパーゼ活性を測定して阻害度を調べた。Z also uses this lipase at 37
0 and maintained at pH 3.0 or pH 12.0, pH 3.
．． Almost completely inactivated in 10 minutes at pH 0 or 120 minutes at pH 12.0 ■Inhibition After contacting this lipase with various metal salts at 370℃ for 10 minutes, the degree of inhibition was determined by measuring the lipase activity. .

１０‐３モルの濃度での主な阻害金属としてはＨｇ十十
，Ｆｅ十十十，ＺｎＨ，ＳｎＨ，ＣｄＨ，Ｃｒ十十十な
どで、いずれも５０％以上の阻害がみられた。The main inhibitory metals at a concentration of 10-3 mol were Hg, Fe, ZnH, SnH, CdH, and Cr, and inhibition of 50% or more was observed in all of them.

又、その他の阻害剤としてはアスコルビ２ン酸ソーダ、
モノョード酢酸が阻害を示したが、フェリシアンカリ、
ピロリン酸塩、ナトリウムアザィド、、ＥＤＴＡ等によ
り殆んど阻害されなかった。■ 活性化
２後述のリパーゼ活性測定法にお
いて各種胆汁酸成分を加えてリパーゼ活性を比較すると
、第２表に示す通り、本リパーゼは明らかに胆汁醸成分
で活性化された。Other inhibitors include sodium ascorbytate,
Monoodoacetic acid showed inhibition, but ferricyankali,
It was hardly inhibited by pyrophosphate, sodium azide, EDTA, etc. ■ Activation
2 In the lipase activity measurement method described below, various bile acid components were added and the lipase activities were compared. As shown in Table 2, this lipase was clearly activated by the bile brew components.

第２表 （注）表中の数字は胆州酌数壷仲欄添加の場合のりパー
ゼ活性を１００としてそれに対する棚蹄を示偽 ■ 力価の測定法 ａ）反応液の組成 酵 素 液 １．０の【ｐＨ８．
７、１モルグリシン緩衝液 ２．０叫オリーブ油
ェマルジョン ２．５凧【蒸 留 水
０．５の【上記オリーブ油ヱマル
ジョンはアラビアガム１０％水溶液１８０の‘にオリー
ブ油２０夕を加え、５〜１ｏｏ０に冷却しつつ１１００
瓜ｐｍで１５分間ホモゲナイズし、ｐＨ８．７に調節し
たものある。Table 2 (Note) The numbers in the table are based on the gluepase activity of 100 in the case of addition to the middle column of the Golju Chakuzu pot.Method of measuring titer a) Composition of the reaction solution Enzyme solution 1 .0 [pH8.
7.1 Morglycine buffer 2.0 Olive oil emulsion 2.5 Kite [distilled water
[The above olive oil emulsion is made by adding 20 parts of olive oil to 180 parts of a 10% aqueous solution of gum arabic, and heating to 1100 parts while cooling to 5~100 parts.
Homogenized with melon pm for 15 minutes and adjusted to pH 8.7.

ｂ）操作 反応液を２５凧‘の共栓試験管に入れ、３７０にて１０
分間正確に反応させた後、２規定の硫酸１泌を加えて反
応を停止し、ｎ−へブタン：イソプロパノール１１：４
の混合液を１５の‘加え、３栃砂間激し〈振渇する。b) Operation Put the reaction solution into a 25' stoppered test tube and incubate at 370°C for 10
After reacting for exactly 1 minute, the reaction was stopped by adding 2N sulfuric acid, and n-hebutane:isopropanol 11:4
Add 15 minutes of the mixture and shake vigorously for 3 minutes.

３０分以上静遣した後、上層を５の‘採取し、０．０１
規定のエタノール性苛性カリ溶液を用いチモールブルー
を指示薬としＮ２ガスを通しながら滴定する。After standing still for more than 30 minutes, collect 5' of the upper layer and 0.01
Titrate using a specified ethanolic potassium hydroxide solution using thymol blue as an indicator while passing N2 gas.

同じ反応組成で２規定の硫酸溶液を加えた後酵素液を加
えて上記と同様の処理を行い、得た苛性カリ溶液の滴定
値を差引く。差引いた残りの滴定値をあらかじめ既知量
のパルチミン酸を加えておいて求めた標準直線から反応
液全体で遊離された脂肪酸量として算出する。After adding a 2N sulfuric acid solution with the same reaction composition, an enzyme solution is added and the same treatment as above is performed, and the titration value of the obtained caustic potassium solution is subtracted. The remaining titration value after subtraction is calculated as the amount of fatty acids liberated in the entire reaction solution from a standard straight line obtained by adding a known amount of palmitic acid in advance.

この反応条件で１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離
させる酵素量を１リパーゼ単位とする。■ 精製方法 本リパーゼの精製方法は塩析、セルロースイオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル炉週などを適宜組み合わせて行
われる。The amount of enzyme that releases 1 micromole of fatty acids per minute under these reaction conditions is defined as 1 lipase unit. ■ Purification method The purification method for this lipase is carried out by appropriately combining salting out, cellulose ion exchange chromatography, gel furnace heating, etc.

その具体例は実施５ 例５に示す通りである。■ 分子
量ゲル炉適法により求めた本酵素の分子量は３５０００
０〜３７００００である。A specific example thereof is as shown in Example 5. ■ Molecular weight The molecular weight of this enzyme, determined using a gel furnace method, is 35,000.
It is 0 to 370,000.

■ 等電点 ０ 結晶構造の解析、および元素分析は、本酵素が結
晶化されていないので実施出来ない。■ Isoelectric point 0 Crystal structure analysis and elemental analysis cannot be performed because this enzyme has not been crystallized.

しし、キャリアーアンホラィン（ＬＫＢ社製）を用いた
等露点電気泳動法で等電点を測定すると４．５±０．５
である。■ リポプロティンリパ−ゼ活性 本酵素はリパーゼ活性を有すると同時にリポプロティン
リパーゼ活性も有する。The isoelectric point of Shishi is 4.5±0.5 when measured by isodew point electrophoresis using Carrier Amphorine (manufactured by LKB).
It is. ■ Lipoprotein lipase activity This enzyme has lipase activity as well as lipoprotein lipase activity.

リポプロティンリパーゼ活性の測定は斉木等の方法（Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２等、１４５９頁、
１９筋年）に従って行ったｏ以上のように本リパーゼの
性質はその作用鞍簿ｐＨ（アルカリ側）、胆汁酸塩類に
よる活性化の点＊において動物のスィ胸リパーゼによく
似ているが、更に又、本リパーゼはコレステロールェス
テルを分解する能力をも持つており、このような性質を
もったりパーゼがアルカリゲネス属の菌により生産され
る事は見出されていない。Lipoprotein lipase activity was measured by the method of Saiki et al. (A
gric. Biol. Chem. 32 etc., 1459 pages,
As described above, the properties of this lipase are very similar to animal chest lipase in terms of its active pH (alkaline side) and activation by bile salts*, but in addition Furthermore, this lipase also has the ability to decompose cholesterol esters, and no pase with this property has been found to be produced by a bacterium of the genus Alcaligenes.

参考のために本リバーゼとこれに類似のリパーゼとの比
較第３表に示した。第３表 この第３表の中ではクロモバクテリウム・ビスコサム、
フコマィセス属及びムコール・ジヤバニクスにより生産
されるリパーゼは胆汁酸による活性化の倍率は似ている
が、作用最適軸日が中性付近にあり、本発明により得ら
れるリパーゼとは異る。For reference, Table 3 shows a comparison between the present lipase and similar lipases. Table 3 In this table, Chromobacterium viscosum,
The lipases produced by the genus Fucomyces and Mucor jabanicus have similar activation rates with bile acids, but their optimum axis of action is near neutrality, which is different from the lipase obtained by the present invention.

又、シュウドモナス・フラジにより生産されるリパーゼ
は胆汁酸により賦活されない。シュウドモナス・ステウ
ツェ川こより生産されるリパ−ゼは胆汁酸により賦活さ
れる倍率が男るし、作用最適ｐＨの曲線は本リパーゼの
もの（第１図）とはかなり異っている。又、本発明者等
が先に発見した侍磯昭５０一９５４３８号のアルカリゲ
ネス属に属する名糖ＰＬ−２６６号（徴工研菌寄第３１
８７号）の生産するりパーゼとはその作用最適温度が異
る他、コレステロールェステルを分解する能力を有して
いる点でも異っている。以上の事から本リパーゼは新規
なもと考えられる。次に本発明の実施例を示すが、本発
明はこれら実施例により制限されるものではない。Furthermore, the lipase produced by Pseudomonas fragi is not activated by bile acids. The lipase produced from Pseudomonas steuze river is activated by bile acids at a higher rate, and the optimum pH curve for its action is quite different from that of the present lipase (Figure 1). In addition, Meito PL-266, which belongs to the genus Alcaligenes of Samurai Isosho No. 50-195438, which the present inventors discovered earlier (Shokoken Bacteria No. 31
It differs from the lipase produced by No. 87) in its optimum temperature of action and also in having the ability to decompose cholesterol esters. Based on the above, this lipase is considered to be a novel source. Next, examples of the present invention will be shown, but the present invention is not limited to these examples.

実施例 １ 大豆粉３％、脱脂大豆粉１％、コーンステープリカー１
％、小麦澱粉１％、リン酸ニカリ０．５％、硝酸ナトリ
ウム０．２５％を含む液体培地のｐＨを８．０に調節し
、この５０の【ずつを５００のとの肩つきフラスコに分
注して１２０ｏｏで１５分間蒸気殺菌を行う。Example 1 3% soybean flour, 1% defatted soybean flour, 1% cornstap liquor
Adjust the pH of a liquid medium containing 1% wheat starch, 0.5% dipotassium phosphate, and 0.25% sodium nitrate to 8.0, and divide 50 μl into 500 μl flasks with a shoulder. Pour and steam sterilize at 120oo for 15 minutes.

これに名糖ＰＬ−６７９号（徴工研菌寄第３７８３号）
を接種し、３０ｑｏにて４加持間振縁培養した後、培養
液を遠心分離し、その上燈のＩＪパーゼ活性を測定した
ところ、５０単位／机上であった。この液１００の‘に
硫安を０．５飽和になるように添加し、生じた沈澱区分
を集めて乾燥すると粗酵素粉末１．５夕が得られ、この
粉末のリパーゼ活性は２５６山単位／夕であった。実施
例 ２ 実施例１に記載の培地にソルビタンオレィルェステル０
．５％を添加する以外は実施例１に記載したと同様に操
作し、培養液の上燈のＩＪバーゼ活性を測定すると、３
５１単位／泌であった。In addition to this, Meito PL-679 (Shikoken Bacteria No. 3783)
After inoculation and shaking culture at 30 qo for 4 cycles, the culture solution was centrifuged and the IJpase activity of the supernatant was measured, and it was found to be 50 units/table. Ammonium sulfate was added to 100 parts of this solution to give a saturation of 0.5 parts, and the resulting precipitate fraction was collected and dried to obtain 1.5 parts of crude enzyme powder, and the lipase activity of this powder was 256 units/day. Met. Example 2 Sorbitan oleyl ester 0 was added to the medium described in Example 1.
．． The same procedure as described in Example 1 was carried out except that 5% was added, and when the IJ base activity of the top light of the culture solution was measured, 3
It was 51 units/secretion.

この液から実施例１に記載したと同様にして酵素粉末の
採取を行い酵素粉末１．４夕が得られた。この粉末のリ
パーゼ活性は１６０００単位ノタであった。実施例 ３
大豆粉３％、脱脂大豆粉０．５％、コーンステイープリ
カー０．５％、小麦澱粉０．１％、リン酸二カリ０．２
％、ポリエチレンステアリルエーテル０．５％、硝酸ナ
トリウム１．０％、シリコン０．０７５％を含む液体塔
地のｐＨを９．５に調節し、その５０叫を５００泌つき
フラスコに分注し、１２０ｑｏ、１流ご間蒸気殺菌を行
う。Enzyme powder was collected from this solution in the same manner as described in Example 1, and 1.4 hours of enzyme powder was obtained. The lipase activity of this powder was 16,000 units. Example 3
Soy flour 3%, defatted soy flour 0.5%, cornstarch liquor 0.5%, wheat starch 0.1%, dipotassium phosphate 0.2
%, polyethylene stearyl ether 0.5%, sodium nitrate 1.0%, and silicone 0.075%. The pH of the liquid column was adjusted to 9.5, and 50% of the solution was dispensed into a 500% flask. 120qo, perform steam sterilization between the first stages.

これに名糖ＰＬ−６７ｙ号（徴工研菌寄第３７８３号）
を接種し、３０ｑｏにて４畑時間振顔培養した後、培養
液に炉過助剤も加えて炉過する。この培養炉過液のＩＪ
パーゼ活性は５００単位／の‘であった。この炉過液５
００柵に冷アセトンを８０％になるまで徐々に加える。
生じた沈澱を集め、冷アセトンで洗浄後、乾燥して粗酵
素粉末１２．５夕を得た。この粉末のリパーゼ活性は１
３２０山単位／夕であった。実施例 ４実施例３に記載
の培地１５のこクエン酸ナトリウム０．４％と硫酸第１
鉄０．０２８％を添加し、３０そ客ジャーファーメンタ
ーに入れ、消泡剤としてシリコン油を５夕加えて蒸気殺
菌した。In addition to this, Meito PL-67y (Shikoken Bacteria No. 3783)
After inoculating and shaking the culture for 4 hours at 30 qo, the culture solution is filtered with a furnace additive added. IJ of this culture furnace filtrate
The pase activity was 500 units/'. This furnace filtrate 5
Gradually add cold acetone to the 00 fence until it reaches 80%.
The resulting precipitate was collected, washed with cold acetone, and dried to obtain 12.5 grams of crude enzyme powder. The lipase activity of this powder is 1
It was 320 mountain units/evening. Example 4 Medium 15 described in Example 3 with 0.4% sodium citrate and 1st sulfuric acid
0.028% of iron was added, and the mixture was placed in a jar fermenter for 30 minutes, and silicone oil was added as an antifoaming agent for 5 days to sterilize with steam.

これに名糖ＰＬ−６７９（徴工研菌寄第３７８３号）を
接種し、２４℃にて３鞘時間通気擬拝して培養を行った
。この培養液を炉遇すると８０山単位／の乙の炉過液１
２．０夕が得られ、この液の２８仇帆での吸光度は１０
０であった。この炉週液２．４夕に硫安を４０％飽和に
なるように添加し、５℃にて２４時間放置した後、上燈
部分を抜き取り、沈澱部分を遠心分離して集めた。硫安
添加によって生じた沈澱中には約７３％のＩＪパーゼ活
性が回収された。実施例 ５ 実施例４で得られた硫安沈澱物をセロフアンチューブに
入れ、流水中で２日間透析後、更に０．０１Ｍ、ｐＨ９
．０のトリス緩衝液を外液とし５℃にて２独時間透析し
た後、炉過して１．３そのの酵素液を得た。This was inoculated with Meito PL-679 (Choken Bacteria No. 3783) and cultured under aeration at 24°C for 3 hours. When this culture solution is treated in a furnace, 80 mounds/unit of the furnace filtrate 1
2.0 yen was obtained, and the absorbance of this liquid at 28 yen was 10
It was 0. Ammonium sulfate was added to the reactor solution at 40% saturation and left at 5° C. for 24 hours, then the top part was extracted and the precipitated part was centrifuged and collected. Approximately 73% of IJpase activity was recovered in the precipitate produced by addition of ammonium sulfate. Example 5 The ammonium sulfate precipitate obtained in Example 4 was placed in a cellophane tube, dialyzed in running water for 2 days, and then further diluted with 0.01 M, pH 9.
．． The mixture was dialyzed for 2 hours at 5°C using 0.0 Tris buffer as an external solution, and then filtered through a furnace to obtain a 1.3-2.0 enzyme solution.

この酵素液のりパーゼ活性は１０２０単位／私であり、
２８仇ｍ山の吸光度は２８．５であった。つぎに０．０
１Ｍ、ｐＨ９．０のトリス緩衝液で充分に平衡化したＤ
ＥＡＥーセルロースィオン交換体にこの酵素溶液を吸着
させ、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液と０．４モルのＮａ
ＣＩを溶解した同緩衝液とで濃度勾配を作り、徐々にＮ
ａＣＩ濃度を上げながらリパーゼ活性を港出させた。Ｎ
ａＣＩ濃度０．０５〜０．２モルの範囲でリパーゼ活性
は溶出されるから、活性を測定して活性区分を集めた。
この区分を濃縮した後、セファデックスＧ‐２０リセフ
ァロース蟹の順に通してゲル炉過を行い活性区分を集め
た。この活性区分を集めて再び透析処理を行った後、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースイオン交換体に吸着させ、食塩によ
る濃度勾配法により活性を溶出させた。次にこのリパー
ゼ活性区分を濃縮し、凍結乾燥して精製リパーゼ粉末２
６３の９を得た。この様にして得た精製酵素粉末の０．
１％溶液の２８仇ｍの吸光度は０．４３であり、リパー
ゼ活性は８９０単位／の９であった。This enzyme solution gluepase activity is 1020 units/I,
The absorbance of the 28m mountain was 28.5. then 0.0
D fully equilibrated with 1M, pH 9.0 Tris buffer.
This enzyme solution was adsorbed onto EAE-cellulose ion exchanger, and after washing with the same buffer, the same buffer and 0.4 mol Na
Create a concentration gradient with the same buffer solution in which CI was dissolved, and gradually add N.
Lipase activity was increased while increasing the aCI concentration. N
Since lipase activity was eluted in the aCI concentration range of 0.05 to 0.2 mol, the activity was measured and the active fraction was collected.
After concentrating this fraction, it was gel filtered through Sephadex G-20 Resepharose Crab to collect the active fraction. After collecting this active fraction and performing the dialysis treatment again, D
It was adsorbed onto an EAE-cellulose ion exchanger, and the activity was eluted using a concentration gradient method using sodium chloride. Next, this lipase active fraction is concentrated and lyophilized to produce purified lipase powder 2.
I got 9 out of 63. The purified enzyme powder obtained in this manner has 0.
The absorbance at 28 m of the 1% solution was 0.43, and the lipase activity was 890 units/9.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は本発明により製造されるリパーゼのｐＨと活性
の変化を示す図であり、第２図は本発明により製造され
るリパーゼのｐＨ安定曲線であり、第３図は本発明によ
り製造されるリパーゼの温度と活性の変化を示す図であ
り、第４図は本発明により製造されるリパーゼの熱耐性
を示す図である。 第１図 第２図 第３図 第４図FIG. 1 is a diagram showing changes in pH and activity of the lipase produced according to the present invention, FIG. 2 is a pH stability curve of the lipase produced according to the present invention, and FIG. 3 is a diagram showing the pH stability curve of the lipase produced according to the present invention. FIG. 4 is a diagram showing changes in temperature and activity of lipase produced according to the present invention, and FIG. 4 is a diagram showing heat resistance of lipase produced according to the present invention. Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ アルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を培地に
培養し、この培養物からアルカリ側に至適ｐＨをもち胆
汁酸塩により活性化され、かつコレステロールと脂肪酸
のエステルを分解する能力を有するリパーゼを採取する
ことを特徴とする新規なリパーゼの製造法。 ２ アルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を非イオ
ン界面活性剤を添加した培地に培養し、この培養物から
アルカリ側に至適ｐＨをもち胆汁酸塩により活性化され
、かつコレステロールと脂肪酸のエステルを分解する能
力を有するリパーゼを採取することを特徴とする新規な
リパーゼの製造法。[Scope of Claims] 1. A lipase-producing bacterium belonging to the genus Alcaligenes is cultured in a medium, and the culture is found to have an optimal pH on the alkaline side, be activated by bile salts, and have the ability to decompose cholesterol and fatty acid esters. 1. A novel method for producing lipase, which comprises collecting lipase having the following properties. 2 A lipase-producing bacterium belonging to the genus Alcaligenes is cultured in a medium supplemented with a nonionic surfactant, and from this culture the culture has an optimal pH on the alkaline side, is activated by bile salts, and decomposes cholesterol and fatty acid esters. 1. A novel method for producing lipase, which comprises collecting lipase having the ability to