JPS5995884A - Bacteriophage and its preparation - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide novel bacteriophages SP A10, SP A18 and SP A48, having actinomycetes as a host, capable of introducing recombinant DNA without converting actinomycetes to protoplast, and obtained by the screening of various soil specimens collected in Urawa City, Saitama prefercture, Japan. CONSTITUTION:Bacteriophages SP A10 having a molecular weight of about 31 Megadalton (Md), SP A18 (about 31 Md) and SP A48 (about 29Md) separated in pure form from the soil specimen collected in Urawa City, and containing phage DNA having the number of scission site by restriction enzyme shown in the table. The bacteriophages can be stored stably at low temperature in liquid state, or in the form of lysogenic bacteria by infecting with a proper host e.g. actinomycete such as Streptomyces parvulus 2297 by conventional method to effect the lysogenization. The bacteriophage can be obtained by the cultivation of the above lysogenic bacteria such as Streptomyces parvulus 2297 (SP A10) (ATCC No. 39185).

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は新規なバクテリオファージに関するものであ
る。さらに詳細には、新規なバクテリオファージ５ＰＡ
Ｉ０．８ＰＡ］、８およびＳＰ／４４８ならひにそれら
の製造法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION This invention relates to a novel bacteriophage. More specifically, the novel bacteriophage 5PA
I0.8PA], 8 and SP/448 Narahi and their production methods.

近年、組換えＤＮＡを使用する遺伝子操作技術の発展に
より、インシュリン、成長ホルモン、インターフェロン
等の有用物質を微生物により製造Ｂ。In recent years, with the development of genetic engineering technology using recombinant DNA, useful substances such as insulin, growth hormone, and interferon can be produced using microorganisms.

することか可能になり、さらに、アミノ酸、抗生物質、
微生物蛋白などの微生物生産能力向上（力価向−１−）
か々されてきだ。In addition, amino acids, antibiotics,
Improving microbial production capacity such as microbial proteins (titer direction -1-)
It's been a long time since I've been in the middle of a long time.

この組換えＤＮＡを使用する遺伝子操作技術にお・いて
、主要な役割を演じるものはベクターであり、これ寸で
開発されたベクターとしては、大腸菌、枯草菌および酵
母を宿主とするプラスミドおよびバクテリオファージが
知られている。Vectors play a major role in this genetic manipulation technology using recombinant DNA, and vectors developed at this scale include plasmids and bacteriophages that host Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast. It has been known.

一方、」１記宿主とは分類学上箱ちゅうを異にする微生
物である放線菌を用いて、発酵工業により、これ寸で多
数の抗生物質等の有用物質の工業的製造かなされてきて
いる。その結果、放線菌による有用物質の工業的製造の
ための技術蓄積は十分になされており、蓄積された技術
の遺伝子操作技術への応用と放線菌により製造される多
数の抗生物質の力価向−Ｌについての遺伝子操作技術の
適用を考慮すれば、バクテリアや酵ｍを宿主とするベク
ターよりも放線菌を宿主とすることのできるベクターの
方かはるかに有利である。On the other hand, a large number of useful substances such as antibiotics have been industrially produced in this scale through the fermentation industry using actinomycetes, which are microorganisms that are taxonomically different from the host described in 1. . As a result, sufficient technology has been accumulated for the industrial production of useful substances using actinomycetes, and it is now possible to apply the accumulated technology to genetic manipulation technology and improve the potency of many antibiotics produced by actinomycetes. Considering the application of genetic engineering technology to -L, vectors that can host actinomycetes are far more advantageous than vectors that host bacteria or yeast.

このような見地から、放線菌を宿主とすることのてきる
ベクターの開発がなされ、これ寸で例えばｐＶＣ６（米
国特許第４．２７３．８７５号参照）等の放線菌のプラ
スミドが見い出されてきた。しかしなから、プラスミド
をベクターとして使用して組換えＤＮＡを放線菌に形質
導入するためには、あらかじめ、放線菌をプロトプラス
ト化しておく必要があり、ここに困難な技術的障害か生
じる。From this perspective, vectors that can host actinomycetes have been developed, and actinomycete plasmids of this size, such as pVC6 (see U.S. Pat. No. 4,273,875), have been discovered. . However, in order to transduce recombinant DNA into actinomycetes using a plasmid as a vector, it is necessary to convert actinomycetes into protoplasts in advance, which poses a difficult technical obstacle.

これに対し、放線菌のバクチリオファ・−ジをベクター
として調製した組換えＤ　Ｎ　Ａを放線菌に導入する場
合には、放線菌をプロトプラスト化する必要はなく、放
線菌の菌体そのま捷の状態で、組換えＤＮＡを菌体内に
導入するこさかできるという利点がある。On the other hand, when introducing recombinant DNA prepared using the actinomycete Bactiliophage as a vector into actinomycetes, there is no need to convert the actinomycetes into protoplasts, and the actinomycetes are directly transformed into bacterial cells. It has the advantage that recombinant DNA can be introduced into the bacterial cells in the same state.

そこで、この発明者等は放線菌を宿主とする新しいバク
テリオファージを取得すべく、土壌試Ｆ１より、バクテ
リオファージのスクリーニングを行ない、種々研究の結
果、浦和型で分収した各種の土壌試料より、新しいテン
ペレート・バクテリオファージ５ＰＡＩＯ，５ＰＡ１８
およびＳ　Ｐ　Ａ４８を見い出し、さらに鋭意研究の結
果、この発明を完成した。Therefore, in order to obtain a new bacteriophage that uses actinomycetes as a host, the inventors conducted bacteriophage screening from soil sample F1, and as a result of various studies, from various soil samples collected using the Urawa type. New Temperate Bacteriophage 5PAIO, 5PA18
and SPA48, and as a result of further intensive research, completed this invention.

バクテリオファージＳＰＡ　１０．ＳＰＡ　１８および
５ＰＡ４８を土壌試料より純粋分離する方法については
、下記実施例に詳細に記載されている。Bacteriophage SPA 10. A method for separating pure SPA 18 and 5PA48 from soil samples is described in detail in the Examples below.

純粋分離したバクテリオファージ５ＰＡＩＯ。Pure isolated bacteriophage 5PAIO.

５ＰＡ１．８および５ＰＡ４８はファージ液の状態で、
低温で安定に保存できるが、さらに、それらのノくクテ
リオファージを適当な宿主、例えばストレプトマイセス
・パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｒｖｕ
−１ｕｓ）２２９７、ストレプトマイセス・セリカラー
　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ
　）、ストレフ０トマイセスφグリセオフラ／＜ス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆ］−ａｖｕｓ
　）、ストレプトライセス。パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓｐａｒｖｕｌｕｓ　）　Ａ　Ｔ　ＣＣ１２
４３４等の放線菌に常法により感染させて溶原化し、病
原菌の状態で保存することかできる。このようにして得
られた病原菌の具体例としては、ストレプトマイセス・
ノ々ルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｒｖｕ
ｌ、ｕｓ　）２２９７　（Ｓ　Ｐ　Ａ　１０）、ストレ
プトマイセス・パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ、ｙｃｅ
ｓｐａｒｖｕｌｕｓ　）　２２９７　（ＳＰＡ　１．８
　）およ０・ストシブ１−マイセス・パルブルス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｒｖｕｌｓ　）２２９７　
（ＳＰＡ　４．８　）かあり、これらの病原菌は１９８
２年７月９日に米国、メ１ノーランドナト１にあるアメ
リカン・タイプ・カッ１ノチ、−ア・コレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）に、それぞれ寄託番ちＡ、ＴＣＣｌσ３
９１．８５゜ＡＴＣＣ履３９１８６および　Ａ−ＴＣＣ
ｌｆｆｉ３９１８７として寄託されている。5PA1.8 and 5PA48 are in the state of phage liquid,
Although they can be stored stably at low temperatures, they can also be stored in suitable hosts, such as Streptomyces parvu.
-1 us) 2297, Streptomyces coelicolor
), Stref0 Tomyces φ griseofura/<s(S
treptomyces griseof]-avus
), Streptolyces. Pulbulus (Strept)
omycesparvulus) AT CC12
It is also possible to infect actinomycetes such as 434 by a conventional method to cause lysogenization, and to preserve the pathogenic bacteria. A specific example of a pathogenic bacterium obtained in this way is Streptomyces
Streptomyces parvu
l, us) 2297 (SPA 10), Streptomyces parvulus (Streptomyces, yce)
sparvulus ) 2297 (SPA 1.8
) and 0 Stsib 1 - Myces Parvulus (St
reptomyces parvuls ) 2297
(SPA 4.8), these pathogens are 198
On July 9, 2013, the American Type Catcher Collection (A Collection), located in Maryland, United States,
merican Type Culture Co11
The deposit numbers are A and TCClσ3, respectively.
91.85° ATCC shoe 39186 and A-TCC
It has been deposited as lffi39187.

捷だ、ノくクテリオファージＳＰＡ　１０　、ＳＦ３へ
１８およびＳＰＡ、４８は、」二記溶原菌力・ら製造す
ることもできる。すなわち、上記溶”菌を培地に培養す
れば、増殖した病原菌の一部力・溶菌し、培養物中にノ
くクテリオファージか遊離し、このノ（クテリオファー
ジを培地より分離すれはよい。The cacteriophage SPA10, SF318 and SPA48 can also be produced by two lysogens. In other words, if the above-mentioned lysed bacteria are cultured in a medium, some of the proliferated pathogenic bacteria will be lysed and cacteriophage will be released into the culture. .

なお、病原菌を常法に従いマイトマイシンＣ崎−のファ
ージ誘導剤で処理しておけは、溶菌に：いっそう容易に
起こる。In addition, if the pathogenic bacteria is treated with a phage inducer such as mitomycin C according to a conventional method, lysis occurs more easily.

病原菌の培養は、一般微生物の培養法に従って行なわれ
るが、通常は液体培地による女子傑作Ｊ培養法が有利で
ある。Cultivation of pathogenic bacteria is carried out according to general microbial culture methods, but the Joshi Hakusaku J culture method using a liquid medium is usually advantageous.

培地としては、病原菌か増殖できる栄養か１１を含有す
る培地であればよい。すなわち、合成培地、半合成培地
あるいは天然培地が用いられ、培地組成は炭素源として
は、例えばグルコース、シュークロース、マルトース、
グリセリン、でん粉、液化でん粉等が用いられ、窒素源
として、例えば肉エキス、カゼイン加水分解物、ペプト
ン、クルテンミール、コーンミール、綿実粕、大豆粉、
コーンスヂーブリカー、ニュートリエンド・フ゛ロス乾
燥酵ＨＪ１酵母エキス、尿素、りん酸アンモニウム等が
用いられる。このほか、例えばりん酸水素２ナトリウム
、りん酸２水素カリウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシ
ウム等の無機塩も必要に応して培地に添加される。The medium may be any medium containing pathogenic bacteria or nutrients that allow growth. That is, a synthetic medium, a semi-synthetic medium or a natural medium is used, and the medium composition includes, for example, glucose, sucrose, maltose,
Glycerin, starch, liquefied starch, etc. are used, and as nitrogen sources, for example, meat extract, casein hydrolyzate, peptone, cornmeal, corn meal, cottonseed meal, soybean flour,
Corn liquor, Nutriendo Floss dry fermentation HJ1 yeast extract, urea, ammonium phosphate, etc. are used. In addition, inorganic salts such as disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium carbonate, and calcium nitrate are also added to the medium as necessary.

培養温度は約３０　’Ｃ前後が適当であり、培養時間は
約２４〜５０時間程反でよい。The appropriate culture temperature is about 30'C, and the culture time is about 24 to 50 hours.

このようにして得られた培養物から、バクテリオファー
ジは、常法により精製することができる。From the culture thus obtained, bacteriophage can be purified by conventional methods.

次に、バクテリオファージＳＰＡ　１０　、５ＰＡ１８
およＯ’５ＰＡ４８の性質について説明する。Next, bacteriophage SPA 10, 5PA18
and the properties of O'5PA48 will be explained.

これらのバクテリオファージはいずれも溶原化る。All of these bacteriophages are lysogenic.

（１）バクテリオファージ５ＰＡＩＱの性質（ａ）ファ
ージＤＮＡの分子ｍ： 約３１メガダルトシ（旧） （ｂ）ファージＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂部位数：表２
に記載の通り。(1) Properties of bacteriophage 5PAIQ (a) Molecule m of phage DNA: Approximately 31 megadaltosi (old) (b) Number of restriction enzyme cleavage sites in phage DNA: Table 2
As stated in.

（ｃ）ファージＤＮＡの制限酵素開裂バクーン表ＩＫ記
載の通り。(c) Restriction enzyme cleavage of phage DNA as described in Bakun Table IK.

（ｄ）ファージＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂地図・第１図
に記載の通り。(d) Restriction enzyme cleavage map of phage DNA - As shown in Figure 1.

（２）バクテリオファージ５ＰＡ１８の性質（ａ）ファ
ージＤ　Ｎ　Ａの分子量： 約３１メガダルトン（Ｍｄ　） （ｂ）ファージＤＮＡの制限酵素開裂ｉｌｘ位数：表２
に記載の通り。(2) Properties of bacteriophage 5PA18 (a) Molecular weight of phage DNA: approximately 31 megadaltons (Md) (b) Restriction enzyme cleavage ilx position of phage DNA: Table 2
As stated in.

（ｃ）ファージＤＮＡの制限酵素開裂パターン：表１に
記載の通り。(c) Restriction enzyme cleavage pattern of phage DNA: as described in Table 1.

（ｄ）ファージＤＮＡの制限酵素開裂地図；第２図に記
載の通り。(d) Restriction enzyme cleavage map of phage DNA; as shown in FIG.

（３）バクテリオファージＳＰＡ　４８の性質（ａ）フ
ァージＤＮＡの分子量： 約２９メガダルトン（Ｍａ） （ｂ）ファージＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂部位数１表２
に記載の通り。(3) Properties of bacteriophage SPA 48 (a) Molecular weight of phage DNA: Approximately 29 megadaltons (Ma) (b) Number of restriction enzyme cleavage sites of phage DNA 1 Table 2
As stated in.

（ｃ）ファージＤＮＡの制限酵素開裂パターン：表１に
記載の通り。(c) Restriction enzyme cleavage pattern of phage DNA: as described in Table 1.

なお、」１記の分子用はファージＤＮＡを制限酵素で開
裂後、各フラグメントの分子用をアガロース電気？ｌＫ
動法により求め、それを合算するとさにより得た数値で
ある。In addition, for the molecules described in item 1, phage DNA is cleaved with restriction enzymes, and then each fragment is electrolyzed with agarose. lK
This is the numerical value obtained by calculating by the dynamic method and adding them together.

なお、放線菌を宿主とするバクテリオファージで自然界
より分離され、その性質が確認されているものにわずか
であり、マイクロバイオロジカル・レビュー（旧ｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　）第４４巻第２
２０頁第４表（１９８０年）に要約されているか、ここ
でδ記載されているバクテリオファージサとの発り］の
７ぐクテリオファージ５ＰＡＩ（１゜３ＰＡ］８およＱ
’５ＰＡ４８とは分子用および制限酵素開裂部位数が異
なり、バクテリオファージＳＰＡ　１０．ＳＰＡ　１８
および５ＰＡ４８は新規なバクテリオファージであるこ
とか明らかである。There are only a few bacteriophages that host actinomycetes that have been isolated from nature and whose properties have been confirmed, and Microbiological Review (formerly known as Crop
Biological Review) Volume 44, No. 2
5PAI (1°3PA)8 and Q
'5PA48 differs in the number of molecular and restriction enzyme cleavage sites, and bacteriophage SPA 10. SPA 18
It is clear that 5PA48 and 5PA48 are novel bacteriophages.

この発明のバクテリオファージ５ＰＡＩＯ，５ＰＡ１８
および５ＰＡ４８けそれ自体、組換えＤＮ　Ａを使用す
る遺伝子操作技術による有用物質の製造法においてベク
ターとして使用できるばかりてなく、これらのベクター
を、例えばビロリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム
、エチレンジアミンテトラアセテ−）（ＥＤＴＡ）等の
二価のイオンのキレ−１・剤で処理して、自己複製に必
要な部分と制限酵素による適当々開裂部位を保存してい
るＤ　Ｎ　Ａ欠失変異株を得、これをベクターとして使
用ｌ〜てもよい。さらにこれらのＤＮＡ欠失変異株と他
のプラスミドまたはファージなどの複合ベクターとして
使用してもよい。Bacteriophage 5PAIO, 5PA18 of this invention
and 5PA48 itself can not only be used as a vector in a method for producing useful substances by genetic engineering techniques using recombinant DNA, but also these vectors can be used, for example, in sodium birophosphate, sodium citrate, ethylenediaminetetraacetate). A DNA deletion mutant strain that preserves the parts necessary for self-replication and appropriate cleavage sites with restriction enzymes is obtained by treatment with a divalent ion cleavage agent such as (EDTA). may be used as a vector. Furthermore, these DNA deletion mutants and other plasmids or phages may be used as a composite vector.

この発明のノくクテリオファージ５ＰＡＩＯ，５ＰＡ１
８およびＳＰ／４４８は組換えＤＮＡを使用する遺伝了
操作技ｊｌｌ：＋におけるベクターとしてイ［川である
か、ベクターとしての使用方法は遺伝ｒ操作技術の常法
により行なわれる。cteriophages of this invention 5PAIO, 5PA1
8 and SP/448 are used as vectors in genetic engineering techniques using recombinant DNA, and their use as vectors is carried out by conventional genetic engineering techniques.

次に、この発明を実施例により説明する。Next, the present invention will be explained with reference to examples.

なお、実施例中で使用する培地は下記組成を有する。Note that the culture medium used in the examples has the following composition.

（Ａ）　　Ｎ　Ｂ培地 バタト・ニュートリエンド・ブロス　８ｙ（商標・ティ
フコ社製） グルコース　　　　　　　　　　　　　５ｙ硝酸カルシ
ウム　　　　　　　　　　５　ｍＭ水　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１１（商標・ティフ
コ社製）８ｙ グルコース　　　　　　　　　　　　　５ｙ硝酸カルシ
ウム　　　　　　　　　　５　ｍ１囚寒天　　　　　　
１５ｙ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１１（商標・ティフコ社製）８ｙ グルコース　　　　　　　　　　　　　５ｙ硝酸カルシ
ウム　　　　　　　　　　５　ｍＭ寒天　　　　　　　
らｙ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｉｆｆ（Ｄ）　　ＧＢ寒天培地 バクト・ニュートリエンド・プロス　３ｙ（商標・ティ
フコ社製） グルコース　　　　　　　　　　　　ｌｏｙ西孝母エキ
ス　　　　　　　　　　　　ｌｙ寒天　　　　　　山 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１１実施例１ （１）土壊試料よりバクテリオファージ５ＰＡＩＯの分
離； Ｎ　Ｂ　培地（５ｍｅ　）　Ｋストレフトマイセス・パ
ルブルス２２９７の胞子のＮＢ培地けん濁液（０，］ｍ
（？、１０’胞子数／　ｍｅ　）と浦和型で採収した土
壌試料１（０，５ｙ）とを加えた後、３０　’Ｃて一夜
振々う培養する。これにクロロホルムを１滴加えた後、
遠心分離（８，０００ｒｐｍＸ１０分間）して」二層を
トル。この」二層をミリポアフィルタ−（ポアサイズ：
　０．４５μｍ）で許過する。Ｐ液をＮＢ培地で適当に
希釈して、この希釈液（０，］、　ｍｅ　）　Ｌストレ
フトマイセス・パルブルス２２９７の胞子のＮＢ培地は
ンＲＭ　（０，１ｍｅ、　　１０’胞子数／　ｍｅ　）
とＮＡソフ）・寒天培地（２，５ｍｅ　）とをＮＡ寒天
培地（２０ｍｅ　）で作成した寒天平板（直径：ｌＯｃ
ｍ）（下層）に上層する。次いて、このようにして調製
した寒天平板を３０°Ｃで２４時間加温すると希釈の適
当な平板」−にプラークか出現する。出現したプラーク
の中１プラークをパスツール・ピペットで分ＩＪ［Ｇす
る。このようにして分離した）くクテリオファージの精
製はシングル・プラーク分離法を３回繰返えすことによ
り行なわれた。(A) NB medium Batato Nutriendo Broth 8y (trademark, manufactured by Tifco) Glucose 5y Calcium nitrate 5mM water
11 (trademark, manufactured by Tifco) 8y glucose 5y calcium nitrate 5ml agar
15y water
11 (trademark, manufactured by Tifco) 8y glucose 5y calcium nitrate 5mM agar
ray water
Iff (D) GB agar medium Bacto Nutriendo Pros 3y (trademark, manufactured by Tifco) Glucose loy Nishikobo extract ly agar Sansui
11 Example 1 (1) Isolation of bacteriophage 5PAIO from soil destruction sample; NB medium (5me) K Suspension of Strephtomyces parvulus 2297 spores in NB medium (0,]m
(?, 10' number of spores/me) and soil sample 1 (0.5y) collected by Urawa type were added, and cultured overnight at 30'C with shaking. After adding one drop of chloroform to this,
Centrifuge (8,000 rpm for 10 minutes) to separate the two layers. This two-layer Millipore filter (pore size:
0.45 μm). Appropriately dilute the P solution with NB medium, and prepare the diluted solution (0,], me).
Agar plate (diameter: lOc) prepared with NA agar medium (20me) and NA soft)/agar medium (2.5me).
m) Top layer on (lower layer). Then, when the agar plate prepared in this way is heated at 30°C for 24 hours, plaques appear on the plate with appropriate dilution. One of the plaques that appeared was extracted with a Pasteur pipette. Purification of the bacteriophages thus isolated was carried out by repeating the single plaque separation method three times.

（２）バクテリオファージＳＰＡ　１０のファージ液の
調製 上記で冑だバクテリオファージ５ＰＡＩＯの１プラーク
をパスツール・ピペットで採り、これをＩＩ　Ｂ培地（
０，２ｍｅ　）にけん濁する。けん濁液とスト１／プＩ
−マイセス・パルブルス２２９７の胞子のＮＢ培地（・
−トん濁液（０，１ｒｎｅ　、　］−０７胞子数／　ｍ
ｅ　）とＮ　Ａソフト寒天培地（２，５ｍｅ　）とをＮ
　Ａ寒天平板（直径：１０Ｑｍ、ＮＡ寒天培地昂：２０
　ｍ、ｅ　）　（下層）に」二層する。これを３０℃で
一夜加瀞すると」二層のほぼ全面が溶菌する。この平板
より、上層を分離し、ＮＢ培地（５ｍｅ）Ｋけん４して
、室温で１時間静置する。次いで、８，０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離して上澄をとる。この」−澄をミリポ
アフィルタ−（ボア・ザイズ：０．４５．ｏｍ）で濾過
して、バクテリオファージ５ＰＡＩＯのファージ液［５
７１１ｅ、バクテリオ７７−ジＳＩ−’ＡＬＯ濃度１０
８プラーク・ホーミング・ユニット（ｐｆｕ　）／ｍｅ
　］を得る。(2) Preparation of phage solution of bacteriophage SPA 10 One plaque of the bacteriophage 5PAIO, which had been exposed above, was taken with a Pasteur pipette and transferred to II B medium (
Suspend in 0.2me). Suspension liquid and strike 1/pu I
- Myces parvulus 2297 spores in NB medium (・
- Suspension (0,1rne, ] -07 number of spores/m
e) and NA soft agar medium (2,5me).
A agar plate (diameter: 10Qm, NA agar medium height: 20
m, e) (lower layer)". When this is heated at 30°C overnight, almost the entire surface of the two layers is lysed. The upper layer is separated from this plate, mixed with NB medium (5me), and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Then, centrifuge at 8,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant. This "-clear" was filtered with a Millipore filter (bore size: 0.45. om), and the phage solution of bacteriophage 5PAIO [5
711e, Bacterio77-diSI-'ALO concentration 10
8 plaque homing units (pfu)/me
] is obtained.

このファージ液は４°Ｃで安定に保存することかできる
。This phage solution can be stably stored at 4°C.

なお、ファージ液を大量に得るには次の方法による。In addition, the following method can be used to obtain a large amount of phage liquid.

スナワチ、ストレフトマイセス・ハルフルス２２９７の
斜面培養物ｌ白金耳をＭ菌Ｊ（Ｂ培地（９０ｍｅ　）含
有５００　ｍｅ容坂ロフラスコに接種し、３０　’Ｃで
２４時間培養する。別に、」−記と口し滅菌ＮＢ培地（
９０ｍｅ）を含有する５　００　ｍｅ容坂口フラスコに
−１−４萌培養物の一部（５ｍＣ）および／くクテリオ
ファージ５ＰＡ１．０のけんｆＡ液（バクテリ副ファー
ジＳＰＡ　１０濃度：　１０８ｐｆ　ｕ　／　ｍｅ　）
　（５ｍｅ）を接種し、３０℃で一夜振とう培養して、
培養物を胃、これをミリポアフィルタ−（ボア・サイズ
：　０．４５　、Ｊｎ　）て無菌的にン濾過して、バク
テリオファージＳＰＡ　１０のファージ液（バクテリオ
７アージ３ｐＡ１０＃度：　１０”　ｐｆｕ／ｍｅ　）
（１−００ｍｅ　）を得る。A platinum loop of a slant culture of Strephtomyces harfurus 2297 was inoculated into a 500 me slope flask containing M bacteria J (B medium (90 me) and cultured at 30'C for 24 hours. and sterilized NB medium (
A portion of the -1-4 moe culture (5 mC) and a concentration of cacteriophage 5PA 1.0 (concentration of bacteriophage SPA 10: 108 pf u/me) were placed in a 500 me Sakaguchi flask containing )
(5me) and cultured with shaking overnight at 30°C.
The culture was aseptically filtered through a Millipore filter (bore size: 0.45, Jn) and bacteriophage SPA 10 phage solution (Bacteriophage 7A 3pA10# degree: 10" pfu/me) )
(1-00me) is obtained.

（３）バクテリオファージ５ＰＡＩＯ溶原菌、ストレフ
トマイセス・パルブルス２２９７　（５ＰＡ１０）の調
製： バクテリオファージＳＰＡ　１０のファージ液（バクテ
リオファージ１０の濃度＋　ｌ　０９ｐｆｕ　／　ｍｅ
　：）をＮＢ培地で適当に希釈して、この希釈液（０，
１ｍｅ　）　トス）・し７”　ｌ−マイセス・パルブル
ス２２９７の胞子のＮＢ培地けん濁液（０，１ｍ乙　１
０７胞子数／　ｍｅ　）とＮ　Ａソフト寒天培地（２，
５ｍＣ）とをＮ　／４寒天乎板（直径：１０ｃｔｎ＋Ｎ
Ａ寒天培地ｆＪ：２０ｍｅ）（下層）に上層する。これ
を３０　’Ｃで２４時間加温すると、適当な希釈のファ
ージ液を含む平板−ににプラークか出現する。この平板
をさらに数日間、３０°Ｃで、加温するとプラークの部
分に菌の生育かみられ、透明なプラークが濁ったプラー
クになる。この濁ったプラークより、滅菌したつ寸よう
して菌を採取し、ＧＢ寒天平板（直径・１０ｃｍ＋ＯＢ
寒天培地ｔ　：　２０　ｍｅ　）　Ｊ：に画線し、３０
°Ｃて２４時間加温するとコロニーか生しる。このコロ
ニーを別のＧＢ寒天平板」二に移［７、胞子か着生する
捷で、３０°Ｃて１週間加温する。このようにして得ら
れた胞子について単胞子分離を２回繰返し、純化し、下
記の方法により、病原菌であることを４％して得た株を
、ストレプトマイセス・パルブルス２２９７　（ＳＰＡ
　１０　）と命名した。なお、この株はアメリカン・ク
イツブ・カルチュア・コレクションに寄託番りＡＴＣＣ
Ａ３９］、８５て寄託されている。(3) Preparation of bacteriophage 5PAIO lysogen, Strephtomyces parvulus 2297 (5PA10): Phage solution of bacteriophage SPA 10 (concentration of bacteriophage 10 + l 09 pfu/me
:) with NB medium and use this diluted solution (0,
1me) 7" l-Myces parvulus 2297 spore suspension in NB medium (0.1m) 1
07 spore count/me) and NA soft agar medium (2,
5mC) and N/4 agar plate (diameter: 10ctn+N
Top layer on A agar medium fJ:20me) (lower layer). When this is heated at 30'C for 24 hours, plaques appear on the plate containing an appropriately diluted phage solution. When this plate is further heated at 30°C for several days, bacterial growth is observed in the plaque area, and the transparent plaque turns into a cloudy plaque. Bacteria were collected from this cloudy plaque using a sterilized tube.
Agar medium t: 20 me) Streak on J:, 30
Colonies will grow when incubated at °C for 24 hours. Transfer this colony to another GB agar plate (7) and incubate at 30°C for 1 week to allow spores to settle. The spores thus obtained were purified by repeating monospore separation twice, and the strain obtained was determined to be 4% pathogenic by the method described below.
10). This strain has been deposited with the American Quitub Culture Collection at ATCC.
A39], 85.

なお、純化した株が病原菌であると吉を確認する試験は
次のようにして行なった。A test to confirm that the purified strain was a pathogen was conducted as follows.

すなわち、純化した胞子の１部を採収し、この胞子とハ
タテリオファージ５ＰＡＩＯのファージ液をＮ　Ａ寒大
平板上に交叉画線し、３０°Ｃて２４時間加ｄ１＾して
、交叉部分が全く溶菌しない株を選択し、次いて、この
株から、バクテリオファージをマイトマイシンＣて誘導
した場合のファージ数か、誘導しなかった場合に比較し
て多けれは（通常１０２〜１０５倍程度多くなる）、病
原菌である。That is, a portion of the purified spores was collected, the spores and the phage solution of Hateriophage 5PAIO were cross-streaked on a NA agar plate, and heated at 30°C for 24 hours. Select a strain that does not lyse at all, and then use mitomycin C to induce bacteriophages from this strain. ), which are pathogenic bacteria.

（４）バクテリオファージＳＰＡ　１０溶原菌、ストレ
フトマイセス・パルブルス２２９７　（ＳＰＡ］、　０
　）　Ａ　Ｔ　ＣＣＬ　３９１８５よりファージの誘導
：Ｎ　Ｂ　培Ｑ　（５＋ｎｌ！　）　Ｋス）−レフトマ
イセス・パルブルス２２９７　（ＳＰＡ　１０　）ＡＴ
ＣＣＡ３９１８５の胞子をげん濁（濁度：　Ａ６６ｏｎ
ｍ　＝　０．２−０．４　）して３０℃で５時間振とう
培養する。次いて、培養物にマイ）・マイシンＣを最終
濃度２０ノｔｙ／ｍｅになるように加えて、３０°Ｃて
１時間振とつする。(4) Bacteriophage SPA 10 lysogen, Strephtomyces parvulus 2297 (SPA), 0
) Induction of phage from AT CCL 39185: NB medium Q (5+nl!)Ks) - Leftomyces parvulus 2297 (SPA 10) AT
Suspend the spores of CCA39185 (turbidity: A66on
m = 0.2-0.4) and culture with shaking at 30°C for 5 hours. Next, myocycin C was added to the culture at a final concentration of 20 knots/me, and the mixture was shaken at 30°C for 1 hour.

次に、培養物を遠心分ｔ’ｌｆｆ、　（３，０００ｒｐ
ｍ　Ｘ　１０９　）して、上澄を捨て、沈殿を新しいＮ
　Ｂ培地（５ｍｅ）にけん濁して、３０°Ｃで一夜振と
う培養する。培養物をミリポアフィルタ−（ボア・サイ
ズ＝０４５）１ｍ）で沖過して、バクテリオファージ５
ＰＡＩＯのファージ液を得る。Next, the culture was centrifuged at t'lff, (3,000 rp
m × 109), discard the supernatant, and replace the precipitate with fresh N
Suspend in medium B (5me) and culture with shaking at 30°C overnight. The culture was filtered through a Millipore filter (bore size = 045) (1 m) to remove bacteriophage 5.
Obtain a PAIO phage solution.

（５）バクテリオファージ５ＰＡＩＯのＤ　Ｎ　Ａの調
製： 上記（２）の方法と同様にして旬だファージ液（バクテ
リオファージＳＰＡ、１０濃度：　］　Ｏ’ｐｆｕ　／
　ｍｅ）（１，０００ｍｅ　）を遠心分Ｎ＃、（６，０
００ｒｐｍＸ　１０分間）シ、」二層に塩化ナトリウム
（最終濃度：０５Ｍ）およびポリエチレングリコ・−ル
６０００（最終濃度−８％）を加えて低温で２時間放間
し、次いで遠心分離（８，０００ｒｐｍ　Ｘ　２０分）
し、沈殿物を得る。これを少量の１０　ｍＭの塩化マグ
ネシウムと０．１　Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にけん濁し、こ
れをリボヌレアーゼＡおよびチオキシリボヌクレアーゼ
１で処理し、超遠心分離（３３，０００ｒｐｍ×１時間
）し、沈殿物を得る。この沈殿物に１０ｍ］ｉ１の塩化
マグネシウムと０．１Ｍの塩化ナトリウムを含有する５
０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　（１，
５ｍｅ　）を加え、４℃で１夜放置する。(5) Preparation of DNA of bacteriophage 5PAIO: Use the same method as in (2) above to prepare a fresh phage solution (bacteriophage SPA, 10 concentration: ] O'pfu/
centrifuge N#, (6,0 me)
Sodium chloride (final concentration: 05M) and polyethylene glycol 6000 (final concentration -8%) were added to the two layers, left at low temperature for 2 hours, and then centrifuged (8,000 rpm). x 20 minutes)
and obtain a precipitate. This was mixed with 50 μl containing a small amount of 10 mM magnesium chloride and 0.1 M sodium chloride.
The suspension is suspended in mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), treated with ribonurease A and thioxyribonuclease 1, and ultracentrifuged (33,000 rpm x 1 hour) to obtain a precipitate. This precipitate contains 10 m]i1 of magnesium chloride and 0.1 M sodium chloride.
0mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) (1,
5me) and left at 4°C overnight.

これをセシウムクロライド−超遠心分離処理して、「１
的さするバクテリオファージのバンドを採取する。これ
を０．１　Ｍの塩化ナトリウムおよびｌ　ＯｍＭのエチ
レンジアミシブトラアセテート（ＥＤＴＡ）を含有する
５　（ｌ　ＩＩＩＭ　ｌ”リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）中４°Ｃ−ｒ２時間透析し、再度リボヌクレアーゼ
Ａ処理をする。次いで、透析処理したバクテリオファー
ジを１％Ｆデシル硫酸ナトリウム水溶液中で６５　”Ｃ
で５分間加熱処理する。処理液をフェノール抽出してバ
クテリファージ５ＰＡＩＯのＤＮＡ（２００パ）を採収
する。This was subjected to cesium chloride-ultracentrifugation treatment, and
Collect the target bacteriophage band. This was dissolved in 5 (lIIIM l)-hydrochloric acid buffer (pH 7,
5) Dialyze at 4°C for 2 hours and treat with ribonuclease A again. The dialyzed bacteriophages were then incubated at 65"C in a 1% F sodium decyl sulfate aqueous solution.
Heat-treat for 5 minutes. The treated solution is extracted with phenol to collect DNA (200 PAIO) of bacteriophage 5PAIO.

（［ｉｌ　　ハク７’　！Ｊ　副７　ｙ−ジＳＰＡ　Ｉ
　Ｏｆ７）　ＤＮＡに対する制限酵素の作用： 制限酵素によりＤＮＡを開裂するときに使用する緩衝液
は次の通りである。([il Haku7'!J Vice7 y-di SPA I
Of7) Action of restriction enzymes on DNA: The following buffers are used to cleave DNA with restriction enzymes.

（ａ、）　　制限酵素旦壮Ｉ、彫恕Ｒ１、占匹■。(a,) Restriction enzymes Danso I, Horiyoshi R1, Zhanryi■.

衝液・ １、０　ｍＭの塩化マグネシウムと１００ｍＭの塩化ナ
トリウムと６　ｍＭの２−メルカプトエタノールと１０
０ｐｙ／ｍｅのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とを含有
する２０ｍＭ１・リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）。Solution: 1, 0 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, 6 mM 2-mercaptoethanol and 10
20mM 1.Lis-HCl buffer (pH 7.5) containing 0 py/me bovine serum albumin (BSA).

（ｂｌ　　制限酵素Ｂａｍ　ｉ（Ｉ　、　　Ｂｇｌ、　
ＩＴ、皿■。(bl restriction enzyme Bami (I, Bgl,
IT, plate■.

−入に旦■、シ二■、主ＩＩおよび」ユＩ１１　　を１
吏用する酵素反応の緩衝液： １０　ｍＭの塩化マグネシウムと６ｍＭの２−メルカプ
トエタノールとを含有する２０ｍＭ１−リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）。-Initan■, Shinji■, Lord II and "Yu I11" 1
Buffer for enzymatic reaction used: 20mM 1-Lis-HCl buffer (pH 7.5) containing 10mM magnesium chloride and 6mM 2-mercaptoethanol.

（ｃｌ　　制限酵素Ｓｍａ　Ｉを使用する酵素反応の緩
衝液： ６ｍＭの塩化マグネシウムと９０ｍＭの塩化ナトリウム
と６ｍＭの２−メルカプトエタノール１　０　０　ｐｆ
ｉｌ　／　ｍｅのＢＳＡを含有する１４ｍＭｌ・リス−
塩酸緩衝液（ｐＩ（７．５）。(cl Buffer for enzyme reaction using restriction enzyme Sma I: 6mM magnesium chloride, 90mM sodium chloride, 6mM 2-mercaptoethanol 100 pf
14mMl lis containing il/me BSA
Hydrochloric acid buffer (pI (7.5).

バクテリオファージＳＰＡ　１０　ノＤＮＡ　（　０．
５−１／７．ｐ）Ｋ、各制御板酵素（６単イｉ７′）を
−に記緩衝液（１５）ｌｆｆ）中３７℃で３時間作用さ
せて、ＤＮＡ鎮を開裂する。この反応液を６５°Ｃで５
分間加温後、水中に入れて急冷しで、ファージＤＮＡの
粘着性末端を開裂させる。次いで、この反応液を０８％
アガロース・ゲルで１．、ＯｍＭのエチレンジアミンデ
１ーラアセテート含有３６ｍＭトリス−３ＱｍＭ　　リ
ン酸２水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を用いて電
気泳動に付す。立て型の電気泳動装置（　０．　３　Ｘ
　１　６．　５　Ｘ　１　６．　５　ａｍ　）を用い、
８０Ｖで３時間泳動後、エヂジクムプロマイド溶液（０
．５）ｌｙ／　ｍｅ　）でｌＯ分間染色させる。短波長
の紫外線で発色後ポラロイド・フィルムで写真をとり、
その写真に基ついて、バクテリオファージＳＰＡ１０４
−　　　　　　−　　　　　の制限酵素開裂フラグメン
トを分析した。なお、ファージＤ　Ｎ　Ａフラグメント
の分子量はアガロース・ゲル」二のλ虱、ＲＪ　　フラ
グメント［ジャーナル・オブ・ピロロシイ−第１４巻第
１２３５頁（１９７４年）参照］、スＨｉｎｄ　Ｉｌｌ
フラグ〆シト［ジーシ第２巻第１頁（１９７７年参腺１
および０２９Ｌ互ＲＩ　　［ピロロジ−第７０春第１３
７頁（１９７６年）参照］を対照とする相′Ｉ打ＩＪ易
動度を比較することにより算出した。Bacteriophage SPA 10 DNA (0.
5-1/7. p) K, each control plate enzyme (6 units i7') is allowed to act in the buffer (15)lff) mentioned above at 37°C for 3 hours to cleave the DNA chain. This reaction solution was heated to 65°C for 5 minutes.
After heating for a minute, the phage DNA is rapidly cooled in water to cleave the sticky ends of the phage DNA. Next, this reaction solution was diluted with 0.8%
1. with agarose gel. Electrophoresis is performed using a 36mM Tris-3QmM sodium dihydrogen phosphate buffer (pH 7.8) containing OmM of ethylene diamine dela-acetate. Vertical electrophoresis device (0.3
1 6. 5 X 1 6. 5 am) using
After electrophoresis at 80V for 3 hours, edjicumpromide solution (0
．． 5) Stain with ly/me) for 10 minutes. After coloring with short wavelength ultraviolet rays, a photograph is taken with Polaroid film.
Based on that photo, bacteriophage SPA104
− − restriction enzyme cleavage fragments were analyzed. In addition, the molecular weight of the phage DNA fragment was measured using agarose gel.
Flag〆shito [Gishi Volume 2, Page 1 (1977 Ginseng 1
and 029L Mutual RI [Pyrology - 70th Spring No. 13
7 (1976)] as a control.

実施例２ （１）土壌試料よりバクテリオファージ３ＰＡ１８０分
離： 浦和型で採取した土壌試料２（０．５ｊ７）より、実施
例１（１）と同様にして、バクテリオファージＳＰＡ１
８の分離、精製を行なった。Example 2 (1) Isolation of bacteriophage 3PA180 from soil sample: Bacteriophage SPA1 was isolated from soil sample 2 (0.5j7) collected with Urawa type in the same manner as in Example 1 (1).
8 was separated and purified.

（２）ノくクテリオファージＳＰＡ１８のファージ液の
調製： 実施例１（２）と同様にして、バクテリオファージＳＰ
Ａ　１８のファージ液（バクテリオファージＳＰＡ１８
濃度：　１　０”　ｐｆｕ　／　ｍｅ　）　　を調製し
た。(2) Preparation of phage solution of bacteriophage SPA18: In the same manner as in Example 1 (2), prepare bacteriophage SP
A 18 phage solution (bacteriophage SPA18
Concentration: 10” pfu/me) was prepared.

（３）ノククテリオファージＳＰＡ１８溶原菌、ストレ
プトマイセス・パルブルス２２９７　（ＳＰＡ１８）の
調製： 実施例１（３）と同様にして、バクテリオファージＳＰ
Ａ１８溶原菌、ストレプトマイセス・パルブルス２２９
７　（　ＳＰＡ　１８　）を調製し、溶原菌であること
をＮ．認した。々お、この（朱０″Ｊ、アメリカン・タ
イプ・カルチュア・コレクションに寄託番りＡ　Ｔ　Ｃ
Ｃ扁３９１８６で寄託されている。(3) Preparation of Streptomyces parvulus 2297 (SPA18), a lysogen of Noccterophage SPA18: In the same manner as in Example 1 (3), bacteriophage SP
A18 lysogen, Streptomyces parvulus 229
7 (SPA 18) was prepared and confirmed to be a lysogenic bacterium. Approved. Hello, this (vermilion 0″J, deposited at the American Type Culture Collection ATC
It has been deposited as C-b39186.

（４）バクテリオファージ５ＰＡ４８溶原閑、スＩ・レ
フトマイセス・パルブルス２２９７　（５ＰＡ１８　）
ＡＴＣＣスｆｆ１３９１８６よりファージの誘導：実施
例１（４）と同様にして、ストンブトマイセス・パルブ
ルス２２９７　（ＳＰＡ　１８　）ＡＴＣＣＡ３９１、
８６より、マイトマイシンＣてバクテリオファージ５Ｐ
Ａ１８を誘導し、バクテリオファージ５ＰＡ１８のファ
ージ液を得だ。(4) Bacteriophage 5PA48 lysogen, Sleptomyces parvulus 2297 (5PA18)
Induction of phage from ATCC Sff139186: In the same manner as in Example 1 (4), Stombomyces parvulus 2297 (SPA 18 ) ATCCA391,
From 86, mitomycin C and bacteriophage 5P
A18 was induced and a phage solution of bacteriophage 5PA18 was obtained.

（５）バクテリオファージ５ＰＡ１８のＤ　Ｎ　Ａの調
製： 実施例１（５）と同様にして、バクテリオファージ５Ｐ
Ａ１８のＤ　Ｎ　Ａを調製した。(5) Preparation of DNA of bacteriophage 5PA18: In the same manner as in Example 1 (5), bacteriophage 5P
A18 DNA was prepared.

（６）バクテリオファージＳＰＡ　１８のＤ　Ｎ　Ａに
対する制限酵素の作用： 実施例１（６）と同様にして、バクテリオファージ５Ｐ
Ａ１８のＤ　Ｉ’Ｔ　Ａを制限酵素により開裂し、バク
テリオファージ５ＰＡ１８のＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂
フラグメントを分析した。(6) Action of restriction enzymes on the DNA of bacteriophage SPA 18: In the same manner as in Example 1 (6), bacteriophage 5P
DI'TA of A18 was cleaved with a restriction enzyme, and the restriction enzyme cleaved fragment of the DNA of bacteriophage 5PA18 was analyzed.

実施例３ の分離： 浦和布で採取した土壌試料３（０，５ｙ）より、実施例
Ｅｌ）表向様にして、バクテリオファージＳＰＡ、４８
の分離、精製を行なった。Separation of Example 3: From soil sample 3 (0,5y) collected in Urawa cloth, bacteriophage SPA, 48
were separated and purified.

（２）バクテリオファージＳＰＡ　４８のファージ液の
調製： 実施例１（２）と同様にして、バクテリオファージＳＰ
Ａ　４８のファージ液（バクテリオファージＳＰＡ、４
８濃度＋　１０９ｐｆｕ　／ｍｅ　）を調製した。(2) Preparation of phage solution of bacteriophage SPA 48: In the same manner as in Example 1 (2), bacteriophage SP
A 48 phage solution (bacteriophage SPA, 4
8 concentrations + 109 pfu/me) were prepared.

（３）バクテリオファージＳＰＡ　４８溶厚菌、ストレ
フトマイセス・パルブルス２２９７　（５ＰＡ４８）の
調製。(3) Preparation of bacteriophage SPA 48 lytic pachybacterium, Strephtomyces parvulus 2297 (5PA48).

バクテリオファージＳＰＡ　４８のファージ液（）ゝク
テリオファージ５ＰＡ４８の濃度：１０９ｐｆす／　ｍ
ｅ　）をＮＢ培地で適当に希釈して、この希釈液（０，
１ｍｅ　）とストレフトマイセス・パルブルス２２９７
　の胞子のＮＢ培地’ｒｊ　ｌｖ　ａ液（０，１ｍｅ　
）とＮＡソフト寒天培地（２，５ｍｆりとをＩｉ　Ａ寒
天平板（直径：１０側、Ｎ　Ａ寒天培地量：２０　ｍｅ
　）　（下層）に」二層する。これを３０°Ｃで２４時
間加温すると適当な希釈のファージ液を含む平板が全面
にファージにより溶菌する。この平板をさらに、数日３
０°Ｃで加温するとコロニーが出現する。コロニーより
滅菌したつまようじで菌を採取し、ＧＢ寒天平板（直径
：１０ｃｍ、ＧＢ寒天培地量：２０ｍｅ　）に画線し、
胞子が着生する捷で、３０°Ｃで１週間加温する。この
ようにして得られた胞子について、単胞子分離を２回繰
返し、純化し、下記の方法により、病原菌であることを
確認して得だ株ヲ、ス）・レフトマイセス・パルブルス
２２９７　（ＳＰＡ　４８　）と命名した。なお、この
株はアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションに
寄託番号Ａ　Ｔ　ＣＣｌに、　３９１８７で寄託されて
いる。Phage solution of bacteriophage SPA 48 () Concentration of bacteriophage 5PA48: 109 pf/m
e) with NB medium and use this diluted solution (0,
1me) and Strephtomyces parvulus 2297
NB medium 'rj lva a solution (0,1me
) and NA soft agar medium (2.5 mf) A agar plate (diameter: 10 side, NA agar medium volume: 20 me
) (lower layer)” to make two layers. When this is heated at 30°C for 24 hours, the entire surface of the plate containing an appropriately diluted phage solution is lysed by the phages. Continue to use this plate for several days.
Colonies appear when heated at 0°C. Collect bacteria from the colony with a sterilized toothpick, streak it on a GB agar plate (diameter: 10 cm, GB agar medium volume: 20 me),
Incubate at 30°C for 1 week to allow spores to settle. The spores thus obtained were purified by repeating monospore separation twice, and confirmed to be pathogenic by the method described below. It was named. This strain has been deposited with the American Type Culture Collection under deposit number AT CCl, 39187.

なお、純化した株か病原菌であることを実施例１（３）
記載の方法により確認した。In addition, Example 1 (3) confirmed that the purified strain was a pathogenic bacterium.
Confirmed using the method described.

（４）バクテリオファージ５ＰＡ４８溶原閑、ストレプ
トマイセス・パルブルス２２９７　（５ＰＡ４８　）Ａ
ＴＣＣＡ　３９１８７よりファージの誘導・実施例１（
４）と同様にして、ストレプトマイセス・パルブルス２
２９７　（ＳＰＡ　４８　）ＡＴＣＣノσ３９１８７よ
り、　マイトマイシンＣてファージ誘導し、バクテリオ
ファージ５ＰＡ４８のファージ液を得た。(4) Bacteriophage 5PA48 lysogen, Streptomyces parvulus 2297 (5PA48)A
Induction of phage from TCCA 39187/Example 1 (
4), Streptomyces parvulus 2
297 (SPA 48 ) ATCC No. 39187 was induced with mitomycin C to obtain a phage solution of bacteriophage 5PA48.

（５）バクテリオファージ５ＰＡ４８のＤＮＡの調製： 実施例１（５）と同様にして、バクテリオファージ３Ｐ
Ａ４８のＤＮＡを調製した。(5) Preparation of DNA of bacteriophage 5PA48: In the same manner as in Example 1 (5), bacteriophage 3P
A48 DNA was prepared.

（６）バクテリオファージ５ＰＡ４８のＤＮＡに対する
制限酵素の作用： 実施例］（６）と同様にして、バクテリオファージ５Ｐ
Ａ４８のＤ　ＮＡを制限酵素により開裂し、バクテリオ
ファージ５ＰＡ４８のＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂フラグ
メントを分析した。(6) Action of restriction enzymes on DNA of bacteriophage 5PA48: Example] In the same manner as in (6), bacteriophage 5P
A48 DNA was cleaved with restriction enzymes, and the restriction enzyme cleaved fragments of bacteriophage 5PA48 DNA were analyzed.

上記実施例１，２および３て得られた分析績Ｗ−を下記
表１および表２に示す。The analysis results W- obtained in Examples 1, 2, and 3 are shown in Tables 1 and 2 below.

なお、アガロース電気泳動により解析不能である極小フ
ラグ７Ｉントおよび制限酵素による開裂部位数Ｕ：含才
れない。In addition, the number of minimal flags 7 that cannot be analyzed by agarose electrophoresis and the number U of cleavage sites by restriction enzymes are not included.

アガロース電気泳動により決定し、１１Ｔは分析しなか
ったことを意味する。Determined by agarose electrophoresis, 11T means not analyzed.

さらに、実施例１，２および３の分析結果に基ついて作
成した、バクテリオファージ５ＰＡＩＯのＤ　Ｎ　Ａお
よびバクテリオファージＳＰＡ］、８のＤ　Ｍ　Ａの制
限酵素地図をそれぞれ第１図および第２図に示す。Furthermore, the restriction enzyme maps of bacteriophage 5PAIO DNA and bacteriophage SPA] and 8DMA prepared based on the analysis results of Examples 1, 2, and 3 are shown in Figures 1 and 2, respectively. show.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図はバクテリオファージ５ＰＡＩＯｆ７）ＤＮＡの
制限酵素地図を示す。第２図はバクテリオファージＳＰ
Ａ］、８のＤＮＡの制限酵素地図を示す。 特許出願人　藤沢薬品工業株式会社 ｙ、”：ｌＪ　−FIG. 1 shows a restriction enzyme map of bacteriophage 5PAIOf7) DNA. Figure 2 shows bacteriophage SP
A] shows a restriction enzyme map of the DNA of 8. Patent applicant: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）下記性質を有するバクテリオファージｓｐ／４１
０、Ｓ　Ｐ　Ａ　ｌ　８および５ＰＡ４８からなる群か
ら選らばれたバクテリオファージ。 （ｉ　）　（ａｔファージＤＮＡの分子信：約３１メガ
ダルトン（Ｍｄ、） （ｂ）ファージＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂部位数：（ｃ
）ファージＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂パターン：上記の
性質を有するバクテリオファージＰＡ１ｏｉ （ＩＩ　）　（ａ）ファージＤＮＡの分子昂：約３１メ
ガダルトン（Ｍｄ、） （ｂｌファージＤＮＡの制限ＩＷ素開裂部位数・（ｃ）
ファージＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂ノー°クーン・１８
；および （ｌｉｉ）　（ａ、）ファー外ＤＮＡの分子量・約２９
メガダルトン（Ｍｄ） （ｂ）ファージＤＮＡの制限酵素開裂部位数：（ｃ）７
アーシＤ　Ｎ　Ａの制限酵素開裂パターン：上記の性質
を有する／ぐクテリオファージ３　Ｐ　Ａ　４　。 （２Ｈｌ）ストレプトマイセス・パルブルス２２９７（
ＳＰＡＩＯ）を培地に培養し、得られる培養物カラバク
テリオファージＳ、ＰＡＩＯを分離するか；捷たは （ｌｉ）ストレプトマイセス・パルブルス２２９７（Ｓ
ＰＡ　１ｓ　）を培地に培養し、得られる培養物からノ
くクテリオファージ５ＰＡ１８を分離するか；または （ｉｉｉ）ストレプトマイセス・パルブルス２２９７（
ＳＰＡ４８）を培地に培養し、得られる培養物からバク
テリオファージ５ＰＡ４．８を分離することを特徴とす
るバクテリオファージの製造法。(1) Bacteriophage sp/41 having the following properties
A bacteriophage selected from the group consisting of 0, SPA18 and 5PA48. (i) (at Molecular length of phage DNA: approximately 31 megadaltons (Md)) (b) Number of restriction enzyme cleavage sites of phage DNA: (c
) Restriction enzyme cleavage pattern of phage DNA: bacteriophage PA1oi (II) with the above properties (a) Molecular concentration of phage DNA: approximately 31 megadaltons (Md) (bl Number of restriction IW elementary cleavage sites of phage DNA・(c)
Restriction enzyme cleavage of phage DNA No. 18
; and (lii) (a,) Molecular weight of extra-fur DNA・approximately 29
Megadalton (Md) (b) Number of restriction enzyme cleavage sites in phage DNA: (c) 7
Restriction enzyme cleavage pattern of archiDNA: cterophage 3 P A 4 having the above properties. (2Hl) Streptomyces parvulus 2297 (
Streptomyces parvulus 2297 (SPAIO) is cultured in a medium, and the resulting culture carabacteriophage S, PAIO is isolated;
(iii) Streptomyces parvulus 2297 (
A method for producing bacteriophage, which comprises culturing SPA48) in a medium and isolating bacteriophage 5PA4.8 from the resulting culture.