JPS599158B2 - Production method of choline cytidine diphosphate - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシチジンニリン酸コリンの製造法に関する。[Detailed description of the invention] The present invention relates to a method for producing choline cytidine diphosphate.

さらに詳しくはサツカロミセス属、クルイベロミセス属
、トルロプシス属、クロツケラ属、キャンジダ属などに
属し、界面活性剤の存在下においてシトシン、糖、コリ
ンもしくはその誘導体、およびリン酸塩からシチジンニ
リン酸コリンを生成する能力を有する酵母の培養液、菌
体またはそれらの処理物を、シトシン、糖、コリンもし
くはその誘導体、リン酸塩および界面活性剤を含有する
反応液に作用せしめてシチジンニリン酸コリンを生成せ
しめることを特徴とするシチジンニリン酸コリンの製造
法に関する。More specifically, it belongs to the genera Satucharomyces, Kluyveromyces, Torulopsis, Clotuchera, Candida, etc., and generates choline cytidine diphosphate from cytosine, sugar, choline or its derivatives, and phosphate in the presence of a surfactant. To produce cytidine diphosphate choline by allowing a culture solution, bacterial cells, or a processed product of yeast having the ability to act on a reaction solution containing cytosine, sugar, choline or its derivative, phosphate, and a surfactant. The present invention relates to a method for producing choline cytidine diphosphate.

シチジンニリン酸コリンは、レシチン生合成の前駆物質
であり、脳障害における治療薬などとして有用な物質で
ある。Choline cytidine diphosphate is a precursor for lecithin biosynthesis and is a useful substance as a therapeutic agent for brain disorders.

従来、シチジンニリン酸コリンの酵母による製造法とし
ては、シチジン、シチジン−５′一一リン酸、シチジン
−５′一二リン酸、シチジン−５′一三リン酸を製造原
料とする方法が知られている（特公昭４８−４０７５７
号公報、同４８−４０７５８号公報、同４８−４１５５
５号公報、同５１−４０１５９号公報、同４８−２８５
８号公報、同４８−２３５９号公報）。Conventionally, methods for producing choline cytidine diphosphate using yeast include methods using cytidine, cytidine-5' monophosphate, cytidine-5' monophosphate, and cytidine-5' monophosphate as raw materials. (Tokuko Sho 48-40757)
No. 48-40758, No. 48-4155
Publication No. 5, Publication No. 51-40159, Publication No. 48-285
No. 8, No. 48-2359).

即ち、これらの従来法においては、酵母の強い解糖エネ
ルギーを利用して、シチジンまたはシチジンー５′−−
リン酸ヲシチジン−５′一三リン酸にリン酸化した後、
これをさらにシチジンニリン酸コリンに導くものであり
、シチジンニリン酸コリンにおいてシチジンｌの形成の
ためにシチジンまたはそのリン酸エステルの利用を必須
とするものである。That is, in these conventional methods, cytidine or cytidine-5'-- is produced by utilizing the strong glycolytic energy of yeast.
After phosphorylation to ocytidine phosphate-5' monotriphosphate,
This is further led to choline cytidine diphosphate, and in choline cytidine diphosphate, the use of cytidine or its phosphate ester is essential for the formation of cytidine l.

本発明者らは、シチジンニリン酸コリンのより安価な製
造法の開発を目的として種々研究した。The present inventors conducted various studies with the aim of developing a cheaper method for producing choline cytidine diphosphate.

その結果、従来の製法における製造原料である、シチジ
ンやそのリン酸エステルなどよりも、より安価なシトシ
ンからシチジンニリン酸コリンを得る方法を見い出した
。As a result, they discovered a method for obtaining choline cytidine diphosphate from cytosine, which is cheaper than cytidine and its phosphate esters, which are the raw materials used in conventional production methods.

以下、本発明について詳細に説明する。The present invention will be explained in detail below.

本発明によれば、糖とシトシンと、コリンまたはその誘
導体およびリン酸塩および必要な若干の無機塩ならびに
界面活性剤を含有する反応液に酵母を作用させることに
より一挙にシチジンニリン酸コリンを生成させることが
出来る。According to the present invention, choline cytidine diphosphate is produced all at once by reacting yeast with a reaction solution containing sugar, cytosine, choline or its derivative, phosphate, some necessary inorganic salts, and a surfactant. I can do it.

使用される糖としては酵母により利用出来るものであれ
ばいずれでもよ《、たとえばグルコース、フラクトース
、シュクロース、マルトースなどが利用出来る。The sugar used may be any sugar that can be used by yeast, such as glucose, fructose, sucrose, and maltose.

界面活性剤としては各種のカチオン性、アニオン性、両
性、中性の界面活性剤がいずれも利用出来るが、特にカ
チオン性の界面活性剤その中でも殊に第３級アミンを有
するものである。As the surfactant, various cationic, anionic, amphoteric, and neutral surfactants can be used, but cationic surfactants, especially those having tertiary amines, are used.

好適な界面活性剤の具体例としては、アルキル・トリメ
チル・アンモニウムクロライド、ヘキサデシル・トリメ
チル・アンモニウムクロライド、ジメチル・アルキルベ
タイン、ラウリルアルコール・硫酸エステル・ジエチル
アンモニウム塩、オクタアンル・ジメチルベンジン・ア
ンモニウムクロライド等があげられる。Specific examples of suitable surfactants include alkyl trimethyl ammonium chloride, hexadecyl trimethyl ammonium chloride, dimethyl alkyl betaine, lauryl alcohol sulfate ester diethylammonium salt, octaanyl dimethylbenzine ammonium chloride, and the like. It will be done.

コリンもしくはその誘導体としては、遊離のコリン、塩
化コリン、臭化コリン、コリンのクエン酸塩、グルコン
酸塩、ホスホリルコリンなどが利用できる。As choline or its derivatives, free choline, choline chloride, choline bromide, choline citrate, gluconate, phosphorylcholine, etc. can be used.

リン酸塩としてはＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｋ３Ｐ
Ｏ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ ２ ＨＰＯ４ 、Ｎａ
３ ＰＯ４、Ｍｇ３（ＰＯ４）２などの無機リン酸塩が
使用できる。As phosphates, KH2PO4, K2HPO4, K3P
O4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na
3 Inorganic phosphates such as PO4, Mg3(PO4)2 can be used.

その他、必要に応じて、反応液に、マグネシウムイオン
やマンガンイオンなどを存在せしめるが、これらは硫酸
マグネシウム、硫酸マンガンなどの無機塩として通常加
える。In addition, magnesium ions, manganese ions, etc. may be present in the reaction solution if necessary, but these are usually added as inorganic salts such as magnesium sulfate and manganese sulfate.

これらのマグネシウムイオン、マンガンイオンは、反応
に用いる酵母源に付随して加えられる場合は勿論新たに
加える必要はない。Of course, when these magnesium ions and manganese ions are added together with the yeast source used in the reaction, there is no need to newly add them.

反応に用いる酵母としては、サッカロミセス属、クルイ
ベロミセス属、トルロプシス属、クロッヶラ属、キャン
ジダ属に属し、界面活性剤の存在下において、シトシン
、糖、コリンもしくはその誘導体、およびリン酸塩から
シチジンニリン酸コリンを生成する能力を有する菌株が
あげられ、これらは反応に際しては、培養液、菌体、そ
れらの処理物として用いる。The yeasts used in the reaction belong to the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulopsis, Blackella, and Candida, and in the presence of a surfactant, the yeast converts cytosine, sugar, choline or its derivatives, and phosphate to cytidine diphosphate. Examples include bacterial strains that have the ability to produce choline, and these are used as culture solutions, bacterial cells, and processed products for the reaction.

好適な酵母の具体例としては、サツ力ロミセス・セレビ
シエＡＴＣＣ１５２４８、サツ力ロミセス・ルキシーＡ
ＴＣＣ１５２４９、クルイベロミセス・ラクチスＡＴＣ
Ｃ１２４２５、トルロプシス・スフエリカＡＴＣＣ８５
４９、クロッケラ・アフリカナＡＴＣＣ１６５１２、キ
ャンジダ・ギレモンデイＡＴＣＣ９０５８などがあげら
れる。Specific examples of suitable yeast include Satsuriromyces cerevisiae ATCC15248, Satsuriromyces luxii A
TCC15249, Kluyveromyces lactis ATC
C12425, Torulopsis sphaerica ATCC85
49, Crochella africana ATCC 16512, and Candida guillemon dei ATCC 9058.

これらの微生物の培養法については、通常の酵母の培養
法が適用できる。For culturing these microorganisms, ordinary yeast culturing methods can be applied.

即ち、培地の炭素源としては、たとえばグルコース、シ
ヨ糖、デンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸などの
有機酸、エタノール、メタノールなどのアルコール、ｎ
−パラフィンなどの炭化水素などが利用できる。That is, carbon sources for the medium include, for example, carbohydrates such as glucose, sucrose, and starch hydrolysates; organic acids such as acetic acid; alcohols such as ethanol and methanol;
- Hydrocarbons such as paraffin can be used.

窒素源としては、硫酸アンモン、塩化アンモン、尿素、
酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカ
ーなどの無機および有機の窒素源が利用できる。Nitrogen sources include ammonium sulfate, ammonium chloride, urea,
Inorganic and organic nitrogen sources are available, such as yeast extract, meat extract, peptone, and corn steep liquor.

さらに、無機塩として、燐酸カリ、硫酸マグネシウム、
塩化カルシウムなどが使用できる。Furthermore, as inorganic salts, potassium phosphate, magnesium sulfate,
Calcium chloride etc. can be used.

さらに鉄、マンガン、亜鉛などの金属イオンの他、菌株
の生育に必要な物質に応じて培地に加える。Furthermore, in addition to metal ions such as iron, manganese, and zinc, substances necessary for the growth of the bacterial strain are added to the medium.

培養は、振とう培養または通気攪拌深部培養などの好気
的条件下で、通常、培養温度２５〜３５℃、ｐＨ５．０
〜９．０で、５〜４０時間行う。Cultivation is carried out under aerobic conditions such as shaking culture or submerged culture with aeration, usually at a culture temperature of 25 to 35°C and a pH of 5.0.
~9.0 for 5 to 40 hours.

（なお使用菌によっては、前記の温度やｐＨの範囲外で
も培養を行うことができる）。(Depending on the bacteria used, culturing can be performed outside the above temperature and pH ranges.)

本発明においては、上記の如き酵母の培養を行う際に、
培養にシトシン、コリン、界面活性剤などを存在せしめ
て培養液にシチジンニリン酸コリンを生成せしめること
も可能であるが、より好ましくは上記の培養法によって
得られる培養液そのもの、菌体、または、菌体の破砕物
、菌体のエタノール、トルエン、エーテル、アセトンな
どの溶剤による処理物などを酵素源として用いる。In the present invention, when culturing yeast as described above,
Although it is possible to produce cytidine diphosphate choline in the culture solution by adding cytosine, choline, surfactant, etc. to the culture, it is more preferable to use the culture solution itself, bacterial cells, or bacteria obtained by the above-mentioned culture method. As enzyme sources, crushed bacterial cells, processed bacterial cells with solvents such as ethanol, toluene, ether, acetone, etc. are used.

菌体はそのま匁反応液に懸濁してもよいし、たとえばア
セトンなどを用いて乾燥したものを用いてもよいし、あ
るいは菌体を固定化して用いてもよい。The bacterial cells may be suspended in the momme reaction solution as they are, dried using, for example, acetone, or may be used after being immobilized.

酵母の菌体を固定化する方法には、主として包括法が用
いられ、触媒重合、放射線重合、光重合、マイクロカプ
セル化等が適用されるが、マイクロカプセル化が比較的
良好な結果を与える。The entrapment method is mainly used to immobilize yeast cells, and catalytic polymerization, radiation polymerization, photopolymerization, microencapsulation, etc. are applied, but microencapsulation gives relatively good results.

本発明における反応に際しては、シトシン１〜７ｍ９７
ｍｌ，糖５ 〜１ ５ ０ｍ９７ｍｌ！、コリンモシ＜
ハその誘導体（コリンとして）０．５〜５０〜／ｒａｉ
！、リン酸塩（ＰＯ４として）２〜２００ｍ９／ｍｌ、
界面活性剤０．０５〜２％（Ｖ／Ｗ）、特に０．１〜０
．５％（Ｖ／Ｗ）の濃度で用いることにより効果的にシ
チジンニリン酸コリンを得ることができる。In the reaction in the present invention, cytosine 1-7m97
ml, sugar 5~150m97ml! , Korimoshi<
C its derivative (as choline) 0.5-50-/rai
! , phosphate (as PO4) 2-200 m9/ml,
Surfactant 0.05-2% (V/W), especially 0.1-0
．． Choline cytidine diphosphate can be effectively obtained by using it at a concentration of 5% (V/W).

マグネシウムイオンやマンガンイオンを添加する場合は
１ｍ９／１〜３？／７３の範囲で加える。When adding magnesium ions or manganese ions, 1m9/1-3? Add in the range of /73.

反応液に作用せしめる酵素源の使用量は酵素源の使用態
様（菌体、培養液、菌体処理物）や反応原料の使用濃度
などによって異るが菌体を用いる場合は２０〜１５０〜
／ｍｌ！ （乾燥重量）が好適である。The amount of enzyme source used to act on the reaction solution varies depending on how the enzyme source is used (bacterial cells, culture solution, processed material of microbial cells) and the concentration of reaction raw materials used, but when using microbial cells, it is 20 to 150.
/ml! (dry weight) is suitable.

反応は、通常、ｐＨ４．０〜９．０、反応温度１５〜４
０℃で３〜３０時間行う。The reaction is usually carried out at a pH of 4.0 to 9.0 and a reaction temperature of 15 to 4.
It is carried out for 3 to 30 hours at 0°C.

反応液からのシチジンニリン酸コリンの精製単離は公知
のイオン交換樹脂を用いる手法などによって行うことが
できる。Purification and isolation of choline cytidine diphosphate from the reaction solution can be carried out by a known method using an ion exchange resin.

次に本発明の実施例を示す。Next, examples of the present invention will be shown.

実施例 １ サツ力ロミセス・セレビシエＡＴＣＣ１５２４８を用い
、該菌株一白金耳を第一次種培養培地〔グルコース１
０ ？／ｌ，肉エキス１０グ／ｌ１ペプ｝ン１ ０ ｆ
ｌ／ｌ！， ＮａＣｌ ３ ？／ｌ： （ ｐＨ ７．
２ ）殺菌前〕３０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラス
コに植菌し、３０℃、２４時間培養を行った。Example 1 Using Romyces cerevisiae ATCC 15248, a loopful of the strain was grown in a primary seed culture medium [Glucose 1
0? /l, meat extract 10g/l1 pep 10f
l/l! , NaCl3? /l: (pH 7.
2) Before sterilization] The bacteria were inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask containing 30 ml, and cultured at 30°C for 24 hours.

かくして得られる第一次種培養を、グルコース２０′？
／ｌ、ペプトン１１’／ｌ：、酵母エキス５？／７３、
ＫＨ，２Ｐ０４１グ／ｌ， Ｋ２ＨＰＯ４２−５ｆｔ／
ｌ，ＮａＣｌＯ． ５ ？／ｌ：， ＭｇＳ０４・７
Ｈ２０ ０． ５？／ Ｌ ＦｅＳ０４・７ Ｌ，０
０． １ ？／ｌ、ＭｎＳＯ４ ｊ ４ Ｈ２ ０
０． Ｉ Ｓ’ ／ ｌ１ｐＨ ６− ５ （殺菌
前）の第二次種培養培地３００ＴＬｌを含む２ｌ三角フ
ラスコに１０％の割合で植菌し、３０℃で２４時間培養
した。The primary seed culture obtained in this way was treated with glucose 20'?
/l, peptone 11'/l:, yeast extract 5? /73,
KH, 2P041g/l, K2HPO42-5ft/
l, NaClO. 5? /l:, MgS04・7
H20 0. 5? / L FeS04・7 L,0
0. 1? /l, MnSO4 j 4 H2 0
0. A 2 L Erlenmeyer flask containing 300 TL of a secondary seed culture medium with IS'/11 pH 6-5 (before sterilization) was inoculated at a rate of 10% and cultured at 30°C for 24 hours.

かくして得られる第二次種培養を、下記組成の培地３ｌ
を含む５ｌ容のジャーファーメンターに１０％の割合で
植菌した。The thus obtained secondary seed culture was added to 3 liters of a medium with the following composition.
A 5 liter jar fermenter containing the following bacteria was inoculated at a rate of 10%.

培地組成：グルコース５０グ／ｌ、 （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ５ ？／ ｌ， ＫＨ２
ＰＯ４１グ／ｌ、ＭｇＳ０４− ７Ｈ２０ ０．５
？／ｌ１ＮａＣｌＯ．１？／ Ｌ ＣａＣｌ２ ０．
１ ？／ ｌ！， Ｎａ２Ｍｏ０４３ ２ｒ／Ｌ ＫＩ
６３ｒ／Ｌ ＭｎＳ０４− ４Ｈ２０６７ｒ／ ｌ，
Ｈ３ ＢＯ３ ４ ３ ｒ／ｌ！， ＺｎＳ０４・７
Ｈ２０３ ３ ０ ｒ／ｌ：， ＣｕＳＯ４ ・７Ｈ
２０ ３ ０ ｒ／ｌ、ビチオンＯ． Ｚ ｒ／ Ｌ
Ｆｅ ＳＯ４ ・７ Ｈ２０１ ”ｉｉｉ’／ ｌ（
殺菌前ｐＨ．’ ６． ０ ）。Medium composition: glucose 50 g/l, (NH4) 2 SO4 5? / l, KH2
PO41g/l, MgS04- 7H20 0.5
? /l1NaClO. 1? / L CaCl2 0.
1? / l! , Na2Mo043 2r/L KI
63r/L MnS04- 4H2067r/l,
H3 BO3 4 3 r/l! , ZnS04・7
H203 30 r/l:, CuSO4 ・7H
20 30 r/l, Bithion O. Zr/L
Fe SO4 ・7 H201 ``iii'/ l(
pH before sterilization. '6. 0).

培養は３０℃で、培地のｐＨを水酸化カリウムで５．０
に調節して攪拌数６ ０ Ｏ ｒ． ｐ．ｍ．通気量３
ｌ／ｍＶＬで４８時間通気攪拌培養を行った。Cultivation was carried out at 30°C, and the pH of the medium was adjusted to 5.0 with potassium hydroxide.
The stirring number was adjusted to 60 O r. p. m. Airflow amount 3
Aeration and agitation culture was performed for 48 hours at l/mVL.

培養後、培養液を５℃で、遠心分離して菌体を分離し、
この菌体を０．１Ｍ−ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て３回洗浄した。After culturing, the culture solution was centrifuged at 5°C to separate the bacterial cells,
The bacterial cells were washed three times with 0.1M-IJ acid buffer (pH 7.5).

か《して得られた菌体を反応に供した。The bacterial cells thus obtained were subjected to a reaction.

前記の生菌体１５００ｍ９（乾燥重量）シトシン２２．
２ｍｇ、グルコース１０８０〜、塩化コリン１４０〜、
硫酸マグネシウム１０雫、ヘキサデシル・トリメチル・
アンモニウム・クロライド（カチオンＰＢ−４０、日本
油脂株式会社製）０．５％を含む０．６Ｍ−リン２緩衝
液（ １）Ｈ ７．５ ） １ ｏｒｎｌを用いて３０
℃で５時問および２４時間反応を行った。1500 m9 (dry weight) of the above-mentioned live bacterial cells Cytosine 22.
2mg, glucose 1080~, choline chloride 140~,
10 drops of magnesium sulfate, hexadecyl trimethyl
Using 1 ornl of 0.6M phosphorus 2 buffer (1)H7.5 containing 0.5% ammonium chloride (cation PB-40, manufactured by NOF Corporation)
Reactions were carried out at °C for 5 hours and 24 hours.

結果を表−１に示す。なお、対照として上記の反応液中
、ヘキサデシル・トリメチル・アンモニウム・クロライ
ドを存在せしめない他は同一条件で反応を行った。The results are shown in Table-1. As a control, the reaction was carried out under the same conditions except that hexadecyl trimethyl ammonium chloride was not present in the reaction solution.

実施例 ２ 実施例１で得られた生菌体を凍結乾燥し、該菌体を用い
て次の方法によりマイクロカプセル化菌体を得た。Example 2 The live bacterial cells obtained in Example 1 were freeze-dried and used to obtain microencapsulated bacterial cells by the following method.

ベンゼン２９？、ｎ−ヘキサン１１グにエチルセルロー
ス（ １ ０ ０ ｃｐｓのもの）３グを溶解し、分散
剤として、スパン−２０（ンルビタンモノラウリル酸）
ｏ．ｓｙを溶解する。Benzene 29? , 3 g of ethyl cellulose (100 cps) was dissolved in 11 g of n-hexane, and Span-20 (nrubitan monolauric acid) was added as a dispersant.
o. Dissolve sy.

この溶液に、凍結乾燥菌体２１を生埋食塩水５グと１％
キトサン水５グの混合液に懸濁したものを強く攪拌しな
がら、５〜１０℃にて完全に分散するように添加しＷ／
Ｏエマルジョンを生成させる。In this solution, freeze-dried bacterial cells 21 were added to 5 g of raw saline and 1%
Chitosan suspended in a mixed solution of 5 g of water was stirred vigorously and added at 5 to 10°C to ensure complete dispersion.
O emulsion is produced.

更にこの一次エマルジョンを１％ホリエチレングリコー
ル溶液（ｐＨ８．５）１２０ＴＬｌ中に添加しＷ／ ０
／Ｗ′エマルジョンを生成せしめる。Further, this primary emulsion was added to 120 TL of 1% polyethylene glycol solution (pH 8.5) and
/W' emulsion is produced.

５〜１０℃に温度を保ちながらベンゼンを除去しエチル
セルロースを析出させるために、氷冷したｎ−ヘキサン
を１０〜１５ｍｌ／ｍｍの速度で約１時間程度定量ポン
プにて供給する。In order to remove benzene and precipitate ethyl cellulose while maintaining the temperature at 5 to 10°C, ice-cooled n-hexane is supplied at a rate of 10 to 15 ml/mm for about 1 hour using a metering pump.

このようにして得られたマイクロカプセル化菌体を沢別
し更にｎ−ヘキサンにて２度洗浄し真空下完全にｎ−ヘ
キサンを除去して反応に使用した。The microencapsulated bacterial cells thus obtained were separated and washed twice with n-hexane to completely remove n-hexane under vacuum, and then used for the reaction.

生成した固定化菌体の性状は約５０〜１００μの完全球
状マイクロカプセルであり約３００〜４００ｍ９／ｍｌ
（マイクロカプセル容量）の菌体が包括されたものであ
る。The properties of the produced immobilized bacterial cells are completely spherical microcapsules of approximately 50 to 100 μ and approximately 300 to 400 m9/ml.
(microcapsule capacity) of microbial cells.

このようにして得られたマイクロカプセル化菌体を５
ｍｌ（菌体として約１５００雫）（乾燥重量）使用し実
施例１と同様の反応液組成で回分反応を３０℃、５時問
および２４時間行った結果、シチジンニリン酸コリンが
、それぞれ２． ０ ２ ｍ９１／ｒｕｌ、３． ０
３ ｍ９／ｍＡ’生成した。The microencapsulated bacterial cells obtained in this way were
ml (approximately 1500 drops as bacterial cells) (dry weight) and a batch reaction was carried out at 30°C with the same reaction solution composition as in Example 1 for 5 hours and 24 hours. 0 2 m91/rul, 3. 0
3 m9/mA' was generated.

実施例 ３ 使用菌株として、表−２記載のものを用いて、実施例１
と同様の方法で培養した。Example 3 Using the strains listed in Table 2 as the bacterial strains used, Example 1
It was cultured in the same manner.

培養液から菌体を分離し、該生菌体を凍結乾燥し、該乾
燥菌体（１５００１ｎ９）を用いて、実施例１と同様の
条件で５時間反応を行った結果は次の通りであった。The bacterial cells were separated from the culture solution, the live bacterial cells were freeze-dried, and the dried bacterial cells (15001n9) were used to perform a reaction for 5 hours under the same conditions as in Example 1. The results were as follows. Ta.

実施例 ４ トルロプシス・スフエリカＡＴＣＣ８ ５４ ９を用い
、実施例１におけると同様の方法で種培養を行い、該種
培養を下記組成の培地３ｌを含む５ｌ容のジャーファー
メンターに１０％の割合で植菌した。Example 4 Using Torulopsis sphelica ATCC8549, seed culture was carried out in the same manner as in Example 1, and the seed culture was inoculated at a rate of 10% into a 5 liter jar fermenter containing 3 liters of a medium having the following composition. It was infected.

培地組成：グルコース５０グ／ｌ、 （ＮＨ４） ２Ｓｏ４５ｆ！／ｌ，ＫＨ２ｐｏ４ １．
５グ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ ？／ｌ， ＭｇＳＯ４
− ７Ｈ２０ ０．５？／ ７３， ＮａＣＩ ０．
１ ？／ ｌ，酵母エキス０． ２？／Ｌ ＭｎＳ０
４・４ Ｈ２０ １ ０ ０ ｒ／ ｌ、β−アラニ
ン５０γ／ｌ１ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０ ５００γ／ｌ，
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０ １１ｎ９／ｌ、Ｆｅ２（ ＳＯ
４ ）３１ ０ ０ ｒ／ｌ， ｐＨ ６．０ （殺菌
前）培養は３０℃で攪拌数４ ０ Ｏ ｒ． ｐ．ｍ．
、通気量２ ｌ ／ｍｉｙｔで４８時間行った。Medium composition: Glucose 50 g/l, (NH4) 2So45f! /l, KH2po4 1.
5g/l, K2HPO40.5? /l, MgSO4
-7H20 0.5? / 73, NaCI 0.
1? / l, yeast extract 0. 2? /L MnS0
4.4 H20 100 r/l, β-alanine 50γ/l1ZnSO4・7H20 500γ/l,
FeSO4・7H20 11n9/l, Fe2(SO
4) 3100 r/l, pH 6.0 (before sterilization) Culture at 30°C with 400 r/l stirring. p. m.
, for 48 hours at an aeration rate of 2 l/miyt.

培養液から菌体を分離し、実施例２におけると同様の方
法によって菌体を固定化（マイクロカプセル化）し、実
施例２の反応液において、ヘキサデシル・トリメチル・
アンモニウム・クロライドの使用量を０．１％にする他
は、実施例２の方法と同様に５時間反応を行い、２−２
３〜／ｒａｉｌのシチジンニリン酸コリンを得た。The bacterial cells were separated from the culture solution and immobilized (microencapsulated) using the same method as in Example 2. In the reaction solution of Example 2, hexadecyl trimethyl
The reaction was carried out for 5 hours in the same manner as in Example 2 except that the amount of ammonium chloride used was 0.1%.
3~/rail of choline cytidine diphosphate was obtained.

実施例 ５ 実施例１の方法において、塩化コ’Ｊ ：／ １ ４
０〜の代りに、ホスホリルコリン１００即を用いる他は
同一の菌株を使用し、同一の反応条件（界面活性剤添加
）で６時間反応を行い、７．３ｍ９／ｍｌのシチジンニ
リン酸コリンが得られた。Example 5 In the method of Example 1, cochloride J: / 1 4
The same strain was used except that phosphorylcholine 100 was used instead of 0~, and the reaction was carried out for 6 hours under the same reaction conditions (surfactant addition), and 7.3 m9/ml of choline cytidine diphosphate was obtained. .

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １ 界面活性剤の存在下において、シトシン、糖、コリ
ンもしくはその誘導体、およびリン酸塩からシチジンニ
リン酸コリンを生成する能力を有し、サツカロミセス属
、クルイベロミセス属、トルロプシス属、クロツケラ属
もしくはキャンジダ属に属する酵母の培養液、菌体また
はそれらの処理物を、シトシン、糖、コリンもし《はそ
の誘導体、リン酸塩および界面活性剤を含有する反応液
に作用せしめてシチジンニリン酸コリンを生成せしめる
ことを特徴とするシチジンニリン酸コリンの製造法。1 Under the presence of surfactants, they have the ability to generate Citizinnirin acid from Citocin, sugar, choline or derivatives, and phosphate, and have the genus Satsukaromisses, the genus Culveropsis, the genus Tropsis, the genus or Candida. production of cytidine diphosphate choline by allowing a yeast culture solution, bacterial cells, or a processed product thereof to act on a reaction solution containing cytosine, sugar, choline or its derivative, phosphate, and a surfactant. A method for producing choline cytidine diphosphate, characterized by: