JPS60118751A - 第四級化フタロシアニン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフタロシアニン化合物ならびにこれを生物学的
染色剤としてまたは染料として使用１−る方法の分野に
関する。

組織および細胞の独類なその染色性によって弁別するこ
とは長い間組織学および血液学における土費な手段であ
った。敬橿のフタロシアニン化合物がこのような用途に
使用されることで知られている。これらのうち最初に発
見されたもσ）しまアルシアンブルーと呼ばれ次のよう
な構造を有して℃する： ｘ−ハ陰イオン例えばノ＼ロｒンイオンである）。

アルシアンブルーは好塩基性細胞の弁号ｌ］用染色に使
用されてきた。この銅フタロシアニンカチオン染料は単
独で使用する場合好塩基性糸１１胞σ−）運択的染色を
達成し得る程十分には特異性でな（・。というのはこの
染料はポリヌクレオチド９１ＪえＧ了ＤＮＡおよびＲＮ
Ａを有する他の細胞をも染色するからである。さらに、
好塩基性細胞が染色されるのはその中の硫酸化多糖であ
るヘパリンの独得の存在のためである。所望の選択性を
確立する−りの方法はこれを廊化ランタンと併用するこ
とで、塩化ランタンはポリヌクレオチドのリン酸基を遮
蔽して、これが７タロシアニン陰イオンと結合するのを
防止する。

アルシアンブルーの使用には精密に調節した強い酸性Ｐ
Ｈが必要でまたこのものは熱に不安定である。アルカリ
性ｐｌ（で、また熱せられた場合アルシアンブルーは粒
状物（不溶性染料）を形成する。

沈殿を生ずるこの性質はアルシアンブルーな含む試薬に
おいて長年の間問題であった。自動分析機器にはこれら
の沈殿を回収する部品例えば濾過器が含まれている。こ
れは測定の信頼性に影響し、この測定法を実施する機器
の操作の妨害になることさえある。それにもかかわらず
この染料はその特異性および明確な色のために優れた染
料と考えられてきた。アルシアンブルーに関するさらに
詳しい背景的情報については、Ｇ１１ｂｅｒｔらの１ア
ルシアンブルーを使用する新染色法による好塩基件細胞
計数」、（Ｂｌｏｏｄ　、　４６　：　２７９−２８６
（１９７５））を参照されたい。

その他の７タロシアニン染料がそれ以後開発されている
。例えばＢｌｏｏｍら（ｌ（ｉｓｔｏａｈｅｍｉｅ　、
　２　：４Ｂ−５７（１９６０））は誘導体化されてい
ないアストラーブルー（遊離塩基）を使用する、ムコ多
糖を含む生物学的組織、特にマスト細胞の染色を開示し
ている。アストラーブルー遊離塩基はｐＨ０，２−０，
３で使用され、このＰＨでは正に荷′市している。ＰＩ
″ｌ００３でイオン化される硫酸誘導体例えばヘパリン
が、ｐＨ３，０でイオン化されないリン酸誘導体例えば
ＤＮＡの弱さに比して本質的に強いため、この低い−に
よって選択性が与えられる。

工ｎａｇａｋｉ　（Ａｃｔａ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ
ａ　、Ｔａｐｏｎｉｃａ　％３２（４）：６４２−６４
７（１９６９））は遊離塩基アストラゾルーと固定液の
アクリジンオレンジメタノール溶液（…約０．６）とを
使用する好塩基性細胞およびマスト細胞顆粒の染色法を
記述している。工ｎａｇａｋｉは末梢血液および骨髄塗
沫物の固′定用としてセチルピリジニウムクロリドの無
水メタノール飽和溶液およびアクリジンの無水メタノー
ル飽和溶液を検討した。セチルビリゾニウムクロリドは
好塩基性細胞顆粒およびマスト細胞顆粒を確実に保存し
たがアストラブルー染色は妨害される１噴向があった。

アクリジンは上記の方法においてこれらの細胞顆粒を十
分に保存することができなかった。

５ｃｏｔｔは、「陽イオン性フタロシアニン染料による
組織化学的染色の分子生物学、アルシアンブルーの代替
の構想（Ｊ９Ｍｉｃｒｏθｃｏｐｙ、１１９：３７３−
３８１（１９７９））において、下記■ａで示される市
販のアストラブルー遊離塩基（バイエル社、Ｌθｖｅｒ
ｋｕｓｅｎ　、***）は硫酸ジメチルによってメチル化
してＩｂに示される第四級化（メチル化）アストラグル
ーを生じ得ることを示している。

これらの化合物を細胞または組織材料σ）染色に使用す
ることは５ｃｏｔｔは示さなかったカー、この目的のた
めにアルシアンブルー以外σ）化合物を見℃）だそうと
いう願望は表明された。これら）　ＩＪメチル第四級塩
およびその他のフタロシアニン染料＆まポリアニオン例
えばヘパリン、ボ１ノがラクツロナ−トＤＮＡおよびＲ
ＮＡ　Ｙ染色することカを示された。

すなわち５ｃＯｔｔはこれらの化合物か好地基性細胞の
弁別に必要な様には選択的にヘノ上１１ンと反応しない
ことを教示している。

要約すれば、アル７アンプルーとアストラグルー遊離塩
基は好塩基性細胞な他σ）白血球力・ら弁Ｍｌｌするこ
とが知られているこの４■の唯一の化合物である。アル
シアンブルー試薬の不安定性は長年の問題で未だに解決
されていない。従って、他の白血球との対比において選
択的に好墳基性細胞を染色し、かつ溶液中で長時間安定
である化合物が依然として必要とされている。

本発明の化合物は好塩基性細胞と選択的に結合し、溶液
中で安定である。これらの化合物は、強酸性の試薬を避
けなければならない自動化された面液学システムに特に
適した組成物に有用に使用することができる。かかる強
酸性試薬は承りエステル界面活性剤の分解を起す上、そ
れらはシアン化物を含んでいてこれが有毒ガスとして放
出されることによる潜在的な危険の可能性がある。

本発明の関する化合物は次の構造を有している：〔不式
においてＡＩ　−Ａ、はそれぞれ独立して水素原子から
、スルホナトか、または少くとも１個のへテロ原子を含
有しているＣ’１＝　Ｃ７炭化水素残基かであり、ここ
でａｌ−Ａ、の少くとも一つは１ （不式においてＲ１−１３はそれぞれ独立して低級アル
キル基か、シクロアルキル基かオレフィン残基かであっ
てその少くとも一つはＣ２−Ｃ，で、２個が合同して環
を形成していてもよく、Ｒ４は水素原子またはＣ１−Ｃ
，アルキル基であり、ｎは１から６までの整数である） であるものとし、Ｍは多価金属イオンであり、ｘ−は水
溶性陰イオンである〕。Ａｌ　−Ａ４の少くとも二つ、
特にＡｌ　−Ａ、の少くとも三つが上記の構造であるこ
とが好ましい。上記の化合物中が・も好ましいのはＲ１
−Ｒ３の少くとも一つがエチル基、プロピル基またはア
リル基でありｎが２または６である化合物である。

この第四級化ンタロシアニン化合物はアストラプルー遊
離塩基を水溶性陰イオンと低級アルキル基、シクロアル
キル基またはオレフィン残基であつ【その少くとも一つ
はＣ２−’Ｃ４であり、二つが合同して環を形成してい
てもよい基とを含有して成る物質と反応させ、その反応
生成物を回収することによって得られる。好ましくは、
水溶性陰イオンは臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオ
ンまたは硫酸イオンであり、この物質のもう一部の成分
はエチル基、プロピル基またはアリル基である。

この物質の例としてはヨウ化ｎ−プロピル、具化エチル
、具化ｎ−プロピル、具化ｎ−ブチルおよび臭化アリル
が挙げられる。

前記の第四級アンモニウムイオンは水性試薬中に広い−
の範囲例えば０．２−１０でよく溶解し従って、危険を
伴う低い−（範囲を使用する必要がない。これらの新規
化合物はここに記述する組成物の一部として使用する場
合、好塩基性細胞を染色するが他の血球を染色しない優
れた選択性を示す。

さらにこれら化合物は好塩基性細胞を選択的に染色する
のに使用される溶液中で安定で、例えば長期間、例えば
６ケ月間４５℃で沈殿を生じない。

この安定性は自動分析装館用の試薬においては９！！に
重要である。

本発明はさらに、少くとも上記の化合物、塩化ランタン
および赤血球を溶解するのに有効な界面活性剤を混合し
た試薬組成物を提供する。好ましくはこの組成物は追加
的な塩例えば塩化ナトリウムを含有する。この組成物は
好塩基性細胞を他の崩球に優先して、アストラブルーや
その第四級化されたメチル訪導体に比してより特異的に
染色する。性能は流動式血球計勇、法忙よって示される
通り標準化合物であるアルシアンブルーより優れている
。

不発明の化合物は芳香族環の少くとも一つが置換されて
いるフタロシアニン誘導体である。好ましくは環のうち
二つ以上が本発明により、決起の構造 １ （２Ｆ：式においてＲ１＋　１３はそれぞれ独立して低
級アルキル基、シクロアルキル基またはオレフィン残基
であってその少くとも一部はＣ２−Ｃ４で二個が合同し
て環を形成していてもよいものとする）を有する残基に
よって置換されている。最も好ましい！線径においては
Ｅｌ　−Ｒ３の少くとも一つは′エチル基、ゾロビル基
またはアリル基であるウシクロペンチルメチル基も好ま
しい。”Ｉ　ＢＳのうち２個以上が０２−　Ｃ，アルキ
ル基、好ましくはエチル基またはプロピル基であっても
よい。Ｒ１−狗の一つのみが上記のような基である場合
には他の二つは同一であることが好ましく、この場合に
はそれらは通常メチル基である。

前記の態様のいずれにおいてもＲ４は水素原子またはＣ
ＩＣ，、アルキル基であってよい。好ましくはＲ４は水
素原子である。

前記の構造において、２個の窒業原子の間にはアルキレ
ン部分が位置しており、これはｎ個（ｎは１から６まで
の聚＃１）のメチレン単位を有することができる。好ま
しくはｎは２または６である。

フタロシアニン環榴造は分子の中心に結合した多価金属
イオンを有することを特徴としている。

Ｎは、好ましくは銅、ニンヶル、亜鉛、コバルト、マグ
ネシウム、鉄、マンガンまたはクロムから選ばれる、多
価全極イオンである。

本発明の化合物は第四級化された誘導体であって、その
正の電荷のため、本来、水溶性飽イオンのＸ−の存在に
おいて存在しなけｉはならない。

かかる陰イオンは好ましくは臭素イオン、塩素イオン、
ヨウ素イオンまたはＯＩコ酸イオンである。

好ましくは、前記構造で述べた以外の環の１次換基は水
素原子、スルホナト、＠鎖状のまたは枝分れした飽和ま
たは不飽和の脂肪族または脂環式炭化水素残基、置換さ
れているかまたはされていないアリール基またはへテロ
アリール基、ペンシル基、または酸素原子かアルキル化
し得ない窒素原子か僅昨原子かによって置換されたベン
シル基である。

本発明によれば）記の化合物はある神の白血球（好耶基
性細胞）を選択的に着色しそれ以外を着色しない染料ま
たは染色剤として有用である。ヒトの白血球はリンパ球
、単球および多形核白血球（ＰＭＮｎ　）に公海１され
る。ＰＭＮｓは顆粒状で、細胞質顆粒の染色特性に基い
て好中球、好酸球および好塩基性細胞に小分類される。

正常なヒト血液中のこれらの細胞種および相対的截は次
の通りである： 細胞の種類　バニセント　絶対斂　（μ１ｌｆｉす）多
形核白血球 好中球　４０−７５　２．５［］］０−７，５００好酸
球　１−６　４０−４４０ 好塩基性細胞　１　１５−１００ 単　球　２−１０　２００−８００ リンパ球　２０−４５　１．５００−５，５００試料中
の好塩基性細胞徂１１定用の本組成物は、少くとも、前
記の本発明の化合物、塩化ランタンおよび赤血球を溶解
するに有効な界面活性剤を含有して成る。

塩化ランタンは核酸の染色を選択的に阻害する。

好ましい界面活性剤としてはセチルピリジニウムクロリ
ドおよびンルビトールの不飽和脂肪酸エステルのポリオ
キシエチレン誘導体例えばツイーン２０（米国ＩＣ１社
、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、プラウエア州）が挙げられる
。セチルビリゾニウムクロリド＆ま赤血球を溶解し、望
ましくない沈＃を除き、赤血球細胞膜溶解質の凝集を防
止する。

本組成物はアルカリ金属塩例えば塩化ナトリウム、緩ｆ
Ｉｉ前および所望の虻四〇−盪を侍るに有効なものを含
むそのイΦの危険のない成分を含有することができる。

以下の実施例は本発明の開発に際して行った実験を記述
するものである。可能な場合は常に標準的の市販試姥級
薬品を使用した。

例　１ プロピルアストラブル−第四級アンモニウムヨージーの
合成 アストラブルーの第四級化プロピル誘導体を合成するた
め、５００ＩｒＬｌ三碩丸底フラスコ内のジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ　）　４５　ｍｌにアストラブル−６
ＧＬＬ遊離塩基〔モペイケミカル社（ビンッパーク、ペ
ンシルバニア州）から入手３１０．０．９をかきまぜな
がら加えた。一つの頚にはＣａＣｌ２乾燥・Ｕを有する
還流冷却器を、別の顕にはヨウ化ｎ−プロピル６、Ｌｌ
ｄ（Ｉ　Ｑ、５　ｇ）とＤＭＦ　５．Ｑ　ｍｅとを入れ
た滴ド漏斗を、第三の顕忙はすり合せがラス栓を取４づ
けた。１０分間かきまぜて遊離塩基が完全に溶解した後
、ヨウ化ｎ−プロピルσ）　ＤＭＦ　＃ｉ＆を２０分間
で滴加した。反応フラスコをアルミ箔で傑って光を遮断
し、内部の反応混合物を室温（２４−２６℃）で２４時
間かきまぜた。次にその一定量をとり、遊離塩基σ）　
ＤＭＦ浴液試料と共に、ｔ−ブタノール：Ｐ％ＮＢ４０
Ｈ＝１（２０１：１：１σ）クロマトグラフィ溶液を使
用してヘーノ々−クロマトグラフィによって分析した。

これにより、出発原料（Ｆｌ、１．０）はほとんど残存
して℃・な℃・ことが判明した。クロマトグラム上Ｒｆ
Ｏ，８とＯ，Ｑとに育色生成物が見いだされた。

次に反応混合物を５００１ｒＬｌ−顕丸底フラスコに移
した。三顆反応フラスコは水１０〃語で２回洗浄し洗液
は一顆フラスコに加えた。−顧フラスコをロータリー蒸
発装置に取付け、水およびコ尚仙１σ）ヨウ化ｎ−プロ
ピルを水流ポンプで４０℃で１５分分間光除去した。蒸
発した留分＋ｔＨ＠した。空になった受器フラスコをロ
ータリー蒸発装置に再び取付けて氷水浴に浸し、ＤＭＦ
を真空ポンプ（Ｑ、１　ｍ＋ｘＨｇ　）により４０℃で
２０分間貿去しに色固体を得た。この固体を６器ｍｌの
半融がラス漏斗に移し５Ｑｒｎｌづつ６回、ジエチルエ
ーテルで洗浄して残存溶媒およびアルキル化剤を除去し
た。洗浄した固体は２５℃で１時間吸引乾燥した。収幇
１５．０，９゜ 赤外透過 工Ｒ（ＫＢｒ）　：　１１定結果＝１１５５および１５
２７ｃｒＩＬ−よ１ ８−０伸縮振動に対してそれぞれ１１８０−１１４０ｃ
ｍ　”および１３５０−１３００ｃｍ、−”。

紫外−ＢＪ視（ＤＭＦ　）−深宵色溶７ｆｉ　：　ｍａ
ｘ、（ｎｍ）λｍａｘ、　ε ３４５　５２．１００ ６０４　５２．２００ ６７０　１２１．０００ 観察されたスペクトルは典壓的な金属フタロシアニンの
ものである。５ａｙｅｒら、ＡＯＣＯｕｎｔｌＩｌ　ｏ
ｆＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１５　：　７
５−７９（１９８２）を参照されたい。

元素分析 ０５６Ｂ’／３Ｎ１４０６Ｓ３Ｉ３Ｃｕ例えば銅フタロ
シアニン［５０２ＮＥ（ＣＨ２）２Ｎ”（ＣＨ３）、Ｃ
Ｈ２ＣＨ２ＣＩ（３〕３ニーに対する理論値：　Ｃ４２
，６％、！（４，６３％、Ｎ　１２．４％。

分析値：　Ｃ４２，５３％、Ｅ　４．５４％、Ｎ１３．
２２％同族体の合成、も行った。アルキル化は上記と同
様にしてアストラブルー＋Ｓ　ＧＬＬ遊離塩がと次のア
ルキル化剤を使用して行った：ヨウ化メチル、臭化エチ
ル、臭化ｎ−プロピル、臭化ｎ−ブチル、臭化ｎ−ペン
チル、臭化シクロプロピルメチル、臭化アリルおよび塩
化ペンシル。臭化物、ヨウ化物のいずれによって得た物
も上記と同様な分ｅｒ結果を示した。

例　２ 好塩基性細胞試薬の性能比較試験 これらの実験に使用した好墳基性細胞試梨組成物は次の
ようにして調製した。脱イオン水７Ｑｍｌを１００ｍ１
メスフラスコに入れ、次いでセチルピリジニウムクロリ
ド０．０７６　＆を加え、完全ニ溶解するまでかぎまぜ
た。次にＬａＣＪ３＊６Ｈｇ○（塩化ランタン）　Ｏ−
７０１１，ＨａＣｌ　Ｏ，９０ｇおよびツイーン２０　
０．２１ｍＪを加え、混合物を完全に溶解する迄かきま
ぜた。これに、例１と同様にして画表したプロピルアス
トラブル−６ＧＬＬ　彫四級アンモニウムプロミド０．
３０　ｇを完全に溶解する迄かきまぜながら加えた。次
に脱イオン水を標線まで加えた。次にこれを１μフイル
ターで瀘、過した。

同様に、アメトラブル−６０ＬＬ遊離塩基とヨウ化メチ
ル、臭化エチル、臭化ｎ−ブチル、臭化ｎ−ペンチル、
臭化アリルおよび塩化ベンシルとの反応で調↓したアス
トラブルー６ＧＬＬのアルキル化誘導体のそれぞれを使
用してＭｉｔ記と同様にしてｉ　Ｑ　Ｑ　ｍｌずつの試
薬組成物をも調製した。

添加した染料がアルシアンゾル−（０，１４９／ｅＬｌ
）である以外は上記と同様にして対照試薬組成物を調製
した。

上記試柴組成物全鄭の６１　Ｕ　ｎｍにおける吸光度を
、水で１００倍に希釈した液の吸光度を測定してめた。

ベンクマンＤＵ７分元光度計（ペンクマンインスンルメ
ント社、７ラートン、カリホルニア州）で光路長１（ｍ
で測定した結果それぞれの吸光度は同一、すなわち４０
であった。これらの染料はアルシアンブルーな含めてす
べて同じ銅フタロシアニン色原体を有するので、この操
作により、下記の比較性能試験用に四−モル濃度の試薬
を得たことになる。

以上のように調製した試薬組成物を使用して次のように
、弁別釣針塩基性細胞試験を行った。全血試料１０種ず
つをテクニツクＨ−６０００へマトロジーシステム（テ
クニコンインスンルメント社、タリタウン、ニューヨー
ク州）Ｋよりメーカーの使用説明書に従い、対照試薬組
成物を使用して分析した。計器は規定の洗浄サイクルを
酢た後同じ１０稙の血液試料のアリコートをとのば４器
で、誘導体成分を貧有する組成物を使用し洗浄サイクル
を間にはさみながら街１１定した。白血球中針塩基性細
胞であるものの平均自分率（平均）および１０試料の標
準偏差（ＳＤ）を駆１表に示す。

前記のデータにより１）メチル誘導体では好塩基性細胞
数が約２倍に過大に出ること２）エチルおよびプロピル
誘導体は椋準偏差内で対照試薬によるものと同じである
こと、および３）ブチルおよびペンチル誘導体はエチル
、プロピル誘導体および棒軸化合物に比して好塩基性細
胞数が過大に出るが、なお樟４偏差によって説明し得る
範囲内であることが実証された。しかしペンチル誘導体
はすぐに機器の配管上に宵色堆積物の生成が始まり、こ
れは流れを悪くし測定結果に悪影響を与える。試験した
他の誘導体ではこのようなことは生じなかった。要約す
れば、これによりエチルおよびプロピル誘導体の予期し
なかった、かつ↑想し侍なかった性能（特にメチル誘導
体と比較して）が証明された。

次に報告する実験の目的は１）メチル誘導体の性能の悪
いのが対イオンとしてヨウ素イオンが存在するためであ
るか否か決定することおよび２）アリル誘導体の性能を
比較測定することである。

ｗ−ＩＮ　哨　寸　唖　千所 跡 これらの結果は（１）第四級化アリル誘導体は第四級化
プロピル誘導体およびアルシアンブルート同等の性能を
示すこと、および（２）第四級化プロピル誘導体の性能
はヨウ素イオンの存在によって低下しないことを示す。

従ってメチル誘導体の性能が悪いのはメチル置換のため
であって対イオンのヨウ素イオンの存在のためではない
。

例　６ 塩基性染料試薬の安定性 ここに報告する実験で試験した試薬は、７ｃ′ロビルア
ストラブル−６ＧＬＬ　第四級アンモニウムヨーシト０
．５０　Ｎ７ｄｌを含有する以外は例２と同様にして調
製した。この試薬−滴を清浄なスライドガラス」二に置
き２００倍の顕微鏡で観察した。この滴には観察し得る
粒状物質は存在しなかった。この同じ試薬１００ゴな４
５℃で７週間貯蔵した。

貯蔵後もこのに薬は２００倍の顕微鏡で検査してやはり
粒状物を含まず、テクニコンＨ−６０００系による性能
データは本質的ｉｃ第１表および第２表に示したゾロビ
ルアストラブルーブロミ）１のデータと同様でおった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１式 〔本式においてＡｌ　−Ａ４はそれぞれ独立して水素原
   子か、スルホナトか、または少くとも１個のへテロＭｔ
   子を含有しているＣ１−　ｃ、炭化水素残基かであり、
   ここでＡＩ　−Ａ４の少くとも一つは（本式において、
   ′Ｒ１一式は互いに独立して低級アルキル基かシクロア
   ルキル基かオレフィンｎｌｋかであってその少くとも一
   つはＣ２−Ｃ４で、２個が合同して環を形成していても
   よく、Ｒ４は水素原子またはＣ１−ｃ３アルキル基であ
   り、ｎは２から６までの整数である） であるものとし１Ｍは多価金属イオンであり、Ｘ−は水
   溶性陰イオンである〕 で表わされる化合物。 （２１Ａｌ　−Ａ４の少くとも二つが １ （本式においてＲ１−拘はそれぞれ成立して低級アルキ
   ル基であってその少くとも一つはＡ２−　Ｃ４アルキル
   基であり、Ｒ４は水素原子またはＣ，−Ｃ，。 アルキル基であり、ｎは２から６までの整斂である） であり１Ｍけ多価金属イオンであり、Ｘ−は水溶性陰イ
   オンである前項（１）に記載の化合物。 （３１Ａｌ−Ａ４の少くとも三つが １ Ｒ，Ｒ３ （本式においてＲ１−１３はそれぞれ独立して低級アル
   キル基であってその少くとも一つはＣ２−Ｃ。 アルキル基であり、Ｒ４は水素原子またはＣ，−０３ア
   ルキル基であり、ｎは２から６までの整数である） であり、Ｍは多価金属イオンであり、Ｘ−は水溶性陰イ
   オンである前項（１）に記載の化合物。 （４）　Ａｌ−Ａ、の少くとも他の一つが水素原子、ス
   ルホナト、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シアノ基、
   カルボアルコキシ基、直鎖のまたは枝分れした、飽和ま
   たは不飽和の脂肪族または脂環式炭化水素残基、置換さ
   れていないかまたは置換されているアリール基またはへ
   テロアリール基、ペンシル基、または酸素原子かアルキ
   ル化し得ない窒素原子か硫黄原子かによって（置換され
   たペンシル基である、前項（１）、（２）または（３）
   のいずれかに記載の化合物。 （５）他の二つのＲ１−＝３が同一であり、Ｒ４が水素
   原子であり、ｎは２または３である前項（１）、（２）
   または（３）のいずれかに記載の化合物。 （６）Ｍが銅、ニッケル、亜鉛、コバルト、マグネシウ
   ム、鉄、マンガンまたはクロムの多価陽イオンである、
   前項（１）、（２）または（３）のいずれかに記載の化
   合物〇 （７１Ｘ−が臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオンま
   たは硫酸イオンである、前項（１）、（２）または（３
   ）のいずれかに記載の化合物。 （８１ＲＩ　Ｅｓの少くとも一つがエチル基またはプロ
   ピル基である、前項（１）、（２）または＋３１のいず
   れかに記載の化合物。 （９）式 〔本式においてＡ１＋　Ａ４はそれぞれ独立して水素原
   子、スルホナト、アルコキシ基、ヒドロキシル基、シア
   ノ基、カルボアルコキシ基、＠佃のまたは枝分れした飽
   和または不飽和の脂肪族または脂環式炭化水素残基、置
   換されていないかまたは置換されているアリール基また
   はへテロアリール基、ペンシル基、または酸素原子かア
   ルキル化し得ない窒素原子か硫黄原子かによって置換さ
   れたペンシル基であって、ただしＡｌ−Ａ４の少くとも
   一つは １ Ｒ４拘 （本式においてＲ１−Ｒ，はそれぞれ独立して低級アル
   キル基であってその少くとも一つはエチル基、プロピル
   基またはアリル基であり他の二つは互いに等しいものと
   し、九は水素原子であり、ｎは２または６である） であるものとし、Ｍは第二銅、ニッケル、亜鉛、コバル
   ト、マグネシウム、第二鉄、第一鉄、マンガンまたはク
   ロムから選ばれた多価金属イオンであり、Ｘ−は臭素イ
   オン、塩素イオン、ヨウ素イオン、または硫酸イオンか
   ら選ばれた水溶性陰イオンである〕 で表わされる化合物。 ０■　次の工程すなわち（１）アストラデルー遊離塩基
   を水溶性陰イオンと低級アルキル基、シクロアルキル基
   またはオレフィン残基であってその少くとも一つはＣ２
   −Ｃ，であり、二つが合同して環を形成してもよい基と
   を含有して成る物質と反応させ、（２）その反応生成物
   を回収する工程から成る方法によって製造される化合物
   。 （１１１水溶性陰イオンがＪＪ：素イオン、壌累イオン
   、ヨウ素イオンまたはｆＡｍイオンから成る前項ａψに
   記載の化合物。 ｕ２　前記物質が水溶性陰イオンとエチル基、プロピル
   基またはアリル基とを含有して成る前項（Ｉαに記載の
   化合物。 ０（前記物質がヨウ化ｎ−グロビル、臭化エチル、臭化
   ｎ−プロピル、臭化ｎ−ブチルおよび臭化アリルを含有
   して成る前項（ｌｏｔに記載の化合物。 ０（イ）前項（り、（２）、（３）、（９）または（！
   υのいずれかに記載の化合物と春化ランタンと赤血球の
   溶解に有効な界面活性剤とを含有して成る、試料中の好
   塩基性細胞の測定用組成物。