JPS5985293A - 機能的に独立したクロ−ニングベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、機能的に独立した複製起源を含有するプラス
ミドｐＥＬ７の制限フラグメントおよび抗生物質耐性を
細管する１またはそれ以上のｌ）　Ｎ　ＡセグメンＩ・
からなる、新規組換えＩ）　Ｎ　Ａクローニングベクタ
ーに関する。さらに本発明は該ベクターの形質転換体に
関する。 本発明は大略として１９８２年ｌＯ月１４［１出願の欧
州特許出願第８２３０５４７２号に記載の１絹の絹換え
ｌ）　Ｎ　Ａクローニングベクターに関連している。こ
の１糺のベクターとは、プラスミドｐ　ｌ’：　Ｌ７と
、プラスミドＰ１・゛土７の制限フラグメントおよび抗
生物質耐性をｆ−］す、する１またはそれ以上のＩ）　
Ｎ　Ａ−＋！り゛′メントとを含む、フ０ラスミ１Ｊ）
ｌ・、１７７に機能的に依存している第２のプラスミド
からなる。これらのベクターは、その構造の上から、そ
して、機能的に独立しているため複製および抗生物質耐
性の発現にプラスミドｐ　Ｉ’：　Ｉ−７の存在を必要
としないことから、容易に識別できる。 この抗生物質耐性付与クローニングベクターは、Ｓｒ　
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　およびこれに関連する宿主細胞
に対して使用する。これまで」二記微生物における組換
えｌ）　Ｎ　Ａ技術の開弛と発展は遅れており一選択に
用い得るクローニングベクター」二の遺伝的マーカーか
一般的に欠損していることから、特に困芙（１とされて
きた。本発明に係るベクターは機能的に独立しており、
５ｔ４ｅｐｔｏｎｓｙｃｅｓおよびその他の宿主菌株上
で選択可能であり、よってこの技術分野において著しい
進歩を示すものである。 本ベクターは、機能的に独立しており、小さく一多方面
に１１１（つて利用でき、耐性を付５する抗生物質に対
１．て感受性である全ての５ｔｒｅｌ）ＬＯＩＴＩｙＣ
ｅＳ細胞中に導入でき、かつ選択できるということから
、極めてイｊ用である。臨床上重要な抗生物質の半数以
上がＳｔ　ｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ菌株によって生産され
るため、このＴ業的に重要な微生物に適用できる、機能
的に独立したクローン系およびベクターを開□発するの
は望ましいことである。本発明は、かかるベクターを提
供し、これにより、既知の抗生４り１質の収ｆｉｌを上
けるため、また新規抗生物質および抗を 生物質誘導体を生産するために、遺伝子５ｔｒｅｐＬｏ
−△ 町＋（：ｅＳ中へクローンすることをｉｉＪ能にするも
のである。 該ベクターは、Ｉ）　Ｎ　ＡをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃ
ｓ宿主細胞中にクローンするための媒体となり、かつこ
れにより形質転換体を簡便に選択できる。形質転換は極
めて低い確率で起こる現象であるので、何百万もの細胞
のうちからプラスミドＩ）ＮＡを獲得した細胞を決定す
るためには、このような機能試験が実際上必須である。 該ベクターには非選択性１）ＮＡ配列を挿入することが
てき一形質転換により一このベクターと、所望の特定の
ｌ）Ｎへ配列とを含有する細胞を、適当な抗生物τｊに
よる選択を用いて分離することができるので、上記のこ
とは重要となる。 木明細書中に記載した発明の理解を助りるために、以下
に用語を定義する。 糾換えｌ）Ｎ’Ａクローニンクベクター：１またはそれ
以上のｌ）　Ｎ　Ａセクメントを（；Ｊ加することので
きる、もしくはそれらが既にイス１加された、自律的複
製媒体であって、プラスミドを含むがこれに限定されな
い。 形質転換：Ｉ）ＮＡを宿主受容細胞中に尋人し、逍１云
型を変化さぜ、その結果該受容細胞を変化さＵ−ること
。 形質転換体：形質転換を受４Ｊた宿主受容細胞。 機能的に依存：ある宿主細胞中におけるプラスミドの複
製およびｌまたはそれ以上の抗生物質に対する耐性の発
現に、これとは異なる別のプラスミドが必要である状態
。 機能的に独立：ある宿主細胞中におけるプラスミドの複
製および１またはそれ以上の抗生物質に対する耐性の発
現が、これとは異なる別のプラスミドの非存在下でも起
こる状態。 感受性宿主細胞：耐性をイ（１与するＩ）　Ｎ　Ａセグ
メントなしでは、ある特定の抗生物質の存在下には生育
できない宿主細胞。 制限フラグメント：１またはそれ以上の制限酵素の作用
により生成したプラスミドまたは染色体１）　Ｎ　Ａの
線状の一部分もしくはその全体。 挿入異性体：　ｌ）　Ｎ　Ａフラグメントが受容体Ｄ　
ＮＡの２またはそれ以上の適合部位のうちの１箇所に挿
入されることにより生成する可能性のある２種またはそ
れ以上の組換えＩ）　Ｎ　Ａ分子のうちの１個。 プラスミドｐｌ−Ｒ２〜１．６　ｋｂ　１３ａ＋ｎ　Ｈ
Ｉ制限フラグメント：プラスミドｐｌＪ６に含まれる〜
１６ｋｌｊｌｓａ＋ｎｌｌ　Ｉチオストレプトン耐性付
与フラグメント−と実質的に同等のもの。 プラスミドｌ）■（Ｊまたは１）ＬＲ４〜３．４　ｋｂ
　ＢａｍＩＩＩ制限フラクメント：プラスミドｐ　１．
１２に含まｔＬ７ｒ、〜３．４　ｋｌｒ　Ｊｌａｎロ１
１ネオマイ／ン而、１↑生伺ノＪ、フラグメントと同等
のもの。 Ａ＋＋ψ１２：アンピシリン耐性表現型。 ′Ｉ”ｅｔ５：テトラザイクリン感受性表現型。 １’ｈｉｏＲ：チオストレプトン面４性表現型。 ＮｅｏＲ：ネオマイシン耐性表現型。 本発明は、 ３）プラスミド１）Ｅｌ、７のＱｌｆｌ藺止プリコンを
含有する制限フラグメントを１ ．１））感受性宿主細胞中に形質転換した時、少なくと
も１つの抗生物質に対する耐性を（；ＪＪｊする１また
はそれ以上のＩ）　Ｎ　Ａセクメント、およびＣ）所望
ならは、ｌｉ、　ｃｏｌｉ中で機能的なし゛プリコンお
よび形質転換、細胞***ならひに培養可能な感受性Ｅ、
ｃｏｌｉ宿主細胞中において抗生物質削性を付与するＩ
）　Ｎ　Ａセグメントを含む制限フラグメントに、 リゲーション（結紮）することからなる、機能的に独立
した組換えｌ）　Ｎ　Ａクローニンクベクターの８１、
■製方法を提供するものである。 さらに本発明は、本発明方法によって調製されたベクタ
ーの形質転換体を提供するものである。 レプリコン含有フラグメントを糾み立てるために使用す
るプラスミドｐＥＬ７は、〜１０．９ｋｂであり、分子
クローンに有利な数個の制限サイトを含む。プラスミド
ｐ　Ｉ！：　Ｉ−７のレプリコンは〜６．７８ｋｌ〕ｌ
５ｃｌ　Ｉ制限フラグメント内に存在するので、このプ
ラスミドを〜６．７　ｓ　ｋｂ　ＢＣＩ　ｌ　ｒｇ＋ニ
位の外側て呻引祈する制限酵素で消化することにより、
種々の異なったレプリコン含有フラグメントが生成する
。プラスミド薯）　Ｅ　Ｉ−７の詳細な制限→ノ“イト
地図を添イ、１の第］　ＩＸ＋に示す。本発明の目的か
らして、第１図およびこれに続く図面は等縮尺でＪ’＋
’＋’ｉかれてはいない。 プラスミド’Ｉ）Ｊ’：［７は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒ
ｅｇｉｏｎａｌＲｃｓｃａｒｃｈ　１．ａｌ）ｏｒａＬ
ｏｒｙ　（１’ｅｏｒｉａ−１１１ｉ＋１ｏｉｓ在）に
受、Ｄ−１ｌ番けＮＲＲＪ、ｊ２５２３の下に寄託され
、その永久ストックカルチャーコレクションの一部とな
っている菌株５ｔｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ　ａｍｌ）ｏ
ｆａｃｉｅｎｓ　／ｐ　Ｅ　Ｌ　７から常法により分離
できる。これは、該プラスミドの好ましい供給源および
保管源として誰でも利用可能である。 プラスミドｐＥ１．７の数多くの異なった複製起源含有
フラグメントが糾み立てられるが、本明細書中では〜６
．７　Ｂ　ｋｌｉ　１３ｃＪ　ｆ制限フラグメントを例
示の１０勺のためにとりあける。このフラグメントは１
またはそれ以上の抗生物質面］性（−１−＋ｊ、　ｌ）
　Ｎ　Ａセグメント、例えばプラスミ１ζ１）口（２の
ヂオストレブトン耐性伺与〜ｌ、　６ｋｂ　Ｂａｍ１ｌ
　ｉマタハ〜、８　ｋ１３１％ｃｌｉ制限フラグメント
、プラスミドｌ）　１−　Ｒ３またはプラスミドｐＬＲ
４のネオマイシン削１生イーＪＪニー３．４ｋｂ　１３
ａｍ　ＩＩ　ｉ制限フラグメント・、およびプラスミド
Ｉ）ＩＪ　４３　（Ｄ〜２．８　ｋｂ　Ｓａｌ　１．’
　７　ラグメントなとと個別にリゲーションして、本発
明の代表的な、機能的に独立したベクターを形成するこ
とができる。 チオストレプトン耐性イ、１与フラクメントの供給源で
あるプラスミドｐＬＲ２は、〜Ｉ　Ｂ、　７　ｋｌ〕で
あり、１１ｉｎｄ　ＩＩＩ処理したプラスミドｌ）　Ｔ
　、１６　（’ｌ’ｈｒｍ＋ｐｓｏｎ等、、１９８（＋
、Ｎａｔｔ＋ｒｃ　２８６　：５２５に記載）を、１１
ｉｎ（ｌ　Ｉｌｌ　処理したプラスミドｌ）旧（３２２
にリケーンヨンすることにより組み立てられる。ネオマ
イシン耐性旧与フラグメントの供給源であるプラスタｔ
’　ｌ）　ＬＲ１は、〜ｌ　４．８ｋｂであり、プラス
ミド１）　Ｔ　Ｊ　５の代わりにプラスミドｐ　Ｉ　Ｊ
　２　（’Ｊ’１ｌＯ１ＪＳ０１１等、１９８０に記載
）を用いることを除けば、同様にして組み立てられる。 プラスミドｐＬＲ４を税く類似の組み立ては、ＩＳａ＋
ｎｌｌ　、１処理したプラスタ１−ｐ旧ζ３２２をＢａ
ｍ　Ｉｆ　］処理したプラスミドｐ１．Ｒ］にリゲーシ
ョンすることによって行なう。プラスミド１）Ｉ−１支
２．１）ＬＲＩおよびＩ）Ｉ−１ζ４はＥ、ｃｏｌｉ中
で機能的であり、故に次の操作のために増幅させ、簡便
に単離することかできる。 エリスロマイシン耐性付与フラグメントの供給源である
プラスミドＩ）ｌＪ４３は−Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ　’ｌ
”ｙｐｅ（、’ｕｌ　　ｔｕｒｅ　　　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　　　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ　　、　Ｍａ　ｒｙＩ
　ａｎｄ　在）に寄託され永久ストックカルチャーコレ
クションの一翔９となっている菌１朱Ｅ、　ｃｏｌｉ　
８０３／Ｐ１．Ｉ４３より得ることができる。これは、
受理番号ＡＴＣＣ３９１５６の下で、該プラスミドの９
−「ましい供給源および保管１ＩＨｊとして、ｌ′ｉ１
１．−７Ｅも利用−Ｃきる。プラスミドｐ　ＬＲ１、１
）Ｌｌ支２およ（Ｊ：’　ｌ）　Ｉ　、　Ｒ４の制限サ
イト並びに機能地図を、添伺の第２図に示１−０組み立
ての便宜と簡便のため、チオストレプトン耐Ｊ１生伺勺
〜１．６　ｋｌ）ｉ３Ｘ１＋ｎ　Ｉｆ　ｌまたは〜、８
ｋｌ）ＩＳｃｌ■フラグメント、ネオマイシン面、１個
、イーＩＩコ〜３．４ｋｌ）１３ａｔｎ　ＩＩ　Ｊフラ
グメント、およびエリスロマイシン削性イ、１ｊ〜２．
Ｂ　ｋｌ）Ｓａｌ　Ｊフラグメントは−各々個別にプラ
スミド１）１゛土７の〜６．７８ｋｌ）複製起源含有Ｂ
（１４フラグメントにリゲーンヨン刈る。次いで化１戊
した絹換えＩ）　Ｎ　Ａを自己結合（リケーション）さ
せ一本発明の代表的な機能的に独Ｓ’Ｌ　Ｌだプラスミ
ドを生産する。ある特定の耐性伺ＪゴＩ）Ｎへフラグメ
シトの方向性に依存して、ニ一方向の絹換えプラスミド
が生成する。即ち、プラスミド１）　Ｉ−Ｒ２の〜ｌ、
　６ｋｂ　Ｂａｆｎｌｌ　Ｊ、　７ラクメントをプラス
ミドｐ　Ｅ　Ｌ　７の〜６．７３　ｋｌ）ｌｓｃｊ　Ｔ
ワラクメン１へにリゲーシ□ヨンすることにより、例示
プラスタｌ”ＰＮＭ７０２におよびｐＮＭ７０２１ｓが
、プラスミド１）　ＬＲｌまたはプラスミドｌ）　ＬＲ
４の〜３．４　ｋｌ）ＢａｍＩｌｌフラグメントのリゲ
ーションにより、例示プラスミドｐＮＭ７Ｑ４Ａおよび
ｐＮＭ　７０４１Ｂが、そしてこの両フラグメントのリ
ゲーションにより、例示プラス〉ドＰＮＭ７０５Ａおよ
びｐＮＭ　７　Ｑ　５　Ｂが生成する。同様にして、プ
ラスミドｐＬＲ２の〜、８ｋｂ　１ｓｃｌ　１フラグメ
ントをプラスタｌ；　ｌ）　Ｉ゛：　Ｌ　７の〜・６．
７８　ｋｌｒ　Ｊ３ｃＪ　７　フラグメントにリケーシ
ョンすることにより、例示プラスミドｐＮＭ　７０３　
ＡおよびＩ）　ＮＭ　７　Ｑ　３　Ｉｓが、〜、　Ｂ　
ｋｂＢｃ　ｔ　ｌおよび〜３．４ｋｂ　ｌｓａ＋ｎ　Ｉ
Ｉ　Ｊ両フラグメンＩ・のリゲーションにより、例示プ
ラスミドｌ）Ｎ＋１１４７０６ＡおよびＰ　ＮＭ７０６
　Ｉｓが、そして適当なリンカ−を備えた〜２．Ｂｋｂ
　Ｓａｌ　Ｊフラグメントをリゲーションすることによ
り、例示プラスミド１）轟Ｊ７０７ＡおよびＩ）　ＮＡ
ｆ　７　Ｑ　７　ＪＳか生成する。 〜６．７８ｋｂ、　Ｂｃｌ　ｉ制限フラグメント中の複
豐起６；１か存在する限り、種々のプラスミド１）口・
７制限フラグメントを、抗生物質耐性材３３．１）　Ｎ
　Ａセグメントとのりゲーションに使用することができ
る。 かかやプラスミドＩ）　ＥＩ、７制限フラグメントには
、〜９．１　ｋｌ）Ｘｈ、ｏ　ｌ　−５ａｃ　Ｔ、　〜
ｌ　Ｑ、９　ｋｌ）Ｓａｃ　（、〜４、７５　ｋｂ　Ｘ
Ｊ）ＯＩ−ＢｃＪ　Ｉ、および〜ｌ　Ｏ，９ｋｂ　Ｊ３
ｃＪＪフラグメント等が含まれるが、これらに限定され
るものではない。さらに、ある抗生物質耐性イ、］与Ｉ
１　Ｎ　Ａセグメントは、複製起源または他の重要なプ
ラスミド支配の生理的（幾能が崩壊しない限り、プラス
ミドＩ）　ＥＩ−７の単一の部位に限らず、多くの箇所
にリゲーションまたは挿入することができる。 特定のｌ）　Ｎ　Ａセグメントのリゲーションまたは挿
入の際−どの部位が有利であるかは一当業者には即解で
きるか、または容易に決定できる。 抗生物質ヂオストレプトン、ネオマイシン、およびエリ
スロマイシン耐性刊−１４，ｌ）　Ｎへセクメントは、
それぞれプラスミドｐＬＲ２の〜・１．６ｋｂ＋幀ロ１
１１１または〜、３ｋｂＢｃｌ■フラクメント、プラス
ミド１）ＬＲＩの〜３．４　ｋｂ　Ｂａｍ　１１　ｉ　
フラグメント、およびプラスミドＰＩＪ４３の〜２．　
Ｂ　ｋｌ）Ｓａ　ｌ　’、ｒ制限フラグメンｌ−によつ
−Ｃ例示しているが、７当業者には、上記抗生物質に対
するｌｌ１ｉＪ４／Ｊ８を（；Ｊｌ″ｉする他のＩ）Ｎ
Ａセクメントを組み立て、個別に、または糾み合わゼて
使用することかできるであろう。プラスミドｌ）　１．
、　Ｒ２の他のヂオストレプトン耐性伺ｒｑ、　Ｉ）　
ＮＡセグメン１゛には、例えは〜ｌ　３　ｋ’ｌ）　Ｐ
ｓ　ｔ　、１制限フラクメントがある。プラスミドＩ）
Ｉ・Ｒ１の他のネオマイシン耐性付Ｆ８ｊ、　ｌ）　Ｎ
　Ａフラグメントには、例えば〜３．５　ｋｌＪＩ’ｓ
ｔ　Ｊ制限フラグメントおよび〜３、４　ｋｂ　ＪＳａ
ｍ　ＩＴ　Ｊ制限フラグメントのＳａｃ　■−１（ｐｎ
■ザブフラグメントのうちの大きい方がある。エリスロ
マイシン耐性を付与する他のフラグメントとじては、例
えばプラスミドｐｊＪ４３の〜・２，５ｋｂＳａ　Ｉ　
Ｉ’、　−Ｂａｒｎ　ＩＩ　Ｉ、〜２．７　ｋｌ）Ｓａ
ｌ　Ｊ　−］Ｓｇｌ　ＩＩ　−〜３．Ｏｋｂ　１ｌｉｎ
ｄ　Ｉｌｌ、〜２．　Ｂ　ｋｂ　Ｘｈｏ　］ニーＢｇｌ
　ＩＩ、オヨヒ〜４、　ｌ　ｋｂ　Ｉらｃ　ｏ　Ｒｌ　
〜１３ａｍ　ＩＩ　、Ｉ制限フラグメントが半りられる
。 さらに、上記のまたは上記とは異なる抗生物質、例えば
クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、ハイグロ
マイシン、ビオマイシン、タイロシンといった抗生物質
に対する耐性を付与するその他のＩ）　Ｎ　Ａセグメン
トも、当業者により組み立てられ、使用することができ
る。加えて−これらのまたは本明細ｍ中に記載した以外
の抗生物質耐性伺与ＤＮＡセクメントの機能的誘導体も
、遺伝的暗号に従っであるヌクレオチドを伺加、脱Ｆｉ
ｔ（または置換することによって絹み立てることができ
る。 当業者には、これら誘導体もしくはこれら以外の抗生物
質酊１性付−１１，ｌ）　ＮΔセグメントを−１）口・
７Ｑ）復製起源含有フラグメントにリゲーションするこ
とによって、これもまた本発明の一部を構成する機能的
に独立したベクターが生成することが理解されるであろ
う。 プラスミドｌ）　Ｅ　Ｌ７の制限フラグメントおよび種
々の抗生物質ｌｌ１ｉＪ性イ：ｆ　Ｉｊ、　ｌ）　Ｎへ
フラグメントは、リゲーションを容易にするため、修飾
することができる。例えば、プラスミド１）ｌ゛土７あ
る１′′１定の制限フラグメントおよびある特定の抗生
物質耐性付与１）　Ｎ　Ａセグメントのうちの一方また
は両者に一分子リンカーを供給することができる。そう
することにより、これに続くリゲーションのための特異
的サイトを簡単に作ることができる。また、複製起源含
有制限フラグメントも、ヌクレオチドを伺加、ＩＨａ　
ｐｉｌｉまたは１１？１換することにより修飾して、１
）ＮＡのリゲーションのための種々の制限サイトを設け
ることができる。当業者は、ヌクレオチド”　化学およ
び遺伝暗号を理解しているので、どのヌクレオチドが交
換可能か、そしてどのｌ）　Ｎ　Ａ修飾が特定の目的に
とって望ましいかが理解できるはずである。 本発明に係る機能的に独立したベクターは、例えはｐｌ
ｓＲ３２２，１）ＢＲ３２４、ｐＢＲ３２５、Ｉ）旧（
３２８といったＥ、　ｃｏｌ　ｉプラスミドの制限フラ
グメントとリゲーションして、１已、（ｏｌｉおよび５
ｔｒｅｐｔｏ−ロＩｙ（ｅ５の両者において複製かつ選
択＋＋Ｊ能な、機能的に独立したベクターを作り出すこ
ともできる。 この三機能性の紹み立て物は、ｐＥＩ−７の複製起源、
Ｓ　Ｌ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中で抗生物質耐性を付与
、−Ｊ−ルＩ）　ＮＡ上セグメントＥ、　ｃｏｌｉ中で
機能するレプリコン、およびＥ、ｃｏｌ　ｉ中で抗生物
質耐性を１；」与する１３ＮＡセグメントからなる。本
明細書中、プラスミドｐＮＭ７０８へとｐＮＭ７Ｑ８１
−により例示している二機能性組み立て物は、プラスミ
ドの増幅および操作がＳ　Ｌ　ｔｅｌ）ｔ０＋１１ｙｃ
ｅｓ中でよりもｌ：、　ｃｏｌｉ中で、より速やかにか
つ簡便にできるという理由で、特に有利である。従って
、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主系の中て所望の絹換えＬ）　Ｎ　Ａ
ＪＷ、作を行なった後に、このプラスミド全体もしくは
特定の５ｔｒｅｐｔｏｒｎｙｃｅｓ　１）　Ｎ　Ａをと
り出し、プラスミドの形にｆｆ絹み立てしく必要ならば
）、次いでＳ　ｔ　ｒｅｌ）ＬＯｒｒ＋ｙＣｅＳまたは
関連宿主細胞中に形質転換することができる。 本発明に係る機能的に独Ｓγした糾換えｌ）　Ｎ　Ａク
ローニングベク身−は、その用途を５ｔｒｅｐｔｒ朋ｙ
ＣｅＳの単一の種または菌株に限るものではない。逆に
、木ベクターは広範囲の適用が１１能で、多くのＳｔｒ
ｅ−１）ｔＯｍ）’ＣｅＳ　ｆｆ１（７）宿ＥＩＪ＋胞
一時にアミノグリコシド、マクロライド、β−ラクタム
、ポリエーテルおよびグリコペプチドのような抗生物質
を産生ずる経済的重要性のある非制限菌株に形質転換す
ることができる。こうした非制限菌株は、文献（Ｌｏ＋
ｎｏｖｓｋａｙａ等、１９８０−　ＮＩｉｃｒｏｌ）ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ　’４４　：　２０６
　）で知られる常套の方法にょリ、Ｓｔ　ｒｅｐＬｔ＞
ｍｙｃｅｓ類から容易に選択、分Ｐ１１１される。非制
限菌株の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形？ｉ”ｌｉ
Ｉ：換の際プラスミドｌ）　Ｎ　Ａをす」断したり劣化
目させることかない。本発明においては、本発明に係る
ベクターのいかなる制限→ノーイトもすＪ断しノよい制
限酵素を含んでいる宿主細胞もまた非制限性とみなすこ
ととする。 アミンクリコシド抗生物質を産生じ、本発明に係る機能
的に独立したベクターを特にイ１用に使用でき、形質転
換できる好ましい５Ｌｒｃｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ　類の非
制限菌株の宿主細胞には、例えは以」・のような微生物
の非制限細胞が含まれる： Ｓ、　ｋａｎａ−ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ　（カブ−マイシ
ン’ｌｉ＋’ｉ）、Ｓ。 ｃｈｒｅｓＬｏｍｙｃｅｔｉｃｔ＋ｓ　（７ミノシジン
）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏ−ｆｌａｖｕｓ　（抗生物質ＭＡ
１２６７）、別＋ｎｉ　ｃ　ｒｏｓｐｏｒｃｕｓ（抗生
物質５Ｆ−７６７）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ
　（抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ、　［１ａｖｏｐｅｒｓ
ｉｃｕｓ　（スペクヂノマイシン）、Ｓ、５ｐｅｃｔａ
ｂｉｌｉｓ　（７クチノスヘククシン）、Ｓ、ｒｉｍｏ
ｓｕｓ　ｆｏｒｍａ　ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ　（
パ０−Ｅ　？イシン類−力テヌリン）、Ｓ、ｆｒａｄｉ
ａｃ　ｖａｒ。 １ｔａｌｉｃｕｓ　（アミノシジ７　）−Ｓ、Ｉ）ｌｕ
ｅｎｓｉｓ　ｖａｒ。 ｂｌｕｅｎｓｉｓ　（フルエフ　７−マイシン）、Ｓ、
ｃａｔｅｎｕｌａｅ（カテヌリン）、Ｓ、ｏｌｉｖｏｒ
ｃＬｉｃｕｌｉ＼＋ａｒ　、　ｃｅｌ　１ｕ−１ｏｐｈ
ｉｌｕｓ　（デストマイシ７Ａ）、Ｓ、　ｔｅｎｃｂｒ
ａｒｉｕｓ（トブラマイシン、アブラマイシン）、５，
１ａｖｅトｄｕｌａｅ　（ネオマイシン）、Ｓ、ａｌｂ
ｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　（ネオマイシン類）、Ｓ、ａｌ
ｌ）ｕｓ　ｖａｔ、　＋ｎｅｃａｍｙｃｉｎｕｓ　　（
メタマイシン）、Ｓ、Ｉｉｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　
ｖａｒ、ｓａｇａｍｉ　−ｃｎｓｉｓ　（スペクチ／フ
イ’ｙン）−Ｓ、Ｉ）ｉｋｉｎｊｃｎｓｉｓ（ストレプ
トマイシン）、５４ｒｉｓｅｕｓ　（ストＬｙブトマイ
シン）、Ｓ、ｅｒｙｔｌｌｒｏｃｌ＋ｒｏ＋ｎｏｇｅｎ
ｃｓ　Ｖａｌ’、ｌ１ａｒＬｌ−ｔｏｅｎｓｉｓ　（ス
トレブｌ−フィシン）、Ｓ、ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ（スト
レプトマイシン）、Ｓ、ｇａｌｌ）ｕｓ　（ストレプト
マイシン）、Ｓ　、　ｒａｍｅｕｓ　（ストレプトマイ
シンＳ，ｇｌｉｖａｃｅｕｓ　（ストレプトマイシン）
、Ｓ　、ｎ＋ａ　ｓ　ｈ’ｕ−ｅｎｓｉｓ　（ストレゾ
ｌマイシン）、Ｓ，ｌ＋ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｔノ
ａ　ｒ　、　Ｉ　ｉｍｏｎｅｕｓ　（バリダマイシン類
）、Ｓ，ｒｉｍｏ−ｆａｃｉｅｎｓ　（デルタマイシン
）、Ｓ．Ｉｑ＋ｇｒｏｓｃＯＰｉｃｒ＋ｓ［ｏｒ＋ｎａ
　ｇｌｅｌ）ｏｓｕｓ　（グレポマイシン）、Ｓ，（ｒ
ａｄｉａｃ（ハイブリマイシン類、ネオマイシン類）、
Ｓ。 ｃｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　（抗生物ｒＩＡ１６３１６−
（薯、Ｓ。 ａｑｕａｃａｎｕｓ．　（　Ｎ−メチルハイグロマイシ
ン１３）、Ｓ，ｃｒｙＳｔａｌｌｉｎｕｓ　（　ハイグ
ロマイシンＡ）、Ｓ。 ｎｏｌ）ｏｒｉｔｏｃｎｓｉｓ　（　ハイグロマイシン
）、Ｓ．１１ｙｇｒｏ−ｓｃｏｐｉｃｕｓ　（　ハイグ
ロフィシン類）、Ｓ．ａｔｒｏｆａｃｉ　−ｅｎｓ　（
　／’イクロフイシン）、Ｓ．ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕ
ｓ　（カブ−マイシン）、Ｓ，ｋａｓＩｔｇａｅｎｓｉ
ｓ　（カブ−マイシン類）、Ｓ，　ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ
　（抗生物ＨＩ−　ｒ、−八Ｍ３１）、Ｓ，ｌｉｖｉｄ
ｕｓ　（　リビドマイシン類）、Ｓ，］ｉｏ［ｕｅｎｓ
ｉｓ（セルドマイシン複合体）、および５，ｃａｎｕｓ
．　（　ＩＪポシルパロマミン）。 マクロライド抗生物質を産生じ、本発明でと係る機能的
に独立したベクターを特に有用に使用でき、形Ｉｅｊ転
換できる好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限
菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非制限
細胞か含まれる：　Ｓ，ｃａｅｌｃｓｔｉｓ　（抗生物
１ｉｄｉへ１１８８　）−　Ｓ．■＞ｌ　ａ　ｔｅｎｓ
　ｉ　ｓ　（プラテノマイシン）、Ｓ，ｒｏｃｈｅｉ　
ｖａｒ，　ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ　（抗生物質１”２６３
６）、Ｓ　、ｖｃｎｅｚｕｅｌａｅ　（メチマイシン類
）、Ｓ　、ｇｒ　ｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ（′ノンドリン
）、Ｓ，ｎａ＋°ｂｏｎｃｎｓｉｓ　（ジョサマイシン
、ナル７ｔミマイシン）、Ｓ，　Ｉ’ｕｎｇｉｃｉｃＪ
ｉｃ旧（抗生物質ＮＡ−１８１）、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｌ
ｔｃｉｅｎｑ　（抗生物ｒｔ　ＰΔ１３３Ａ、Ｂ　）、
Ｓ，　ｒｏｓｅｏｃｉ　ｔｒｃｕｓ　（アイポザイクリ
ン）、Ｓ，Ｉｒｒｕｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ　（　Ｔ　／
ｌ／ポ→）°イクリン）、Ｓ，　ｒｏｓｅ．ｏｃｂｒｏ
ｎｌｏｇｅｎｅｓ　（アルポザイクリン）、Ｓ。 ｃｉ＋１ｅｒｏｃ１１ｒｏ＋ｎｏｇｅｎｅｓ　（シネ０
フイシン１３）、Ｓ。 ａｌｂｕｓ　（アルボ７−（セチン）、Ｓ，ｆｃｌｌｅ
ｕｓ　（　７／ｌ／ゴマイシン、ピクロマイシン）、Ｓ
．ｒｏｃｈｃｉ　　（ランカシジン、ボレリジン）、Ｓ
，ｖｉｏｌａｃｃｏｎｉｇｃｒ　（ランカシジン）　＝
　Ｓ，ｇｒｉｓｅｕｓ　（ホレリジン）、Ｓ。 ＋ｏａｉｙ．ｅｕｓ　（インクラマイジン）、５．ａｌ
ｌ）ｕｓ　ｖａｒ。 ｃｏｉｌ＋ｎｙｃｅＬｉｃｕｓ　（　コレイマイシン）
、Ｓ，ｍｙｃａｒｏ−ｆａｃｉｅｎｓ　（　７セチルロ
イコマイシン、ニスピノマイノン）、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓ
ｃｏｐｉｃｕｓ　（　メタマイシン、レロマイシン、マ
リドマインンータイロンン、カルボマイシン）、　Ｓ，
ｇｒｉｓｅｏｓｐｉｒａｌｉｓ　（　Ｌ／ロフイシン）
、Ｓ　、ｌａｖｅｎ市＋Ｉａｅ　（アルドカマインン）
、Ｓ。 ｒｉ＋ｎｏｓｕｓ　（　、＝−１−トラマイシン）、３
Ｊｃｌｔａｅ　　（デルタマイシン）、Ｓ．ｆｕｎｇｉ
ｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ．　ｅ１＋ｐｉｎｏ　−ｍｙｃ
ｅｔｉｃｕｓ　（ニスピノマイシン１：Ｑ）−　Ｓ，ｆ
ｔ＋＋山ｃｉｄｉｃｕｓ（ミテカマイシン）、５．ａｎ
市ｏｆａｃｉｅｎｓ　（フオ０７シジン１））、Ｓ、ｅ
ｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ　（メチマイシン）、Ｓ、ｇｒｉ
ｓｅｏｌｏｓ　（グリセオマイシン）、Ｓ、Ｎａｖｏｃ
ｂ−ｒｏｍｏｇｅｎｅ　ｓ　（アマロマイシン、シリコ
マイシン類）、Ｓ、　ｆｉｍｌｎｉａＬｕｓ　（アマロ
マイシン）、５．　ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ（７７０マイ
シン）、Ｓ、ｅｒｙｔｌｏｅｕｓ　（エリスロマイシン
類）、Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　（オレアント′
マイシン）、Ｓ、ｏｌ　ｉｖｏｃｌｎＯｍｏｇｅｎｅｓ
　（オレアンドマイシ／）、Ｓ　、　ｓｐｉｎｉｃｈｒ
ｏｍｏｇｅ＋ｔｃｓ　ｖａｒ　、　ｓｔ＋ｒａｇａｏｃ
ｎｓ　ｉ　ｑ　（クンマイシン類）、Ｓ、ｋｉｔａＳａ
ｔｏｅｎｓｉｓ　（ｏイコ（フィシン）、　Ｓ、ｎａｔ
市ｏｎｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ、、ｉｏｓａｍｙｃｅｔｉ
ｃｕｓ　（ＤイオマイシンＡ３、シラマイシン’）−Ｓ
、；ｌＩｌ＋（＋−ｇｒｉｓｅｏロ１５（ミコノマイシ
ン）、Ｓ、Ｉ）ｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ（チャルコマイシ
ン）、Ｓ、ｃｉｒｒａｔｕｓ　（シラマイシン）、Ｓ、
ｃｌｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ　（ニダマイシン）、Ｓ。 ｅｕｒｙｔｌｌｅｒｎ＋＋＋ｓ　（アンゴラマイシン）
、Ｓ、ｆｒａｄｉａｃ（タイロシン、ラクテノシン、マ
クロシン）−５，ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ　（パンダ
マイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏ−ｆｌａｖｕｓ　（アキ
、１１？イシン）、Ｓ、ｈａｌ　３ｔｅｄｉｉ　（カル
ボマイシン）、Ｓ、Ｌｅｎｄａｅ　（カルボマイシン）
、Ｓ　、＋ｎａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　（カルボマイシ
ン）、Ｓ、ｔｈｅｎｎｏ−ｔｏｌｅｒａｎｓ　（カルボ
マイシン）、およびＳ、ａｌｌ）ｉｒｃ　−ｔｉｃｕｌ
ｉ　（カルボマイシン）。 β−ラクタム抗生物質を産生じ、本発明に係る機能的に
独立したベクターを特に有用に使用でき、形質転換でき
る好ましいＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿
主細胞には、例えは以下のような微生物の非制限細胞が
含まれる：　Ｓ、Ｉｉｐ＋ｎａｎｉｉ　（Ａ　］　（３
（３８４、”　Ｍ　４５５０、ｐ、４Ｍ　１３ｇ０２　
）−Ｓ、ｃｌａｖｕｌｉｇｃｒｕｓ（Ａ１．６８８６Ｂ
、クラフラン酸）−Ｓ、ｌａｃｔａｍ小１ｒａｌｌＳ（
セファマイシンＣ）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ　（セファマ
イシンＡ−Ｂ）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃ（中１ｃｕｓ　（
テアセトキシセファｏスポリンＣ）−Ｓ、ｗａｄａｙａ
ｍｃｎｓｉｓ　（〜＼’ｓ、−３４４２−１））、Ｓ、
ｃ１１ａｒ＋ｒｅｕｓｉｓ　（Ｓ　ｌ”　３　Ｇ２３　
’）、Ｓ。 ｈｃｔｃｒｏｍｏｒ１市ＬＩＳおよびＳ、ｐａｎａｙｃ
ｕｓｉｓ　（Ｃ２（＋８１Ｘ）　　；　　　Ｓ　、　ｃ
ｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ　　−Ｓ、　　ｆｉ＋ｎ１）
ｒｉａｔｕｓ　　、　　Ｓ、ｈａｌ−ｓ［ｅｔＪ首、Ｓ
　、ｒｏｃｈｅ　ｉおよヒ’　Ｓ　、ｖ　ｉ　ｒ　１（
ｌｏｃｈ　ｒｏｕ＋ｏｇｃｎｃ　ｓ（セファマイシンＡ
、　Ｉｓ　）　；　Ｓ、ｃａＬＬＩｅｙａ　（ヂエナマ
了シン）；およびＳ、ｏｆ　１ｖａｃｅｕｓ　−Ｓ、　
ｆｌａｖｏｖｉｒｃｎｓ、Ｓ、　■ａｖｕｓ＝　　　Ｓ
、ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｃｌｉｓ−Ｓ　、ｉｒｇｅｎＬｅ
ｏｌｕｓ　　　およびＳ、５ｉｏｙａｅｎｓｉｓ　（Ｍ
Ｍ４５５（）およびＭＭ］、３９Ｑ　２’）。 ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明に係る機能的に
独立したベクターを特に有用に使用でき、形質転換でき
る好ましいＳ　ｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅ　ｓ類の非制限
菌株宿主細１１ωには、例えば以下のような微生物のジ
１制限細胞か含まレル：　Ｓ、ａｌｂｕｓ　（Ａ２０４
、Ａ２８６９５　Ａおよび＋３、サリノマイシン）、Ｓ
、ｈｙｇｒｏ−ｓｃｏｐｉｃｕｓ　（Ａ　２　］　］８
エメリシト、ｌ）　Ｅ　３９３６、Ａ１２ＯＡ、Ａ２８
６９５Ａおよび１３、エテロマイシン、シラマイシン）
、５．ｇｒｉｓｅｕｓ　（クリツリキシン）、Ｓ、ｃｏ
ｎｇｌｏｂａｔｕｓ　（イオノマイシン）、５．ｃｕｒ
ｏ−ｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ、　ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉ
ｃｕｓ　（ライドマイシン）、△ Ｓ、　Ｉａｓａｌ　１ｅｎｓｉｓ　（う→ノーロシド）
、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ（ロノマイシン）、
Ｓ、ｃａｃａｏｉ　ｖａｒ、ａｓｏｅｎｓｉｓ　（ライ
ソセリン）、Ｓ、ｃｉ＋＋ｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ　（モ
ネンシン）、Ｓ、ａｕｒｅｏｒａｃｉｃｎｓ　（ナラジ
ン）、Ｓ、ｇａｌｌｉｎａｒｉｔ＋ｓ　（ＲＰ３０５０
４）、Ｓ、　ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓｉｓ　（ライソセ
リン）、Ｓ、　ｆｌａｖｅｏｌｕｓ　（ＣＰ３８９３６
　）、Ｓ、ｍｕＬａｌｔｉｌｌｉｓ（Ｓ−１，１７４３
ａ）、および５．ｖｉｏｌ’ａｃｅｏｎｉｇｅｒ　（＝
ゲリシン）。 グリコペプヂド抗生物質を産生じ、本発明に係る機能的
に独立したベクターを４、′ｉに有用に使用でき、形質
転換できる好ましイ４ｉｔｒｅｐｌｏｕ＋ｙｃｃｓ類の
非制限菌株宿主細胞には、例えはり、下のような微生物
の非ｆｌｉり限細胞が含まれる：　Ｓ、　ｏｒｉｅｎｔ
ａｌ　ｉｓ　およびＳ、ｂａｒａｎｏ＋ｎａｃｈｉｅｎ
ｓｉｓ　（バンコマイシン）−８，ｃａｎｄｉｄｕｓ　
（Ａ−３５５１２−アホパルシン）、およびＳ、ｅｌ〕
ｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ　（Ｌ　Ｌ−Ａ　Ｍ３７４　’）
。 本発明に係る機能的に独立１−５だベクターを特に有用
に使用でき、形質転換できるーその他の好ましイ５ｔｒ
ｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓの非制限菌株宿主細；１７）１に
は、例えば以下のような微生物の非制限細１１（スか３
才れる：　Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ　１３２６　（１ｓｉ
ｌ〕ｌｒ　、へ・＋、ｌ、等−１．９７７−１、ｏｆ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｃｎａｒａｌ　Ｇｅｎ
ｃｔｉｃｓ−１５４：　１５５　；　５ｃ１１ｏｔｔｅ
ｌ　、　、１．１等、１９８１、ｌ、ｏｒｌｓａｃＬｃ
ｒｉｏｌｏｇｙ　、　１４６　（］　）：　３　Ｇ　Ｏ
および１ｌＩ）１〕、１ｌｉｌ。 、１１等、　１９８１、　Ｊ、ｏｆ　　へＩｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　ａｎｃｌ　　Ｇｅｎｅ＋°ａｌＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ、１４８　：　２３０　）、Ｓ、ｃｏｃｌｉｃｏｌ
ｏｒ−Ｓ。 ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ−Ｓ、ｒｏｓｅｏｓＨ）を月
°ｕｓ　−Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ　。 Ｓ、　ｔｅｎｅｌ）ｒａｒｉｕｓ、Ｓ、ｃｓｌ）ｉｎｏ
ｓｕｓ　−Ｓ、ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ　−Ｓ、ｇｌａｕ
ｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ、ｐａｒｖｉｌｉｎ−Ｓ、ｐｒｉｓ
ｔｉｎａｅｓｐｉ　−ｒａｌｉｓ＋Ｓ、ｖｉｏｌａｃｅ
ｏｒｕｂｅｒ−Ｓ、ｖｉｎａｃｅｕｓ　　およびＳ、ａ
ｚｕｒｅｕｓ　ｎ 」Ｌ記の代表的なＳ　Ｌ　ｌ’ｅｌ）ｔｏ＋１１ｙｃｅ
ｓ宿主細胞に加えて、未発→別に係る機能的に独立した
ベクターを特に有用に使用てき−かつ細胞中に形’Ｉｉ
”ｌｉｔｇ換てきるその他の即用の非制限菌株は、例え
は以下のようなものである：　１Ｓａｃｉｌｌｕｓ−５
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳ　ｔ　ｒｅｐＬ
ｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、
Ｎｏｃａｌ（ｌｉａおよびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒ
ａを含むΔｃｔｉｎｏ−＋ｎｙｃｅ１．ｅＳ関連菌株。 このように本発明に係るベクターは広ｑ・旧）１（に適
用可能てあり、イ１用てかつ数多くの微生物宿主細胞に
形質転換できる。 本発明の実１７ｉ１．ｉｊ声様は全てイ＝１’ＪＩであ
るが、中でも幾つかの本発明に係る組換えＩ）　Ｎ　Ａ
クローニングベクターおよＯ・形豹転換体がよりｌｒま
しい。即し好適ｌＳＳツクーは、プラスミドｐＮＩｋｌ
　７０２Ａ　−１）ＮＭ７０３Ａ−ｐＮＭ７０４Ａ、ｐ
ＮＭ７０５Ａ−ｐＮＭ７０６Ａ−ｐＮＭ７０７Ａおよび
ＩＮＮ八１へ０８Ａてあり、好適な形で■転換体は、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ　／
１）Ｎへ４７０２八、Ｓ、　ａｍｂｏｆａｃｉｃｎｓ　
／　ｐＮｈｌ　７０３　Ａ　−Ｓ　。 Ｉ　１ｖｉｄａｎｓ’　ｌ　３２６　／　ｐＮＮｌ　７
０３　Ａ　−Ｓ、　ａｍｌ〕０ｈｃｉｃｎｓ／ｐＮＭ７
Ｑ４Ａ−Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＮＭ７Ｑ５Ａ
、Ｓ　、　ａ＋ｎｂｏｆａｃ　１ｃｎｓ　／　ｐＮＭ　
７　Ｑ　（ｉ　Ａ　−Ｓ　、ａｍｌ〕０ｆａｃ　１ｃｎ
ｓ　７１）Ｎへ４７Ｑ７Ａ−Ｓ、ａ＋ｒ市ｏｒａｃｉｃ
＋＋ｓ　／　ｐＮＭ７０８Ａ　およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ
１２　１１１３１Ｑｌ／′ｐＮＭ７０８Ａである。 さらに、これら好適な群の申でもプラスミドｌ）Ｎへ１
７０２Ａ、Ｉ）ＮＭ　７　（１３Δ、ｌ）　ＮＭ　７　
Ｑ　５　Ａ、およびｐＮへ１７０７Ａ並ひに形質転換体
Ｓ、ａ＋ｎ１）ｏＦａｃｉｅｎｓ　／ｐＮＭ７（１２Ａ
−Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＮへ１７（１３Ａ−
ｓ、ｌ１ｖｉ−ｄａｎｓ　１３２６　／　ｐＮＭ７０３
Δ、Ｓ、ａ＋ｎ１）ｏｆａｃｉｅｎｓ／’ｐＮへ１７０
５ＡおよびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉｃｎｓ　、−′ｐＮへ
１７（１７Ａ　　か最も好ましい。 本発明に係る機、仕向に独立した絹換えｌ）　Ｎ　Ａク
ローニングベクターおよび形質転換体は、広範囲な効用
を有し、５Ｌｒｃｐｔｏ…ｙｃｃｓおよび関連微生物に
使用するだめの好適なりローン媒（Ａ、の必要ｆ（１を
ＭＭｉたすものである。その」二、非形質転換宿主細胞
には有為な抗生物質に対する剛性をｆ−１１ｊする本発
明に係るベクターの能力は一同時に一形質１．＝換体を
選択する機能約１１段を提供することとなる。このこと
は、ヘクター１）　Ｎ　Ａを獲得した特定の細胞を決定
し選択する実際」二の必要性の故に■１要である。その
存在を確認するだめの機能的手段を欠く他の１）、ＮＡ
セクメントを、さらに本発明に係るベクター上に挿入す
ることもでき、この非選択性１）ＮＡを含有する形質転
換体を、適当な抗生物心による選択により分離できる。 このような非選択性１）　Ｎ　Ａセクメントは、プラス
ミドの機能と複製に必要な領域の内部り、外ならどのサ
イトへも挿入することかでき、抗生物質修飾酵素を指定
する遺伝子およびあらゆる型の調節遺伝子を含むか、こ
れらに限定される訳ではない。 さらに詳細には、ある遺伝ｒを含有する非選択性１）　
Ｎ　Ａセクメントは、例えは、例示プラスミドｐＮＭ７
Ｑ５Ａの、〜］、、　５　ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ■耐性付与
−ｙ　ラクメントの中央の５ａｉｌまたはザフ末端のＩ
’ｖｕ　Ｊｌ制限サイトに挿入される。かかる１１１人
によってチオストレプトン耐性遺伝子が不活性化される
ので、組換えプラスミドを含む形質転換体を同定するこ
とができる。即ち、この’Ｌｊ音まず才、オマイシン面
、ｊ性によって選択し、次にヂオストレブトン面、１件
でないネオマイシン耐性形質転換体を同定する。同様に
、所望のＤ　Ｎ　ＡセグメンＩ−を例えば〜：３．４ｋ
ｌ〕ｌｓａｍ　ＩＩ　１．　ｉｉｌ性伺与フラクメント
ノ内側０）　１３ａｍ　ＩＩ　１制限ザイトに１＋１１
人ずれは、ネオマイシ、ン面Ｊ例遺伝子が不活性化する
。従って−この釦換えプラスミドを持つ形質転換体もま
たーまずヂオストレブトン削性で選択し、次にネオマイ
シン而１性でないヂオストレブトン耐１／１弓ヒ％ｉ転
換体を同定することによって、容易に同定できる。エリ
スロマイシン耐性遺伝子への挿入不活性化を含む同様の
選択もまた可能である。以」−のように、Ｓ　Ｌ　ｒｅ
ｐｌ＋ｎｙｃｅｓおよび関連細胞における抗４ト物１■
耐性にょる〕ｊ１１択能力によって、「Ｉ的とする特定
のジ１選択゛ｌ’ｌ　Ｉ）　Ｎ　Ａを含有するこく少数
の細胞を効率的に分ｐｓできるようになる。 上述の抗生物質面Ｊ性についての膿能試験は、さらに、
制御（コントロール）因子として作用し仙々の抗生物質
ｍｌ性遺伝子の発現を支配するＩ）　Ｎ　Ａセグメント
の位置決定にも使用される。ブロモ−クー、アテニュエ
ークー、リブレッザー、インデューリ゛−、リボゾーム
結合サイト等を含む（これらに限定さ第１．る訳ではな
い）」二記セグメントは一５ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓお
よび関連微生物の細胞における他の遺伝子の発現の制御
に使用される。 チオストレプトン、ネオマ・イシンおよびエリスロマイ
シンの耐性を（，１’：する本発明に係る機能的に独立
したベクターは、結合したＩ）　Ｎ　Ａセグメントが宿
主細胞中で幾１］１ｓ代にも渡って安定に維ｔ！テされ
ることを保証するためにも有用である。ヂオストしブト
ン、エリスロマイシンまたは床オマイシン耐ｔノ１イ、
Ｉｌｊフラグメントと共有結合し一５ｔｒｃｐＬｏ−Ｈ
１γＣｅＳまたは関連微生物の細胞中で増殖するこれら
遺伝子あるいはｌ）　Ｎ　Ａフラグメントは、井形ｙＪ
ｌｆｘ換細胞にとってはイイ毒な濃度のチオストレプト
ン形でｊ転換体をさらすことによって維持できる。そう
することにより、ベクターを失い従って共有結合しブ：
ー）Ｎ八をも失った形質転換体は生育できず、培地から
除去される。以」二のようにして本発明に係るベクター
は、所望のいかフ，（るｌ）Ｎへ配列をも安定化し維持
することができる。 本発明に係る機能的に独立したクローニンクベクターお
よび形質転換体によって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓお
よＯ・関連細胞において現在産生されている数多くの生
成物の収量を向上させる遺伝子をクローンすることがで
きる。こうした生成物の例として、ストレプトマイシン
、タイロシン、セファロスポリン類、アクタブラニンー
ナラシン〜モネンシン、アブラマイシン、トブラマイン
ン、エリスロマイシン等が挙けられるが、これらに限定
される訳ではｌＳい。さらに本発明は、商業的に重要な
蛋白、例えはヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン
、クルカゴン、インターフェロン、ヒトＪ戊長ポルモン
、牛成長ホルモン等；商業的にＴＩ−１要ｆ．：　’．
’ｌ’．稈および物質につながる代謝経路におりる酵素
機能；または遺伝子の発現を改善する制御囚−ｒ、を暗
号化しているＩ）ＮＡ配列をクローンし、特徴（、Ｊす
、再構成するのに着用な選択可能なベクターを提供する
。これらの望ましいＩ）　Ｎ　Ａ配列とは、例えばスト
レプトマイシン ン、アククプラニンーナラシン、モネンシン、アブラマ
イシン、］・フラマイシンおよびエリスロマイシン誘シ
，１体等の誘等抗生物質の合成を触媒する酵素、または
抗生物質もしくは他の生成物の生合成を仲介し増強させ
る酵素を暗壮化しているＩＮＮ八を含むが、これらに限
定される訳ではない。このようにＩ）　Ｎ　Ａセグメン
トの挿入および安定化が可能なことから、Ｓ　ｔ　ｒｅ
ｐ’ｔＯｍｙｃｅ　ｓおよび関連微生物の産生ずる抗生
物質の収量と利用性を増加さぜることかできる。 プラスミドｐ　Ｅ　Ｌ７の供給源となるＳｔ　ｔｅｌ）
ｔｏＩｎ＞’ＣｅＳａｎ＋ｂｎｆａｃｉｅｎｓ　／’ｌ
）　ｌ’：Ｉ、７は、幾つかの異なる培地のとれかを用
いて多くの方法で培養できる。培地中の好ましい炭水化
物源としては、例えば糖蜜、グルコース、テキストリン
およびグリセロールが含まれ、窒素源としては例えば大
豆粉、アミノ酸混合物およびペプトン類が含まれる。栄
養無機塩類もまた添加され、これにはナトリウム、カリ
ウム、アンモニア、カルシウム、リン酸、塩酸、硫酸等
のイオンを放出し得る通常の塩類が含まれる。他の微生
物の発育と増殖に必要であるように、必須微量元素もま
た添加する。こうした微ＦＩｉ′元素は、通常、他の培
地成分の添加にイ、１随する不純物の形で供給される。 ＳＬｒｃｐＬ曲＋ｙｃｃｓ　ａｍｌｒｏｆａｃｉｃｎｓ
／ｐ目＋７は、約５〜９という比目的７い１由領域に渡
って約１５′ｃ〜４０°Ｃの／ｌｌｒｌ＋　ＩＪＣ範囲
において好気的培養条件下に発育する。しかしながらプ
ラスミドｌ）　ｌ’：　ｒ、７を最大限の複製数で生産
するためには、培地のｐＨを約６、５で培養を開始し、
約３０″ｃｏ）　ｌ！ｉｉ’を度にｉｆｆ持するのが望
ましい。上記の条件てＳＬｒｅｐｔＯ＋ｎｙＣｅＳａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ　／ｐＥＬ７を培養ずれは、プラス
ミド゛Ｉ）■・７を分離するだめの貯蔵体となる細胞が
簡単に得られる。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。 本発明の説明および本発明を４１ｒ：成する実、際の手
法を適宜述べた。 実施例１　プラスミドｌｌ　Ｉ引−７の分ｊ柚八、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ａｎ市ｏｆａｃｉｅｎｓ　／
ｐ　Ｆ、Ｃ７ノ培ＦｅＳ　Ｌ　ｔｅｌ）ＬＯＩｔｌｙＣ
ｅＳ　　ａｌＴｌｌ）ＯｆａＣ１ｅｌｌｓ　／ｐ　Ｆ、
　Ｌ　７　（Ｎ　ＲＲＬｌ　２５２３　）の栄養接種物
を、以下の好ましい組成を有する５　０　ｍｅの滅菌栄
養培地中、液中好気的条件下に発育させることにより、
常法のことく調製する。 成分　　　　　　　覇 一雫１画ψ１−−−■−Φ−−−−噌−ｈ−一グルコー
ス　　　　　　　　　　　　２０Ｉ／／Ｉ栄養大豆粉（
Ｎｕｔｒｉｓｏｙ　ｆｌｏｕｒ　’）”　　　１５　ｇ
／′ｐとうもろこし浸漬液　　　　　　　ｊＯり／ｌＣ
ａ　ＣＯ３２り／ｆ 水（ｔａｐ　）　　　　　　　　　　　１．１　ｅ×栄
谷大豆粉はＡｒｃｈｅｒ　Ｉ）ａｎｉｅｌｓ　Ｍｉｄｌ
ａｎｄ　Ｇｏ＋ｎｐａｎｙ（４６６６Ｆａｒｉｅｓ　　
ｌ’ａｒｋｗａｙ−１）ｃｃａｔｕｒ　　ｌ１ｌｉｎｏ
ｉｓ６２５２６在）より入手。 ×とうもろこし浸漬液はＣＰＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ　。 Ｃｏｒｎ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　ｔ　　１’、０．　
１３ｏｘ　　３０００　、　Ｅｎｇｌｅｗｏｏｃｌ。 Ｎ、Ｊ、０７６３２在）より入手。 この栄養接種物を温度３０　”Ｃ−，１）１１６．５で
４８時間インキュベー１・する。インキュベーション後
−この接種物約１．０　ｍｅを一以下の好ましい組成を
有する滅菌した細胞発育培地５（）〃・Ｃに移す。 成分　　　　　　　畢 トリプヂカーゼ大はブロス　　　　３０！７／（！グル
コース　　　　　　　　　　　　１−０’ｊ／。 クリシン　　　　　　　　　　　　　ｌ　Ｖ／ｅ脱イオ
ン水　　　　　　　　　　　１ｇ／ｌ×トリプヂカーゼ
大豆ブロスはｌ）ｉ　ｆｃｏ　Ｌａ１）ｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ（１）ｅｉｒｏｉｔ、Ｍｉｃｌ＋ｉｇａｎ在）より
人手。 接種した細胞発育培地を３０゛Ｃで約２０時間インキュ
ベートする。１泪は調節しない。インキュベーション後
、このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ　ａｍｌ〕ｏｆａｃｉ
ｃｎｓ　７１）　Ｉ’：　Ｌ　７細胞は、収Ｉｌ（シし
、引き続きブラスミ１ｌ）Ｎ八を分離できる状態にある
。 約１０７　（湿巾）ｆ　）（７）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　　ａｎ由ｎｆａｃｉｃｎｓ／ＰＥＩ、７の細胞を
遠心沈降（１０分間、５　’Ｃ１１０，０００ｒｐ＋ｎ
　）により収穫する。この細胞を、組織磨砕器を用いて
ホモゲナイズし−’ｌ’　Ｅ　Ｓ緩衝液（０，０５Ｍ　
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］−Ｉ・リス
−１，０，００５ＭのＥ　Ｉ）　’ｌ’　Ａ、および０
．０５ＮＩＮシ田ｌ、ｐＨ８，０）中で洗浄し、２５％
シュクロースを含むｌ”　Ｅ　Ｓ緩衝液中に懸濁する。 ２０ｍｅのｌ’　Ｅ　Ｓ　−２５％シュクロース緩衝液
中のりソヂート約１２０　＝＝・ｙを添加後、この）酢
濁液を３５〜・３７°Ｃて約２０分間インキュベ−１・
し、次いて！１２５λｌのＥＩ）　’３’　Ａ（＋）１
１８．０　）　４０　ｈ１Ｌ’を添ＩＪＩＩ　Ｌ、でこ
の！Ｍ　ｊ蜀ｌ（’＊　４再度３５゛Ｃで１０５）出ｊ
インイユベ−１・する。引き続き１”１緩衝液（０，０
１λ１トリス、０．００　］　ｂｉノＥｌ）ｉ”Ａ、ｐ
ｌ＋　−８，０）中の５％５１）５（Ｆデシル硫酸ナト
リウム）約４’　Ｏｍｅを加え、得られた混合物を再び
３５〜３７℃で２０分間インキュベー１−シー説イオン
水中の５　Ｍ　ＮａＣ４約５０ｍ（を加える。この混合
物を攪拌し一氷浴ｊ−に４時間保った後、遠心沈降させ
る（３０分間、４　”ｃ、１０．００　Ｏｒｐｍ　）。 脱イオン水中の４２％ポリエチレンクリコール約、３１
３容量をこのＮａＣ１上澄液に加え、得られた混合物を
４℃で約１８１Ｒ？間冷却する。ｌ）　Ｎ　Ａの沈殿を
遠心沈降（５分間−４℃−３００（ｌ　Ｉ’ｌ捕）によ
り集め、’Ｊ’　Ｉ’、　Ｓ緩衝液（１）ＩＩ８．０）
に溶解する。塩化セシウムおよびエヂジウムブロミド勾
配を使って遠心沈降（４０１１Ｊ「間、１５℃、３５，
０００　ｒｐＨ１）すると、Ｉ）　Ｎ　Ａ　Ｌｌ　２　
個（７）　良好に識別できるバンドに分かれた。低い方
のバンドが所望のプラスミドｐ　ｉ礼１・７を構成して
いた。常套の操作に従ってプラスミドのバンドを分離し
、イソアミルアルコール−６２回洗浄し、”　Ｅ４７２
　？Ｊｉ液（ｐＨｓ、ｏ　）で透析し、エタノール沈殿
にかけた。 以上のようにして分離したブラスミｌｊ　ｐｌｃｌ−７
は、　４　ｍｅの′１゛１°；緩衝設（＋）ＩＩ　８，
０　）に溶解し、貯蔵のため一２０゛Ｃで凍結さぜた。 実施例２　プラスミド１）１・Ｒ２の斜立てプラスミド
Ｉ）　Ｉ　Ｊ６（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　（１１１０１ＴＩ
Ｉ）ＳＯｌｌ等。 １９８０−　Ｎａｔｕｒｅ、２８６　：５２５に開示）
約２０１ｚｚ（２０μｙ”）、Ｉ）　Ｓ　Ａ　（牛血清
アルフミン、］　ｍｇ／　ｍｅ’）５ｔｉｉ、水１９μ
ｉ、ｊｌｉｎｃｌ川制限酵素用（３ｎｅｗＩｌ、ｎｇｌ
ａ＋＋Ｊ　ＪＳｉｏ　Ｌａ１）単位を含イｉ　）］　／
／／　オＪ：　Ｄ反ｕ・、Ｙミックス　　５／Ｉｔを、
３７℃で２時間インキュベートする。４Ｍの酢酸アンモ
ニウム約５０　ｐ　１およひ９５％エタノール２００１
１ｚを添加して反応を停止１さぜる。（ｊ４られたｌ）
　Ｎ　Ａ　／、ｊＸ殿を７０％エタノールで２回洗ｒｆ
ＩＬ、減圧下で乾燥し、１Ｅ緩衝１１夕２゜１１１に）
Ｖ濁後、貯蔵のため一２０゛Ｃて凍結さぜた。 ×制限酵素は以下の供給源より入手できる：ＮｅＷＥｒ
＋ｇｌａｎｄ　１３ｉｏ　Ｌａｂｓ、　、　Ｉｎｃ　、
　（３２Ｔｏｚｅｒ　Ｒｃｌ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ
ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｑ　ｌ　９１５在）および
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃ
ｌｌｅｍｉｃａｌ　ｓ　（７９４１Ｃａｓｔ、Ｉｅｗａ
ｙ　１）Ｔ、、１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ−１ｎｄｉａ
ｎａ　４　（ｉ　２５０在）。 ××ｆｌｉｎｄ　ＩＩＩ　　制限酵素用の反応ミックス
は以下の成分より調製した。 ６００ｍ１ｌ＋Ｉ　ＮａＣｅ １　ｇ　□＋ｎＭｌ−リス塩酸（））ＩＩ　７．９　）
７０＋ｎＭＭｇＣ１２ １０＋ｎＭジチオトレイトール プラスミドＰ旧く３２２のＩ）　Ｎ　Ａ約８ｐｌ（４／
ｌり）−反応ミックス５　ｐｌ−ＢＳＡ　Ｃ１ｍｙ／ｍ
Ｏ！５μｌ、水３１７ｒｆおよびｌ１ｉｎｄ　Ｉｌｌ制
限酵素１ｌｉｌを３７℃で２時間インキュベー１・する
。６０゛Ｃて］、０分間インキュベー１・することによ
り反Ｌ；、＼を停止さぜた後、酢酸アンモニウム約５０
７ｚ／および９５％エタノール２ｏｏｐｅを添加する。 貨られた１、）　Ｎ　Ａ沈殿を７０％エタノールで２回
洗浄し、減圧乾燥し、水４５／ｉｌ　に！ヒ濁させる。 １１ｉｎｄ川処川Ｊプラスミドｐ１１６（実施例２Ａで
調製）約２０／ノｌ、ｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩ処理プラスミ
ド１）旧ζ３２２（実施例２１３で調製）２０１１１、
Ｂ　Ｓ　Ａ　（１ｍｙ／　ｍ（）　５　ｌｉｅ、’Ｉ’
４１）ＮＡリカーセ”’　１　／１１およびリゲーショ
ンミックス”””’　５　ｌｉｅを１６゛Ｃて４時間イ
ンキュベートする。４Ｍの酢酸アンモニウム約５０Ｉｌ
ｌおよび９５％エタノール２００１Ｉｌを加えて反応を
停止させる。得られたＩ）　Ｎ　Ａ沈殿を７０％エタノ
ールで２回洗浄し、減圧乾ハへし、’Ｉ’Ｅｐ衝液に懸
ぷ１する。この懸濁１）　Ｎ　Ａは所望のプラスミドｐ
　ＬＲ２を構成していた。 Ｘ’ｒ４１）　Ｎ　ＡリノノーゼはＬリートの（ｊ（給
Δ〕１ミより入手てきる：　Ｎｅｗ　Ｉ’：ｎｇｌａｄ
　ｌ５ｉｏ　Ｌａｂｓ、、　Ｉｎｃ、（３２１’ｏｚｃ
ｒＲｄ　０、ｌ５ｅｖｅｒｌ　ｙ　−１１１１ａｓｓａ
ｃｂｕｓｅＬ　ｔｓ　’ｏ　１９　］、　５在）ｙ×　
リゲーションミックスは以下の成分より調製　し　ノこ
。 ５０（）１１Ｍトリス１ＩＣｒ　（＋）ＩＩ　７．８　
）２００　ｍ　ＭジヂオＩ・レイＩ・−ル】０（）“＞
Ｐ′ｌ　ＭｇＣｚ２ Ｉ　ＯＩＩＩ　Ｍ　Ａ　ｌ’　ｌ’ 実施例３１・７．　ｃｏｏｒ＜１２　１１Ｂｌ［）ν’
ｐＬＲ２ノ４１１ミ立て コンピテントな凍結Ｅ、　ｃｏｌｉ　＋＜１２１１１ｓ
Ｈ）Ｊ細胞（１ｓｏｌ　１ｖａｒ等−Ｊ９７７、Ｇｅｎ
ｅ、２　：　７５〜９３　）約１０　ｍｅを遠心にか１
ｊてペレット化し、０．　（１１Ｍ塩化すトリウム約１
．　Ｏｍｅに懸濁する。次いてこの細胞を丁１］びペレ
ット化し１．０３Ｍの塩化カルシウム溶液約１０　ｍｅ
に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした後再度
ペレット化し、最後に、０３Ｍの塩化カルシウム溶液１
．２５　ｍｅに）Ｖ濁する。得られた細胞懸濁液は、次
きに行なう形質転換に対してコンピテントである。 ′１“Ｅ緩衝液中のプラスミドｌ）［１ζ２（実施例２
Ｃで調製）をエタノール沈殿にイ；１し、３　Ｑｌｌｌ
Ｍの塩化カルシウム溶液１．５０／／／に懸濁後、試験
管内てコアｔ”テア　）　臥ｃｏｌｉ　Ｋ１２１１１Ｊ
（Ｂ細胞約２００１Ｉｅと穏やかに混合する。得られた
混合物を氷上で約４５分間−次いて４２′Ｃて約１分間
イン片ユベートする。次にアンピシリン５０”ｇ／ｍｒ
を含有するＬ　７０７　（Ｂｅｒｔａｎｉ、１９５１、
Ｌ　ＩＳａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ６２：２９３）約３　
ｎｆを加える。混合物を３７゛Ｃて１時間振とうしなが
らインキュベ−１・した後、アンピシリンヲ含有ずル■
、寒天（Ｎ１１ｌｌｅｒ−１９７２、Ｆｘｐｅｒｉ＋ｎ
ｅｎＬｓ　ｉｎλ１ｏ１ｅｃｕ１．ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ’−ＣｏｉｃｌＳｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｌ）ｏｒ　
ＬａｔＪｓ　＋Ｃ０Ｉ（Ｉ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉｌａｒｌ
）ｏｒ−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　Ｊ−に蒔く。生き残っ
たコロニーを選択して所望の表現型（Ａ１１ｌ＋）’ゞ
、’ｌ’ｅｔ”　）について試験したところ、このコロ
ニーは目的とするｌ’、、ｃｏｌｉＫ１２１１ＢＩＯＩ
／ｐＬＲ２形質転換体を構成シティた。 実施例４　プラスミドｐＬＲ１の糺ゐ立てプラスミドｌ
）　Ｉ　Ｊ　５の代わりにプラスミドｌ）　ｆ　Ｊ　２
（−１’ｌｌｏｍｐｓｒ＞ｎ等、１９８０、Ｎａ口ぼｅ
　　２（４６：５２５に開示）を使用する以外は実施例
２／＼〜０の教示するところに実質的に従ってプラスミ
）’ｐＬ１句を調製する。「１的プラスミド１）１上ｌ
は′ｒ　＋＞　１ど衝液に）Ｖ濁する。 実施例５　　Ｆ’、、ｃｏｌｉ　Ｋ１２１１１３１０１
／ｌ）■（１の糾み立て プラスミド゛１）ｔ、ｌｊ２てはなくプラスミドＩ）　
ＬＲｌを形で■転換に使用する以外は、実施例３に実質
的に従って目的とする組み立てを行なう。生存コロニー
を選択して所望の表現型（Ａ１１ｌ＋）”　−１’ｃ　
ｔ　”口こついて試験したところ、このコロニーは目的
とするＦ、、　ｃｏｌｉ　１（１２１１１３１Ｑ１／ｐ
ＬＲ１形質転換体を構成していた。 実施例６　プラスミドｐＬＲ４の糾み立てプラスミドＩ
）Ｉ・Ｒ１約１０μＩ（１０１）ｇ）、Ｂ　Ｓ　Ａ（］
、　ｎＩ９７ｍｅ　）　５１１１−水２９　／７　ｐ　
−Ｂａｍ　ＩＩ　］制限酵素（水で１：４に希釈）１μ
ｌおよび反応ミックスパ５／Ｎを３７°Ｃて１５分間イ
ンキュベートする。４Ｍの酢酸アンモニウム約５０７ｚ
ｚ＋および９５％エタノール２００１を添加して反応を
停止さゼる。（＜７られプこＩ）　Ｎ　Ａ沈殿を７０％
エタノールで２１

【コｌ　？１：　／（）し、減圧乾燥
後、７Ｊ（２（１／／　／ｌに！Ｙ、ｉ′♂１１する。 ×ｌｓａｍ　ＩＩ　ｉ制限酵素用反応ミックスは以下σ
）成分より調製した。 ｌ、　５　ＭＮａＣ６ ６０＋ｎＭｌ、リスＩＩＣＺ！　（１）ＩＩ　７．９　
）６　Ｑ　＋ｎ〜１ｔｖ１ｇ　Ｃｌ　２ １１ｉｎｃｌ　Ｊｌｌ　制限酵素の代わりにＪ３ａｍ　
Ｉｆ−１制限Ｍ素を用いる以外は実施例２１３と実質的
に同様にして目的とする消化を行なう。消化したプラス
ミド゛１）Ｂ１ζ３２２は水２９／／Ｉ！ｌこ尉、♂ｉ
１−る。 所望のリゲーションは実施例２Ｃと実τｊＩ′（＜Ｊｌ
こ同様にして行なう。得られたリゲーションＩ）　Ｎ　
Ａ　＋ｉＴ　Ｅ緩衝液に！貿濁した。これは目的とする
プラスミドｐＬＲ４を構成していた。 実施例７　１ｉ、、ｃｏ１ｉＫ１２１１１ｓ１０１／ｐ
Ｌ］（４の糾み立て プラスミドｌ）　Ｌ　Ｒ２ではなくプラスミドｌ）　Ｌ
Ｒ４を形τ」転換に使用する以外は実施例３と実質的に
同様にして所望の組み立てを行なう。生存コロニーを選
１ｉＶ！して所望の表現型（ＡｌＴｌ＋）’、ｌ’ｅｔ
Ｊにライて試験したところ、目的とするＥ、ｃｏｌ　ｉ
　Ｋ　ｌ　２ＩＩＩｓ１（口／　ｌ）　Ｌ　Ｒ４形質転
換体を構成していた。 実施例８　プラスミドｐＮＭ７０２ＡおよびｐＮＭ７　
（１２１１の組み立で の分割 プラスミドｐＬＲ２のＩ）　Ｎ　Ａ約２５７１７、反応
ミックス１．０１ｔｅ１．１Ｍのジチオトレイト−ル５
μｌ、Ｂ　Ｓ　ｉ〜（］　ｍｙ　／　ｍｅ　）ｌ　Ｏ／
／　／、水４５／１１およＱ：　Ｉｌａｍｌｌ、１制限
酵系５１ｉｌ（４！ｌ！位／１ｌｌ）を３７℃で２１＋
！。 間インキュベートする。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウム
および２容［１−１の９５％エタノールを添加後、混合
物を一２０′Ｃで約１８時間冷却してＩ）　Ｎ　Ａを沈
殿させる。Ｉ）　Ｎ　Ａ沈殿を遠心して集め−−１’　
Ｅ緩衝液約５０１ｔｌに懸濁する。〜・〜’１ｅｓｌａ
ｎｄｅｒ、　Ｌ、、１９７９、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　
　Ｊ′ＪｉｏｃｈｃｍｉｓＬｒｙ　９８　：　３０５の
教示するところに実物的に従って、アカロースゲル゛屯
気泳動により、１）　Ｎ　Ａ　ｊｊ７　ｇ３ｉ’ｌ　液
から所望の〜・１、’（３ｋｂ　Ｂａｍ　ＩＩ　Ｊ　１
ｉｌｌ限フラクメントを常法により分ｕ＋１Ｉ−１−る
。分団１後、このフラクメンＩ・を、次−１−程のリゲ
ーションのために１”１゛−緩衝成約２０１１１に再懸
濁する。 プラスミ１ｘ　’ｌ）　ＬＲ２、ｌｏａｍ　ＩＩ　１制
御ＮＮ　酵７＝　オ、Ｊ：　ヒ’　Ｊｙ一応ミックスで
はなく、プラスミドｐＥＬ７．１Ｓｃｌ　Ｊ制限酵素お
よび反応ミックスゝを使用する以外は、実施例８Ａと実
質的に同様にして〜５０゛Ｃで所望の消化を行なう。さ
らに、このＩ）　Ｎ　Ａ消化物は゛電気泳動にイ、１ず
ことなく、次のリゲーションのため直接′１′１ら緩１
！ＩＩｊ液２０１１１に懸濁する。 ×１’、ｃｌ　ｌ制限酵素用反応ミックスはＬ２Ｊ下の
成分より調製した。 １２　＋ｎ　Ｍ　Ｎａ　Ｃ１ １２ｌ＋１Ｍ　　ト　リ　ス　ｌｌＣｌ　（ｐａｌ　　
７．４　　’）１２゛＋Ｍへ４ｇＣｌ　２ ５　＋ｎ　Ｍジチオトレイトール １３ｃｌｌで制限処理したプラスミドｌ）Ｉ’：Ｌ７の
１）ＮＡ約２０１１！／、プラスミドｌ）　ＬＲ２の〜
１．６　ｋｂ　１３ａｍＩｊｌ制限フラクメント１Ｏｔ
ｔ（ｊ、１３　Ｓ　／〜（１ｍｇ／ｍｅ　）５　ｐ　、
１１、リゲーションミックス１（）ｌｌｌ、水４５１Ｉ
ｌオヨヒ”’　４　ｌ）　Ｎ　Ａ　’Ｊ　カー　セ３．
５　／／　ｌを約１６′ｃで約１８時間インキュベート
する。３Ｍの酢酸アンモニウム、】客用および冷エタノ
ール２容量を加えた後、混合物を−２０’Ｃで約１８時
間冷却してＤ　ＮＡを沈殿させる。ｌ）　Ｎ　Ａ沈殿は
遠心して集め一７０％エタノールて洗＃Ｌ、Ｐ］ひ集め
、次の形でｆ転換のため媒質Ｐ　（ｌｌｏｐｗｏｏｄお
よびＷｒｉｇｂｔ、１９７８．１、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　］
　６２　：３０７）５（Ｈｚｚに懸濁させる。 挿入された〜１．６　ｋｂ　Ｂａｍ１ｌ　Ｉヂオストレ
プトン酬性付与フラグメントの方向性に応じて、２つの
方向性を有する組換えプラスミドが生じる。プラスミド
ｐＮＭ７Ｑ２Ａとは、耐性伺与フラグメントのザブ末端
Ｓａｌ　ｌ制限→）−イトがプラスミドｐｌｉＬ７の側
面（７）　（ｆｌａｎｋｉｎｇ　）Ｓａｃレリ゛イトの
極く近接した部位に挿入されて生成した糺換えプラスミ
ドを呼称する。プラスミドｌ）　ＮＭ　７０２１３は逆
向きの糾換えプラスミドをさす。このように、最終的１
．）　Ｎ　Ａ１冒濁液はプラスミド１）ＮＭ７０２Ａお
よび：ｐＮＭ７０２１１を含むこととなる。各々のプラ
スミドｌ）　ＮＭ　７０２ＡおよびｐＮＭ７０２Ｂの制
限サイト地図を添付の第３図に示した。 実施例９　　ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏＦａｃ
ｉｅｎｓ／ｐ＋’：ｌ−７０２ＡおよびＳ、ａ＋ｎ１）
ｏｆａｃｉｃｎｓ　／Ｉ）　Ｅｌ−７０２Ｉｓの絹み立
て 実施例８Ｃからの１）ＮＡ約２７７１７および５ｔｒｃ
ｐＬｏ−ｎｌＸＣｅＳ　　ａｌｌｌｌｌａｃｉｅｎＳＬ
　ＮｏｒＬｌ＋ｃｒ＋ｔ　Ｒｃｇｉｏｎａｌ　　Ｒｃｓ
ｅ−ａｒｃｈ　Ｉ−ａｌ）ｏｒａＬｏｒｙ　（１’ｅｏ
ｒｉａ−１１１ｉｎｏｉｓ在）に寄託されストックカル
チャーコレクションの一部となっており、受】１１！番
号Ｎ１ζｌ’−１−２４２０の下で一般に入手可能な菌
株〕のプロトプラスｌ−１，Ｘ１０８を用いて、国際公
開＋ｂＷ０７９１０　］　１６９　（国際特許出願陽Ｐ
ＣＴ／Ｇ　Ｂ　７９／　０００９５　）明細巴の実施例
２に記載の方法と実質的に同様にして所望の絹み立てを
行なう。抗生物質チオストレプトン約５０　／／　Ｆ　
／　１１１１’を含有するベネット改良培地７に蒔くこ
とにより、目的とする形質転換体をチオストレプトンｍ
ｌ性について選択する。得られた５ＬｒｅｐＬｏ−＋ｎ
３′ｃｅｓ　ａｍｌ）ｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＮＭ７Ｑ２
Ａおよび５．ａｍｌ）ｇ−ｆａｃｉｃｎｓ　７’ｐＮＭ
　７０２　Ｂチオ−ストレプトン耐性コロニーを分離、
培養し、次いて常法に従って構成プラスミドの制限酵素
分析および構成プラスミドのアガロースゲル°ｒｌＪ、
気泳動分析（Ｗｉｅｓｌａｎｃｌｅｒ−１９７９）によ
り同定を行なう。この形質転換培養体は、引き続きそれ
ぞれのプラスミドの生産および分離に使用する。 ｒ／Ｗａｋ５ｍａｎ、１９６１、ｌ’ｈｅ　Ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｃｔｅｓ−第１１巻、ｉ’ｂｅ　Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｎｑ）ａｎｙ　　
ＬＩＳａｌｔｉｍｏｒｃ−Ｍａｒｙｌａｎｄ在）に記載
のベネットの培地（寒天）を、Ｃ：ｏ　Ｃ１２・６１１
２０　（−０１’／　／　’　）の添加およびクルコー
スをデキストリンに高き換えることにより一改変した。 実施例１０．プラスミドｐＮＭ７０４Ａ　オＪ：　Ｕ　
Ｉ”””７０４Ｂの組み立て プラスミドｐＬＲ１の冒）ＮＡ約５０／／／、反応ミッ
クス２０ｐｅ、０．ＩＭジチ第１・レイｉ・−ル１０７
ｚ／、Ｂ　ＳＡ　（１ｍａ／ｍｅ　）　２０μｌ、水４
５１１１およびｌ’ｓＬＪ制限酵素”５ｐｌ（４単位／
１）ｌ）を３７°Ｃで２時間インキュベートする。同容
量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量の９５％エタノ
ールを加えた後、混合物を−２０“Ｃで約１８時間冷却
してＩ）　Ｎ　Ａを沈殿させる。このＩ）　Ｎ　Ａ沈殿
を遠心して集め、■王緩衝液約５０１ＩＩ！に懸濁する
。アガロースゲル゛嘔気泳動（Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｔ、
１９７９）を用イ（−５Ｉ）　Ｎ　Ａ　＠濁液から常法
により目的とする〜３４．　ｋｌ）１３ａｍ１１．１制
限フラグメントを分離する。この分ＭＩＮ　したフラグ
メントを′ｌＥ緩衝液約２０／７１！に丙懸濁し、引き
続きリゲーションに伺ず。 実施例８Ｃの教示するところに実質的に従って、ＪＳｃ
ｌＪ制限処理したプラスミド１）ＥＩ、７のｌ）ＮＡ（
実施例８Ｉｓて調製）約２０７７　ｇおよびプラスミド
゛１）　１．Ｒ］　ノー　　３．４　ｋｌ〕Ｂａｎ目Ｉ
Ｔ制限フラクメント約］、　９　ｐｒｔを反応させるこ
とにより、目的とするリゲーションを行ｌＳう。挿入さ
れた〜３．４　ｋｂ　Ｂａｒｎ　Ｉｆ■ネオマイシン耐
性付与フラグメントの方向により、２つの方向性の組換
えプラスミドか生成する。 プラスミドｐＮＭ７０４Ａとは、耐性伺与フラグメント
のサブ末端Ｐｓ（ｉ制限サイトかプラスミドｐｌｃＩ・
７の側面の５ａｃＪサイトの極く近接した部位に挿入さ
れて生成した組換えプラスミドを呼称する。 プラスミド１）Ｎｈ４７（Ｊ４１３は逆向き方向の糾換
えプラスミドをさす。このように、最終的１）　Ｎ　Ａ
懸γＢ：ｊ　ｌ（１はプラスミド１３Ｎ〜１７０４Ａお
よびＩ）　ＮＭ７０４　Ｂを含むこととなる。各々のプ
ラスミドｐＮＭ７０４ＡとｐＮＭ７　Ｑ　４　Ｉｓの制
限→ノ゛イト地図を添伺の第３図に示した。 実施例１　Ｉ　　５ｔｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ　ａｍｂ
ｏｆａｃｉｃｎｓ　／ｐｉｌ１７０４ＡおよびＳ、ａｔ
ｎｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＮＭ７Ｑ４１３　ｃｒ）組み
立て 実施例１０　Ｃからの１）　Ｎ　Ａ約２／１ｇおよびＳ
Ｌ＋°ｅｌ）ｔＯ−ｍｙｃｅｓ　ａ＋ｎｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ　（ＮＲＲＬ　Ｎｏ、　２４２０　’）のプロトプ
ラス１−］、Ｘ１０８を用いて、国際公開ＮＯＸ〜′０
７９１０１１６９（国際特許出願歯１’　ＣＩ’　／Ｇ
　Ｉｓ　７　ｇ／　０００９５　’）の実施例２と実質
的に同様にして所望の組み立てを行なう。目的とする形
質転換体を、抗生物質ネオマイシン７約１．ｐｇ／ηｔ
ｅを含有するベネット改良培地に蒔くことにより、ネオ
マイシン耐性について選択する。得られた５ｔｒｅｐｔ
ｏ＋ｎｙｃｅｓａ＋ｎｂｏ（ａｃ　１ｅｎｓ　／　ｌ）
Ｎへ１７０４ＡおよびＳ、　ａ＋ｎ１）ｏ［ａｃｉｅｎ
ｓ／Ｉ）ＮＭ　７０４１３ネオマイシン面４性コロニー
を分１）Ｉｌｔｌ、培養し、次いて常法に従って＋１々
成プラスミドの制限酵素分析およびアガロースゲル′屯
気泳動分オハ（Ｗｅｉｓｌａｎｄｅｒ、１．９７９　”
）により同定を１：ｉなう。この形質転換体は、引き続
きそれぞれのブラスミｌ−“の生産および分離に使用す
る。 ５〈抗生物質ネオマイシンはＳｉｇｍａ　（ＳＬ、　Ｌ
ｏｕｉｓ−へｌ１ｓｓｏｕｒｉ在）より入手できる。 実施例１２　プラスミドｌ）　ＮＭ　７０５ΔおよびＩ
）Ｎへ１７０５Ｂの組み立て　　　　　。 Ａ、プラスミｌＪ）ＮＭ７０２Ａ（７）分割実施例１１
３の分離方法と実質的に同様にして、５ｔｒｅｐｔｏｎ
＋ｙｃｅｓ　　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＮＭ７Ｑ　
２Ａ　　（実施例９で調製、実施例ＩＡと同様にして培
養）から目的プラスミドを分離する。分離したプラスミ
ド１３　ＮＭ　７０２　Ａのｌ）　Ｎ　Ａは、次の制限
酵素消化に伺すため−１’　Ｉ’：緩衝液（ｐＨ８，Ｑ
　、＞に懸濁する。 プラスミドｐ　Ｌ　Ｒ４、Ｂａｍ１ｌＩ制限酵素および
反応ミックスの代わりにプラスミドｐＮＭ７０２への１
”）ＮＡｉ　１ｓｃｌ　ｌ制限酵素および反応ミックス
を使用する以外は、実施例６Ａ４実質的に同様にして、
所望の消化を行なう。消化したＩ）　Ｎ　Ａは、引き続
きプラスミドｐＬＲ１０）〜３．４　ｋｂ　ＢａｍＩＩ
　Ｔ制限フラグメントとのリゲーションに不１すため、
’ｌ’ｌ礼ｉ衝液２０Ｉｌｌに懸濁する。 実施例１ＯＣの教示するところに実質的に従って、Ｂｃ
ｌｌ制限処理プラスミド１）ＮＭ　７０２　Ａの１）Ｎ
Ａ約２０ｐｙおよび〜３．４　ｋｂ　Ｂａｍ　ＩＴ　Ｔ
制限フラグメント（実施例１０Ａで調製）約１Ｏ１ｌ！
７を反応させ一所望のリゲーションを行なう。 挿入された〜３．４　ｋｂ　Ｂａｎ％■１ネオマイシン
耐性（＝ｊ与フラグメントの方向性の結果、２つの方向
性を有する組換えプラスミドが生成する。プラスミドＰ
Ｎｈ’　７０５　Ａとは一耐性伺与フラグメンｉ・のザ
ブ末端Ｊ’Ｓｔｌザイトがブラフ、　ミドｐ’ＮＭ　７
０２　Ａ　ｔ））側面のＳａｃ　ｉサイトの極く近接し
た部位に挿入されて生成した組換えプ？スミドを呼称す
る。プラスミドｐＮｈ４７０５１１．は逆向きの方向性
の組換えプラスミドをさす。さらに、プラスミドｐＮＭ
７０２Ａは、ネオマイシン耐性付Ｉｊ、フラクメントの
挿入に使われるＢＣ１１制限ザイトを２個有するため、
プラスミドｐＮＭ７０５Ａおよびｐ　ＮＭ７０５　Ｂの
それぞれの挿入異性体もまた生成する。各々のプラスミ
ド１）Ｎへ４７０５Ａおよびｌ）ＮＭ　７０”５　Ｂの
制限サイト地図を添伺の第４図に示した。 実施例１３　５ａｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ　ａｎ山ｏｆａ
ｃｉｅｎｓ　／　ｐＮＭ７０５ＡおよびＳ、　ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅ＋ｔｓ　／ｐＮｈｉ７０５３３　（７，）組
み立て 実施例１２Ｃからのｌ）　Ｎ　Ａ約２／７！７および５
Ｌｒｅ−ｐ【ｏｍｙｃｅｓ　　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
　（ＮＲＲｌ、ｆｆ　２４２Ｑ　）　　のプロトプラス
＋−Ｉ　Ｘ　］、　Ｏ’を用いて、国際公開Ｎ０Ｗ（）
７９／’０１１−６９４国際特許出願陽１’　ＣＴ／　
Ｇ　ｌ５７９１０００９５）の実施例２と実質的に同様
にして所望の組み立てを行なう。目的とする形質転換体
を、抗生６物質ヂオストレプトン約５０／７１７／Ｉ・
・ｅＪ６よひ抗生物質ネオマイシン１ｔｔｙ／η１ｅを
含有するベネツト改良培地に蒔くことにより、チオスト
レプトンおよびネオマイシン耐性について選択する。 得られたＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｍｌ＋ｏｆａｃ
ｉｅｎｓ　／′ｐＮＭ７　（］　５Ａ　オヨヒＳ、　ａ
ｍｌ＞ｏｆａｃｉｅｎｓ　／ｌ）ＮＭ　７　Ｑ　５　Ｂ
のヂオス１゛レブトンおよびネオマイシン耐性コロニー
を常法により分離、培養し、次いて構成プラスミドの制
限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分析（Ｗｉｃ
ｓｌａｎｄｅｒ、１９７９）により同定を行なう。この
形質転換体は、引き続きそれぞれのプラスミドの生産お
よび分離に使用する。 実施例１４　プラスミドｐＮＭ７Ｑ３Ａおよびｌ）Ｎへ
１７０３Ｂの組み立て 分割 Ｂａｍ　ＩＩ　ｉ制限酵素および反応ミックスではなく
、１３ｃｌｌ制限酵素および反応ミックスを使用するり
。 外は、実施例８Ａと実質的に同様にして所望の消化を行
なう。目的とする〜　Ｂ　ｋｌ）Ｂｃｌ　Ｉ制限フラグ
メントは、Ｗｅｉｓｌａｎｄｃｒ、１９７９の教示する
ところと実質的に同様に１７でアガロースゲル上気泳動
を用いてＩ）　Ｎ　Ａ懸濁液より常法のごとく分離する
。分離したフラグメントは、引き続きリゲーションに付
すためＪ’　Ｅ　緩衝成約２０／７１！に再ＦＡ　１９
ｊｔする。 Ｉｓ、　　リゲーション ｌ５ｃｌＪで制限処理したプラスミドｐＥＬ７　（７）
　ｌ）　ＮＡ（実施例８ＩＳて調製）約２０７１４７お
よびプラスミドｌ）’　Ｉ−１ζ２の〜、　８ｋｌ）Ｉ
Ｓｃｌ　Ｊ制限フラグメント１ＯＩｌりを一実施例８Ｃ
と実ｒｊ的に同様にしてリゲーションする。 １市人された〜　Ｂ　ｋｂ　Ｂｃｌ　］］チオスＩ−レ
ブトン耐性＝３与フラグメントの方向性の結果、２つの
方向性の組換えプラスミドが生成する。プラスミド瞥）
ＮＭ７０３Ａとは、耐性伺＋ｇ、フラグメントのリーフ
゛末端””’ｌ制限サイトがプラスミドｌ）目、７の側
面のＳａｃ　］ザイＩ・から離れて（極く近接してでは
なく）挿入され、生成した組換えプラスミドを呼称する
。プラスミドｐＮＭ７０３Ｂは逆向き方向の組換えプラ
スミドをさす。このように、最終的なＩ）　Ｎ　Ａ）ヒ
濁液はプラスミドｐＮＭ７０３Ａおよびｐ　ＮＭ　７０
３１１を含有することになる。それぞれのプラスミドｐ
ＮＰｖ１７０３ＡおよびｐＮｈ４７０３　Ｂ　ノ制限サ
イト地図を添付の第４図に示した。 実施例１５　　Ｓｔ＋°ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ　／ｐＮＭ７０３ＡおよびＳ　、　ａ＋
ｎｂｏｆａｃｉｅｎｓ　／ｐＮＭ　７　Ｑ　３　Ｂの糾
み立て 実施例１４で調製した１）ＮＡを使用し、実施例９と実
質的に同様にして所望の形質転換体を組み立てる。得ら
れた５Ｌｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ　ａｍｂｏ［ａｃｉｅ
ｎｓ　／ｐＮＭ７０３ＡおよびＳ、　ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ　／Ｉ）ＮＭ　７０３　Ｂチオストレプトン耐性
コロニーを単離、培養し、常法に従って構成プラスミド
の制限酵素分析およびアガロースゲル電気泳動分析によ
り同定する（Ｗｅ　ｉ　ｓ　Ｉ　ａｎｔｌｃ　ｔ、１．
９７９）。この形質転換培養体は、引き続きそれぞれの
プラスミド′の生産および分離に使用する。 実施例１６　ゲラスミ１臼）ＮＭ７（１６ＡおよびｐＮ
Ｎ＋７０６’　Ｈの組み立て プラスミドｐＮＭ７０４Ａの代わりにプラスミドｐ’Ｎ
Ｍ７０３Ａｆ実施例１５の５ｔｒｅｌ）ｔｏｌｎｙｃｅ
ｓ　ａｌｎｌ）Ｏ−ｆａｃｉｅｎｓ　／ｌ）ＮＭ　７０
３　Ａより分割）を使Ｊｆｌする以外は、実施例１２Ａ
’−Ｃと実質的に同様にして所望の糺み立てを行な為。 挿入されブこ〜３．４　ｋｌ）’　Ｂａｍ冒１１ネオマ
イシン耐性付与フラグメントの方向性の結果７２つの方
向性の組換えプラスミドが生成する。プラスミドＩ）Ｎ
Ｍ７０６　Ａとは、耐性伺１ｊ、フラグメントのザブ末
端１’ＳＬＩ制限・す゛イトがプラスミ１’ｐＮＭ７Ｑ
３Ａの側面ノ５ａ（１リ−イト）極く近接した部位に挿
入されて生成した組％えプラスミドを呼称する。プラス
ミドｌ）　ＮＭ７　Ｑ　６−Ｂは逆向きの方向の組換え
プラスミドをさす。さらに、プラスミド１）　ＮＭ’７
０３　Ａは、ネオマイシン面→性イー１与フラクメント
の挿入に使われる１ｓｃｌｌザイトを２個ｆ１するため
、プラスミドｐＮＭ　７　（１６Ａおよ０、ｌ）　ＮＭ
７０　（ｉ　ｌ’のそれぞれの１１Ｄ人異性体もまた生
成する。プラスミＦｌ）ＮＭ７０６ＡおよびｐＮへ１７
０６Ｂ（Ｄ各々の制限→ノイド地図を添ｆ、１の第５図
に示した。 実施例］　７　　Ｓｔｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓ　ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ／′ｐＮｔｌ＋１７０６ＡおヨヒＳ　、
　ａｍｌ）ｏｆａｃｉｅｎｓ　／１）ＮＭ７０６　Ｂ　
Ｏ）糾み立て 実施例１６からのＩ）　Ｎ　Ａ約２ｐｙを使用し、実施
例１３と実質的に同様にして所望の糺ろ立てを行なう。 得られたＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ　ａｍｌ〕ｏｒａｃ
ｉｅｎｓ　／ｐＮＭ　７０６　ＡおよびＳ　、ａｍｂｏ
ｆａｃ　１ｅｎｓ　／　ｌ）　ＮＭ　７０６Ｂのチオス
トレプトン ニーを常法のことく分離、培養し、構成プラスミＩパの
制限酵素分析とアガロースゲル電気泳動う）析により同
定する（　Ｗｃｉｓｌａｎｄｃ＋、１９７９　）。コノ
形質転換培養体は、引き続き各々のプラスミドの生産お
よび分離に使用する。 実施例１８　プラスミドｐＮＭ７０７ＡおよびＩ）　Ｎ
　Ｍ７　０　７　Ｂの糸■み立て １）ａｖｉｓ　、１１，Ｗ．等、　１９８０、　Ａ　　
Ｍａｎｕａｌ　　ＦｏｒＧｅｎｅｔｉｃ　　　Ｅｎｇｉ
ｎｅｃｒｉｎｇ−　　Ａｃｌｖａｎｃｅｃｌ　　　ＩＳ
ａｃｔｅｒｉａｌＧｃｎｃｔｉｃｓ−　Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ＩＩａｒｂｏ＋１．ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉｌａｒｂｏｒ−　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ在）の教示するところに実質的−に従って
、目的とするｌｉ，ｃｏｌｉ８０３／Ｐ’Ｊ４３（ＡＴ
ＣＣ３９１．５６　）の培養およびこれに続くプラスミ
ｌ’ｐｊ１４３の分離を行なう。 ｐ　ｌ　、ｌ　４　３のＩ）　Ｎ　Ａは常法のことくｌ
Ｅ緩衝液に懸澗した後、保存のため−２　０　”Ｃに冷
却する。 プラスミＦ　ｌ）　ｌ　Ｊ　４　３のＩ）　Ｎ　Ａ約２
０μｇ、反応ミック７、”１０ｐｅ、１′）Ｓ　Ａ　（
　］、　ｍｇ／ｍｅ　’）　１　０　ｌｉｅ−水３９１
１１およびＳａｌ　Ｉ制限酵素１　１Ｈ　（　］、　／
’ｌが約６ＯＮｅＸｖ　、Ｉ’．ｎｇｌａｎｄ　ｌｓｉ
ｏ，　１．ａｄ，　ｊｌ−位を含有するように希釈して
調製する）を、周ｌＪｌｉ　７７、、！　Ｉｉで約６０
分間インキュベートする。４へ１の酢酸アンモニウム同
容ＩＢおよび９５％エタノール２容量を添加した後、混
合物を約１８時間−２０°Ｃに冷却してｌ）　Ｎ　Ａを
沈殿させる。このＩ）　Ｎ　Ａ沈殿を遠心して採取する
。 所望の〜２，Ｂ　ｋｂ　Ｓａｌ　ｌ　　フラグメントを
分離し、常会のアガロースゲル電気泳動（　Ｗｅｉｓｌ
ａ＋ｔｄｃｔ、１９７９）によって取１４する。 ／ｓａｌｌ制限酵素用反応ミックスは以下の成分により
調製した。 １、　５　Ｍ　Ｎａ　Ｃ１ ６Ｑ　ｍ　Ｍ’　）リスＩＩＣｌ（　ｐｉｆ　７．９　
）６　０　＋ｎＭ　　ＭｇＣ／２ ６０ｎ１Ｍ２−メルカプトエタノール ＢｃｌＩリンカ−　の付加は、Ｕｌｌｒｉｃｈ等、１９
７７、５ｃｉｅｎｃｅ　　１９５：１３１３　　（７）
方法と実質的に同様にして行なう。得られたフラグメン
トをＢｃｌ■制限酵素で処理し、所望のＢｃｌＩ粘着末
端を形成さぜる。この〜２，　８　ｋｂ　Ｂｃｌ　１フ
ラグメントを既知の方法に従って分離し、続くリゲーシ
ョンのために保存する。 ×口ｃｌ　ｉ（ｌｄ　（　ＣＧＧＡＴＣＣＧ）’］　お
よびそのイ也のリンカ−は、Ｇｏｌ　Ｉａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｂ　Ｉｎｃ　。 （　１２８　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｓｔｒｅｅｔ、Ｌｅｘ．
ｉ　ｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｌ＋ｕ　−ＳｅｔｔＳ　
０２１７３在）より容易に人手てきる。 Ｂｃｌｌ消化プラスミド１）目７７（実施例８Ｉｓて調
製）約１１ｔ！およびブラスミＦ　Ｉ）　］　、ｊｌ４
３　（７）　〜２，８　ｋｌ）フラグメント（実施例１
８１３およびＣて調製）１１ｉｙを、実施例８Ｃと実質
的に同様にしてリゲーションを行なう。 挿入された〜２，Ｂ　ｋｂ　Ｂｃｌ　Ｉエリスロマイシ
ン耐性付与フラグメント・の方向性の結果−２つの方向
性の絹換えプラスミドが生成する。プラスミドｐＮＮ１
７Ｑ７Ａとは、酬性伺与フラグメン１−のザフ末端１’
ｓｔｌサイトがプラスミドｐ　ｌ’：　Ｉ−、’７の側
面のＳａｃｌサイトの極く近接した部位に挿入されてい
る絹換えプラスミドを呼称する。プラスミｌ；　ｐ　Ｎ
　Ｍ７　０　７　Ｂはその逆向きの配向のプラスミドを
さす。 プラスミドｌ）ＮＭ７０７Ａおよびｐ　ＮＭ　７　Ｑ　
７　１３の各々の制限サ−（　ト地図を添伺の第５図に
示した。 実施例　１　　９　　　　Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓ　
　ａｍｌ）ｏｆａｃｉｅｎｓ　／ｐＮ！ｌ＋ｆ７０７Ａ
およびＳ　、　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ　７　ｐＮＭ７
　０　７　Ｂ　ＯＪ　ＭＩＩみ立て 実施例８ＣからのＩ）　Ｎ　ＡではなくプラスミドｐＮ
Ｍ７０７ＡおよびｐＮＭ７０７Ｂのｌ）　Ｎ　Ａを使用
する以外は、実施例９と実質的に同様にして所望の紹み
立てを行なう。目的とする形質転換体は、倍径皿中の濃
度が５０ｐｇ／ｍｅとなるような十分■のエリスロマイ
シンを含有する１（２培地積層（ｔｏｐ’）寒天を再生
産したプロトプラストに積層することにより、エリスロ
マイシン而４性について選択を？−ｉなう。得られた５
ｔｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ　
／ｐＮＭ７０７ＡおよびＳ　、　ａｍｌ）ｏｒａｃｉｅ
ｎｓ　／ｐＮＭ　７　Ｑ　７１１エリスロマイシン耐性
コロニーを既知の方法で分割、ｄｅｒ−１９７９）によ
り同定する。この形質転換培養体は、続いて各々のプラ
スミ下の生産および分離に使用する。 実施例２０　プラスミドｐＮＭ７ＱｇＡおよびｌ）ＮＭ
７０８　Ｉｓの組み立て リンカ−の付加 ｌｓａｍ　ＩＩ　１消化プラスミド■）旧ミ３２２（実
施例６１３で調製）　ヘ（７）　１３ｃ　Ｉ　］リンカ
−の伺加を、Ｕｌｌｒｉｃｂ等、１９７７．５ｃｉｅｎ
ｃｅ　１９６　：１３１３の教示するところと実質的に
同様にして行なう。得られたフラグメントは１へ（＋１
制限酵素て処世１し、所望の１ｓｃｌ（粘着末端を形成
させる。次いてこのフラグメントを既知の方法によって
分肉１１シ、次工程のリゲーションのために保存する。 Ｉｓ、リゲーション ＢｃｌＩて部分消化したプラスミドｐＮへ１７０２Ａ（
実施例１２Ｂ・て調製）約２０　ｐりおよび３３（ＩＩ
帖層表末端有するプラスミド１）旧（３２２のｌ）　Ｎ
　Ａ　　約１０μｇを、実施例２Ｃと実質的に同様にし
てリゲーションする。得られたＩ）ＮＡを７０％エタノ
ールで２回洗浄し、減圧乾燥し、ｌ’　ｊう緩衝欣に懸
濁する。 挿入されたｐＢＲ３２２フラグメントの方向性の結果、
２つの方向性の紹換えプラスミドが生成す　　　　。 る。プラスミドｐＮＭ７Ｑ３Ａとは、１）１０（３２２
フラグメントのザブ末端１１ｉｎｄ　ＩＩＩＩ限サイト
がプラスミドｌ）　ＮＭ　７０２　への側面のＳａｃ　
ｌサイトに極く近接した部位に挿入された紹換えプラス
ミドを呼称する。ブラスミＦｐＮＭ７０３Ｂは逆向き配
向の釦換えプラスミドをさす。さらに、プラスミドｐＮ
Ｍ７０２Ａは、−１）　ＩＳＲ３２２フラグメジトの挿
入のためのＢｃｌＩ制限サイトを２個有するので、プラ
スミドＩ）ＮＭ７０８ＡおよびＩ）ＮＭ７０８Ｂのそれ
ぞれ挿入異性体もまた生成する。各々のプラスミドＩ）
Ｎ！１１１７０８ＡおよびＰＮＭ７０８Ｂの制限サイト
地図を添右１の第６図に示した。 実施例２１　　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　）ＩＢＩＯＩ／
ｐＮＭ７０８Ａおよび１・５．　ｃｏｌ　ｉ　Ｋｌ　２
１１Ｂ　１０　］／ｐＮＭ７０８　Ｉｓ　　の組み立て プラスミドｐｌ、１（２てはなく、実施例２　Ｑ　、ｌ
Ｓからのプラスミｌ？Ｉ）ＮＡを形質転換に使月１する
以外は、実施例３と実質的に同様にして、所望の糺み立
てを行なう。生き残ったコロニーを、まず選択し、期待
される表現型（１ｕｎｐＲ１’ｌ’ｅｔｓ）についての
試験を行ない、次いで構成プラスミドの制限酵素分析と
アガロースゲル電気泳動分析（Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ、
１９７９）により、所望の１気ｃｏｌｉ　Ｋ３２１１Ｉ
Ｓ１（Ｈ／１）隅１７０８Ａおよびｌ・１．　ｃｏｌ　
ｉ　Ｋ　１２１ＮｓＩ　Ｏ１／　ｐＮＭ７０８　Ｂ形質
転換体であることを常法により同定する。得られた形質
転換培養体は、引き続き各々のプラスミドの生産および
分割に使用する。 実施例２２　５ｔｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ　ａ＋ｎｌ〕
ｏ［ａｃｉｅｎｓ　７ｐＮＭ７０８ＡおよびＳ、ａ＋ｎ
ｂｏｌａｃｉｅｎｓ　／ｐＮＭ７０８１′％　の糸１１
み立て プラスミドｐＮＭ７０２ＡおよびＩ）　ＮＭ　７０２　
Ｂではなく、実施例２０からのｌ）　Ｎ　Ａを形τｉ転
換に使用する以外は、実施例９と実質的に同ｌ；ｉにし
て所望の糾み立てを行なう。１１ｔられた形質転換体は
一前述の実施例９に記載の方法を用いて、チオストレプ
トン られたチオストレプトン ［ａｃｉｅｎｓ　／ｐＮＮイア０８ＡおよびＳ．ａ＋ｎ
ｌｔｏｆａｃｉｅｎｓ　／ｐＮＭ７０８Ｊ３のコロニー
を、既知の方法で分離し。 次いて構成プラスミドの制限酵素分析および′嘔気泳動
分析（　Ｗｅｉｓｌａ＋ｔｄｅｒ−　１９７９　）によ
り、常、法に従って同定する。 既に述べた方法に従って糺み立てることのできる代表的
なプラスミドおよび形質転換体を以下の表１および表２
に挙ける。 表　　２ 代表的な形質転換体 １、　　ＳＬｔｅｌ）Ｌｏｍｙｃｃｓ　Ｒ／Ｒ’　　（
ここでｌくはａ１１市（）−ｆａｃｉｅｎｓ　　−ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ　　、　　ｇｌｏｉ　ｅ　Ｓ　（
ｌ　ｆ　ｕ　Ｓｃ　ｕ　ｓ　　−ｆｒａｄｉａｅ　−１
１ｖｉｔｌａｎｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ　１３２６、ｇ　
ｒ　ａ　＋１１１−１ｏｒｕｌ＋ｅｒ−ｔｅｎｅｌ）ｒ
ａｒｉｕｓまたはｃｉ＋＋ｎａｍｏｎｅｎｓｉｓてあり
、ｋｌは独立してプラスミドｐＮＭ７０２Ａ、ｐＮＭ７
Ｑ２１３、ｐＮＭ７０４Ａ−１）ＮＭ７０４１３−　ｐ
ＮＭ７０５Ａ、１）ＮＭ７９５Ｂ−１）ＮＭ７Ｑ３Ａ、
１）ＮＭ　７０３１３−ｐＮＭ７０６Ａ、Ｉ）　ＮＭ７
０６　”、ｌ）Ｎへ一１７０７Ａ、ＰＮへ１７０７１３
、ｐＮＭ７０８Ａ、ｐＮＭ７０８Ｂ　または表１に挙げ
たプラスミドである） ２、　　Ｅ、　ｃｏｌｉｌ支２／Ｒ３＜ここてｌ吏は１
（１２またはＫ１２１１ＢＩＱｌてあり、ｌζ３は独立
してプラスミドｐＮＮｆ７０８Ａ、Ｉ）ＮＭ７０８Ｂ−
ｐ’ＮＭ７］、３Ａ、ｐＮへ１７１３Ｂ、ｐＮＮ１７１
４　Ａ−ｐＮＭ７　］、　４　、Ｂ、ｐＮＭ７１５Ａ−
ｐＮ八へ７１６Ａ＝　Ｉ）ＮＭ７１５１３またはｌ）　
ＮＭ７１．３　Ａ　　である）

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｌ）目７７の制限→Ｊ−イト地図−
第２図ではプラスミドｌ）　ＬＲ１、ｐＬＲ２およびＰ
Ｉ、ｌζ４の制限サイト地図、第３図はプラスミドｐＮ
Ｍ７０２Ａ、　ｐＮＭ７Ｑ２Ｂ、　ｐＮＭ７Ｑ４Ａおよ
びｌ）　Ｎ　Ｍ７０４１３の制限サイト地図、第４図は
プラスミドｐＮＭ７Ｑ５Ａ−ｐＮＭ７Ｑ５Ｂ、ｌ）ＮＭ
７０３Ａおよび１）　ＮＭ　７　Ｑ　３’Ｂの制限サイ
ト地図、第５図はプラスミドｐＮＭ７Ｑ５Ａ−ｐＮＭ７
０６Ｂ、ＰＮＭ７０７入オヨヒ））ＮＭ７Ｑ７Ｂの制限
サイト地図、第６図はプラスミドｐＮＭ７０８Ａおよび
ｐＮＭ７０８Ｂの制限サイト地図である。 特ｒｉ’ｌ’出願人　イーライ・リリー・アンド・カン
パニー代叩人　　　弁理上　青　１１１　　　葆　　　
外１名ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、４ ２ρＮＵＦＯ５６１−１２，４ｋｂｌ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ ＢＲ３２２ １゜ｐＮＭ７０ＢＡ　（〜１４．６　ｋｂ）２、ｐＮＭ
７０８Ｂ　（〜１４．６　ｋｂ）ブ アメリカ合衆国インディアナ４６ ２５９インデイアナポリス・リト ル・オーク・レイン７４１０番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．８）プラスミドｐＨ−７の機能的レプリコンを含有
   する制限フラグメント、 ＋３）感受性宿主細胞１月こ導入した時、少なくとも１
   つの抗生物質に対する耐性を付与するｌまたはそれ以上
   のＩ）　Ｎ　Ａセグメント、およびＣ）所望ならば、Ｅ
   、　ｃｏｌ　ｉ中で機能的なレプリコン、および形質転
   換、細胞***ならびに培養可能な感受↑ｔｌ　Ｉｃ、　
   ｃｏｌ　ｉ宿主細胞中におりる抗牛物″Ｉｆ　１１１ｉ
   Ｊ性をイ、１ｒｊずルＩ）　Ｎ　Ａ　（グメント、から
   なる、機能的に独立した組換えｌ）　Ｎ　Ａクローニン
   グベクター。 ２、　　ｐＥＩ、７の制限フラグメントが〜６，７３ｋ
   ｂＢｃｌＩ制限フラグメントである一第１項に記載のベ
   クター。 ３、チオストレプトンに対する抗生物質耐性かプラスミ
   ドＩ）　Ｉ−Ｒ２の〜１．６ｋｂ　ｌｓａｍ　ＩＩ　■
   制限フラグメントまたは〜、Ｂｋｂｌλｃｌｌ制限フラ
   クメントによって付ｊゴされる、第１項または第２項の
   し）すれかに記載のベクター。 ４、ネオマイシンに対する抗生物質耐性かプラスミド１
   ？Ｉ−Ｒ１（７）　〜３．４　ｋｂ　ｌｓａｍ　１１１
   制限−ｙ　ラクメントによって付与される、第１項また
   は第２項のいずれかに記載のベクター。 ５、エリスロマイシンに対する抗生物質耐性かフラスミ
   ｌ’ｐｌＪ４３（７）〜２．８　ｋｌ）Ｓａｌ　Ｉ　−
   〜２．７ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ、〜３．　
   □　ｋｌ）Ｉｒｉ　ｎｃｌ　ＩＩＩ、〜２．５ｋｂ　Ｓ
   ａｌ　ｌ、　−Ｂａｍ　ｌｊｌ、〜２．８　ｋｂ　Ｘｈ
   ｏ　ｆ　−ＩｓＩ＜ｌ　ＩＦ、または〜４．１　ｋｂ　
   ＥｃｏＲｌ−１ｓａ＋ｔ＋　ＩＩ　１制限フラグメント
   にＪ二ってイ、ｊｌｊさ１］る、第１Ｊ直まブこは第２
   １０のいずれかに記載のベクター。 ５、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ中で機能的なレプリコンおよ、
   ひ１らｃｏｔ　ｉ　　中で抗生物質耐性をイ；１ｔ１．
   するＩ）　Ｎ　Ａセグメントが、プラスミドｐ１３Ｒ３
   ２２、ｐｌｓＲ３２４、ｐＢＲ３２５またはｐＢＲ３２
   ８の制限フラグメントからなる、第１項〜第５項のいず
   れかに記載の−くり、クー。 ７、　プラスミドｐＮＭ７０２Ａ−１）Ｎへ１７０２Ｂ
   、ｐＮＭ７Ｑ３Ａ〜Ｐ　ＮＭ７０３　Ｂ、Ｉ）ＮＭ７０
   ４Ａ、Ｉ）Ｎへ１７（１４ＩＳ−ｐＮＭ７０５Ａ−ｐＮ
   Ｍ７０５Ｂ　、　　ＰＮλ１７（Ｎ３Ａ−ｐＮＬ・１７
   ０６　Ｂ、ｐＮＭ７Ｑ７Ａ−ｐＮＭ７０７１ｓ、１）Ｎ
   Ｍ７０８Ａ−１）Ｎ〜１７０８１Ｓ−’ｐＮＭ７０９Ａ
   −ｐＮＭ７Ｑ９Ｂ、ｐＮＭ７１ＱＡ、　ｐＮＭ７１０Ｂ
   −ＰＮ１１１４７１１Ａ−ｐＮＭ７１１１ｓ、ｐＮＮ４
   ７１２八、ｐＮＭ７１２Ｂ−１）ＮＭ７１３Ａ−ｐＮＭ
   ７１３Ｂ、ｐＮ１１７１４Ａ−ｐＮＭ７１４１Ｓ、ｐＮ
   Ｍ７１５Ａ−ｐＮＭ７１６ノ〜、ｐＮＭ７１７Ａ−１）
   ＮＭ７１８Ａ−Ｐ　ＮＭ７１９Ａ−１）Ｎへ４７１　ｇ
   ｌＳ−ｐＮＭ７２０ＡまたはｐＮＭ７２０１ｓ　　の名
   称を有する第１項〜第６項のいずれかに記載のベクター
   〇 ８　第１項〜第７項のいずれかに記載の糺換え１）　Ｎ
   　Ａクローニングベクターを含有する形τ１転換宿主細
   胞。 ９、　　Ｓ　Ｌ　ｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｃｓである第８項
   に記載の宿主刺１目１包。 １０、　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ａｍｂｏ、ｆ
   ａｃｉｅｎｓ、ａｕｒｅｏｒａｃｉｅｎｓ−ｇｒｉｓｅ
   ｏｆｕｓｃｕｓ−ｆｒａｄｊａｅ−１ｉｖｉｄａｒｓｓ
   −ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒ−ｔｅｎｃｌ＋Ｈａｒｉｕ
   ｓまたはｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ　である第９項に
   記載の宿主細胞。 ｌ　１．　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎ市ｏｆａ
   ｃｉｅｎｓである第１０項に記載の宿主細胞。 １２、第６項に記載のベクターを含有するＥ、ｃｏｌｉ
   である第８項に記載の宿主細胞。 １３、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２１１ＢＩＯＩ／ｌ）ＮＭ
   ７０８Ａ、１）　ＮＭ　７１．３　ＡまたはｐＮＭ７１
   ７Ａである第１２項に記載の宿主細胞。 １４、プラスミド１）ＥＬ７の６．７８ｋｂ　１３ｃｌ
   　Ｉ制限フラグメント。 １５．２）プラスミドｌ）Ｆ、Ｌ７の機能的レプリコン
   を含有する制限フラグメントを、 １〕）感受性宿主細胞中に智入した時、少なくとも１つ
   の抗生物質に対する耐性をｉｔ　！：する１またはそれ
   以上のｌ）　Ｎ　Ａセグメントおよび一〇所望ならば、
   Ｅ、　ｃｏｌｉ中で機１１に的なレプリコン、および形
   質転換、細胞***ｌ、ｉらびに培養ｉ■能な感受性Ｅ、
   ｃｏｌｉ宿主細胞中における抗生物質耐性を伺与するＩ
   ）　Ｎ　Ａセグメントとを含む制限フラグメントに、 リゲーションすることからなる、機能的に独立した糺換
   えＩ）　Ｎ　Ａクローニングベクターの調製方法。 １６、　１１目、７の制限フラグメントが〜・６．７８
   １′ｊｃ１１制限フラグメントである第１５項に記載の
   方法。 １７１・１．ｃｏｌｉ　ｌ＋Ｃ機能的なレブリ＝１ンお
   ｊ；０：　＋゛・。 ｃｏｌｉ　　中において抗生物質耐性を（；ＪＩ−ｊ、
   するｌ）　Ｎ　Ａセグメントが、プラスミド１）　Ｂ　
   Ｒ３２２、ｐ　Ｂ　、ｌＬ　３２４．１）旧（３２５ま
   たは１）旧（３２８の制限フラグメントからなる、第１
   ６項に記載の方法。 １８　　プラスミドＩ）　ＬＲ２の〜１．６ｋｌ）出則
   １ｊ　１制限フラクメントをプラスミドｌ）　ＥＬ　７
   の〜（５，７１３ｋｌＪｌｓｃｌｌＩ制限フラグメント
   にリゲーションすることからなる、第１５項または第１
   ６項のいずれかに記載のプラスミドｐＮＭ７０２Ａおよ
   びｌ）Ｎへ１７０２１Ｓを調製する方法。 １９、プラスミドＩ）Ｉ、Ｒ１の〜３．４　ｋｌ）Ｂａ
   ｒｎ　１１　］　制制限フラグメントをプラスミド１）
   １佳７０）〜・ｆｉ、７８ｋｌ）Ｂｃｊ［制限フラグメ
   ントにリゲーションすることからなる、第１５項または
   第１６項のいずれかに記載のプラスミドｐＮＭ７Ｑ４Ａ
   およびｐＮＭ７０４Ｂを調製する方法。 ２０、ブラスミ１−Ｊ）Ｎへ１７０２／〜のｌ５ｃｌｒ
   部分消化物ヲフラスミト１）目’−１（７）　〜３．４
   　ｋｌ＞　Ｊ３ａｍ　Ｉｆ　、Ｔ　制限フラグメントに
   リゲーションずろことからなる一第１５項または第１６
   粕のいＪ”Ｊ＋かに記・１・ν１のノ′ラスミドｌ’　
   ＮＶ’ｌ　７０５　Ａおよび１１Ｎ八’７０５１Ｓなら
   ひにそれらの挿入異性体を調製する方法。 ２１、プラスミド１ｕｌｌζ２の〜０．８ｋｌ）Ｂｃｌ
   　１制限フラクメントをブラスミｌＪ＋Ｉ”、１．７の
   〜６．７８ｋｌ）ＩＳｃｌＪ制限フラクメントにリケー
   ションすることからなる、第１５頃または第１６項のい
   ずれかに；７己載のプラスミド を調製する方法。 ２２、プラスミドｐ　ＮＭ７　０　３　ＡのＩｔｃｌＪ
   部分消化１１，′″りをプラスミドｐ１．Ｒ］の〜３．
   　４　ｋ．ｂ　ＩＬａ＋ｎ　Ｉｔ　ｌ　ｉｌｉｌｌ　ｌ
   ’１．！フラグメントにリケーションすることからなる
   １、第１５項または第］．　（ｉ　Ｊｒ！のいずれかに
   記Ｉ代のプラスミドｌ）　ＮＭ　７　（１　６八および
   ｐＮＮ＋７　０６Ｂ　ｆλらＯにそわ、らの挿入異性体
   を調製する力′７１′．。 ２３、　　Ｂｃｌ　ｉ粘着末端を有するブラスミｌ’　
   ＋１　１　、＋　４　３の〜２．　８　ｋｌｔ　Ｓａｌ
   　ｌ制限フラグメントをプラスミトｐｌら１−７の〜６
   ．７　Ｂ　ｋｂ　Ｂｃｌ　、Ｉ制限フラグメントにリゲ
   ーションすることからなる、第１５または第１６項のい
   ずれかに記載のプラスミドｐＮλｆ７０７Ａ　　および
   ｌ）　ＮＭ　７　Ｑ　７１３　を調製する方法。 ２４、　　Ｂｃｌ　ｌ粘着末端を有するプラスミド））
   　Ｂ　Ｒ３２２のレプリコン含有Ｂａ＋ｎ　ＩＩ　■制
   限フラグメントをプラスミドｐＮＭ７０２ＡのＢｃｌＩ
   部分消化物にリゲーションすることからなる、第１７項
   に記載のプラスミドＰＮＭ７０８ＡおよびＰＮＭ７０８
   Ｂならびにそれらの挿入異性体を調製する方法。