JPS5982095A - ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト白血球あるいはヒト白球系細胞から非特異
的ウィルス抑制物質であるγ型インターフェロンを安価
に、収率良くしかも高純度で製造する方法に関する。更
に詳細には１本発明はヒト白血球あるいはヒトＴ細胞か
らヒトｒ型インターフェロンを製造するに際し、培地と
して無ｎｏ消培地を用い、かつ複数のインターフェロン
誘導物質を併用することにより高単位のγ型インターフ
ェロンを培養誘導し、得られた粗ｒ型インターフェロン
液から目的物を分離・精製することにより筒状率・高純
度かつ工業的規模で容易にｒ型インターフェロンを製造
する方法を提供するものである。

現在、α型、β型、γ型の６柿が知られているインター
フェロンは分子量・等電点その他物理化学的性質におい
てそれぞれ異った物質であるが。

いずれも非特異的に各秒ウィルスの細胞内増殖を抑制す
る共通の性質ン持っている。γ型インターフェロンは核
酸やウィルス等で誘発されたα型や（２） β型と異った物質であり、それぞれ特異中和抗体や酸性
ｐＨでの安定性、熱耐性、ＳＤＳ耐性等により区別され
る。γ型インターフェロンは免疫インターフェロンとも
称され、主として胸腺由来のリンパ球が生産する非特異
的ウィルス抑制活性を持つ物質であり、ワクチンやツベ
ルクリン等抗原による二次感作、植物由来のレクチン類
、ある棟の細菌あるいは毒素、カルシウムイオンフォア
。

抗リンパ球抗体等により誘導される蛋白様物質の総称で
ある。γ型インターフェロンはα型やβ型と比べ細胞抑
制活性や免疫調節活性が強く、モデル動物のガン疾患モ
デルにおいてα型やβ型よりも強いガンの成長抑制が入
られ、更にα型やβ型とｒ型と併用する事により相乗的
な制ガン作用が見られる。この様にγ型インターフェロ
ンは極めて微量で高い活性を持った物質であるが、いま
だ医桑として各種疾患に応用されるには至っていない。

ソノ最大の理由としてはγ型インターフェロンが、α型
やβ型に比べて更に種特異性が筒いうえ（３） に安定性が低く、極めてｅ量しか得られｔｃい事が挙げ
られろ。すなわち、ヒトの各種ウィルス性疾患や癌の治
療に用いようとするインターフェロンはヒトの細胞がら
誘発されたものでなければ効果がブエい。ヒトのγ型イ
ンターフェロン乞産生させ得る＃ｌ　ＩＪｉｌ！とじて
はヒト白捕球、ヒトＴリンパ球。

ヒトＴリンパ芽球・ヒト牌１ｉ＝Ｗ　＆ＪＵ胞が知られ
ているが、これらのうち工業的規模において効率良くγ
型インターフェロンを産生させ得る細胞は現在の所ヒト
末梢血由来の白捕球しか知られていない。

ｒＢρインターフェロンは糖蛋白と考えられていて。

微生物乞用いた組換えＤＮＡ法では天然と同一の糖蛋白
の製造は現在では不可能である。

ヒト白佃球から粗ｙｒ型インターフェロン液を製造する
方法は、　）（、Ａ、Ｊｏｈｎｓｏｎ　（ＩＲＣ３Ｍｅ
ｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ　　７　５５９（１９７９）
　）　　、　　Ｍａｒｃｄｅｌｅｙ　ら（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｌｍｎａｕｎｏｌ　、　１０８７１　８８３（１９
８０）　）およびＹ、に、ＹＩＰら（Ｐｒｏｃ、Ｎ、Ａ
、Ｓ、　７８Ｌｄ　１６０１−１６１Ｊ５（１９８１）
）等により報告されている。これらの方法は、ヒト末梢
血バフィーコートより済皿ある（４） いはフィコールを用いた比重遠心により、リンパ球やマ
クロファージを含む単核球を精製し、ヒト血漿あるいは
血清を５〜１０チ添加したＲＰＭＬ１６４０培地等に１
０６〜１０７細胞／ｍ７！に浮遊した後、それぞれの研
究グループ独自のγ型インターフェロン・インデューサ
ー（例たば、血球凝集素、スタフィロコッカス・エンテ
ロトキシンＡまたはＢ。

抗リンパ球抗体等）を加え３７　Ｃで１〜４日間培養し
た後、培養戸液乞遠心分離して粗γ型インターフェロン
溶液乞得ている。この粗溶液中には誘発物質として加え
た異種蛋白や毒素・多くの血清蛋白が混在しているため
、これを人体に投与するには充分に精製する必要がある
。

柑γ型インターフェロン液からγ型インターフェロン乞
抽出する従来の方法は、コントロールトポアグラスある
いはシリカゲルｆｒ型インターフェロンケ吸着させ、エ
チレングリコールン含むリン酸バッファーで溶出し、コ
ンカナバリンＡ・セファローズによるアフィニティー・
クロマトグラフィー、更に、ゲルパーミェーションによ
る分子（５） 量分画法等により約１０〜１０単位／〜蛋白稈度の部分
精製標品を得る方法であるっγ型インターフェロン１（
は現在定められた検定法も国際標準品もなく、研究者に
よって様々であるが１便宜的に国際標準があるα型イン
ターフェロンの検定法ン準用する例が多いつ 従来、ヒト白血球あるいはヒ）　Ｔ　ＩＪンバ球細胞株
の培養液として得られる粗ｒ型インターフェロン液中の
γ型インターフェロンは歇的に非常に少なく、培地に添
加した血清由来の蛋白が大部分であるといえるので、γ
型インターフェロンのみを培養ろ液中から補集する事は
はなはだ困難である。

ヒトα型インターフェロンに比べ酸性領域における安定
性、熱安定性、凍結融解に対する耐性が劣る事はγ型イ
ンターフェロンの精製を更に困難にしていて１人体に投
与可能な程度に精製するには多大な労力７要する。これ
らの困難を克服するために、リンパ球の培養終Ｔ時のγ
型インターフェロンの力価を萬力価にする誘導培養法を
用い、且つｒ型インターフェロン以外の夾雑物を棲力含
ま（６） ない粗γインターフェロン溶液を得ろこと、および簡単
かつ高収率で精製を行う事が望まれている。

このような問題点の解決のため本発明ではリンパ球の培
養に通常添加される５〜１５％のヒトあるいは動物血清
を用いず、第１表に示す様な、限られた量のヒト血清ア
ルブミンのみヲ蛋白成分として含有する無血清培地を用
いる事により、ｍ清添加培地と同等又はそれ以上のγ型
インターフェロンを誘導させる事に成功した。さらにγ
型インターフェロンの各種インテユーサーの中でと（に
スタフィロコッカス−エンテロトキシンＢと０Ｋ４６２
との併用により、それぞれの岸独の使用では得られない
高力価のγ型インターフェロンが誘導され併用による顕
著な相乗効果が認められた。

更に、無ＩＩＩＩ清培地に血液蛋白成分の１つであるト
ランスフェリン（ジデロフィリン）２適当量添加するこ
とにより、より高力価のγ型インターフェロン活性を得
ろことができる（表３参照）。尚。

トランスフェリン羊独ではγ型、インターフェロンを誘
導しない。つまり、この場合、トランスフェ（７） リンはγ型インターフェロン誘導に補助的に働いて〜・
ろと考えられろ。

提供されるリンパ球からのγ型インターフェロンの誘動
能には個人差が存在するが、上記相乗効果はとくに低力
価生産者に顕著に現われ、＊市なヒト白血球乞有効に利
用でｔろ。

発明者らは無血ｍ培地の使用と初数のインターフェロン
誘導剤の使用の絹合せにより、夾雑物の少ない高力価の
粗インターフェロン溶液Ｚ得ろ事に成功し本発明火完成
した。本発明方法によれば精製工程が著しく単純化され
、容易に且つ短期間に公ン縮された純度１００／ｍｇ蛋
臼以上（α型インターフェロンの国際単位に換算した）
のｒ型インターフェロン乞収率８０％以上で得ろ事がで
きる。

さらに本発明者は二Ｓ類のアフイニテイ力ラムクロマト
グラフイー、すなわちチバクロンブルーを結合した担体
及びコンカナバリンＡ′（！１′結合した担体を用い、
上記無血清培地ン用いて＠養誘導して得た粗γ型インタ
ーフェロン液に廟効、高収率。

連球に分画精製できろ事を見出した。

（８） 図１の精製分画のフローシートに示す様にインターフェ
ロンは４分画され、各々’ｉＡ　、　Ｂ　、　Ｃおよび
Ｄ画分と称する。全両分を合計した全活性の回収率は８
０％以上である。このうちわけはチバクロンブルー系の
カラムでの全活性の回収率が８゜係以上であり、コンカ
ナバリンＡセファローズカラムの回収率がほぼ１００チ
である。

本発明で使用できる精製分画法の詳＃ｌを以下に説明す
る（図３および図４参照）。

粗γ型インターフェロンをマトリックスブルーＡ・アガ
ロース（アミコン社）あるいはブルーセファローズ０Ｌ
−６Ｂ（ファルマシア社）に通スと、インターフェロン
活性は非吸着画分と吸着画分とに分画され、いずれの両
分もγ型の件質乞示し１両者を合した活性の全回収率は
８０％以上である。平均して、非吸着画分（ＭＢｉ）の
粗抽出液の活性に対する収率は約１６係、吸着画分（Ｍ
Ｂ　ＩＩ　）は約６４チである。吸着画分（ＭＢＩＩ）
を浴出し、更にコンカナバリンＡ・セファローズ４Ｂ（
ファルマシア社）のアフィニティーカラムク（９） ロマトグラフイー乞行うと、インターフェロン活性は非
吸着画分と吸着画分とに部分されろ。両両分？合した活
性のＭ　Ｂ　ｌｌ活性に対する回収率はほぼ１００幅で
ある。コンカナバリンＡ・セファローズ４Ｂ非吸着画分
（画分Ｃ）の活性は粗抽出液活性に対して約２．３係で
ある。一方、吸着部発火溶出して得ろ画分りのｒ型イン
ターフェロン活性は粗抽出液活性に対して約６１．７　
％である。溶出後カラム７更に溶出液を変えて溶出を行
ったがインターフェロン活性は溶出されず、β型インタ
ーフェロンは含有されていないと結論される。また。

培地に添加されたヒト血清アルブミンはこの段階で完全
に除去されている。

ブルーセファローズまたはマトリックスブルーＡ・カラ
ムの非吸着画分（ＭＢりに含まれるγ型インターフェロ
ンもコンカナバリンＡ・セファローズカラムにより非吸
着部分と吸着部分とに分画され、非吸着画分（画分Ａ）
の活性は粗抽出液活性に対し１約６％である。吸着され
た画分Ｂは溶出され５画分Ｂ活性の粗抽出液活性に占め
る割（１０） 合は約１６係であり、γ型インターフェロン特異抗体に
より中和されろ。

本発明の分画・精製のためのクロマトグラフィーに使用
できる具体的溶出液は、以下の実施例に記載するが５本
発明の目的ケ達成できる範囲内で適宜変更することがで
きる。

γ型インターフェロンのウルトロゲ）ＬｌＡＣＡ５４（
ＬＫＢ社）による、ＭＢＩ画分およびＭＢ［画分のゲル
パーミェーションクロマトグラフィーにより１分子量は
いずれも約４３．０００ダルトンと推定された。主画分
Ｄ（ＭＢＩ−ＣｏｎＡｌｌ）のγ型インターフェロンの
比活性は２８［ｌｌｎｍ１単位の吸光度が蛋白水溶液０
．７ｍｑ／ｍｌと仮定して１０６Ｖ９蛋白以上であった
。尚、精製前の抽出液の比活性はおよそ３Ｘ１０　Ｕ／
〜蛋白であった。

本発明の精製工程を血清添加培地で培養した例に適用す
ると比活性の上昇は容易に見られず、逆に低下する例も
数多く見られた。このことから。

ここで説明した精製工程は本発明の無血清培地の使用で
得た粗γ型インターフェロン溶液の製梢に（１１） 特異的に有効でル）ると言えるっ 一方、血清アルブミンに親和性２欠くレマゾール・ブル
ーセファローズ力ラムヶ用い４）と、上記粗インターフ
ェロン＃液から一段階で比活伯−が１０”　Ｕ　／　ｍ
ｙ　蛋白９上の高純度γ型インターフェロンが一段階で
精製できる（図５参照）。この操作はカラム法、バッチ
法のいずれでもｉｉＪ能であり。

工業的規模の操作にも適している。

更に別の精製法として１等１＄点の差による分画法であ
るクロマトフオーカシングカラムによる分画では、粗イ
ンターフェロン液から一段階で少くともＡａのγ型イン
ターフェロンを分取できる（図６参照）。

後に述べた２つの分画法は単独で、またはＭｉ＋に述べ
た１裏方法と組合せて操作することもできろう本発明の
方法７９下の実施例により更に詳細に説明する。

実施例１：無血消垢地を用いての仮数の肪導剤併用によ
るγ型インターフェロンがシ専の（］２） 新鮮なヒトの個人別のバフィーコートに等量のハンクス
氏平衡塩溶液乞混合し、バフィーコートと等量のフィコ
ール−パンク溶液（ファルマシア社）に重層した。１９
Ｃにて２，０００ｒｐｍ　２０分遠心し、リンノ、（ｇ
ａｉｎ集めた。ＰＢＳ（−）　　で２回培地で１回洗浄
したリンパ球を培地に５Ｘ１０／ｄに浮遊させ、スタフ
ィロコッカス書エンテロトキシンＢ及び０Ｋ４３２（ビ
シバニール）をそれぞｆｔ最終濃度５０　ｎ’！’／ｒ
ｒｔｌ　、　０．０２５ＫＥ／ｍ？ｅイｙターフエロン
・インデューサーとして添加した。無血清培地の組成は
表１に示した。４２時間６７Ｃ５％　ＣＯ□存在下で培
養し、培養上清’２１．５　Ｑ　Ｏｒ、ｐ、ｒｎ。

５分の遠心分離により得た。上清中のインターフェロン
の力価は、ヒトＦＬ細胞のシンドビスウイルスの細胞障
害阻止′ＰＩ：５０％にするサンプルの希釈数ケもって
表示する。上記のようにして得られた粗インターフェロ
ン溶液の力価は最高１．６×ｉ　０　’　Ｕ／　ｔｎｌ
　Ｙ　越エフ’ｊ。

この検定法の感度は、α型インターフェロン１国際単位
が７〜２４単位を示す。ｒ型インターフ（１３） 二ロンについては国際漂準及び共通の検定系がないので
、慣行に従ってα型インターフェロンを標率とした。Ｆ
Ｌ細胞とシンドビスウイルスの組合せは）］、Ａ、Ｊｏ
ｈｎｓｏｎらかＷＩＳ）ｉ細胞と７７ドビスウイルスの
組合せに比べ約１０倍の感度な示したつ無血清培地につ
いてスタフィロコッカス・エンテロトキシンＢとＯＫ４
ろ２とのインターフェロン力価に対する濃度依存性２表
２および図２に示す。

表２および図２に見られろ様に用いた二種のインデュー
サーはインターフェロンの誘導に対し相乗的に働く。相
乗効果はとくにインターフェロン誘導能の低い検体につ
いて明瞭にみもれた。誘導能の高い検体では単独のイン
デューサーでも充分高いインターフェロン力価乞示した
。０Ｋ４３２とスタフィロコッカス廖エンテロトキンン
併用例は同一個体についての比較でも、単独使用例より
も篩力価のインターフェロンか訪専された。誘導された
インターフェロン活性ＹｐＨ２，０で１７時間処理する
とインターフェロンの残存油性は殆んど消滅し、またγ
型インターフェロン特異中和抗体で（１４） 殆んど中和される事から、誘導されたインターフェロン
はγ型であることが確認された。

ＲＰＭＩ−１６４０（日永製薬Ｇｌ巾製）　　　　　　
　９６ｍｌ必須アミノ酸混合液（×５０）　　　　　　
２ｍｌ非必須アミノ酸混合液（’Ｘ１００）　　　　１
ｍｉヒト血清アルブミン　　　　　　　：６５０ｍ９Ｈ
ＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　１０ｎＭ７％重
炭酸ソーダ　　　　　　　　　　２ｍｌ。

表２．スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ（ｓＥ
Ｂ）と０Ｋ４３２　によるｒ型インターフェロンの（１
５） また、上記無血清培地にトランスフェリンを添加するこ
とによりインターフェロン活性の上昇が入られた。適当
量のトランスフェリンを添加した上記無血清培地ア用い
、＃終儂１！［でスタフィロコッカス・エンテロトキシ
ンＢ（ＳＩＥＢ）’＆’５０ｎＶｒｒｔ１．０Ｋ４３２
ｖ０．０２５ＫＥ／ｍｌ”Ｑ、　上述の手順に従いｒ型
インターフェロンを誘導（７た。結果を表３に示すっ表
３から明らかな如＜、トランスフェリ７　”；ｓ：　１
　ｍｌ当り５　ｐＦｊ　、　１０．ｔｔＰ　加エタ時、
　ｉ加してない場合に比べ約４倍の活性の上昇が入られ
た。

尚、トランスフェリン’Ｙ１０μ’／−／ｍｌ添加１〜
た無ＩｆＩｌｆｆ培地で上記２つの誘導剤を用いずにヒ
トリンパ球を前述と同条件で培養した場合には、インタ
ーフェロン活性は認められなかった。

また、以下に述べろヒトΦγ型インターフェロンの分離
・精製には、トランスフェリン添加による影響は入られ
なかった。すなわち、トランスフェリンは以下の精製過
程において、血清アルブミンと同様′Ｉ′、ｒ挙動を示
したっ″ （１６） 表６．トランフェリン添加によるγ型インターフトラン
スフェリン添加量　　インターフェロン活性（μｖ／ｍ
ｌ）　　　　　　　　（ｕ７ｙ）０　　　　　　　　　
　　７、２８１ ０・５　　　　　　　　　　７．２８１１・０　　　　
　　　　　　７．２８１５．０　　　　　　　　　２９
，１２７１０．０　　　　　　　　　２９，１２７＊　
スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ５０　ｎｆｔ
／ｍｌ　＋　０Ｋ４３２　（ヒシハ＝　−ｖ　）０．０
２５Ｋｇ／ａでγ型インターフェロン乞誘導した。

実施例２：マトリックスブルーＡ・カラムおよびＧ　ｏ
ｎ　Ａセファローズカラムによる精製（そのＩ） 実施例１で得た培養上清を粗γ型インターフェロン溶液
として精製する。粗γ型インターフ二口（Ｉ７） ン浴液１０ｄをＰＢＳ（−１で平衡化したマトリックス
ブル−Ａ・カラム（的イ羊土５ｔＭＴ、高さ６　ｃｍ　
）に加えたつ通過画分（ＭＢＩ）もγ型インターフェロ
ンを含Ｗｊる為４Ｃに保存して更に精製したっ７トリソ
クスブルー吸＞？’ｒ　ＩＩ！１１分（Ｍ　Ｂ　ＩＩ　
）は１．５Ｍ１ｉａＣ６を含有するＰ　Ｂ　Ｓ　（−）
にて脱着する事によって得られた。５０％エチレングリ
コール及び１、５　Ｍ　Ｎａ　Ｃ１ｙｆ５加してＰ　Ｂ
　Ｓ　（−）による溶出画分にはインターフェロン活性
は全く回収されス、マトリックスブルーＡ−カラムクロ
マトグラフィーによるＭＢＩとＭＢＩＩの回収率は合計
８０係以上であったつＭＢＩ及びＭＢｌｌＹｐＨ２，Ｏ
に−＆透析すると活性は回収されない事から、この両両
分の含有するインターフェロンはγ型か大部分と思われ
る（図６参照）。同様な結果はファルマシア社製ブルー
セファローズＣＬ−６Ｂについても得られた。

Ｍ’ＢＩＩをＰＢＳ（−１に透析後、）’ＢＳ（→で平
衡化したＧｏｎ　Ａ　ｅセファローズカラム（１，５Ｘ
５ｔ−ｒｎ）を通過させた（図４参照）。通過画分（画
分Ｃ：（１８） ＭＢ　［−ＣｏｎＡ　Ｉ　）には回収された粗抽出液活
性に対して２．６チでγ型インターフェロン活性ケ含有
した。吸着両分にもインターフェロン活性が含まれて、
ｔにす、０．１Ｍのα−メチルマンノシド乞金含有るＰ
　Ｂ　Ｓ　（−）により溶出された（画分Ｄ：ＭＢ１−
ＣｏｎＡ　ｌｌ　）。画分りの粗抽出液活性に対する回
収率は６１．７％であり、ｐＨ２，０処理及び抗γ型イ
ンターフェロン抗体による中和試験よりγ型である事が
確認された。

実施例３：マトリックスブルーＡおよびＣｏｎＡセファ
ローズガラムによろ１Ｆｉ３インター粗インターフエロ
ン液１ｔｖＰＢＳ（−）で平向化したマトリックスブル
ー１ｏｏｙに４Ｃで混合し。

４時間放置後カラムに充填し、ＰＢＳ（−）でよく洗滌
後、吸着画分Ｙ　１．０　Ｍ　５ａＧＩ　Ｙ含むＰＢＳ
（−１溶液で溶出した。非吸着画分（ＭＢＩ：２ｔ）は
そのま〜、吸着画分（ＭＢＩＩ：１．２／＝）は水にて
９倍に希釈し、ＰＢＳ（−）で平向化したコンカナバリ
ンＡ・セファロース４Ｂ（非吸着画分は２００ｍ１゜（
１９） 吸着画分は２５０ｍ１りと混合し、４ｔ？で４時間放置
後カラムに充填しＰ　Ｂ　Ｓ　（−）で充分に洗浄した
。

吸着画分の溶出は０．１Ｍα−７テルマンノシド乞含む
ＰＢＳ（−１４７で行った。

かくして、Ｍ　Ｂ　ｌ　−Ｇｏｎ　Ａ　ｌ１画分および
Ｍ　Ｂ　ｌｌ−ＣｏｎＡ１両分に、　　１０６Ｕ／ｍ９
　蛋白シ上のγ型インターフェロン活性ケ有するか液を
６６６０口ｍｌ。

７５０ｒｄ　ラピイ尋たっ 両方の両分７ｊ合わせたインターフェロン活性の回収単
に７５％以上であった。

実施例４：クロマトフオーカシング法によるγファルマ
シア社製ポリバッファーＴＭ９６およびリハソファー交
換体ＰＢＳ　ＴＭ９４’＆用いたクロマトツメ−力ツシ
ング・ツノラムクロマトグラフィーをγ型インターフェ
ロンの分画・精製に適用した。

粗インターフェロン６に’ＩＯｍｅをｐ　［−］　Ｂ、
　６に透Ｖ］平償１化したもの’（＜ＰＢＥＴＭ９４カ
ラム（１，５ｃｍＸ１２ｍ）に加え、ｐＨ６，０のポリ
バッファー（２０） ２５０ｍｌにて液出した。

図１１０に４３２．！：スタフイロコツカスエンテロト
キシンＢ（ＳＥＢと称す）の同時添加により誘導された
粗インターフェロン溶液のクロマトフオーカシング法に
よる分離パターンを示す。図のようにインターフェロン
活性は、ｐＨ９からｐ）１６の勾配では３つの両分に両
分され、それらの′Ｊ電点ｐＩは各々８．５．８．０，
７．８（各々ＣＰ−１゜ｃ　ｐ　−１１・ＣＰ−１と称
す）であった。また分画Ｐｒ後更に１．５　Ｍ　ＮａＣ
６で溶出される両分（画分Ｓ）にもインターフェロン活
性が見いだされ、この画分Ｓはさらに低い領域のｐＨ勾
配で等電点６、：２（ＣＰＩ及び等電点５．２（ＣＰＶ
）にインターフェロン活性ビークｌｆ　Ｊえた。

コレらの分画は抗ヒトγ−インターフェロン抗体ですべ
て中和された。各分画の分子量をウルトロアゲルＡｃＡ
３４（ＬＫＢ社）によるゲルパーミェーションクロマト
グラフィー（ｏ、５ｘ　５０ｃｔｎ）により推定すると
、ＣＰ−ｌ　、　ＣＰ−１１、ＣＰ　−皇及びＣＰ■は
分子量約４３，０００ダルトンに相当（２Ｉ） する単一ピークを示すのに対し、ＣＰ−Ｖは３０．００
０〜４０．０００ダルトンの範囲に液出された。

実施例５：レマゾールブルーカラムによるｒ型インター
フェロンの精製（図５参照） 実施例１で示した粗インターフェロン溶液５ｍ１ｉ、Ｐ
ＢＳ（−）で充分平衡化したレマゾールブルーカラム（
Ｉ　ＩＭＸ　９　ｃｍ　）に通した。ａインターフェロ
ン活性の５０％と蛋白の殆んどは通過画分（Ｒ−１）に
得られたか、実施例６に示すようにこの両分は実施例２
の如くしてさらに精製に用いることができる。吸着画分
（Ｒ−１）は１．５　Ｍ　ＮａＧｔを含むＰＢＳ←）＃
液で溶出され、この一段階操作で収率５０％、比活性が
１０５Ｕ／〜蛋白以上のｒ型インターフェロンを得た。

この両分は他のブルーセファローズ吸着画分と異なり培
地に添加した血清アルブミン蛋白を含有しない特徴を持
っていた。

実施例６：実施例５で示したレマゾールブルー力（２２
） 実施例５で得られろレマゾールブルーカラム非吸着画分
（Ｒｌ　）　９．５ｍ１ｋ、実施例２（および６）で示
したマトリックスブルーＡ・カラム（１ｃｒｎ×９　ｃ
ｍ　）に通した。図７に示すように、非吸着画分（ＲＩ
−ＭＢＩ’）と吸着画分（１，５Ｍ　ＮａＣ１’ｆｃ含
むＰＢＳ（−１で浴出される画分ＲＬ　−ＭＢ　ｌ’）
のインターフェロン活性ははｙｌ：１の割合で得られ。

活性回収率はＲ１−ＭＢ　ｌ’、　Ｒ１−ＭＢ　［１’
合わせて８０％以上であった。即ち、実施例５で示した
レマゾールブルー吸着画分（１０５Ｕ／Ｉｎｇ蛋白以上
の活性ケ有す）と本実施例におけるＲ１−ＭＢｌ’画分
と合わせると粗インターフェロン液から７０係以上の回
収率で比活性の商いγ型インターフェロンヶ得ろことが
できた。これは実施例５と本実施例に示される方法の組
合わせが異なる５ｕｔ）ｐｏｐｕ　ｊａ　ｔ　ｉ　ｏｎ
　　が別々に分離可能であり、γ型インターフェロンの
精製に極めて秀れていることを示している。

尚、これら（実施例５と６）の精製法は無血消培地乞用
いてγ型インターフェロンヲ産生じた場合（２３） に特に有用であり１通常の血清培地７用いた場合は混在
タンパク質の除去は困難であった。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の方法に有効なγ型インターフェロンの精
製例ケ示すフローシートである。 図２は本発明の無血清培地においてスタフィロコッカス
・エンテロトキシンＢとＯＫ４ろ２によるγ型インター
フェロンの相乗的誘導７示すグラフである。 図６は実施例１で得た粗γ型インターフェロン溶液のマ
トリックスブルーＡ・カラムクロマトグラフィーによる
分離パターンヶ示す図である。 図４は第６図のマトリックスブルーＡ・カラム吸着画分
（ＭＢｌｌ）のＣｏｎＡ・セファローズノノラムク・ロ
マトグラフイーによる分離パターン７示す図である。 図５は実施例１で得た粗γ型インターフェロン彪液のレ
マゾールブルーカラムクロマトグラフィーによる分離パ
ターンケ示す図である。 図６は本発明方法により誘導された和γ型イン（２４） ターフエロン溶液のクロマトフオーカシング法による分
離パターンを示す図である。 図７は実施例５で得たレマゾールブルーカラム非吸着画
分（Ｒ−１）のマ）　ＩＪツクスプルーＡ・カラムクロ
マトグラフィーによる分離パターンヶ示す図である。 特許出願人　　サン　トリ　　−株式会社３−′−“。 代理人　弁理士　湯浅恭三・′、−１゛′−フ　！゛ （外４名） （２５） 手続補正書 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１９３１４６　　号２、発明の名称 ヒトγ型インターフェロンの製造方法 ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の〔特許請求の範囲〕と〔発明の詳細な説明〕の
欄６、補正の内容 別紙の通り （別紙） （１）　　特許請求の範囲を下記の通り訂正する。 「１）　無血清培地を用いて、ヒト白血球、単核球、リ
ンパ芽球、白血病細胞または牌臓細胞等を、スタフィロ
コッカス・エンテロトキシンＢおよび０Ｋ４３２（ピシ
バニール）をγ型インターフェロン誘導体として添加し
、培養することによりヒトγ型インターフェロンを高生
産せしめ、分離・精製することを特徴とするヒトγ型イ
ンターフェロンの製造方法。 ２）　レマゾールブルー・アガロース・カラム、マトリ
ックスブルーＡ・カラム、またはコンカナバリンＡカラ
ムクロマトグラフィーの１または２以上を用いて、ヒト
γ型インターフェロンを分離・精製することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 γ型インターフェロンを分離・精製することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。」（１） （２）明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁　　　　行　　　　補正前　　　　　　補正後２　　
　３　　ヒト白球系　　　　ヒト白血球系４　　１０　
　白血球　　　　　　単核球５　　　６　　例たば、　
　　　　例えば６　　　７　　白血球　　　　　　単核
球８　　　４　　誘動能　　　　　　誘導能９　　１７
　約１６％　　　　約２０％９　　１８　約６４％　　
　　約６０％１０　６　約２．３％　　　　約２％ １０　　８　　約６１．７％　　　約、６０％１１　２
０　　製精　　　　　　　精製１２　　１２　　　Ａ種
　　　　　　４種ｌ　４　　　４　　　Ｊｏｈ、ｎ５ｏ
ｎらが　　Ｊｏｈｎｓｏｎらの１５　　　８　　１０ｎ
Ｍ　　　　　　１０ｍＭ１９　　１６　　５ａ（Ｊ７　
　　　　　　Ｎａ（Ｊ２０　　１１　　　フォーカッシ
ン　　フオーカシンググ ２０　　１４　　　リバツファー　　　ポリバッファー
２０　　１４　　　ＰＢＳ　　　　　　　ＰＢＥ２０　
　１５　　　フォーカッシン　　フオーカシンググ ２１　　１　　液出　　　　　　　溶出２１１６〜１７
　　ウルトロア　　　　ウルト口２１１７−１８　　　
ゲルバーミニ−ゲルパーミエーシシシン　　　　　　シ
ン ２２　　２　　液出　　　　　　　溶出２２　８〜９ａ
インターフエ　　インターフェロンロン ２６　１５　　組合才つせが　　　　組合わせにより２
３　　１６　　５ｕｂｐｏｐｕｊ　ａｔｉｏｎｓｕｂｐ
ｏｐｕｌａｔｉｏｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）無血清培地ケ用いて、ヒト白血球、リンパ芽球、白
   油病細胞または牌臓細胞等馨、スタフィロコッカス・エ
   ンテロトキシンＢオヨヒ０Ｋ４６２（ビシバニール）乞
   γ型インターフェロン誘導体として添加し、培養するこ
   とによりヒトｒ型インターフェロンを高生産せしめ、分
   離、精製することを特徴とするヒトｒ型インターフェロ
   ンの製造方法。 ２）レマゾールブルー・アガロース−カラム。 マトリックスブルーＡ・カラム、またはコンカナバリン
   Ａカラムクロマトグラフィーの１または２以上を用いて
   、ヒトγ型インターフェロンを分離。 精製することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。 ６）クロマトフオー力ツシング法により、ヒトγ型イン
   ターフェロンを分離、精製することを特（１） 徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造方法つ