JPS5991884A - Inspection of polynucleatide arrangement and probe - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に？リヌクレオチド試料の検定法に関する
。特に、本発明は未知のまたは不確定含Ｊｌｉ　（ｃｏ
ｎｔｅｎｔ　）の試料ン！リヌクレオチドエキス中の、
特定の標的ヌクレオチド配列の存在に対する定性または
定量検定を行なう方法に関する。[Detailed Description of the Invention] What is the invention generally? This invention relates to a method for assaying polynucleotide samples. In particular, the present invention provides for unknown or uncertain
ntent)'s sample! In the lynucleotide extract,
It relates to a method of performing a qualitative or quantitative assay for the presence of a particular target nucleotide sequence.

一般に遺伝物質の操作技術または生物の遺伝特性の評価
においては、特定の遺伝子または遺伝子部分が生物にま
たけ生物からの遺伝物質の細胞外エキス中に存在するか
どうかを確かめることがしばしば望ブしい。遺伝子また
は遺伝子部分は、本質的にポリヌクレオチド分子のすべ
てまたは一部分を形成するヌクレオチド塩基の特定の配
列（５ｅｑｕｅｎｃｅ　）　　であるから、特定の遺伝
子または遺伝子フラグメントが試料中に存在するかどう
かを発見するためには、遺伝子を形成するヌクレオチド
塩基の特定の配列が試料中に存在するかどうかを発見す
るために試料ポリヌクレオチドを直接試験することが可
能である。In genetic material manipulation techniques in general or in the evaluation of the genetic properties of an organism, it is often desirable to ascertain whether a particular gene or gene portion is present in extracellular extracts of genetic material from an organism across organisms. . Since a gene or gene portion is essentially a specific sequence of nucleotide bases that forms all or part of a polynucleotide molecule, it is useful to discover whether a particular gene or gene fragment is present in a sample. It is possible to directly test a sample polynucleotide to discover whether a particular sequence of nucleotide bases that form a gene is present in the sample.

ＤＮＡまたけＲＮＡポリヌクレオチド試料における牧定
のヌクレオチド標的配列（ｔａｒｇｅｔ　５ｅｑｕ−ｅ
ｎｃｅ　）　　の検出に一般に使われる現在の方法は、
試験配列（ｔｅｓｔ　−５ｅｑｕｅｎｃｅ　）と呼ばれ
る試料を、扶的配列ケ含む放射性標識した相補ＤＮＡ７
’ローブ°（ｐｒｏｂｅ　）に対しヒプリダイゼーショ
ン（ｈｙｂｒｌｄｌＺａｔｌｏｎ　）するととに依存し
ている。nucleotide target sequence (target 5equ-e) in a DNA-spanning RNA polynucleotide sample
Current methods commonly used to detect
A sample called the test sequence (test-5 sequence) was prepared using radiolabeled complementary DNA containing complementary sequences.
'HybrldlZatlon' for 'probe' depends on and.

ｅＤＮＡ７’ロープは多ｉｔ匠単離でき、またはプラス
ミドまたはファージのＯＮ＾ベクターに挿入するような
既知の方法を使いクローン化でき、これを栄養基地で成
長したバクテリアに挿入する。培地が３°２Ｐのようカ
バクチリアによシ自身のＯＮ　、Ａ　Ｋ吸収される放射
性同位体を含むときけ、クローン化したＤＮＡ７”ロー
プは放射性成分を含む。一方、単離しｆＦ−ＯＮ　Ａ　
グローブを試駆管内化学反応により放射性標識もできる
。検出操作においては、典型的には一過器上に固定した
試験配列を放射性標識した相補ＤＮＡグローブに算出し
、その後ＲＣＭ配列を洗う。ついで試験配列の放射能検
定をシンチレーシミン分光器または放射能写真法で行な
う。放射能検定により検出される放射性同位体の景け、
試験配列にヒプリダイゼーションされた放射性ｃＤＮ＾
グローブの量を示し、そこで試験配列が求めている標的
配列を含むかどうかを示している。The eDNA 7' rope can be isolated or cloned using known methods such as insertion into a plasmid or phage ON^ vector, which is then inserted into bacteria grown on a nutrient base. When the medium contains a radioactive isotope that is absorbed by the cavacteria themselves, such as 3°2P, the cloned DNA 7'' rope contains a radioactive component.On the other hand, the isolated fF-ONA
The gloves can also be radioactively labeled by a chemical reaction inside the test tube. In the detection procedure, a test sequence typically immobilized on a transient device is transferred to a radiolabeled complementary DNA globe, followed by washing of the RCM sequence. The test array is then assayed for radioactivity using scintillation spectroscopy or radiography. View of radioactive isotopes detected by radioactivity assay,
Radioactive cDNA hipridized to test sequence
The amount of globe indicates whether the test sequence contains the desired target sequence.

放射性標識したぎりヌクレオチドを用いる検定法をこの
ようが配列の検定に有効であるが、このような操作に固
有の幾つかの欠点がある。必要とする放射性物質は本質
的に幾分危険であシ、また本質的に不安定である。さら
に、このよう外検定操作を打力う実験室は、特別に認可
される必要があシ、オた放射性物質を使うためには特別
に訓練された技術者を必要とする。多くの実験室はこの
ような検定を実施できかい。このような物質の使用にお
ける保謁のわずられしい性質と必要な特別の認可操作の
ためである。Although assays using radiolabeled nucleotides are effective in testing sequences, there are several drawbacks inherent to such procedures. The radioactive materials required are inherently somewhat dangerous and also inherently unstable. Furthermore, laboratories performing such external testing operations must be specially licensed and require specially trained technicians to work with radioactive materials. Many laboratories are unable to perform such assays. This is due to the burdensome nature of the guarantees and special authorization procedures required for the use of such substances.

本発明の検定法は一部分、放射性物質の使用を避けるこ
とが意図されている。The assay method of the present invention is intended, in part, to avoid the use of radioactive materials.

本発明は、試料ポリヌクレオチド試験エキス中の特定の
標的ヌクレオチド配列の存在の検定法は、まず試験エキ
スを試験試料として単離し、ついで試験試料を０１枦的
ヌクレオチド配列に実質上相補のｃＤＮＡ配列と予め決
めた蛋白質に結合するのに適した蛋白質結付配列の両者
を含む変性グローブにさらし、（２１俊性グローブの蛋
白質結合配列にＰ１合する結合蛋白質にさらすことを含
むと劣約できる。試験試料を洗って未成１（成分を除い
た後、結合蛋白質の存在に対し試験試料の検定を行かう
。The present invention provides a method for assaying the presence of a specific target nucleotide sequence in a sample polynucleotide test extract by first isolating the test extract as a test sample, and then converting the test sample into a cDNA sequence that is substantially complementary to the 01-specific nucleotide sequence. Exposure to a modified glove containing both a protein binding sequence suitable for binding to a predetermined protein (21) and a binding protein that has a P1 binding sequence to the protein binding sequence of the binding glove (21) can be degraded. After washing the sample to remove unformed components, assay the test sample for the presence of binding protein.

このようが試験試料の検定は、酵素、ケイ先糸、溶解訪
発基、−井たけ他の適当力非放射性マーカー残基のよう
が既知のマーカー型を利用する直接または間接のマーカ
ー結合免疫検定が好着しい。Assays of test samples may include direct or indirect marker-binding immunoassays that utilize known marker types, such as enzymes, carbon fibers, lytic visiting groups, and non-radioactive marker residues such as those of Itake et al. is preferable.

そこで、本発明の目的に特定のヌクレオチド標的配列の
存在を、放射性物質の必要なしに確かめることができる
ように、できれば増幅したマーカー結合検定により試料
？リスクレオチド試験エキス中の特定の標的ヌクレオチ
ド配列の検出法を提供することにある。Therefore, for the purposes of the present invention, the presence of a specific nucleotide target sequence can be confirmed in a sample, preferably by an amplified marker binding assay, without the need for radioactive substances. The object of the present invention is to provide a method for detecting a specific target nucleotide sequence in a riskreotide test extract.

本発明の別の％ｇね、？リヌクレオチド検定挟作に使用
できる変性ポリヌクレオチドグローブでアリ、この変性
グローブは共通の分子内に標的配列に実質上相補のｃＤ
ＮＡ配列と蛋白質結合配列の両者を含んでいる。Another %g of the invention, right? This is a modified polynucleotide globe that can be used in polynucleotide assays.
It contains both an NA sequence and a protein binding sequence.

本発明の々お別の特徴は、特異な抗原性ヌクレオチドを
ｃＤＮＡ配列に合体するときけ、蛋白質結合配列とｃＤ
Ｎ＾配列が一つで同一配列であることができることであ
る。Another feature of the invention is that when a specific antigenic nucleotide is incorporated into a cDNA sequence, a protein binding sequence and a cDNA
One N^ sequence can be the same sequence.

本発明の検定法を使うと、生物のｆ）ＮＡ″！たけＲＮ
Ａにおいて特定の標的ヌクレオチド配列を検出できる。Using the assay method of the present invention, the f) NA''!
A specific target nucleotide sequence can be detected in A.

そこで、本発明の方法を診断オたは病気診断のための病
原体または非病原体の同定に、またはウィルス、類ウィ
ルス体、ノ々クチリア、かび、グロトゾア、瞥たけ他の
植物または動物の生命形の同定に使用できる。さらに、
通常の育種技術またＦｉ遺伝子操作によシ生物に導入し
た遺伝子配列の存在を確かめるために、新しく育種した
生物中のまたは生物からのＤＮＡ、ＲＮＡ、首たはｍＲ
ＮＡセグメントの検定に本性を使用できる。Therefore, the method of the present invention can be used for the identification of pathogens or non-pathogens for diagnosis or disease diagnosis, or for the identification of viruses, viroids, fungi, grotozoa, and other plant or animal life forms. Can be used for identification. moreover,
In order to confirm the presence of gene sequences introduced into an organism by conventional breeding techniques or Fi genetic manipulation, DNA, RNA, DNA, or mR in or from the newly bred organism may be used.
True nature can be used to test NA segments.

生命形を遺伝子の表現型の表功、が起る段階まで成長さ
せる必要なしに、宿主の細胞中の特に関心の標的遺伝子
の存在１ｆＣはそのｍＲＮＡ複写の存在の決定に本性な
第１１用できる。これは、育種ストックの初期段階での
選択に対しふるい分は検定を可能、にし、望む素質を含
捷力い全子孫を直ちに捨てることを可能にするから、植
物のような育種計画で特に有用である。さらに、表視型
が問題の個体で表塑されるかどう≠・に関係なく、動物
細胞号たけ人間細ル）Ｋおける同−画伝子の存在または
不在の決定に本検定法を使用できる。そこで、情伝病の
検出にまたけ遺伝子が表塑さねてい表い個体におＨ゛る
劣性泣伝素質キャリヤーの検出に、本発明の方法を応用
できる。The presence of a target gene of particular interest in a host's cells can be used naturally to determine the presence of its mRNA copy, without the need to grow the life form to a stage where phenotypic expression of the gene occurs. . This is particularly useful in plant-like breeding programs, as it allows screening to be tested for selection at an early stage of the breeding stock, and allows immediate discarding of all progeny containing the desired qualities. It is. Furthermore, the present assay can be used to determine the presence or absence of the same picture gene in animal cells as well as human cells, regardless of whether the picture type is expressed in the individual in question. . Therefore, the method of the present invention can be applied not only to the detection of inherited diseases but also to the detection of carriers of recessive genetic predispositions in individuals whose genes are not expressed.

本発明の他の目的、利点、特徴は以下の詳し、い記載か
らさらに明らかとなろう。Other objects, advantages, and features of the invention will become more apparent from the detailed description that follows.

本醐明の検定法は、試験ポリヌクレオチドの単離試料を
一連の試薬にさらすことを含む。操作法をか、もよく理
解するために、捷ず検定物資の製造法と内芥牧１を談論
し、ついで検定法を記載することにする。The present assay involves exposing an isolated sample of test polynucleotide to a series of reagents. In order to better understand the operation method, I will discuss the manufacturing method of uncut test materials and Uchikumaki 1, and then describe the test method.

ｌ　検定物質の調製 本検定操作のため率俯し力ければならカい第ｌの千要物
質は、共通の分子内に標的配列に実質上相補のｃＤＮ＾
ＤＮＡ蛋白質結合配列の両者を含むクローン化ＤＮＡ７
’ローブストランドである。プローブストランドを、こ
こでは「変性グローブｊ　（ｍｏｄＮｒｅｄ　ｐｒｏｂ
ｅ　）　　と呼ぶ。変性プローブをつくるためには、検
定しようとする特定の標的ヌクレオチド配列に対ｃＤＮ
Ａ配列のつくシ出し単離できる必要がある。Preparation of Assay Substances Preparation of the Assay Substances For this assay procedure, the first essential substance is a cDNA that is substantially complementary to the target sequence within a common molecule.
Cloned DNA 7 containing both DNA and protein binding sequences
'It's a lobe strand. The probe strand is here referred to as “modNred prob
e). To create a degenerate probe, a cDNA is added to the specific target nucleotide sequence to be assayed.
It is necessary to be able to identify and isolate the A sequence.

ｃＤＮＡ配列をつくるためには、まず検定が検出を意図
している特定のヌクレオチド標的配列の試料を単離する
必要がある。標的配列の試料エキスの単離のためＫは、
試験エキスに関し次で議論するよう力操作を利用できる
。一方、桓、的配列のヌクレオチド配列が完全に既知の
ときり、その配列を直接合成で鳶る。ついで標的配列を
含む？リヌクレオチドから複写によってｃＤＮＡ配列を
つくることができる。標的配列なｆＨｉ足し、ＣＤＮ＾
ＤＮＡつくり、単離する方法は１（袈ではなく、この操
作部分に対しては肖″　　核技術分野で此められている
どのような方法も使用できる。好捷しくは、公表された
技術のどわかｆｆ使って、ｃＤＮＡストランドをクロー
ン化ベクターに挿入する。To generate a cDNA sequence, it is first necessary to isolate a sample of the specific nucleotide target sequence that the assay is intended to detect. For isolation of sample extract of target sequence, K is
Force manipulation can be utilized for test extracts as discussed below. On the other hand, when the nucleotide sequence of a target sequence is completely known, the sequence can be synthesized directly. Then does it contain the target sequence? cDNA sequences can be created by copying from polynucleotides. Add target sequence fHi, CDN^
The method for making and isolating DNA is 1. Insert the cDNA strand into the cloning vector using Wakaff.

ｅＤＮＡ配列をつくり出し、とねをクローン什ベクター
に押入する両者のための一つの有第１」カカ活け、ハグ
チラ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｌ。One tool for both creating an eDNA sequence and inserting it into a cloning vector.

ｕｓ八へ３巻、３　／’Ｉｔ、〜３１Ｓθ頁（／９’Ｈ
。us8 volume 3, 3 /'It, ~31Sθ page (/9'H
.

年）により実証されている。この操作においてに１、反
転？？写を利用１−１て、ヌクレオチドの各々が標的６
１列のヌクレオチドに対し相補であるＣＤＮＡ＠＠スト
ランドをつくり出す。ついで、こうしてつくりだしたｃ
ｒ）ＮＡストランドをまずエキソヌクレアーゼで処理し
、ついで末端トランスフェラーゼで処理すると、唯一の
ヌクレオチドの存在で反応しｃＤＮ＾ストランド上に唱
定のホモ所すマー尾配列をつくり出す。このホモポリマ
ー尾ｈｅ　列はポリヌクレオチドグラスミドまたはファ
ージベクター中にＴｈ（以のグロセスによりつくり出さ
れた相補ホモポリマー尾配列に釣合っている。ついで上
記ベクターはクローン化のためバクテリアに挿入される
。(year). 1 in this operation, invert? ? Using the sequence 1-1, each of the nucleotides corresponds to the target 6.
Creates a CDNA@@strand that is complementary to a row of nucleotides. Then, I created c
r) Treating the NA strand first with an exonuclease and then with a terminal transferase reacts with the presence of a unique nucleotide to create a presumptive homologous mer-tail sequence on the cDN^ strand. This homopolymer tail he sequence is matched to a complementary homopolymer tail sequence created by Th in a polynucleotide grasmid or phage vector. The vector is then inserted into bacteria for cloning. .

このようなりＮＡｔたはｃＤＮ＾ＤＮＡメントをベクタ
ーに挿入し、ついでクローン化のためバクテリアに押入
する幾つかの操作は、文献でよく実証されている。手近
にある操作では、ｃＤＮＡ配列を含んでいるグラス建ド
童たけファージであることのできるベクターを、バクテ
リア内でクローン化し、ｃＤＮＡ配列を含む多数の娘ポ
リヌクレオチドストランドクｉ−ンを発生させ、これを
変性グローブの形成に利用できる。配列が全恨伝子、遺
伝子の一部分管たけ複写、オペロン、ブロモ−ター、イ
ントロン、または他のヌクレオチド１列かどうかとは無
関係に、上記同一操作を使ってＤＮＡ、ＲＮＡ。Several such procedures for inserting NAt or cDNA DNA elements into vectors and then pushing them into bacteria for cloning are well documented in the literature. In the procedure at hand, a vector, which can be a grass-grown phage containing a cDNA sequence, is cloned in bacteria to generate a large number of daughter polynucleotide strand clones containing the cDNA sequence; This can be used to form modified gloves. The same procedure described above can be used to construct DNA, RNA, regardless of whether the sequence is an entire gene, a partial copy of a gene, an operon, a bromotor, an intron, or any other single string of nucleotides.

またはｍＲＮ＾配列に相補の′ＣＤ　Ｎ　Ａ　ｆｉＦ列
をつくり出す。Alternatively, create a 'CD N A fiF array complementary to the mRN^ sequence.

ｃＤＮ＾ＤＮＡブをクローン化後、ｃＤＮ＾ＤＮＡンド
を含むクローンオたはクローン化ストランドのセグメン
トを変性して、ある種の蛋白質に特に結合を意図してい
る追加のＤＮＡ配列を含ν）る〇 本発８ｈｉの目的には、この配列は、蛋白５ｆ結合配列
と呼ば−１１、それに結合する蛋白質は結合蛋白質と呼
は名る。面配列が夫々の目的に活性であり、−諸に結合
ｊ−でいる限り、蛋白結合へ「１列をｃ　ｎ　Ｎ　Ａ　
Ｆ！＋？列に結合するため使う力θ−Ｆｉｉ、１１だし
く重要では力い。この結合操作は鈍端結紮（ｂｌｕｎｔ
　ｅｎｄ　１ｌＨａｔｌｏｎ　）　、粘性端結紮、甘た
け他の結紮操作のような既知法によって、着たけ各スト
ランドＶ〆結合されたアダプター結合残基を使って、遂
行−７’きる。ｃＤＮ＾ＤＮＡブを含むストランドのこ
の変性を遂行する一方法は、ストランドを制限（ｒａｓ
ｔｒｌｃｔｌｏｎ　）エンドヌクレアーゼで切る方法で
あ一す、着たけ合成リーンカーを使うか甘たに粘性末８
Ａを冶するストランドをつくり出すためホモＩリマー尾
配列を添加することによりその末端を３Ｐ性する。蛋白
質結合配列な有するＤＮＡの配列は、制限エンドヌクレ
アーゼを使いまたはＣｐＮ＾ストランドの粘性端に相補
でを、る他の方法を使い、同様に謝離し変性する。蛋白
質結合配列を含むセグメントをついでｃＤＮＡを含むセ
グメントに結合して、変性グローブをつくり出す。この
変性プローブは全ベクター自身であるが、オたは変性グ
ローブをベクターに挿入して変性ベクターをつくり出す
。ついで変性ベクターをバクテリアに挿入して、一連の
クローン化費性グローブをつ〈シ出す。After cloning the cDNA strand, the clone or segment of the cloned strand containing the cDNA strand is denatured to include additional DNA sequences that are specifically intended to bind to certain proteins. For purposes of the present invention, this sequence is referred to as the protein 5f binding sequence -11, and the protein that binds to it is referred to as a binding protein. As long as the surface arrays are active for their respective purposes and are bound to each other, it is possible to "c n N A
F! +? The force used to connect the columns is θ-Fii, which is 11 and is of particular importance. This joining operation is performed using a blunt end ligation.
The 7' end is performed using known methods such as end ligation, viscous end ligation, and other ligation procedures, using adapter binding residues attached to each strand. One way to accomplish this modification of strands containing cDNA DNA blocks is to restrict the strands (ras
trlctlon) Cut it with endonuclease, use a synthetic lean car or use a sweet viscous powder 8
To create a strand that binds A, its terminus is rendered 3P by adding a homo I remer tail sequence. Sequences of DNA containing protein binding sequences are similarly excised and denatured using restriction endonucleases or other methods that complement the sticky ends of the CpN^ strands. The segment containing the protein binding sequence is then joined to the segment containing the cDNA to create a modified globe. This denatured probe is the entire vector itself, or a denatured probe is inserted into the vector to create a denatured vector. The modified vector is then inserted into the bacteria, producing a series of cloneable globes.

ｃＤＮ＾ＤＮＡストランドターに挿入し、蛋白結合Ｗ４
ｅ列をクローン化ベクターに挿入する前にクローン化す
る上記操作の別法と１−で、二つの１列をクローン化ベ
クターに挿入する順番を逆にすることも含まれている。Insert into the cDNA strand and protein binding W4
An alternative to the above operation of cloning the e column before inserting it into the cloning vector, 1-, also includes reversing the order in which the two 1 columns are inserted into the cloning vector.

たとえば、適当力制限エンドヌクレアーゼまたは他の開
裂法を使ってまず蛋白ｖｉ結合配列を単離し、ついで得
られた蛋白鵞結合西Ｐ列ストランドをクローン化ベクタ
ーに挿入することができる。ベクターをクローン化前ま
たは後で、一層多くの物質を扱えるよう蛋白質結合配列
を含むベクターの初めのクローン化を行なうのが好まし
いが５ｃＤＮ＾ストランドをベクターに挿入し、ついで
さらにクローン化する。そこで、二つの配列の各々を悴
・性ベクターに導入する順番は、両者を同一ベクター１
７ｉ７２ｔ！、入１．てそのベクターに変性プローブを
つくり出す神霊よりも型部でけない。すでに蛋白質結合
ｆｉＰ列を含んでいるデラスミドオたけグローブのベク
ターを使うとともできる。そこＴ、ｃＤＮＡ西１列をク
ローン化のためベクターに挿入！−、ベクターに変性グ
ローブをつ〈ｈ出すことだけが必要である。ｃＤＮＡ配
列および蛋白質結合配列の情が信義単離でき、ついで互
に結合できれば、クローン什＄２作自身は必要でＶ［な
い。For example, the protein vi binding sequence can be first isolated using an appropriate restriction endonuclease or other cleavage method, and then the resulting protein vi binding sequence can be inserted into a cloning vector. Before or after cloning the vector, the 5 cDN^ strand is preferably inserted into the vector and then further cloned, preferably by performing an initial cloning of the vector containing the protein binding sequence to accommodate more material. Therefore, the order in which each of the two sequences is introduced into the vector is the same vector.
7i72t! , entering 1. It is worse than a divine spirit that creates a denatured probe in that vector. This can also be done by using Derasmid Otake's vector, which already contains a protein-binding fiP sequence. Insert the first row of cDNA west into the vector for cloning! -, it is only necessary to export the modified globe to the vector. If the cDNA sequence and protein binding sequence information can be isolated and then linked to each other, cloning itself is not necessary.

本発明の方法で第１１用できる蛋白質結合配列の（φつ
かのけんちゆうけ沖在知らねており、この蛋白質結合配
列の単動１および第１１用法は公表されている。たとえ
ば、生物の構造遺伝子の表現は、ゼ；、造ＪＮ伝子如よ
りコードされた蛋白ａの合成を抑制御たけ促進できるレ
ギュレーターおよびオペレーター制御遺伝子の絹により
しはしけ変性豊たは制御される。制御遺伝子のなかには
、構造ｌｒ伝子からｍ　ＲＮ　Ａ分子の複写の開始を容
易にするためＲＮＡｙＪ？リメラーゼの結合に対し特異
点であるプロモーター配列がしばしば見出される。そこ
で、このようがプロモーターはＲＮ　Ａ　ｒ　ｌメラー
ゼ、蛋白質酵素に結合する親和力をもつ。大腸菌の１ｅ
ｅ−プロモーターおよびｔｒｐ−プロモーター配列は著
しく研究され、ベクターにクローン化され、よく同定さ
れている。これらプロモーターに隣接した制限エンドヌ
クレアーゼ開裂の位置、および事実これらプロモーター
のヌクレオチド配列も公表されている。そこで、このプ
ロモーター配列を含むＤＮＡフラグメントを単離し、ク
ロン化する方法は既知である。１ａｃ−プロそ一ター訃
よびｔｒｐ−プロモーターが列のように、プロモーター
の塩基配列が同定されていれば、このような蛋白ＩＮ、
結合配列を全部合成することもできる。The protein-binding sequence that can be used in the method of the present invention (φ11) is unknown, and the single-acting and eleventh uses of this protein-binding sequence have been published.For example, the structure of living organisms The expression of the gene is controlled by the silk gene expression, which is a regulator and operator control gene that can suppress and promote the synthesis of protein A encoded by the JN gene. Some of the control genes are: Promoter sequences are often found that are singular points for the binding of RNAyJ?rimerase to facilitate the initiation of replication of mRNA molecules from the structure lr gene. Has affinity for binding to enzymes.E. coli 1e
The e-promoter and trp-promoter sequences have been extensively studied, cloned into vectors, and well identified. The positions of restriction endonuclease cleavage adjacent to these promoters, and indeed the nucleotide sequences of these promoters, have also been published. Methods are therefore known to isolate and clone DNA fragments containing this promoter sequence. If the nucleotide sequence of the promoter has been identified, such as the 1ac-promotor promoter and the trp-promoter, such protein IN,
It is also possible to synthesize the entire binding sequence.

同様に、栴造遣”伝子の表現に効果をもつＤＮＡストラ
ンド上の他の制御点も、蛋白質結合配列として利用でき
る。たとえば、構造遺伝子の表現を抑制する幾つかのオ
ペロンセグメントが大腸菌で同定されている。このよう
な一つのオペロンセグメントはＩａｃ−オペレーターを
含むオペロンにあり、セグメントが１ａｃ−阻害物と呼
ばれる蛋白質に結合すると抑制される。そこで１ａｃｌ
ｌ害物に結合するこのオペロンセグメントも適当な蛋白
質結合配列である。Similarly, other control points on the DNA strand that have an effect on the expression of the Senzo genes can also be used as protein binding sequences. For example, several operon segments that suppress the expression of structural genes have been identified in E. coli. One such operon segment is in the operon containing the Iac-operator, which is inhibited when the segment binds to a protein called the Iac-inhibitor.
This operon segment that binds to harmful substances is also a suitable protein binding sequence.

他の有用な蛋白質結合配列はバクテリオファージ活性に
関連したプロモーターである。Ｔ！ｒおよびＴクバクテ
リオファージのようなバクテリオファージは強いプロモ
ーター配列を含んでおシ、これも感染した生物のＲＮＡ
＆リメラーゼに優先的に結合し、ファージの遺伝子によ
りコードされた蛋白質の蛋白合成を開始させる。Other useful protein binding sequences are promoters associated with bacteriophage activity. T! Bacteriophages, such as the R and T bacteriophages, contain strong promoter sequences, which are also linked to the RNA of the infected organism.
& binds preferentially to limerase and initiates protein synthesis of the protein encoded by the phage gene.

そこで、強いプロモーター配列を含むファージのＤＮＡ
ストランドまたはその部分は、ＲＮＡポリメラーゼに対
する有効な蛋白質結合配列として働らくことができ、フ
ァージが感染した生物から単離される。Therefore, phage DNA containing a strong promoter sequence
The strand, or portion thereof, can serve as an effective protein binding sequence for RNA polymerase and is isolated from the phage-infected organism.

別の組の有用な蛋白質結合配列は、特異な抗原性である
ヌクレオチｒ物質の配列である。一般Ｋ。Another set of useful protein binding sequences are sequences of nucleotopic substances that are uniquely antigenic. General K.

ｔ）ＮＡ配列は著しく温和な抗原性で、ＤＮＡ配列に対
しつくった抗血清はその配列に特異的でない。t) NA sequences are extremely mildly antigenic, and antisera raised against DNA sequences are not specific for that sequence.

しかし、ある種のヌクレオチド配列は特異な抗原性であ
り、このような配列は本発明の変性グローブにおいて蛋
白質結合配列として使用できる。この特異な抗原性配列
を直接ＣＤＮＡ配列に含めることができ、または変性グ
ローブの別の部分に含めることができる。特異な抗原性
ヌクレオチド配列のコ例はＺ−ＤＮＡ配列および特に稀
なヌクレオチドを含む配列である。However, certain nucleotide sequences are uniquely antigenic and such sequences can be used as protein binding sequences in the modified globes of the invention. This unique antigenic sequence can be included directly in the CDNA sequence or in another part of the modified globe. Examples of unique antigenic nucleotide sequences are Z-DNA sequences and sequences containing particularly rare nucleotides.

蛋白質結合配列として使用できる特異な抗原性配列の一
つの型けＺ−ＤＮＡである。Ｚ−ｆ）ＮＡけＤＮＡの異
性体であり、大部分のＤＮＡの右手らせんよりも左手ら
せんストラン「の形成に熱力学的に有利な一連の塩基対
（ポリｄＧｄＣ）を含んでいる。Ｚ−ＤＮＡは抗原性で
また比較的自然において稀であるから蛋白質結合配列と
して有用である。Ｚ−ＤＮＡの抗原性はＺ−ＤＮＡに結
合し正常のＤＮＡに結合しない抗血清をつくることを許
し、Ｚ−ＤＮＡが比較的稀である事実は、あや１つだ正
の徴候の割合を下げる。一般ＶＣ，ＤＮＡは著しく温和
な抗原性で、そのためにつくった抗血清はどの配列に対
しても特異的でない。そこで蛋白質結合配列としてＺ−
ＤＮＡを使うと、抗血清により識別できて非特異性の問
題を避けｂヌクレオチド配列を与える。Ｚ−ＤＮＡは著
しく稀であり、抗−Ｚ−ＤＮＡ抗血清はふつうの右手Ｄ
ＮＡを識別しないからである。One type of unique antigenic sequence that can be used as a protein binding sequence is Z-DNA. Z-f) is an isomer of DNA that contains a series of base pairs (poly-dGdC) that thermodynamically favors the formation of left-handed helical strands rather than right-handed helices in most DNA. DNA is useful as a protein binding sequence because it is antigenic and relatively rare in nature. -The fact that DNA is relatively rare reduces the rate of positive indications.In general, DNA is extremely mildly antigenic, and therefore the antiserum produced is specific for any sequence. Therefore, Z-
The use of DNA provides b nucleotide sequences that can be distinguished by antiserum, avoiding problems of non-specificity. Z-DNA is extremely rare, and anti-Z-DNA antisera are common to right-handed D
This is because the NA is not identified.

本発明内で蛋白質結合配列として使用できる別の型の特
異な抗原性配列は、稀な抗原性ヌクレオチＰを含むヌク
レオチド配列、たとえば！−ブロモデオキシウリジンお
よびＳ−ヨードデオキシウリジンである。この−程の稀
なヌクレオチドは、自然に稀に存在ししかし通常のヌク
レオチドと同一様式でヌクレオチド配列に自由に合体で
き為ヌクレオチドの例である。これらのヌクレオチドの
ハロゲン成分は、これらの稀なヌクレオチドに特異な抗
血清の発生を可能にする。当該ヌクレオチＰけ自然の配
列において著しく稀であるから、当該抗血清は稀なヌク
レオチドを含む配列に対し高度に特異的である。この特
徴を利用するためには、標的配列に対し相補のＣＤＮＡ
　　配列を含むプローブを、これらの稀なヌクレオチド
を含む特異カ培地で生長した宿主中で成長させることが
できる。この方法は標的配列にヒブリダイゼーション□
できまた稀なヌクレオチーを含んでいる特異な抗原性配
列を合体している変性グローブを生体内で生産する。そ
こで、稀なヌクレオチドに対する抗血清はその配列に結
合する。蛋白質結合配列として機能する特異が抗原性配
列を、直接ＣＤＮＡ配列に合体でき、または変性プロー
ブ上の別の配列に合体できる。特異な抗原性ヌクレオチ
ド配列を使おうとするときけ、必要ではないが、稀なヌ
クレオチドおよびＺ−Ｄ　Ｎ　ＡＫ対するモノク四−ン
抗血清が好ましい。Another type of unique antigenic sequence that can be used as a protein binding sequence within the present invention is a nucleotide sequence containing a rare antigenic nucleotide P, such as! -bromodeoxyuridine and S-iododeoxyuridine. These rare nucleotides are examples of nucleotides that occur rarely in nature but are free to incorporate into nucleotide sequences in the same manner as normal nucleotides. The halogen moiety of these nucleotides allows the generation of antisera specific for these rare nucleotides. Since the nucleotides are extremely rare in natural sequences, the antisera are highly specific for sequences containing rare nucleotides. To take advantage of this feature, it is necessary to use cDNA complementary to the target sequence.
Probes containing the sequences can be grown in hosts grown in specific mosquito media containing these rare nucleotides. This method involves hybridization to the target sequence □
A modified glove is produced in vivo that incorporates unique antigenic sequences, including rare nucleotides. Antisera against rare nucleotides then bind to that sequence. A specific antigenic sequence that functions as a protein binding sequence can be incorporated directly into the CDNA sequence or into another sequence on a denatured probe. When attempting to use unique antigenic nucleotide sequences, monoquine antisera directed against rare nucleotides and Z-DNA AK are preferred, although not required.

一般に、当該配列が単離できてクローン化ベクターに挿
入でれるときは１、または画が特異的に結合蛋白質に結
合親和性をもつと１！け、また特別の結合蛋白質が検定
操作により検出できるときけ、ＤＮＡフラグメンメ中に
含まれるどのヌクレオチド配列も本発明の方法で蛋白質
結合配列として役立てることができる。Ｚ−ＤＮＡを使
わないときは、結合蛋白質に対し免疫検定を行なうこと
が好ましいから、結合蛋白質は他の種の動物において抗
原反応をひき起し得ることが好ましい。２−ＤＮＡまた
は稀なヌクレオチド配列のような特異な抗原性配列と蛋
白質結合配列として使うときは当該蛋白質結合配列を多
分クーロン化ベクター中に勿論存在させることができ、
または別の配列としてまたｔｆｃ［）ＮＡ配列の一部分
として、り四−ン化ベクターへの特異な抗原性配列およ
びヌクレオチドの体体内−！！たけガラス管内合体によ
りつくり出すことができる。Generally, 1 if the sequence can be isolated and inserted into a cloning vector, or 1 if the sequence has specific binding affinity for the binding protein! Furthermore, any nucleotide sequence contained in a DNA fragment can serve as a protein binding sequence in the method of the invention, provided that the particular binding protein can be detected by assay procedures. When Z-DNA is not used, it is preferred that the binding protein is capable of eliciting an antigenic response in other species of animal, since it is preferred to perform immunoassays on the binding protein. 2-When used as a protein binding sequence with a unique antigenic sequence such as DNA or a rare nucleotide sequence, the protein binding sequence may of course be present in the cloning vector;
Or as a separate sequence and as part of the tfc[)NA sequence, in vivo-! ! It can be produced by combining inside a bamboo glass tube.

本発明の方法において試薬として使う結合蛋白質の選択
は勿論、蛋白質結合配列の選択に依存しる。結合蛋白質
の選択に対する唯一の重要な基準は、結合蛋白質が選択
性をもって選ばれた特定の蛋白質結合配列に結合する親
和力をもつことが要求されることであり、また免病検定
を使う場合は、当該蛋白質が別の種の動物において抗原
反応をひき起し得ることが要求される。他物質に対する
蛋白質の錯体、たとえば蛋白質−ハゾテン錯体、蛋白質
−酵素錯体、または他の蛋白質−マーカー錯体を結合蛋
白質として使用もできる。ＲＮＡポリメラーゼは、本発
明の方法で利用するのに特に適した蛋白質である。この
蛋白質は多くの構造遺伝子に関連した多くのプロモータ
ー配列に結合する親和力を有し、そこでこの蛋白質に特
異的である多くの蛋白質結合配列が役立つからである。The choice of binding protein to be used as a reagent in the method of the invention will, of course, depend on the choice of protein binding sequence. The only important criterion for the selection of a binding protein is that the binding protein is required to have an affinity to bind to the specific protein binding sequence chosen with selectivity, and when using an immunoassay, It is required that the protein be capable of eliciting an antigenic response in an animal of another species. Complexes of proteins to other substances, such as protein-hazotene complexes, protein-enzyme complexes, or other protein-marker complexes, can also be used as binding proteins. RNA polymerase is a particularly suitable protein for use in the methods of the invention. This protein has an affinity for binding to many promoter sequences associated with many structural genes, and many protein binding sequences that are specific to this protein are useful.

さらに、ＲＮＡポリメラーゼの単離および適当なプロモ
ーター配列の単離操作はよく研究され、公表されている
から、これらは本発明の方法で利用するのに特に適した
物質である。ｌａｃ阻害物、蛋白質錯体も特によく実証
され、この操作に使用できる。特異な抗原性配列を蛋白
質結合配列として使うときけ、結合蛋白質は好ましくは
特異”な抗原性配列に対し特電的な抗血清であり、また
は酵素のよった非放射性マーカーに結合した上記抗血清
である。本発明の操作で使用できる他の結合蛋白質は、
他の阻害物、ヒストン、ｒｌＮＡ変性酵素、ポリメラー
ゼ、および異化代謝産物遺伝子賦活体重白質（ＣＡＰ）
のような他の賦活体蛋白質を含む。Furthermore, since isolation procedures for RNA polymerase and suitable promoter sequences are well studied and published, they are particularly suitable materials for use in the methods of the invention. Lac inhibitors, protein complexes, are also particularly well demonstrated and can be used in this procedure. When a specific antigenic sequence is used as a protein binding sequence, the binding protein is preferably an antiserum specific for the specific antigenic sequence, or an antiserum conjugated to a non-radioactive marker such as an enzyme. Other binding proteins that can be used in the procedures of the present invention include
Other inhibitors, histones, rlNA-modifying enzymes, polymerases, and catabolite genes activate heavy white matter (CAP)
Contains other activator proteins such as.

結合蛋白質を検出できる既知の検出法によって、結合蛋
白質の検出を遂行できることが含まれている。しかし、
特異な抗原性蛋白質に特異な抗血清が結合蛋白質である
場合を除いて、特異性と感度の理由で当該蛋白質を免疫
検定により検出することが好ましい。このよう表免疫検
定を行なうためには、結合蛋白質に対し特異的な抗血清
を用意することが必要である。うさぎまたは他の動物か
ら、当該技術で既知の常法で抗血清をつくり、単離する
。動物に最大抗原反応を起させるのに十分な時間わくで
、異質の結合蛋白質を抗原として動物に注射する。つい
で血清を動物から取り返し、結合蛋白質に特異的な抗血
清を後で使うため単離する。It is included that detection of the binding protein can be accomplished by any known detection method capable of detecting the binding protein. but,
Unless the binding protein is an antiserum specific for a specific antigenic protein, it is preferred to detect the protein by immunoassay for reasons of specificity and sensitivity. In order to perform such a surface immunoassay, it is necessary to prepare an antiserum specific to the binding protein. Antisera are generated and isolated from rabbits or other animals by conventional methods known in the art. The foreign binding protein is injected into the animal as an antigen for a period of time sufficient to cause the animal to mount a maximal antigenic response. Serum is then recovered from the animal and antiserum specific for the binding protein isolated for later use.

下記のように、直接免疫検定操作を使わうとするときは
、マーカー結合免疫検定にふつう使うマーカーの一つ、
たとえばペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスホター
ゼのような酵素、またはフルオレセインのようなケイ光
マーカーに抗血清を結合する。When using the direct immunoassay procedure as described below, one of the markers commonly used in marker binding immunoassays,
For example, the antiserum is conjugated to an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphotase, or a fluorescent marker such as fluorescein.

当該技術分野で熟知の方式で、マーカー効果を増幅する
ため複数のマーカーを抗血清に結合できまた好ましい。It is possible and preferred to couple multiple markers to the antiserum in a manner well known in the art to amplify the marker effect.

本発明の方法に関連し間接免疫検定を利用しようとする
ときけ、第２抗血清を含む試薬が必要である。結合蛋白
質に対する抗血清の調製に類似の方式でつくり出した山
羊抗−うさぎＩｇＧを、第ａ抗血清として使用できる。When attempting to utilize indirect immunoassays in conjunction with the methods of the present invention, reagents containing a second antiserum are required. Goat anti-rabbit IgG, generated in a manner similar to the preparation of antisera against binding proteins, can be used as antiserum a.

ついで第コ抗血清を酵素ペルオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼのような
マーカー、またはフルオレセインのようカケイ光マーカ
ー、または可視検定で検出できる他の残基と結合する。The first antiserum is then combined with a marker such as the enzyme peroxidase, β-galactosidase, or alkaline phosphatase, or a fluorescent marker such as fluorescein, or other residues that can be detected by a visual assay.

酵素の結合なしに羊毛抗−うさぎＩｇＧを利用でき。Wool anti-rabbit IgG can be used without enzyme conjugation.

また下記のような二重間接検定操作で市販ＰＡＰｍ体＜
Ａ！ルオキシダーゼーうさぎ抗ペルオキシダーゼ）を利
用できる。In addition, commercially available PAPm bodies <
A! peroxidase (rabbit antiperoxidase).

ユ、方法 本発明に従う特定のヌクレオチド標的配列の存在の検定
法を記載する。引用数字は添附図面の流れ図に示した工
程を指す。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Methods A method of assaying for the presence of a specific nucleotide target sequence according to the present invention is described. Referenced numbers refer to the steps shown in the flowchart in the attached drawings.

試験ポリヌクレオチドエキスの試料の単離および固定で
操作を始める。検定用の試験エキスの試料の準備のため
には、遺伝物質の試料または遺伝物質を含む他の細胞物
質の試料を均質化し、必要なときｉｊ精製する。ついで
エキス中の４リヌクレオチドがたとえばニトロセルロー
ス濾過器まだは他の不溶マトリックス上に析出すること
により固定できるような方式で、試料の水性エキスをつ
くる。水性エキスを好ましく中性ないしアルカリ性ｐ■
に緩衝する。このようなポリヌクレオチド試料の単離の
ための幾つかの操作が知られており、この操作は典型的
には高塩濃度でフェノールおよびクロロホルムーイソア
ミルアルコールエキスヲ使うことによりエキスの除蛋白
を含む。エキスの単離は好ましくはニトロセルロース濾
過器上の固定によるが、他の固定ｐ過担体または他の担
体媒体または他の不溶マトリックス上の固定によ不こと
もできる。他のヌクレオチｒ単離または固定操作も使用
できる。マトリックス上に同定した試料ポリヌクレオチ
ド試料配列を以後試験試料と呼ぶ。Begin the procedure with isolation and fixation of a sample of test polynucleotide extract. For the preparation of a sample of test extract for assay, a sample of genetic material or other cellular material containing genetic material is homogenized and, if necessary, purified. An aqueous extract of the sample is then prepared in such a way that the four nucleotides in the extract can be fixed, for example by precipitation on a nitrocellulose filter or other insoluble matrix. Preferably aqueous extract with neutral or alkaline pH
buffer. Several procedures are known for the isolation of such polynucleotide samples, which typically involve deproteinization of the extract by using phenol and chloroform-isoamyl alcohol extracts at high salt concentrations. . Isolation of the extract is preferably by immobilization on nitrocellulose filters, but may also be by immobilization on other immobilized filters or other carrier media or other insoluble matrices. Other nucleotide isolation or fixation procedures can also be used. The sample polynucleotide sample sequences identified on the matrix are hereinafter referred to as test samples.

固定工程は図の数字で１１で示されている。The fixing step is indicated by the number 11 in the figure.

検定しようとするポリヌクレオチド試験エキスは、微生
物、バクテリア、ウィルス、類ウィルス体、植物、また
は動物組織を含め、どの生命形からのものであることも
できる。微生物−リヌクレオチドの試験試料エキスをつ
くるには、微生物を直接濾過器上にとらえ、洗剤（すな
わちラウリル硫酸ナトリウム）または酵素（たとえばリ
ゾチーム）で溶解する。ついでポリヌクレオチＹを細胞
物質の残りから分離できる。植物または動物組成に対し
ては、乳ばちと乳棒またけウオーリングブレンダーを使
い植物または動物組織の機械的均質化を行なうことがで
き、ふたたびついで洗剤またげ酵素で処理し、分離工程
を行なう。濾過器上にポリヌクレオチドエキスの固定に
適したノ々クチリア、植物、または動物のエキスの調製
を詳しくあつかった種々の方法が手に入り、たとえばサ
イトウらのＢｌｏｃｈｌｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ
、クコ巻（１９６３年）ＡＩ９〜６コ９頁、キスレブら
の、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｌｏ１０Ｆ１９．　Ａ　４巻、
／　／’７０〜ｌｌり３頁。The polynucleotide test extract to be assayed can be from any life form, including microorganisms, bacteria, viruses, viroids, plants, or animal tissues. To prepare a microbial-linucleotide test sample extract, microorganisms are captured directly on a filter and lysed with a detergent (ie, sodium lauryl sulfate) or an enzyme (eg, lysozyme). The polynucleotide Y can then be separated from the rest of the cellular material. For plant or animal compositions, mechanical homogenization of the plant or animal tissue can be carried out using a mortar and pestle running blender, followed by treatment again with detergent and enzymes, followed by a separation step. A variety of detailed methods are available for the preparation of Nectaria, plant, or animal extracts suitable for immobilization of polynucleotide extracts on filters, such as Blochlm, Blophys, Acta by Saito et al.
, Kuko volume (1963) AI9-6, p.9, Kislev et al., PlantPhyslo10F19. A 4 volumes,
/ /'70~ll 3 pages.

Ｃｌ９１θ年）、ケンプルらのＧａｎｅｔｌｃｓ、　９
　！ｒ巻、ダｓｉ−ダｓｒ頁Ｃｌ９１０年６月）、ムレ
−らのＮｕｃｌｓｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ＠５ｅａｒｃｈ
、　ｇ巻、１９号、１１３２／−１１３，２！ｒ頁ｃｔ
ｑｇｏ年）がある。Ganetlcs of Kemple et al., 9
! Vol. r, p. Cl, June 910), Mouret et al.'s Nuclslc Ac1ds R@5earch
, Volume g, No. 19, 1132/-113,2! r page ct
qgo year).

本発明の方法で比較的純粋ガーリヌクレオチＰエキスを
利用することが可能であね、一般に好ましいが、エキス
中に存在する不純物が本方法で使う他の試薬と反応する
ような性質のものでない限り、本発明の方法内で不純エ
キスを使用もできる。It is possible, and generally preferred, to utilize a relatively pure Garlic Nucleotid P extract in the method of the present invention, provided that the impurities present in the extract are not of such a nature that they will react with other reagents used in the method. , it is also possible to use impure extracts within the method of the invention.

典型的には、関心のポリヌクレオチド配列を含む細胞か
らの機能質の使用は、本発明の方法の有効性に影響する
過剰量の不純物を含まない。Typically, use of functional materials from cells containing the polynucleotide sequence of interest will not contain excessive amounts of impurities that would affect the effectiveness of the methods of the invention.

試Ｍポリヌクレオチドのエキスを、「南プロット」、「
化プロット」、または「ドツトプロット」のような確立
された操作を使って、ニトロセルロース濾過器上に固定
できる。これらの操作は典型的には試料核酸を熱、また
はアルカリ性または他の化学処理（たとえばグリオキサ
ールおよびメチル水銀クロリド処理）Ｋより変性し、つ
いでニトロセルロース濾過器に非共有結合することを含
む。Sample M polynucleotide extract was added to the "South Plot", "
can be immobilized on nitrocellulose filters using established procedures such as 'dot plots' or 'dot plots'. These operations typically involve denaturing the sample nucleic acids with heat or alkaline or other chemical treatments (eg, glyoxal and methylmercury chloride treatments) and then non-covalently binding to a nitrocellulose filter.

たとえば［）８Ｍ紙のようにヌクレオチドエキスに共有
結合を形成するマトリックス物質を利用できることも含
まれている。上記のように、試験エキスを固定できる限
り、またマトリックスが操作の残りぢゆう試験エキスを
結合できる限カ、マトリックスの選択は重要でけたい。This also includes the availability of matrix materials that form covalent bonds with the nucleotide extract, such as [)8M paper. As mentioned above, the choice of matrix is important as long as the test extract can be immobilized and the matrix can bind the test extract for the remainder of the operation.

検定しようとする試料試験エキス中のポリヌクレオチド
完全なＯＮ八へ子を形成する全４リヌクレオチドストラ
ンドであることができ、または全ＲＮＡ分子であること
ができ、または全ｍＲＮＡ分子であることができ、また
けＤＮＡｔたＦｉＲＮ＾分子の制限酵素開裂または他の
開裂によりつくり出したある長さのポリヌクレオチーフ
ラグメントであることができる。The polynucleotide in the sample test extract to be assayed can be all four nucleotide strands forming a complete ON chain, or can be an entire RNA molecule, or can be an entire mRNA molecule. , a length of polynucleotide fragment created by restriction enzyme cleavage or other cleavage of a FiRN^ molecule that spans DNA.

一過器上に試験配列の固定後、緩衝溶液によるヒブリメ
イゼーショｙ前洗浄ＩＢを行なって、試料から不必要な
不純物を除去し、マトリックス上のすべての非特異的結
合点を飽昭するのが好ましい。After immobilization of the test array on the transitor, a pre-hybrimization wash IB with a buffer solution is performed to remove unnecessary impurities from the sample and saturate all non-specific binding points on the matrix. It is preferable to do so.

試験試料として試料ヌクレオチドエキスの固定工程およ
びヒブリダイゼーション前洗浄後、水洗の次の工程は試
験試料をヒブリダイゼーションのため変性グローブにさ
らすことである。上記の変性プ四−プをつくり出す操作
を図の数字１８に示す。ヒプリメイゼーション操作１４
でけ、試験試料を化学量論量より過剰の変性プローブを
添加した緩衝溶液に浸漬する。化学量論量より過剰の変
性プ四−プを使って、標的配列を含む試料エキス中に含
まれるデリヌクレオチｒストランドの各々のヒブリダイ
ゼーションに十分量の変性グローブが役立つことを確実
にする。このようなヒブリダイゼーション操作には既知
である。たとえばトー”ｔｒＸ、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、ｓｃｌ、ＵＳＡ、クク巻、９号、！；２０／
　〜！ｒ：ｌθｔｒ頁＜１ｑｔｒｏ年）　オＪ：　（ｉ
　ｆ”　ｙハート、Ｅｌｌｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　ＢＩｏ
、ｐｈｙｓ、Ｃｏｍｍａ　ｌ　　２３巻、ＡＩＩ／〜６
頁（１９６１，年）参照。試料ヌクレオチド試９エキス
の一部分のヌクレオチド配列が変性プローブ中の相当す
る相補ヌクレオチド配列配列と釣合ったときだけ、成功
するヒブリダイゼーションが起る。そこで、試料試験ポ
リヌクレオチドエキスにおいて標的配列を有するストラ
ンドがあれば、変性プローブからのｃＤＮＡ配列はその
標的配列にヒブリダイゼーションし、二重ストランド錯
体を形成する。溶液中のｃＤＮＡストランドの若干の部
分は変性プローブの他のストランドに含まれる他のｃＤ
ＮＡ配列にヒブリダイゼーションでき、変性グローブの
互につながったストランド錯体を形成する。互につなが
ったストランドのなかのｃＤＮＡ配列のどれか一つが試
験試料中のストランドの一つに結合すると、全錯体は試
験試料に結合する。試料試験エキスは固定されているか
ら、試料に結合したｃＤＮＡ配列を含む変性プローブの
上記錯体または単一ストランドも固定される。こうして
固定した変性プローブの上記ストランドも蛋白結合配列
を含む。After the fixation step of the sample nucleotide extract as a test sample and the pre-hybridization wash, the next step after water washing is to expose the test sample to a denaturing glove for hybridization. The operation for producing the above-mentioned modified polymer is shown at numeral 18 in the figure. Hipprimization operation 14
Then, the test sample is immersed in a buffer solution containing a stoichiometric excess of the denatured probe. A stoichiometric excess of the denaturing globe is used to ensure that a sufficient amount of the denaturing globe is available for hybridization of each of the derinucleotide rstrands contained in the sample extract containing the target sequence. Such hybridization procedures are known. For example, ``trX, Proe, Natl,
^cad, scl, USA, Kuku Volume, No. 9,! ;20/
~! r:lθtr page<1qtro year) OJ: (i
f”y heart, Ellochem, and BIo
, phys, Comma l vol. 23, AII/~6
(1961). Successful hybridization occurs only when the nucleotide sequence of a portion of the sample nucleotide assay 9 extract matches the corresponding complementary nucleotide sequence in the denatured probe. Therefore, if there is a strand with the target sequence in the sample test polynucleotide extract, the cDNA sequence from the denatured probe hybridizes to the target sequence to form a double-strand complex. Some of the cDNA strands in solution may contain other cDs contained in other strands of the denatured probe.
It can hybridize to NA sequences, forming interconnected strand complexes of modified globes. When any one of the cDNA sequences in the interconnected strands binds to one of the strands in the test sample, the entire complex binds to the test sample. Since the sample test extract is immobilized, the complex or single strand of denatured probe containing the cDNA sequence bound to the sample is also immobilized. The strands of the denatured probe thus immobilized also contain protein binding sequences.

ｃＤＮＡ配列と試験配列との間には正確な相補を必要と
しないことを理解すべきである。がなりの数の釣合って
いない塩基対、ある場合には３θ係まｆｃはそれ以上が
存在してさえ、ヒブリダイゼーションは起る。ヒプリダ
イゼーション操作のきびしさを変えることにより、ヒブ
リダイゼーションに対し一層多くのまたは一層少ない相
補を必要とすることが可能である。It should be understood that exact complementarity between the cDNA sequence and the test sequence is not required. Hybridization will occur even if there are an unbalanced number of base pairs, in some cases more than 3θ fc. By varying the severity of the hybridization operation, it is possible to require more or fewer complements for hybridization.

ヒブリダイゼーション九ついで、ヒブリダイゼーション
後洗浄１５を行なって、試験試料に直接または間接に結
合していない変性プローブの過剰の非ヒプリダイゼーシ
ョン１１を試験試料からすすぎ去る。ヒプリダイゼーシ
ョン後洗浄は緩衝溶液で行なう。Following hybridization 9, a post-hybridization wash 15 is performed to rinse the test sample of excess non-hybridization 11 of denatured probe not bound directly or indirectly to the test sample. Post-hipridization washing is performed with a buffer solution.

操作の次の工程は試験試料を結合蛋白質にさらすことで
ある。試験試料を結合蛋白質を含む溶液にさらす。この
溶液は結合蛋白質を含む必要があり、また結合蛋白質が
変性プローブ中の蛋白質結合配列に結合するのを促進す
る条件に試料を保つ必要がある。変性プローブが固定さ
れた試料ポリヌクレオチド試験エキスに結合していれば
、結合配列を含む変性プローブの一部分けなお試験試料
中にある。蛋白質結合配列が試験試料中に存在すれば、
結合蛋白質は蛋白質結合配列に結合し、試験試料中に固
定される。図の１６で示した蛋白質結合工程も、完全な
結合を確実とするために過剰量の結合蛋白質を含むべき
である。The next step in the procedure is to expose the test sample to the binding protein. A test sample is exposed to a solution containing the binding protein. This solution must contain the binding protein and the sample must be maintained under conditions that promote binding of the binding protein to the protein binding sequences in the denatured probe. If the denatured probe is bound to the immobilized sample polynucleotide test extract, a portion of the denatured probe containing the binding sequence is still in the test sample. If the protein binding sequence is present in the test sample,
The binding protein binds to the protein binding sequence and becomes immobilized in the test sample. The protein binding step shown at 16 in the figure should also include an excess amount of binding protein to ensure complete binding.

結合操作後、過剰の結合蛋白質をν過器から洗ｔｎ去る
。１７で示したこのヒブリダイゼーション後洗浄操作は
、変性プローブに結合し、ついで結合蛋白質に結合した
固定された試験ｙｊ？　ＩＪヌクレオチド試料間に形成
され得る錯体を邪ましない緩衝溶液を利用すべきである
。After the binding procedure, excess bound protein is washed away from the filtration vessel. This post-hybridization wash procedure, shown in 17, allows the immobilized test yj? to bind to the denatured probe and then to the binding protein. A buffer solution should be utilized that does not interfere with complexes that may form between IJ nucleotide samples.

ｃＤＮＡ配列が試料ポリヌクレオチドエキス中に含まれ
る一つまたはそれ以上のストランドの配列に実質上釣合
うときは、試験試料はマトリックス上に試料エキス、変
性プローブの一つまたはそれ以上のストランド、変性グ
ローブに結合した結合蛋白質を含む錯体を含んでいる。When the cDNA sequence substantially matches the sequence of one or more strands contained in the sample polynucleotide extract, the test sample is combined with the sample extract, one or more strands of the denatured probe, and the denatured globe on the matrix. contains a complex containing a binding protein bound to.

ここで結合蛋白質の存在に対し検定を行なう。結合蛋白
質のｌ検出法は、酵素またはケイ光体のよう表マーカー
残基を結合蛋白質に直接結合することである。たとえば
、抗−Ｚ−ＤＮＡ抗血清を結合蛋白質として使うときけ
、イルオキシダーゼを抗血清に直接結合でき、この酵素
を試験することによって当該蛋白質の存在を検出できる
。結合蛋白質の検出にどの他の非放射性法を使用できる
が、蛋白質の免疫検定が好ましく、この操作を詳Ｌ　＜
試験する。An assay is now performed for the presence of binding proteins. One method for detecting binding proteins is to directly attach surface marker residues, such as enzymes or fluorophores, to the binding proteins. For example, when anti-Z-DNA antiserum is used as the binding protein, yl oxidase can be directly coupled to the antiserum and the presence of the protein can be detected by testing this enzyme. Although any other non-radioactive method can be used to detect bound proteins, protein immunoassays are preferred and this procedure is described in detail.
test.

直接免疫検定のためには、試験試料を結合蛋白質に対し
てつくった抗血清のリン酸塩緩衝食塩溶液のような水溶
液にさらす。抗血清は結合蛋白質に特異的であるから、
結合蛋白質が錯体中に存在するときだけ、抗血清は試験
試料に含まれるとの錯体に結合する。抗血清結合工程を
１８に示す。For direct immunoassays, the test sample is exposed to an aqueous solution, such as a phosphate-buffered saline solution, of an antiserum raised against the binding protein. Since the antiserum is specific to the binding protein,
The antiserum binds to the complex contained in the test sample only when the binding protein is present in the complex. The antiserum binding step is shown in 18.

試料試験？リヌクレオチドエキスのどの部分本質性ゾロ
ープ中のｃＤＮＡと釣合わないときけ、変性プローブは
試験試料に結合せず、そこで結合蛋白質本試験試料に結
合せず、この段階で抗血清は結合するための結合蛋白質
を見出さない。これに対比し、錯体が形成されていれば
、抗血清も錯体に結合する。この反応についで、リン酸
塩緩衝食塩溶液のような緩衝液により、試験試料から過
剰の抗血清を洗う１９゜ 操作におけるこの抗血清結合工程では、酵素またはケイ
光マーカーのようなマーカーを結合している結合蛋白質
に特異的な抗血清を利用できる。Sample test? When any part of the polynucleotide extract is not commensurate with the cDNA in the essential zorope, the denatured probe will not bind to the test sample, so the binding protein will not bind to the main test sample, and at this stage the antiserum will bind to the binding protein. No protein found. In contrast, if a complex is formed, the antiserum will also bind to the complex. This reaction is followed by washing excess antiserum from the test sample with a buffer such as phosphate-buffered saline.The antiserum binding step in the 19° procedure involves binding markers such as enzymes or fluorescent markers. Antisera specific for binding proteins are available.

このようなマーカーを結合した抗血清を使うときけ、抗
血清に結合したマーカーの存在のため、試験試料の適当
な検定がすぐできる。マーカーとして抗血清への結合に
利用できる適当な酵素はアルカリ性ホスホターゼ、ペル
オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼを含む。ｚＯで示
したこの直接免疫検定は、しかし抗血清の存在を検定す
るための多くの方法の一つにすぎない。When such marker-bound antisera are used, appropriate assay of the test sample is readily available due to the presence of the marker bound to the antiserum. Suitable enzymes that can be used to bind antisera as markers include alkaline phosphotase, peroxidase, β-galactosidase. This direct immunoassay, designated zO, is however only one of many methods to assay for the presence of antiserum.

一方、結合蛋白質に特異的な抗血清がマーカーに結合し
ていないときけ、通常の間接またけ二重間接マーカー結
合免疫検定を行って、結合蛋白質に対する抗血清の存在
を検出できる。このような間接および二重間接免疫検定
およびその変形はよく知られており、当該技術で実証さ
れている。間接検定は、蛋白質に結合させるために使っ
た抗血清、すなわちうさぎＩＦｌ、Ｇ’に特異的である
山羊抗−うさぎＩｇＧのような抗血清を使う。マーカー
Ｆｉ第コの抗血清、すなわち山羊抗−うさぎＩｇＧに結
合している。二重間接検定はマーカーを結合していない
こわら二つの抗血清の両者を使い、つｈでマーカーを結
合している抗血清、すなわち酵素でマーカーした々ルオ
キシダーゼーうさぎアンチペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）
を使い、これを第ａ抗血清に結合する。このような間接
または二重間接検定を使う利点は、第コ抗血清が第１抗
血清を発生した種からのすべての抗血清眞対し一般的な
ことである。このようなマーカーを結合した抗血清本商
業上入手できる。検定結果を増幅するために、一つ以上
のマーカーを各ＩｇＧ分子に結合本できる。On the other hand, if the binding protein-specific antiserum does not bind to the marker, a conventional indirect straddle double indirect marker binding immunoassay can be performed to detect the presence of antiserum against the binding protein. Such indirect and double indirect immunoassays and variations thereof are well known and proven in the art. Indirect assays use the antiserum used to bind to the protein, such as goat anti-rabbit IgG, which is specific for rabbit IF1, G'. Marker Fi binds to the second antiserum, goat anti-rabbit IgG. A double indirect assay uses two antisera that do not have a marker attached to them, and one that uses an antiserum that does have a marker attached to it, i.e., the enzyme marker oxidase-rabbit antiperoxidase (PAP).
This is used to bind to antiserum No. a. The advantage of using such an indirect or double indirect assay is that the first antiserum is generic to all antisera from the species that generated the first antiserum. Antisera that bind such markers are commercially available. One or more markers can be attached to each IgG molecule to amplify the assay results.

抗血清に結合したマーカー酵素により接触される灰石に
よって、検定が検出を求めている蛋白質の存在に対し目
による表示を与えることけ、このような操作の常法であ
る。標的配列の存在の検出に、＃素の代りに抗血清に結
合したフルオレセインのようなケイ光マーカー、または
他のマーカー残基を利用できる。このようなケイ光マー
カーを使うときけ、洗浄後の試験試料をＵＶ照射ｋかけ
、得られたケイ光水準は試験試料エキス中に存在する特
定のヌクレオチド配列の量の直接の表示である。It is common practice in such procedures that the assay provides a visual indication of the presence of the protein that the assay seeks to detect by contacting the ashes with the marker enzyme bound to the antiserum. Fluorescent markers, such as fluorescein, or other marker residues conjugated to the antiserum can be used in place of the # prime to detect the presence of the target sequence. When using such fluorescent markers, the washed test sample is subjected to UV irradiation and the resulting fluorescent level is a direct indication of the amount of a particular nucleotide sequence present in the test sample extract.

こうして、本発明の方法は放射性核酸プ四−ブの使用を
含まないＲＮＡまたはＯＮ＾配列の検定を可能にする。Thus, the method of the invention allows for the assay of RNA or ON^ sequences without the use of radioactive nucleic acid probes.

そこで、このよう壜放射性プローブの使用忙固有の欠点
が避けられる。当該操作は、抗原性蛋白質の検出に広く
使われる熟知の操作であるマーカー結合免疫検定のよう
表蛋白質検出に　“適する方法により検出できる蛋白質
−ヌクレオチド錯体を生じる。Ｚ−１）ＮＡ以外の核酸
は一般に最小に抗原性であり、また核酸に対する抗血清
は一般に特定の配列に対し非特異的であるから、上記操
作はふつうはポリヌクレオチド配列の検出に役立た力い
。本発明の方法はポリヌクレオチド配列の単一検定操作
をつくり出すために、ｆリヌクレオチドヒプリダイゼー
シ目ンの特異性とマーカー結合免疫検出のような蛋白質
検出検定の感度の利点を組合せ、そこで著しく特異的で
著しく敏感であり、またポリヌクレオチド配列を検出で
きる。The drawbacks inherent in the use of such bottled radioactive probes are thus avoided. This procedure yields a protein-nucleotide complex that can be detected by a method suitable for protein detection, such as a marker-linked immunoassay, which is a well-known procedure widely used to detect antigenic proteins.Z-1) Nucleic acids other than NA The above procedures are generally useful for detecting polynucleotide sequences, as they are generally minimally antigenic, and antisera to nucleic acids are generally non-specific for a particular sequence. We combine the specificity of f-rinucleotides with the sensitivity advantages of protein detection assays such as marker-linked immunodetection to create a single assay procedure that is both highly specific and extremely sensitive. , and can also detect polynucleotide sequences.

特異性を与えるｃＤＮＡ配列および蛋白質検出検定操作
の感度の利用を許す蛋白質結合配列の両者を含む変性ゾ
ローブを利用するととＫより、当該方法を遂行する。そ
こで、この操作は極度に高い感度を与えるが、なお著し
く選択的で、特別の認可または特別の取扱を必要とする
危険な物質を使用しない。The method is accomplished by utilizing a modified zorobe containing both a cDNA sequence that confers specificity and a protein binding sequence that allows access to the sensitivity of the protein detection assay procedure. This procedure thus provides extremely high sensitivity, yet is still highly selective and does not use hazardous materials that require special approval or special handling.

本発明の方法の別の利点け、操作に利用する試薬の多く
が多くの検定に共通であゆ、そこで、多数の検定操作で
使うため多ｔに製造できることである。検出しようとす
る特定のヌクレオチド配列に特異的であるｃＤＮ＾配列
以外け、操作に使う残りの成分と試薬は標準化できる。Another advantage of the method of the present invention is that many of the reagents utilized in the procedure are common to many assays, and thus can be manufactured in large quantities for use in multiple assay procedures. Other than the cDN^ sequence, which is specific to the particular nucleotide sequence to be detected, the remaining components and reagents used in the procedure can be standardized.

たとえば、蛋白質結合配列をり四−ン化ベクターに挿入
し、なかに蛋白質結合配列を含む上記ベクターの妥当な
供給をつくり出すことができ、また結合蛋白質、マーカ
ーの結合した結合蛋白質、″またはその結合蛋白質に特
異的な抗血清の類似のストックをつくり出すことができ
る。そこで、本発明の検定法を開始する前に、ｃＤＮＡ
配列をつ〈す、蛋白質結合配列を含むストランドに挿入
することだけが必要である。また、同一検定操作を多数
反覆し行なわうとするときは、本発明の変性プローブを
多数のクローン化のためクーロン化ベクターに挿入して
、この検定を行なうのに使う変性プローブの大きなため
をつくり出すこともできる。変性プローブはこれをクロ
ーン化する生物から単離する以外は、使うのに特別の処
理を必要としないから、操作に使うため多量のプローブ
をつくることができる。For example, a protein binding sequence can be inserted into a polymerized vector to create an adequate supply of said vector containing a protein binding sequence therein, and a binding protein, a marker-conjugated binding protein, or a combination thereof. Similar stocks of protein-specific antisera can be generated; therefore, before starting the assay of the invention, the cDNA
It is only necessary to insert the sequence into the strand containing the protein binding sequence. In addition, if the same assay procedure is to be repeated many times, the denatured probe of the present invention can be inserted into a cloning vector for multiple cloning to create a large pool of denatured probes for use in this assay. You can also do it. Because denatured probes require no special treatment for use other than isolation from the organism in which they are to be cloned, large quantities of probes can be made for use in manipulations.

次の実施例はさらに本発明を具体的に例示するものであ
る。これらの実施例は、どのような方式でも本発明の技
術的範囲を制限する意図のもので示すものではない。The following examples further illustrate the invention. These examples are not intended to limit the scope of the invention in any way.

実施例１ 結合蛋白質配列をつくるために、Ｔ７バクテリオフアー
ジのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｅ　５ｌｉｔ　
　にさらした。完全消化後、強いプロモーターＡ／、Ａ
、２、Ａ３を含むフラグメントを電気泳動により分離し
、アガロースゲルから回収した。Example 1 T7 bacteriophage DNA was digested with the restriction endonuclease He 5lit to generate binding protein sequences.
exposed to After complete digestion, strong promoter A/, A
, 2, A3-containing fragments were separated by electrophoresis and recovered from an agarose gel.

これらのプロモーター配列を蛋白質結合配列として使っ
た。回収したプロモーターフラグメン）？結紮して高分
子量重合体をつくり、ついで直接ＴｌｌＤＮＡリガーゼ
を使い鈍端結紮によりプラスミトヘクｐ−ｐＮｏｉｓｉ
ｑ”＋たけｐ　Ｎ　Ｏ／！ｒ２３のＳｍａｌｉたけＨｐ
ａ１部分に接合し、変性プローブをつくり出した。つい
で変性プローブを大腸菌菌株ＭＣ／θ０９中でクローン
化し、多量につくった。These promoter sequences were used as protein binding sequences. recovered promoter fragments)? ligation to create a high molecular weight polymer, and then directly ligate the plasmid p-pNoisi by blunt-end ligation using Tll DNA ligase.
q"+takep N O/!r23's SmalitakeHP
It was ligated to the a1 portion to create a denatured probe. The denatured probe was then cloned into E. coli strain MC/θ09 and produced in large quantities.

ベクターｐＮｏ　／　、５−　／　’７およびｐＮｏ　
／　３２　、？けシラスミドｐＢＲ３２２の誘導体で、
そこでそれに相同の配列を示す。ベクター１）Ｎｏ　／
　左／りまたけｐＮｏ　／　３　ａ２３　またけプラス
ミドｐＢＲ３２２はＴ７パクテリオフアーゾの蛋白質結
合配列に相同の配列を含まない。Vectors pNo/, 5-/'7 and pNo
/ 32,? A derivative of Kecilasmid pBR322,
Therefore, the sequence homologous to it is shown. Vector 1) No /
Left/Reversing pNo./3 a23 Reversing plasmid pBR322 does not contain a sequence homologous to the protein binding sequence of T7 bacteriophazo.

試験エキスとして、プラスミドｐＢＲ３２コのＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼＴａｑ　ｌ　　で消化し、最高
分子量の２フラグメントをアガロースゲル中に分離し、
サウザン、Ｊｏｕｒ、　ｏｆ　Ｍｏ、　Ｂｌｏｔｓ、　
９　！ｒ巻、３０３〜３／７頁（／９７左年）に記載の
方式でニトロセルロース濾過器上に固定した。As a test extract, the DNA of plasmid pBR32 was digested with restriction endonuclease Taq l, and the two fragments with the highest molecular weight were separated in an agarose gel.
Southern, Jour, of Mo, Blots,
9! It was fixed on a nitrocellulose filter by the method described in Volume R, pp. 303-3/7 (/97 left year).

対照試験エキスとして、子牛胸腺からの［）ＮＡを同様
に固定した。ついでニトロセルロース濾過器を予備洗浄
し、コｘｓｓｃ％Ｏ，コ係ＢＳＡ。As a control test extract, [)NA from calf thymus was similarly fixed. Then, the nitrocellulose filter was pre-washed and treated with %O and BSA.

０．２係フイコル、０．．２％ｐｖｐ、変性鮭***ｏ　
Ｎ　Ａ　！；　Ｏｔｔ　ｉ　／　ｙＬｔを含む緩衝液中
で、エラブロモ−ターを有する変性プローブｐＮｏ　／
　、ｔ　／りおよびｐＮｏ　／　５２３に対しヒブリダ
イゼーションした。0.2 Section Ficole, 0. ．． 2% pvp, denatured salmon sperm o
NA! ; In a buffer containing Otti/yLt, the denatured probe pNo/
, t/ri and pNo/523.

ヒブリダイゼーション前、変性プローブをｇＯ℃ＶＣ１
０分加熱することにより変性した。ヒブリダイゼーショ
ン後、濾過器をまず、４．！ｔ’ｃでＯ，、ｌＳＳフコ
ル、０，２％ＰＶＰを含む、ｌ　ｘ　ｓ　Ｓ　Ｓ　Ｑ、
３Ｍの緩衝液中で、第コに６．５−”Ｃで０．２係フイ
コル、０．２’４ＰＶＰを含む／Ｘ５ＳＣの緩衝液中で
、最後に室温で（，２，２〜、２左’Ｃ）ＲＮＡポリメ
ラーゼ結合緩衝液（ＲＮＡＰＢＢ）中で、各々７０〜３
０分洗浄した。ついで濾過器を１０ｍＭへｄ　ｘ　（ｐ
Ｈ７ｍ　−２）、／　Ｏｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ２　、θＱｍ
’Ｍ’ｔＤＴＡ、ｔｈ／ＰＪＩＮｊＩＣ１，、′ＪＦ３
ＳＭ’ＳＯｐ　１１　／　ｔＬｌを含むＲＮＡＰＢＢｏ
、２ｍｌに、３７℃で２分浸漬した。大腸菌からのＲＮ
Ａポリメラーゼ２５μｇを加え、濾過器と混合した。濾
過器を３７℃でコル３分培養した。Before hybridization, store the denatured probe at gO℃VC1.
Denatured by heating for 0 minutes. After hybridization, first remove the filter from 4. ! O at t'c, lSS Fucol, containing 0.2% PVP, l x s S S Q,
In 3M buffer, firstly at 6.5-''C, containing 0.2% ficoll, 0.2'4PVP/X5SC buffer, and finally at room temperature (,2,2~,2 Left 'C) RNA polymerase binding buffer (RNAPBB) at 70-3
Washed for 0 minutes. The filter was then diluted to 10 mM d x (p
H7m-2), / Om M MgCl2, θQm
'M'tDTA, th/PJINjIC1,,'JF3
RNAPBBo containing SM'SOp 11/tLl
, for 2 minutes at 37°C. RN from E. coli
25 μg of A polymerase was added and mixed with the filter. The filter was incubated at 37°C for 3 minutes.

ついで濾過器を除去し、ｒＨ４ＡｐＢＢＯ，！；ｒｎｒ
、中でツ回１，２　、ｔ　”Ｃで／３分洗った。ついで
濾過器をＲＮＡＰＢＢＱ、左ｒｎεに移し、うさぎでつ
くった抗−ＲＮＡポリメラーゼ抗血抗血ｒ　００　ｔｉ
　／ｌを加えた。３７℃で６θ分後、濾過器を除去し、
ＲＮＡＰＢＢｏ、３ｍｌ中でコ回１．２５　”Ｇで７５
分洗った。ツいで濾過器をＲＮＡＰＢＢＯ，、ｔ＃Ｉｆ
ｆＫ移し、山羊抗−うさぎＩｇ０２３μｇを加えた。The filter was then removed and rH4ApBBO,! ;rnr
The filter was then washed 1,2 times for 3 minutes at t''C for 1 to 3 minutes in a vacuum chamber.
/l was added. After 6θ minutes at 37°C, remove the filter,
RNAPBBo, 75 in 1.25”G in 3ml
I washed it for a minute. Use the filter to RNAPBBO,,t#If
fK transfer and 3 μg of goat anti-rabbit IgO was added.

３７℃で６θ分後、濾過器を除去し、ＲＮＡＰＢＢθｅ
　３　ｍｚ中でコ回洗った。ついで濾過器を３り℃のＲ
ＮＡＰＢＢ１０θμを中で７時間西洋わさびベルオキシ
ダーゼ−りさぎ抗−ペルオキシダーゼ錯体（ＦＡＡ）１
１．３ｉ’μｇと反応させた。ついで濾過器をＲＮＡＰ
ＢＢｏ、左ｖでコ回、Ｊ　、ｔ　”Ｃで各々／！ｒ分洗
った。濾過器を乾燥プロットし、ペルオキシダーゼ基質
溶液（左Ｏｍ　Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム、２！；ｍ
Ｍクエン酸、０．０’１４ｏ−フェニレンジアミン、Ｏ
０θ／　！ｒＩ　Ｈ２Ｏ２）と室温で３分反応させた。After 6θ min at 37°C, remove the filter and remove RNAPBBθe.
Washed twice in 3 mz. Then, heat the filter to 3°C.
Horseradish peroxidase-risagi anti-peroxidase complex (FAA) 1 for 7 hours in NAPBB 10θμ
It was made to react with 1.3i'μg. Then RNAP the filter
BBo, washed twice with left v, J, t''C for /!r minutes each. Filters were plotted dry and peroxidase substrate solution (left Om M dibasic sodium phosphate, 2!; m
M citric acid, 0.0'14o-phenylenediamine, O
0θ/! rI H2O2) for 3 minutes at room temperature.

試料が試験の標的配列である１）ＢＲ３２２フラグメン
トを含むときけ、鮮明外帯黄かっ色が発展し、正の結果
を示した。試料がＤＮＡを含まないかまたは子牛胸腺か
らのＤＮＡを含むときは、認められた結果は負で、強い
色は発展しなかった。この実施例では、結合蛋白質、大
腸菌ＲＮＡポリメラーゼは、酵素結合二重間接免疫検定
により検出した。When the sample contained the target sequence of the test, 1) the BR322 fragment, a bright yellowish-brown color developed, indicating a positive result. When the sample contained no DNA or DNA from calf thymus, the results observed were negative and no strong color developed. In this example, the binding protein, E. coli RNA polymerase, was detected by enzyme-linked double indirect immunoassay.

実施例コ 実施例／と同一操作に従ったが、ただしハイブリダイゼ
ーション前洗浄およびハイブリダイゼーションを直接Ｒ
ＮＡＰＢＢおよびＱ、７ｍＭジチオスレイトール中で行
ない、ハイブリダイゼーション後洗浄はＲＮＡＰＢＢ中
であった。Example Co The same procedure as Example/ was followed except that the pre-hybridization wash and hybridization were performed directly.
NAPBB and Q were performed in 7mM dithiothreitol, and post-hybridization washes were in RNAPBB.

実施例３ 実施例コと同一操作に従ったが、ただ１−結合蛋白ηＲ
ＮＡポリメラーゼをハイブリダイゼーション工程中伯接
変性グローブと共に加えた。Example 3 The same procedure as in Example 3 was followed, but with only 1-binding protein ηR
NA polymerase was added during the hybridization step along with the denatured globe.

実施例 実施例１と同一操作に従ったが、ただしＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲル中に分離後、これを霜、気溶出に
より回収し１、アンドレ、５ｃｈｌｅｌｃｔ＋ｅｒ＆　
５ｃｈｅｌｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ＸＡｐｐＨｃａｔ
ｌｏｎ　Ｕｐｄａｔ＠。EXAMPLE The same procedure as in Example 1 was followed, except that the DNA fragments were separated into an agarose gel, collected by frost, air elution,
5chell 5equences XAppHcat
lon Update@.

１９ｇ２年に記載の方法に従いニトロセルロース濾過器
上に「ドツトプロット」した。19g2, on a nitrocellulose filter.

実施例Ｓ 実施例１と同一操作を使ったが、ただし第コ抗廂清をア
ルカリ性ホスファターゼに接合した。Example S The same procedure as in Example 1 was used, except that the first antibody was conjugated to alkaline phosphatase.

３り’ｃテｌ、　０’Ａ−後、Ｆ？ｌａｆ除去Ｌ、ＲＮ
　Ａ　Ｂ　Ｂ中で洗い、乾燥プロットした。ついで濾過
器を色発展のためアルカリ性ホスシアターゼ基質溶液（
７Ｍジェタノールアミン（ｐｌ童９−ｇ＞、ｏ、；ｍＭ
ＭｇｃＡ　　、／　ｊｍＭ　　ｐ−、−トロフェニルホ
スフアート）と反応させた。本実施例では、結付蛋白質
をＰ紫結合間接免疫検定により検出した。3ri'ctel, 0'A-after, F? laf removal L,RN
Washed in A B B and plotted dry. The filter was then washed with an alkaline phosphatase substrate solution (
7M jetanolamine (pl>9-g>, o, ;mM
MgcA,/jmM p-,-trophenyl phosphate). In this example, binding proteins were detected by P-purple binding indirect immunoassay.

実施例６ 実施例Ｓの掃作に従ったが、ただしハイブリダイゼーシ
ョン前洗浄とハイブリダイゼーションをＲＮＡＢＢおよ
び０　＊　／ｍＭジチオスレイトール中で実施し、ハイ
ブリダイゼーション後洗浄はＲＮＡＢＢ中であった。Example 6 The sweep of Example S was followed except that the pre-hybridization wash and hybridization were performed in RNABB and 0*/mM dithiothreitol and the post-hybridization wash was in RNABB.

実施例７ 実施例６の操作に従ったが、ただし結合蛋白質ＲＮＡ／
リメラーゼをハイツリメイゼーション工程中直接費性グ
ローブと共に加えた。Example 7 The procedure of Example 6 was followed, except that the binding protein RNA/
Limerase was added with a direct cost globe during the height remization process.

実施例ざ 実施例コと同一操作に従ったが、ただしうさぎ抗−ＲＮ
Ａ−リメラーゼ抗抑清の結合ついで洗浄後、濾過器を過
剰量の黄色ぶどう球菌コワン蛋白質Ａ−８ガラクトシダ
ーゼ接合体を含むＱ、３；ｍｌのＲＮＡＢＢＫ移した。Example The same procedure as in Example was followed, except that rabbit anti-RN
After binding the A-limerase anti-inhibitor and washing, the filter was transferred to Q, 3; ml of RNABBK containing an excess amount of Staphylococcus aureus Cowan protein A-8 galactosidase conjugate.

３７℃で６０分後、濾過器を除去し、ＲＮＡＢＢ中で洗
い、乾燥プロットした。ついで色発展のため、濾過器を
β−ガラクトシダーゼ基質溶沿（４Ｑ　ｍＭ　Ｎａ、Ｈ
ＰＯ４、＃　ＯｍＭＮａＨ２ＰＯ４、／　ｍＭ　ＭｇＳ
Ｏ４、／　ＯｍＭ　Ｋｃｇ　、β−メルカプトエタノー
ルコ、７ｍｌ／）、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド３■（＃！／）と反応させた。本実施例
では、第コ抗抑清の代りに黄色ぶどう球菌カワンから単
離した蛋白質＾を第１」用する酵素結合間接免疫検定に
より、結合蛋白質を検出した。After 60 minutes at 37°C, the filters were removed, washed in RNABB, and plotted dry. The filter was then diluted with β-galactosidase substrate solution (4Q mM Na, H
PO4, # OmMNaH2PO4,/mM MgS
O4,/OmM Kcg, β-mercaptoethanol, 7 ml/), and 0-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside 3 (#!/) were reacted. In this example, the binding protein was detected by an enzyme-linked indirect immunoassay using a protein isolated from Staphylococcus aureus in place of the anti-inhibitor.

実施例９ 実施例ｇと同一操作に従ったが、ただし結合蛋白＠ＲＮ
Ａｆリメラーゼをハイツリダイゼーション工程中直接変
性グローブと共に加えた。Example 9 The same procedure as in Example g was followed, except that the binding protein @RN
Af limerase was added with the denatured globe directly during the hyturidization step.

実施例ＩＱ 仮定的には、実施例１と同一操作を打力うことができる
が、ただし山羊抗−うさぎＩｇＧをフルオレセインに結
合できる。山羊抗−うさぎＩｇＧの結合および洗浄後、
濾過器をＵＶ照射下に観察できる。特定のヌクレオチド
配列を含む試料では、ケイ光が銭さつされるだろう。Example IQ Hypothetically, the same procedure as Example 1 could be performed, except that goat anti-rabbit IgG could be coupled to fluorescein. After goat anti-rabbit IgG binding and washing,
The filter can be observed under UV irradiation. Fluorescence will be detected in samples containing specific nucleotide sequences.

これはケイプ・マーカー結合した間接免疫検定の例であ
る。This is an example of an indirect immunoassay coupled to a cape marker.

実施例／／ 仮定的には、実施例１と同一操作を行なうことができる
が、たたし濾過器を酵素ペルオキシダーゼに結合した山
羊抗−うさぎＩｇＧにさらすことができる。反覆洗浄後
、濾過器を検出のためペルオキシダーゼ基質溶液に浸漬
する。試料ヌクレオチドエキスが特定のヌクレオチド配
列を含んでｈるときは、強い帯赤かっ色が発展するのを
観さってきる。EXAMPLE // Hypothetically, the same procedure as in Example 1 could be performed, but the strainer could be exposed to goat anti-rabbit IgG conjugated to the enzyme peroxidase. After repeated washing, the filter is immersed in peroxidase substrate solution for detection. When the sample nucleotide extract contains a specific nucleotide sequence, an intense reddish-brown color will be seen to develop.

これは結合蛋白質の検出のため酵素結合間接免疫検定の
例である。This is an example of an enzyme-linked indirect immunoassay for the detection of binding proteins.

本発明の精神内で、本発明を実施するため上記方法の変
形が可能であシ、そこで本発明は上記明細に限定される
べきものではない。Variations may be made in the method described above for carrying out the invention within the spirit of the invention, so the invention should not be limited to the details described above.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

添付図面は本発明に従い試料ポリヌクレオチド試験エキ
ス中の特定の標的ヌクレオチド配列の存在を検定する方
法を例示したオとめた流れ図である。The accompanying drawing is a complete flowchart illustrating a method for assaying for the presence of a particular target nucleotide sequence in a sample polynucleotide test extract in accordance with the present invention.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 ｆｉｌ（ａ）　　試料ポリヌクレオチドエキスを試験試
料中に単離し、 （ｂ）　　試験試料を（１）％定のヌクレオチド配列に
実質上相補のｃＤＮＡ配列および蛋白質結合配列を含ん
でいるポリヌクレオチド変性プローブにさらし、また（
１１）変性グローブの結合配列に結合する結合蛋白質に
さらし、 （Ｃ）　　試験試料を単離して試料？リヌクレオチドエ
キスに結合しなかった成分を除去し、（ｄ）　　結合蛋
白質の存在に対し試験試料の検定″を行なう工程を特徴
とする試料４リヌクレオチド試験エキス中の特定のヌク
レオチド標的配列の存在の検定法。 （２１試料？リヌクレオチドエキスの単離工程が試料エ
キスを不溶マトリックス上に肯定することを含む特許請
求の範囲０１に記載の検定法。 （３）変性グローブ中の蛋白質結合配列がプロモーター
、オペレーター、ＩＪＰ異か抗原性配列、反覆配列、ヒ
ストン結合配列の群から選ばれる特許請求の範囲（１１
に記載の検定法。 （４）　　変性グローブ中の蛋白質結合配列が１ａｃ−
プロモーター、１８ｃｍオペレーター、ｔｒｐ−プロモ
ーター、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオフア
ージ配列の群から選ばれる特許請求の範囲（３）に記載
の検定法。 （５）結合蛋白ηがＲＮＡ−？リメラーゼ、オペロンレ
ギュレーター、ヒストン、ＤＮＡ変性酵素、抗−Ｚ−Ｄ
Ｎ＾抗血抗血群から、′ＪＩ４ばれる特許請求の範囲０
１に記載の検定法。 （６１（ａ）　　％定のヌクレオチド配列配列に相補の
ｃＤＮＡ配列をつ〈υ、 （ｂ）ｃＤＮ＾配列をクローン化するベクターに挿入し
、°。 （ｃｌｃＤＮＡ配列を含むベクターをクローン化し、 （ｄｌｃＤＮＡ配列を含むクローン化ベクターを単離し
、 （ｅ）　　蛋白質結合配列をクローン化ベクターに挿入
する工程によって変性グローブをつくり出す特許請求の
範囲（１１に記載の検定法。 ＋７１　（ａ）　　Ｗ白質結合耐外を含むベクターを単
離し、（ｂ）　　！定のヌクレオチド標的配列に相補の
ＣＤＮＡ配列をつ〈シ、 （ｃ）ＣＤＮＡ配列を蛋白質結合配列を含むベクターに
挿入する工程により変性グローブをつくり出す特許請求
の範囲（１１に記載の検定法。 （８）　　蛋白質結合配列を含むベクターの単離工程が
（ａ）　　一つの釉のＤＮＡから蛋白質結合配列を単離
し、 （ｂ）　　ＭＥ白質結合配列を第２の種からのクローン
化するベクターに挿入し、 （ｅ）　　クローン化するベクターを単細胞生物中でク
ローン化し、 （ｄ）　　ｉ白’ＪＩＪ−合配列を含むクローン化ベク
ターまたはそのセグメントを単離する工程を含む特許請
求の範囲（７）に記載の検定法。 （９）　　すでに蛋白質結合配列を含んでいるベクター
として働らくことのできるバクテリオファージポリヌク
レオチドを単離することにより、ベクターの単離工程を
遂行する特許請求の範囲（７）に記載の検定法。 （ＩＱ　　さらに変性グローブをクローン化する工程を
含む特許請求の範囲（６）または（７）にト１ツ載の検
定法。 ａｎ　　ｙ、験試料をさらす工程がさらに各試薬にさら
した後、試験試料から未反応成分を除去するための分離
工程を含む特Ｗ■・請求の範囲（１１に記載の４・ｒ定
法。 Ｏ２結合蛋白質の検定を行７Ｃう工程か、試験試料を結
合蛋ｌｉｉ仙に特異的な抗血清にさらし、抗血清の存在
に対し試験試料の検定を行なう工程を含む特許請求の範
囲（１：に記載の怜声法。 ＯＪ　　抗血清がマーカーを結合しており、結合マーカ
ーの存在を試駆することによシ試験試料の検定を行なう
特Ｗ１−稍求の範囲０２に記載の検定法。 ０４１　　抗血清に対する１１１接またけ二重間接マー
カー結合免疫検定により試験試料の相定を行なう特許請
求の範囲ａ”ａに記載の検定法。 ０！９　　マーカーが酵翠である特許請求の範囲α３−
またけ０４に記載の検定法。 （１６１蛋白質結合配列が特異な抗原性配列であり、結
合蛋白質が％異方抗原性配列に対し特異的な抗血清であ
る特許請求の範囲（１！に記載の検定法。 （１７１抗−Ｚ−ＤＮＡ抗而清面マーカーを結合してい
る特許請求の範囲（ＩＱに記載の検定法。 ６８　　特定の蛋白質に結合するための蛋白質結合配列
および標的配列に結合するため標的ヌクレオチド配列に
対し実質上相補であるように選ばれたＣＤＮＡ配列の両
者を含んでいる単一ポリヌクレオチド分子からなる標的
ヌクレオチド配列の検定に使うのに適合した変性グロー
ブ。 Ｏｌ　　蛋白質結合配列がブロモ−ター、オペレーター
、特異な抗原性配列、反覆配列、ヒストン結合配列の群
からがばれる特許請求の範囲０櫓に記載の検定法。 ■　蛋白質結合配列がＨａ（Ｈ−ブロモ−ター、Ｉａｅ
−第４レータ−１ｔｒｐ−ブロモ−ター、Ｔｊバクテリ
オファージプロモーター、Ｔクバクテリオファージグロ
モーターの群から選ばれる特許請求の範囲６１に記載の
変性グローブ。 ！２、特許請求の範囲０１に記載の変性グローブの有効
量を含んでいる特定のヌクレオチド配列の検定に使う試
薬。 （２２１（ａ）　　％定のヌクレオチド標的１列に実質
上相補のＣＤＮＡ配列をつくり、 （ｂ）ＣＤＮＡ配列をクローン化するベクターに挿入し
、 （Ｃ）　ＣＤＮＡ配列を含むベクターをクローン化し、 （ｄ）　　ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ　配列を含むクローン化ベク
ターを単離し、 （ｅ）　　蛋白質結合配列をクローン化ベクターに挿入
する工程から々る標的ヌクレオチド配列の検定に使う変
性グローブの製造法。 （ハ）（ａ）　　蛋白質結合配列を含むベクターを単離
し、（ｂ）　　％定のヌクレオチド標的配列に実質上相
補のＣＤＮＡ配列をつくり、 （ｃｌｃＤＮ＾配列を蛋白質結合配列を含むベクターに
押入する工程からなる標的ヌクレオチド配列の検定に使
う質性グローブの製造法。 ｃ１４　　蛋白質結合配列を含むベクターの単離工程が
（ａ）　　一つの種のＤＮＡから蛋白質結合配列を単離
し、 （ｂ）　　蛋白質結合配列を第２の種からり四−ン化す
るベクターに押入し、 （ｃ）　　クローン化するベクターを単細胞生物中でク
ローン化ｌ−１ （ｄ）　　蛋白質結合配列を含むクローン化ベクターま
たはそのセグメントを単離する工程を含む特許請求の範
囲（至）Ｋ配−のｆ性グローブの製造法。 ＠　％異な抗原性配列がＺ−ＯＮ＾配列であシ、結合蛋
白質が抗−Ｚ−ＤＮ＾抗血清である特許請求の範囲６ｅ
に記載の検定法。 （至）％異珍抗原性配列が稀な特異々抗原性ヌクレオチ
ドを含む配列であシ、結合蛋白質が上記ヌクレオチドを
含む配列に対し特異的な抗血清である特許請求の範囲Ｏ
１に献敞の検定法。 ｈｍ々ヌクレオチドが５−ブロモデオキシウリジンおよ
びＳ−ヨードデオキシウリジンの群から犀ば力る特許請
求の範囲（イ）に記載の検定法。[Claims] fil (a) a sample polynucleotide extract is isolated in a test sample; (b) the test sample comprises (1) a cDNA sequence and a protein binding sequence that are substantially complementary to a given nucleotide sequence; (
11) Expose to a binding protein that binds to the binding sequence of the modified glove; (C) Isolate the test sample and prepare the sample? sample 4 for the presence of a specific nucleotide target sequence in the polynucleotide test extract, characterized by the step of: removing components that did not bind to the polynucleotide extract; and (d) assaying the test sample for the presence of binding proteins. Assay method. (21 samples? The assay method according to claim 01, wherein the step of isolating the nucleotide extract comprises affirming the sample extract on an insoluble matrix. (3) The protein binding sequence in the denatured globe is a promoter. , operator, IJP heteroantigenic sequence, repeat sequence, histone binding sequence (11)
Assay method described in. (4) The protein binding sequence in the modified globe is 1ac-
Assay method according to claim (3), selected from the group of promoter, 18cm operator, trp-promoter, T3 bacteriophage, T7 bacteriophage sequences. (5) Is the binding protein η RNA-? Limerase, operon regulator, histone, DNA denaturing enzyme, anti-Z-D
N^ From the anti-blood anti-blood group, 'JI4 claims 0
The assay method described in 1. (61 (a) inserting a cDNA sequence complementary to the specified nucleotide sequence 〈υ; (b) inserting the cDNA sequence into the vector to be cloned into the vector to be cloned; (cloning the vector containing the clcDNA sequence; (e) Inserting a protein binding sequence into the cloning vector to create a modified globe (assay method according to claim 11. +71 (a) W white matter binding resistance (b) inserting a CDNA sequence complementary to a given nucleotide target sequence; and (c) creating a modified globe by inserting the CDNA sequence into a vector containing a protein binding sequence. Range (assay method described in 11. (e) cloning the cloned vector in a unicellular organism; and (d) isolating the cloned vector or segment thereof containing the iwhite'JIJ-binding sequence. (9) The step of isolating the vector is carried out by isolating a bacteriophage polynucleotide capable of acting as a vector that already contains a protein binding sequence. The assay method according to claim (7), which further comprises the step of cloning the degenerated globe. The step of exposing the sample further includes a separation step for removing unreacted components from the test sample after being exposed to each reagent. 7C, or exposing the test sample to an antiserum specific for the bound protein, and assaying the test sample for the presence of the antiserum. Method. OJ The assay method described in Scope 02 of Special W1-Request, in which the antiserum binds a marker and the test sample is assayed by testing for the presence of the bound marker. 041 111 for antiserum The assay method according to claim a"a, wherein a test sample is determined by a cross-sectional double indirect marker binding immunoassay. 0!9 Claim α3- where the marker is yeast green
The assay method described in Matake04. (161 protein binding sequence is a unique antigenic sequence, and the binding protein is an antiserum specific to the % anisotropic antigenic sequence. - Claims that bind a DNA antibody marker (assay method described in IQ) A modified globe adapted for use in assaying target nucleotide sequences consisting of a single polynucleotide molecule containing both CDNA sequences chosen to be complementary. The assay method according to claim 0, wherein the protein binding sequence is separated from the group of antigenic sequences, repetitive sequences, and histone binding sequences.
62. The modified glove according to claim 61, which is selected from the group of - fourth promoter-1trp-bromotor, Tj bacteriophage promoter, T bacteriophage glomotor. ! 2. A reagent for use in assaying a specific nucleotide sequence, containing an effective amount of the modified globe according to claim 01. (221(a) creating a CDNA sequence that is substantially complementary to a specific string of nucleotide targets; (b) inserting the CDNA sequence into a vector to be cloned; (C) cloning a vector containing the CDNA sequence; (d) ) e A method for producing a modified glove for use in assaying a target nucleotide sequence, which comprises the steps of isolating a cloned vector containing a DNA sequence and (e) inserting a protein binding sequence into the cloned vector. (c) (a) (a) isolating a vector containing a protein binding sequence; (b) creating a CDNA sequence substantially complementary to a certain nucleotide target sequence; c14 The process of isolating a vector containing a protein-binding sequence consists of (a) isolating the protein-binding sequence from the DNA of one species, and (b) converting the protein-binding sequence into a second species. (c) cloning the vector to be cloned in a unicellular organism; (d) isolating the cloned vector or segment thereof containing the protein binding sequence; Claims (to) A method for manufacturing a K-specific f-sex glove. range 6e
Assay method described in. (To) The unusual antigenic sequence is a sequence containing a rare and unique antigenic nucleotide, and the binding protein is an antiserum specific to the sequence containing the nucleotide.
1 is Kensho's test method. The assay method according to claim (a), wherein the nucleotides are selected from the group of 5-bromodeoxyuridine and S-iododeoxyuridine.