JPS5982095A - ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法 - Google Patents
ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法Info
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- JPS5982095A JPS5982095A JP19314682A JP19314682A JPS5982095A JP S5982095 A JPS5982095 A JP S5982095A JP 19314682 A JP19314682 A JP 19314682A JP 19314682 A JP19314682 A JP 19314682A JP S5982095 A JPS5982095 A JP S5982095A
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- interferon
- human
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- type interferon
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト白血球あるいはヒト白球系細胞から非特異
的ウィルス抑制物質であるγ型インターフェロンを安価
に、収率良くしかも高純度で製造する方法に関する。更
に詳細には1本発明はヒト白血球あるいはヒトT細胞か
らヒトr型インターフェロンを製造するに際し、培地と
して無no消培地を用い、かつ複数のインターフェロン
誘導物質を併用することにより高単位のγ型インターフ
ェロンを培養誘導し、得られた粗r型インターフェロン
液から目的物を分離・精製することにより筒状率・高純
度かつ工業的規模で容易にr型インターフェロンを製造
する方法を提供するものである。
的ウィルス抑制物質であるγ型インターフェロンを安価
に、収率良くしかも高純度で製造する方法に関する。更
に詳細には1本発明はヒト白血球あるいはヒトT細胞か
らヒトr型インターフェロンを製造するに際し、培地と
して無no消培地を用い、かつ複数のインターフェロン
誘導物質を併用することにより高単位のγ型インターフ
ェロンを培養誘導し、得られた粗r型インターフェロン
液から目的物を分離・精製することにより筒状率・高純
度かつ工業的規模で容易にr型インターフェロンを製造
する方法を提供するものである。
現在、α型、β型、γ型の6柿が知られているインター
フェロンは分子量・等電点その他物理化学的性質におい
てそれぞれ異った物質であるが。
フェロンは分子量・等電点その他物理化学的性質におい
てそれぞれ異った物質であるが。
いずれも非特異的に各秒ウィルスの細胞内増殖を抑制す
る共通の性質ン持っている。γ型インターフェロンは核
酸やウィルス等で誘発されたα型や(2) β型と異った物質であり、それぞれ特異中和抗体や酸性
pHでの安定性、熱耐性、SDS耐性等により区別され
る。γ型インターフェロンは免疫インターフェロンとも
称され、主として胸腺由来のリンパ球が生産する非特異
的ウィルス抑制活性を持つ物質であり、ワクチンやツベ
ルクリン等抗原による二次感作、植物由来のレクチン類
、ある棟の細菌あるいは毒素、カルシウムイオンフォア
。
る共通の性質ン持っている。γ型インターフェロンは核
酸やウィルス等で誘発されたα型や(2) β型と異った物質であり、それぞれ特異中和抗体や酸性
pHでの安定性、熱耐性、SDS耐性等により区別され
る。γ型インターフェロンは免疫インターフェロンとも
称され、主として胸腺由来のリンパ球が生産する非特異
的ウィルス抑制活性を持つ物質であり、ワクチンやツベ
ルクリン等抗原による二次感作、植物由来のレクチン類
、ある棟の細菌あるいは毒素、カルシウムイオンフォア
。
抗リンパ球抗体等により誘導される蛋白様物質の総称で
ある。γ型インターフェロンはα型やβ型と比べ細胞抑
制活性や免疫調節活性が強く、モデル動物のガン疾患モ
デルにおいてα型やβ型よりも強いガンの成長抑制が入
られ、更にα型やβ型とr型と併用する事により相乗的
な制ガン作用が見られる。この様にγ型インターフェロ
ンは極めて微量で高い活性を持った物質であるが、いま
だ医桑として各種疾患に応用されるには至っていない。
ある。γ型インターフェロンはα型やβ型と比べ細胞抑
制活性や免疫調節活性が強く、モデル動物のガン疾患モ
デルにおいてα型やβ型よりも強いガンの成長抑制が入
られ、更にα型やβ型とr型と併用する事により相乗的
な制ガン作用が見られる。この様にγ型インターフェロ
ンは極めて微量で高い活性を持った物質であるが、いま
だ医桑として各種疾患に応用されるには至っていない。
ソノ最大の理由としてはγ型インターフェロンが、α型
やβ型に比べて更に種特異性が筒いうえ(3) に安定性が低く、極めてe量しか得られtcい事が挙げ
られろ。すなわち、ヒトの各種ウィルス性疾患や癌の治
療に用いようとするインターフェロンはヒトの細胞がら
誘発されたものでなければ効果がブエい。ヒトのγ型イ
ンターフェロン乞産生させ得る#l IJil!とじて
はヒト白捕球、ヒトTリンパ球。
やβ型に比べて更に種特異性が筒いうえ(3) に安定性が低く、極めてe量しか得られtcい事が挙げ
られろ。すなわち、ヒトの各種ウィルス性疾患や癌の治
療に用いようとするインターフェロンはヒトの細胞がら
誘発されたものでなければ効果がブエい。ヒトのγ型イ
ンターフェロン乞産生させ得る#l IJil!とじて
はヒト白捕球、ヒトTリンパ球。
ヒトTリンパ芽球・ヒト牌1i=W &JU胞が知られ
ているが、これらのうち工業的規模において効率良くγ
型インターフェロンを産生させ得る細胞は現在の所ヒト
末梢血由来の白捕球しか知られていない。
ているが、これらのうち工業的規模において効率良くγ
型インターフェロンを産生させ得る細胞は現在の所ヒト
末梢血由来の白捕球しか知られていない。
rBρインターフェロンは糖蛋白と考えられていて。
微生物乞用いた組換えDNA法では天然と同一の糖蛋白
の製造は現在では不可能である。
の製造は現在では不可能である。
ヒト白佃球から粗yr型インターフェロン液を製造する
方法は、 )(、A、Johnson (IRC3Me
dicalScience 7 559(1979)
) 、 Marcdeley ら(Eur。
方法は、 )(、A、Johnson (IRC3Me
dicalScience 7 559(1979)
) 、 Marcdeley ら(Eur。
J、Lmnaunol 、 10871 883(19
80) )およびY、に、YIPら(Proc、N、A
、S、 78Ld 1601−161J5(1981)
)等により報告されている。これらの方法は、ヒト末梢
血バフィーコートより済皿ある(4) いはフィコールを用いた比重遠心により、リンパ球やマ
クロファージを含む単核球を精製し、ヒト血漿あるいは
血清を5〜10チ添加したRPML1640培地等に1
06〜107細胞/m7!に浮遊した後、それぞれの研
究グループ独自のγ型インターフェロン・インデューサ
ー(例たば、血球凝集素、スタフィロコッカス・エンテ
ロトキシンAまたはB。
80) )およびY、に、YIPら(Proc、N、A
、S、 78Ld 1601−161J5(1981)
)等により報告されている。これらの方法は、ヒト末梢
血バフィーコートより済皿ある(4) いはフィコールを用いた比重遠心により、リンパ球やマ
クロファージを含む単核球を精製し、ヒト血漿あるいは
血清を5〜10チ添加したRPML1640培地等に1
06〜107細胞/m7!に浮遊した後、それぞれの研
究グループ独自のγ型インターフェロン・インデューサ
ー(例たば、血球凝集素、スタフィロコッカス・エンテ
ロトキシンAまたはB。
抗リンパ球抗体等)を加え37 Cで1〜4日間培養し
た後、培養戸液乞遠心分離して粗γ型インターフェロン
溶液乞得ている。この粗溶液中には誘発物質として加え
た異種蛋白や毒素・多くの血清蛋白が混在しているため
、これを人体に投与するには充分に精製する必要がある
。
た後、培養戸液乞遠心分離して粗γ型インターフェロン
溶液乞得ている。この粗溶液中には誘発物質として加え
た異種蛋白や毒素・多くの血清蛋白が混在しているため
、これを人体に投与するには充分に精製する必要がある
。
柑γ型インターフェロン液からγ型インターフェロン乞
抽出する従来の方法は、コントロールトポアグラスある
いはシリカゲルfr型インターフェロンケ吸着させ、エ
チレングリコールン含むリン酸バッファーで溶出し、コ
ンカナバリンA・セファローズによるアフィニティー・
クロマトグラフィー、更に、ゲルパーミェーションによ
る分子(5) 量分画法等により約10〜10単位/〜蛋白稈度の部分
精製標品を得る方法であるっγ型インターフェロン1(
は現在定められた検定法も国際標準品もなく、研究者に
よって様々であるが1便宜的に国際標準があるα型イン
ターフェロンの検定法ン準用する例が多いつ 従来、ヒト白血球あるいはヒ) T IJンバ球細胞株
の培養液として得られる粗r型インターフェロン液中の
γ型インターフェロンは歇的に非常に少なく、培地に添
加した血清由来の蛋白が大部分であるといえるので、γ
型インターフェロンのみを培養ろ液中から補集する事は
はなはだ困難である。
抽出する従来の方法は、コントロールトポアグラスある
いはシリカゲルfr型インターフェロンケ吸着させ、エ
チレングリコールン含むリン酸バッファーで溶出し、コ
ンカナバリンA・セファローズによるアフィニティー・
クロマトグラフィー、更に、ゲルパーミェーションによ
る分子(5) 量分画法等により約10〜10単位/〜蛋白稈度の部分
精製標品を得る方法であるっγ型インターフェロン1(
は現在定められた検定法も国際標準品もなく、研究者に
よって様々であるが1便宜的に国際標準があるα型イン
ターフェロンの検定法ン準用する例が多いつ 従来、ヒト白血球あるいはヒ) T IJンバ球細胞株
の培養液として得られる粗r型インターフェロン液中の
γ型インターフェロンは歇的に非常に少なく、培地に添
加した血清由来の蛋白が大部分であるといえるので、γ
型インターフェロンのみを培養ろ液中から補集する事は
はなはだ困難である。
ヒトα型インターフェロンに比べ酸性領域における安定
性、熱安定性、凍結融解に対する耐性が劣る事はγ型イ
ンターフェロンの精製を更に困難にしていて1人体に投
与可能な程度に精製するには多大な労力7要する。これ
らの困難を克服するために、リンパ球の培養終T時のγ
型インターフェロンの力価を萬力価にする誘導培養法を
用い、且つr型インターフェロン以外の夾雑物を棲力含
ま(6) ない粗γインターフェロン溶液を得ろこと、および簡単
かつ高収率で精製を行う事が望まれている。
性、熱安定性、凍結融解に対する耐性が劣る事はγ型イ
ンターフェロンの精製を更に困難にしていて1人体に投
与可能な程度に精製するには多大な労力7要する。これ
らの困難を克服するために、リンパ球の培養終T時のγ
型インターフェロンの力価を萬力価にする誘導培養法を
用い、且つr型インターフェロン以外の夾雑物を棲力含
ま(6) ない粗γインターフェロン溶液を得ろこと、および簡単
かつ高収率で精製を行う事が望まれている。
このような問題点の解決のため本発明ではリンパ球の培
養に通常添加される5〜15%のヒトあるいは動物血清
を用いず、第1表に示す様な、限られた量のヒト血清ア
ルブミンのみヲ蛋白成分として含有する無血清培地を用
いる事により、m清添加培地と同等又はそれ以上のγ型
インターフェロンを誘導させる事に成功した。さらにγ
型インターフェロンの各種インテユーサーの中でと(に
スタフィロコッカス−エンテロトキシンBと0K462
との併用により、それぞれの岸独の使用では得られない
高力価のγ型インターフェロンが誘導され併用による顕
著な相乗効果が認められた。
養に通常添加される5〜15%のヒトあるいは動物血清
を用いず、第1表に示す様な、限られた量のヒト血清ア
ルブミンのみヲ蛋白成分として含有する無血清培地を用
いる事により、m清添加培地と同等又はそれ以上のγ型
インターフェロンを誘導させる事に成功した。さらにγ
型インターフェロンの各種インテユーサーの中でと(に
スタフィロコッカス−エンテロトキシンBと0K462
との併用により、それぞれの岸独の使用では得られない
高力価のγ型インターフェロンが誘導され併用による顕
著な相乗効果が認められた。
更に、無IIII清培地に血液蛋白成分の1つであるト
ランスフェリン(ジデロフィリン)2適当量添加するこ
とにより、より高力価のγ型インターフェロン活性を得
ろことができる(表3参照)。尚。
ランスフェリン(ジデロフィリン)2適当量添加するこ
とにより、より高力価のγ型インターフェロン活性を得
ろことができる(表3参照)。尚。
トランスフェリン羊独ではγ型、インターフェロンを誘
導しない。つまり、この場合、トランスフェ(7) リンはγ型インターフェロン誘導に補助的に働いて〜・
ろと考えられろ。
導しない。つまり、この場合、トランスフェ(7) リンはγ型インターフェロン誘導に補助的に働いて〜・
ろと考えられろ。
提供されるリンパ球からのγ型インターフェロンの誘動
能には個人差が存在するが、上記相乗効果はとくに低力
価生産者に顕著に現われ、*市なヒト白血球乞有効に利
用でtろ。
能には個人差が存在するが、上記相乗効果はとくに低力
価生産者に顕著に現われ、*市なヒト白血球乞有効に利
用でtろ。
発明者らは無血m培地の使用と初数のインターフェロン
誘導剤の使用の絹合せにより、夾雑物の少ない高力価の
粗インターフェロン溶液Z得ろ事に成功し本発明火完成
した。本発明方法によれば精製工程が著しく単純化され
、容易に且つ短期間に公ン縮された純度100/mg蛋
臼以上(α型インターフェロンの国際単位に換算した)
のr型インターフェロン乞収率80%以上で得ろ事がで
きる。
誘導剤の使用の絹合せにより、夾雑物の少ない高力価の
粗インターフェロン溶液Z得ろ事に成功し本発明火完成
した。本発明方法によれば精製工程が著しく単純化され
、容易に且つ短期間に公ン縮された純度100/mg蛋
臼以上(α型インターフェロンの国際単位に換算した)
のr型インターフェロン乞収率80%以上で得ろ事がで
きる。
さらに本発明者は二S類のアフイニテイ力ラムクロマト
グラフイー、すなわちチバクロンブルーを結合した担体
及びコンカナバリンA′(!1′結合した担体を用い、
上記無血清培地ン用いて@養誘導して得た粗γ型インタ
ーフェロン液に廟効、高収率。
グラフイー、すなわちチバクロンブルーを結合した担体
及びコンカナバリンA′(!1′結合した担体を用い、
上記無血清培地ン用いて@養誘導して得た粗γ型インタ
ーフェロン液に廟効、高収率。
連球に分画精製できろ事を見出した。
(8)
図1の精製分画のフローシートに示す様にインターフェ
ロンは4分画され、各々’iA 、 B 、 Cおよび
D画分と称する。全両分を合計した全活性の回収率は8
0%以上である。このうちわけはチバクロンブルー系の
カラムでの全活性の回収率が8゜係以上であり、コンカ
ナバリンAセファローズカラムの回収率がほぼ100チ
である。
ロンは4分画され、各々’iA 、 B 、 Cおよび
D画分と称する。全両分を合計した全活性の回収率は8
0%以上である。このうちわけはチバクロンブルー系の
カラムでの全活性の回収率が8゜係以上であり、コンカ
ナバリンAセファローズカラムの回収率がほぼ100チ
である。
本発明で使用できる精製分画法の詳#lを以下に説明す
る(図3および図4参照)。
る(図3および図4参照)。
粗γ型インターフェロンをマトリックスブルーA・アガ
ロース(アミコン社)あるいはブルーセファローズ0L
−6B(ファルマシア社)に通スと、インターフェロン
活性は非吸着画分と吸着画分とに分画され、いずれの両
分もγ型の件質乞示し1両者を合した活性の全回収率は
80%以上である。平均して、非吸着画分(MBi)の
粗抽出液の活性に対する収率は約16係、吸着画分(M
B II )は約64チである。吸着画分(MBII)
を浴出し、更にコンカナバリンA・セファローズ4B(
ファルマシア社)のアフィニティーカラムク(9) ロマトグラフイー乞行うと、インターフェロン活性は非
吸着画分と吸着画分とに部分されろ。両両分?合した活
性のM B ll活性に対する回収率はほぼ100幅で
ある。コンカナバリンA・セファローズ4B非吸着画分
(画分C)の活性は粗抽出液活性に対して約2.3係で
ある。一方、吸着部発火溶出して得ろ画分りのr型イン
ターフェロン活性は粗抽出液活性に対して約61.7
%である。溶出後カラム7更に溶出液を変えて溶出を行
ったがインターフェロン活性は溶出されず、β型インタ
ーフェロンは含有されていないと結論される。また。
ロース(アミコン社)あるいはブルーセファローズ0L
−6B(ファルマシア社)に通スと、インターフェロン
活性は非吸着画分と吸着画分とに分画され、いずれの両
分もγ型の件質乞示し1両者を合した活性の全回収率は
80%以上である。平均して、非吸着画分(MBi)の
粗抽出液の活性に対する収率は約16係、吸着画分(M
B II )は約64チである。吸着画分(MBII)
を浴出し、更にコンカナバリンA・セファローズ4B(
ファルマシア社)のアフィニティーカラムク(9) ロマトグラフイー乞行うと、インターフェロン活性は非
吸着画分と吸着画分とに部分されろ。両両分?合した活
性のM B ll活性に対する回収率はほぼ100幅で
ある。コンカナバリンA・セファローズ4B非吸着画分
(画分C)の活性は粗抽出液活性に対して約2.3係で
ある。一方、吸着部発火溶出して得ろ画分りのr型イン
ターフェロン活性は粗抽出液活性に対して約61.7
%である。溶出後カラム7更に溶出液を変えて溶出を行
ったがインターフェロン活性は溶出されず、β型インタ
ーフェロンは含有されていないと結論される。また。
培地に添加されたヒト血清アルブミンはこの段階で完全
に除去されている。
に除去されている。
ブルーセファローズまたはマトリックスブルーA・カラ
ムの非吸着画分(MBりに含まれるγ型インターフェロ
ンもコンカナバリンA・セファローズカラムにより非吸
着部分と吸着部分とに分画され、非吸着画分(画分A)
の活性は粗抽出液活性に対し1約6%である。吸着され
た画分Bは溶出され5画分B活性の粗抽出液活性に占め
る割(10) 合は約16係であり、γ型インターフェロン特異抗体に
より中和されろ。
ムの非吸着画分(MBりに含まれるγ型インターフェロ
ンもコンカナバリンA・セファローズカラムにより非吸
着部分と吸着部分とに分画され、非吸着画分(画分A)
の活性は粗抽出液活性に対し1約6%である。吸着され
た画分Bは溶出され5画分B活性の粗抽出液活性に占め
る割(10) 合は約16係であり、γ型インターフェロン特異抗体に
より中和されろ。
本発明の分画・精製のためのクロマトグラフィーに使用
できる具体的溶出液は、以下の実施例に記載するが5本
発明の目的ケ達成できる範囲内で適宜変更することがで
きる。
できる具体的溶出液は、以下の実施例に記載するが5本
発明の目的ケ達成できる範囲内で適宜変更することがで
きる。
γ型インターフェロンのウルトロゲ)LlACA54(
LKB社)による、MBI画分およびMB[画分のゲル
パーミェーションクロマトグラフィーにより1分子量は
いずれも約43.000ダルトンと推定された。主画分
D(MBI−ConAll)のγ型インターフェロンの
比活性は28[llnm1単位の吸光度が蛋白水溶液0
.7mq/mlと仮定して106V9蛋白以上であった
。尚、精製前の抽出液の比活性はおよそ3X10 U/
〜蛋白であった。
LKB社)による、MBI画分およびMB[画分のゲル
パーミェーションクロマトグラフィーにより1分子量は
いずれも約43.000ダルトンと推定された。主画分
D(MBI−ConAll)のγ型インターフェロンの
比活性は28[llnm1単位の吸光度が蛋白水溶液0
.7mq/mlと仮定して106V9蛋白以上であった
。尚、精製前の抽出液の比活性はおよそ3X10 U/
〜蛋白であった。
本発明の精製工程を血清添加培地で培養した例に適用す
ると比活性の上昇は容易に見られず、逆に低下する例も
数多く見られた。このことから。
ると比活性の上昇は容易に見られず、逆に低下する例も
数多く見られた。このことから。
ここで説明した精製工程は本発明の無血清培地の使用で
得た粗γ型インターフェロン溶液の製梢に(11) 特異的に有効でル)ると言えるっ 一方、血清アルブミンに親和性2欠くレマゾール・ブル
ーセファローズ力ラムヶ用い4)と、上記粗インターフ
ェロン#液から一段階で比活伯−が10” U / m
y 蛋白9上の高純度γ型インターフェロンが一段階で
精製できる(図5参照)。この操作はカラム法、バッチ
法のいずれでもiiJ能であり。
得た粗γ型インターフェロン溶液の製梢に(11) 特異的に有効でル)ると言えるっ 一方、血清アルブミンに親和性2欠くレマゾール・ブル
ーセファローズ力ラムヶ用い4)と、上記粗インターフ
ェロン#液から一段階で比活伯−が10” U / m
y 蛋白9上の高純度γ型インターフェロンが一段階で
精製できる(図5参照)。この操作はカラム法、バッチ
法のいずれでもiiJ能であり。
工業的規模の操作にも適している。
更に別の精製法として1等1$点の差による分画法であ
るクロマトフオーカシングカラムによる分画では、粗イ
ンターフェロン液から一段階で少くともAaのγ型イン
ターフェロンを分取できる(図6参照)。
るクロマトフオーカシングカラムによる分画では、粗イ
ンターフェロン液から一段階で少くともAaのγ型イン
ターフェロンを分取できる(図6参照)。
後に述べた2つの分画法は単独で、またはMi+に述べ
た1裏方法と組合せて操作することもできろう本発明の
方法79下の実施例により更に詳細に説明する。
た1裏方法と組合せて操作することもできろう本発明の
方法79下の実施例により更に詳細に説明する。
実施例1:無血消垢地を用いての仮数の肪導剤併用によ
るγ型インターフェロンがシ専の(]2) 新鮮なヒトの個人別のバフィーコートに等量のハンクス
氏平衡塩溶液乞混合し、バフィーコートと等量のフィコ
ール−パンク溶液(ファルマシア社)に重層した。19
Cにて2,000rpm 20分遠心し、リンノ、(g
ain集めた。PBS(−) で2回培地で1回洗浄
したリンパ球を培地に5X10/dに浮遊させ、スタフ
ィロコッカス書エンテロトキシンB及び0K432(ビ
シバニール)をそれぞft最終濃度50 n’!’/r
rtl 、 0.025KE/m?eイyターフエロン
・インデューサーとして添加した。無血清培地の組成は
表1に示した。42時間67C5% CO□存在下で培
養し、培養上清’21.5 Q Or、p、rn。
るγ型インターフェロンがシ専の(]2) 新鮮なヒトの個人別のバフィーコートに等量のハンクス
氏平衡塩溶液乞混合し、バフィーコートと等量のフィコ
ール−パンク溶液(ファルマシア社)に重層した。19
Cにて2,000rpm 20分遠心し、リンノ、(g
ain集めた。PBS(−) で2回培地で1回洗浄
したリンパ球を培地に5X10/dに浮遊させ、スタフ
ィロコッカス書エンテロトキシンB及び0K432(ビ
シバニール)をそれぞft最終濃度50 n’!’/r
rtl 、 0.025KE/m?eイyターフエロン
・インデューサーとして添加した。無血清培地の組成は
表1に示した。42時間67C5% CO□存在下で培
養し、培養上清’21.5 Q Or、p、rn。
5分の遠心分離により得た。上清中のインターフェロン
の力価は、ヒトFL細胞のシンドビスウイルスの細胞障
害阻止′PI:50%にするサンプルの希釈数ケもって
表示する。上記のようにして得られた粗インターフェロ
ン溶液の力価は最高1.6×i 0 ’ U/ tnl
Y 越エフ’j。
の力価は、ヒトFL細胞のシンドビスウイルスの細胞障
害阻止′PI:50%にするサンプルの希釈数ケもって
表示する。上記のようにして得られた粗インターフェロ
ン溶液の力価は最高1.6×i 0 ’ U/ tnl
Y 越エフ’j。
この検定法の感度は、α型インターフェロン1国際単位
が7〜24単位を示す。r型インターフ(13) 二ロンについては国際漂準及び共通の検定系がないので
、慣行に従ってα型インターフェロンを標率とした。F
L細胞とシンドビスウイルスの組合せは)]、A、Jo
hnsonらかWIS)i細胞と77ドビスウイルスの
組合せに比べ約10倍の感度な示したつ無血清培地につ
いてスタフィロコッカス・エンテロトキシンBとOK4
ろ2とのインターフェロン力価に対する濃度依存性2表
2および図2に示す。
が7〜24単位を示す。r型インターフ(13) 二ロンについては国際漂準及び共通の検定系がないので
、慣行に従ってα型インターフェロンを標率とした。F
L細胞とシンドビスウイルスの組合せは)]、A、Jo
hnsonらかWIS)i細胞と77ドビスウイルスの
組合せに比べ約10倍の感度な示したつ無血清培地につ
いてスタフィロコッカス・エンテロトキシンBとOK4
ろ2とのインターフェロン力価に対する濃度依存性2表
2および図2に示す。
表2および図2に見られろ様に用いた二種のインデュー
サーはインターフェロンの誘導に対し相乗的に働く。相
乗効果はとくにインターフェロン誘導能の低い検体につ
いて明瞭にみもれた。誘導能の高い検体では単独のイン
デューサーでも充分高いインターフェロン力価乞示した
。0K432とスタフィロコッカス廖エンテロトキンン
併用例は同一個体についての比較でも、単独使用例より
も篩力価のインターフェロンか訪専された。誘導された
インターフェロン活性YpH2,0で17時間処理する
とインターフェロンの残存油性は殆んど消滅し、またγ
型インターフェロン特異中和抗体で(14) 殆んど中和される事から、誘導されたインターフェロン
はγ型であることが確認された。
サーはインターフェロンの誘導に対し相乗的に働く。相
乗効果はとくにインターフェロン誘導能の低い検体につ
いて明瞭にみもれた。誘導能の高い検体では単独のイン
デューサーでも充分高いインターフェロン力価乞示した
。0K432とスタフィロコッカス廖エンテロトキンン
併用例は同一個体についての比較でも、単独使用例より
も篩力価のインターフェロンか訪専された。誘導された
インターフェロン活性YpH2,0で17時間処理する
とインターフェロンの残存油性は殆んど消滅し、またγ
型インターフェロン特異中和抗体で(14) 殆んど中和される事から、誘導されたインターフェロン
はγ型であることが確認された。
RPMI−1640(日永製薬Gl巾製)
96ml必須アミノ酸混合液(×50)
2ml非必須アミノ酸混合液(’X100) 1
miヒト血清アルブミン :650m9H
EPES 10nM7%重
炭酸ソーダ 2ml。
96ml必須アミノ酸混合液(×50)
2ml非必須アミノ酸混合液(’X100) 1
miヒト血清アルブミン :650m9H
EPES 10nM7%重
炭酸ソーダ 2ml。
表2.スタフィロコッカス・エンテロトキシンB(sE
B)と0K432 によるr型インターフェロンの(1
5) また、上記無血清培地にトランスフェリンを添加するこ
とによりインターフェロン活性の上昇が入られた。適当
量のトランスフェリンを添加した上記無血清培地ア用い
、#終儂1![でスタフィロコッカス・エンテロトキシ
ンB(SIEB)’&’50nVrrt1.0K432
v0.025KE/ml”Q、 上述の手順に従いr型
インターフェロンを誘導(7た。結果を表3に示すっ表
3から明らかな如<、トランスフェリ7 ”;s: 1
ml当り5 pFj 、 10.ttP 加エタ時、
i加してない場合に比べ約4倍の活性の上昇が入られ
た。
B)と0K432 によるr型インターフェロンの(1
5) また、上記無血清培地にトランスフェリンを添加するこ
とによりインターフェロン活性の上昇が入られた。適当
量のトランスフェリンを添加した上記無血清培地ア用い
、#終儂1![でスタフィロコッカス・エンテロトキシ
ンB(SIEB)’&’50nVrrt1.0K432
v0.025KE/ml”Q、 上述の手順に従いr型
インターフェロンを誘導(7た。結果を表3に示すっ表
3から明らかな如<、トランスフェリ7 ”;s: 1
ml当り5 pFj 、 10.ttP 加エタ時、
i加してない場合に比べ約4倍の活性の上昇が入られ
た。
尚、トランスフェリン’Y10μ’/−/ml添加1〜
た無IfIlff培地で上記2つの誘導剤を用いずにヒ
トリンパ球を前述と同条件で培養した場合には、インタ
ーフェロン活性は認められなかった。
た無IfIlff培地で上記2つの誘導剤を用いずにヒ
トリンパ球を前述と同条件で培養した場合には、インタ
ーフェロン活性は認められなかった。
また、以下に述べろヒトΦγ型インターフェロンの分離
・精製には、トランスフェリン添加による影響は入られ
なかった。すなわち、トランスフェリンは以下の精製過
程において、血清アルブミンと同様′I′、r挙動を示
したっ″ (16) 表6.トランフェリン添加によるγ型インターフトラン
スフェリン添加量 インターフェロン活性(μv/m
l) (u7y)0
7、281 0・5 7.2811・0
7.2815.0 29
,12710.0 29,127*
スタフィロコッカス・エンテロトキシンB50 nft
/ml + 0K432 (ヒシハ= −v )0.0
25Kg/aでγ型インターフェロン乞誘導した。
・精製には、トランスフェリン添加による影響は入られ
なかった。すなわち、トランスフェリンは以下の精製過
程において、血清アルブミンと同様′I′、r挙動を示
したっ″ (16) 表6.トランフェリン添加によるγ型インターフトラン
スフェリン添加量 インターフェロン活性(μv/m
l) (u7y)0
7、281 0・5 7.2811・0
7.2815.0 29
,12710.0 29,127*
スタフィロコッカス・エンテロトキシンB50 nft
/ml + 0K432 (ヒシハ= −v )0.0
25Kg/aでγ型インターフェロン乞誘導した。
実施例2:マトリックスブルーA・カラムおよびG o
n Aセファローズカラムによる精製(そのI) 実施例1で得た培養上清を粗γ型インターフェロン溶液
として精製する。粗γ型インターフ二口(I7) ン浴液10dをPBS(−1で平衡化したマトリックス
ブル−A・カラム(的イ羊土5tMT、高さ6 cm
)に加えたつ通過画分(MBI)もγ型インターフェロ
ンを含Wjる為4Cに保存して更に精製したっ7トリソ
クスブルー吸>?’r II!11分(M B II
)は1.5M1iaC6を含有するP B S (−)
にて脱着する事によって得られた。50%エチレングリ
コール及び1、5 M Na C1yf5加してP B
S (−)による溶出画分にはインターフェロン活性
は全く回収されス、マトリックスブルーA−カラムクロ
マトグラフィーによるMBIとMBIIの回収率は合計
80係以上であったつMBI及びMBllYpH2,O
に−&透析すると活性は回収されない事から、この両両
分の含有するインターフェロンはγ型か大部分と思われ
る(図6参照)。同様な結果はファルマシア社製ブルー
セファローズCL−6Bについても得られた。
n Aセファローズカラムによる精製(そのI) 実施例1で得た培養上清を粗γ型インターフェロン溶液
として精製する。粗γ型インターフ二口(I7) ン浴液10dをPBS(−1で平衡化したマトリックス
ブル−A・カラム(的イ羊土5tMT、高さ6 cm
)に加えたつ通過画分(MBI)もγ型インターフェロ
ンを含Wjる為4Cに保存して更に精製したっ7トリソ
クスブルー吸>?’r II!11分(M B II
)は1.5M1iaC6を含有するP B S (−)
にて脱着する事によって得られた。50%エチレングリ
コール及び1、5 M Na C1yf5加してP B
S (−)による溶出画分にはインターフェロン活性
は全く回収されス、マトリックスブルーA−カラムクロ
マトグラフィーによるMBIとMBIIの回収率は合計
80係以上であったつMBI及びMBllYpH2,O
に−&透析すると活性は回収されない事から、この両両
分の含有するインターフェロンはγ型か大部分と思われ
る(図6参照)。同様な結果はファルマシア社製ブルー
セファローズCL−6Bについても得られた。
M’BIIをPBS(−1に透析後、)’BS(→で平
衡化したGon A eセファローズカラム(1,5X
5t−rn)を通過させた(図4参照)。通過画分(画
分C:(18) MB [−ConA I )には回収された粗抽出液活
性に対して2.6チでγ型インターフェロン活性ケ含有
した。吸着両分にもインターフェロン活性が含まれて、
tにす、0.1Mのα−メチルマンノシド乞金含有るP
B S (−)により溶出された(画分D:MB1−
ConA ll )。画分りの粗抽出液活性に対する回
収率は61.7%であり、pH2,0処理及び抗γ型イ
ンターフェロン抗体による中和試験よりγ型である事が
確認された。
衡化したGon A eセファローズカラム(1,5X
5t−rn)を通過させた(図4参照)。通過画分(画
分C:(18) MB [−ConA I )には回収された粗抽出液活
性に対して2.6チでγ型インターフェロン活性ケ含有
した。吸着両分にもインターフェロン活性が含まれて、
tにす、0.1Mのα−メチルマンノシド乞金含有るP
B S (−)により溶出された(画分D:MB1−
ConA ll )。画分りの粗抽出液活性に対する回
収率は61.7%であり、pH2,0処理及び抗γ型イ
ンターフェロン抗体による中和試験よりγ型である事が
確認された。
実施例3:マトリックスブルーAおよびConAセファ
ローズガラムによろ1Fi3インター粗インターフエロ
ン液1tvPBS(−)で平向化したマトリックスブル
ー1ooyに4Cで混合し。
ローズガラムによろ1Fi3インター粗インターフエロ
ン液1tvPBS(−)で平向化したマトリックスブル
ー1ooyに4Cで混合し。
4時間放置後カラムに充填し、PBS(−)でよく洗滌
後、吸着画分Y 1.0 M 5aGI Y含むPBS
(−1溶液で溶出した。非吸着画分(MBI:2t)は
そのま〜、吸着画分(MBII:1.2/=)は水にて
9倍に希釈し、PBS(−)で平向化したコンカナバリ
ンA・セファロース4B(非吸着画分は200m1゜(
19) 吸着画分は250m1りと混合し、4t?で4時間放置
後カラムに充填しP B S (−)で充分に洗浄した
。
後、吸着画分Y 1.0 M 5aGI Y含むPBS
(−1溶液で溶出した。非吸着画分(MBI:2t)は
そのま〜、吸着画分(MBII:1.2/=)は水にて
9倍に希釈し、PBS(−)で平向化したコンカナバリ
ンA・セファロース4B(非吸着画分は200m1゜(
19) 吸着画分は250m1りと混合し、4t?で4時間放置
後カラムに充填しP B S (−)で充分に洗浄した
。
吸着画分の溶出は0.1Mα−7テルマンノシド乞含む
PBS(−147で行った。
PBS(−147で行った。
かくして、M B l −Gon A l1画分および
M B ll−ConA1両分に、 106U/m9
蛋白シ上のγ型インターフェロン活性ケ有するか液を
6660口ml。
M B ll−ConA1両分に、 106U/m9
蛋白シ上のγ型インターフェロン活性ケ有するか液を
6660口ml。
750rd ラピイ尋たっ
両方の両分7j合わせたインターフェロン活性の回収単
に75%以上であった。
に75%以上であった。
実施例4:クロマトフオーカシング法によるγファルマ
シア社製ポリバッファーTM96およびリハソファー交
換体PBS TM94’&用いたクロマトツメ−力ツシ
ング・ツノラムクロマトグラフィーをγ型インターフェ
ロンの分画・精製に適用した。
シア社製ポリバッファーTM96およびリハソファー交
換体PBS TM94’&用いたクロマトツメ−力ツシ
ング・ツノラムクロマトグラフィーをγ型インターフェ
ロンの分画・精製に適用した。
粗インターフェロン6に’IOmeをp [−] B、
6に透V]平償1化したもの’(<PBETM94カ
ラム(1,5cmX12m)に加え、pH6,0のポリ
バッファー(20) 250mlにて液出した。
6に透V]平償1化したもの’(<PBETM94カ
ラム(1,5cmX12m)に加え、pH6,0のポリ
バッファー(20) 250mlにて液出した。
図110に432.!:スタフイロコツカスエンテロト
キシンB(SEBと称す)の同時添加により誘導された
粗インターフェロン溶液のクロマトフオーカシング法に
よる分離パターンを示す。図のようにインターフェロン
活性は、pH9からp)16の勾配では3つの両分に両
分され、それらの′J電点pIは各々8.5.8.0,
7.8(各々CP−1゜c p −11・CP−1と称
す)であった。また分画Pr後更に1.5 M NaC
6で溶出される両分(画分S)にもインターフェロン活
性が見いだされ、この画分Sはさらに低い領域のpH勾
配で等電点6、:2(CPI及び等電点5.2(CPV
)にインターフェロン活性ビークlf Jえた。
キシンB(SEBと称す)の同時添加により誘導された
粗インターフェロン溶液のクロマトフオーカシング法に
よる分離パターンを示す。図のようにインターフェロン
活性は、pH9からp)16の勾配では3つの両分に両
分され、それらの′J電点pIは各々8.5.8.0,
7.8(各々CP−1゜c p −11・CP−1と称
す)であった。また分画Pr後更に1.5 M NaC
6で溶出される両分(画分S)にもインターフェロン活
性が見いだされ、この画分Sはさらに低い領域のpH勾
配で等電点6、:2(CPI及び等電点5.2(CPV
)にインターフェロン活性ビークlf Jえた。
コレらの分画は抗ヒトγ−インターフェロン抗体ですべ
て中和された。各分画の分子量をウルトロアゲルAcA
34(LKB社)によるゲルパーミェーションクロマト
グラフィー(o、5x 50ctn)により推定すると
、CP−l 、 CP−11、CP −皇及びCP■は
分子量約43,000ダルトンに相当(2I) する単一ピークを示すのに対し、CP−Vは30.00
0〜40.000ダルトンの範囲に液出された。
て中和された。各分画の分子量をウルトロアゲルAcA
34(LKB社)によるゲルパーミェーションクロマト
グラフィー(o、5x 50ctn)により推定すると
、CP−l 、 CP−11、CP −皇及びCP■は
分子量約43,000ダルトンに相当(2I) する単一ピークを示すのに対し、CP−Vは30.00
0〜40.000ダルトンの範囲に液出された。
実施例5:レマゾールブルーカラムによるr型インター
フェロンの精製(図5参照) 実施例1で示した粗インターフェロン溶液5m1i、P
BS(−)で充分平衡化したレマゾールブルーカラム(
I IMX 9 cm )に通した。aインターフェロ
ン活性の50%と蛋白の殆んどは通過画分(R−1)に
得られたか、実施例6に示すようにこの両分は実施例2
の如くしてさらに精製に用いることができる。吸着画分
(R−1)は1.5 M NaGtを含むPBS←)#
液で溶出され、この一段階操作で収率50%、比活性が
105U/〜蛋白以上のr型インターフェロンを得た。
フェロンの精製(図5参照) 実施例1で示した粗インターフェロン溶液5m1i、P
BS(−)で充分平衡化したレマゾールブルーカラム(
I IMX 9 cm )に通した。aインターフェロ
ン活性の50%と蛋白の殆んどは通過画分(R−1)に
得られたか、実施例6に示すようにこの両分は実施例2
の如くしてさらに精製に用いることができる。吸着画分
(R−1)は1.5 M NaGtを含むPBS←)#
液で溶出され、この一段階操作で収率50%、比活性が
105U/〜蛋白以上のr型インターフェロンを得た。
この両分は他のブルーセファローズ吸着画分と異なり培
地に添加した血清アルブミン蛋白を含有しない特徴を持
っていた。
地に添加した血清アルブミン蛋白を含有しない特徴を持
っていた。
実施例6:実施例5で示したレマゾールブルー力(22
) 実施例5で得られろレマゾールブルーカラム非吸着画分
(Rl ) 9.5m1k、実施例2(および6)で示
したマトリックスブルーA・カラム(1crn×9 c
m )に通した。図7に示すように、非吸着画分(RI
−MBI’)と吸着画分(1,5M NaC1’fc含
むPBS(−1で浴出される画分RL −MB l’)
のインターフェロン活性ははyl:1の割合で得られ。
) 実施例5で得られろレマゾールブルーカラム非吸着画分
(Rl ) 9.5m1k、実施例2(および6)で示
したマトリックスブルーA・カラム(1crn×9 c
m )に通した。図7に示すように、非吸着画分(RI
−MBI’)と吸着画分(1,5M NaC1’fc含
むPBS(−1で浴出される画分RL −MB l’)
のインターフェロン活性ははyl:1の割合で得られ。
活性回収率はR1−MB l’、 R1−MB [1’
合わせて80%以上であった。即ち、実施例5で示した
レマゾールブルー吸着画分(105U/Ing蛋白以上
の活性ケ有す)と本実施例におけるR1−MBl’画分
と合わせると粗インターフェロン液から70係以上の回
収率で比活性の商いγ型インターフェロンヶ得ろことが
できた。これは実施例5と本実施例に示される方法の組
合わせが異なる5ut)popu ja t i on
が別々に分離可能であり、γ型インターフェロンの
精製に極めて秀れていることを示している。
合わせて80%以上であった。即ち、実施例5で示した
レマゾールブルー吸着画分(105U/Ing蛋白以上
の活性ケ有す)と本実施例におけるR1−MBl’画分
と合わせると粗インターフェロン液から70係以上の回
収率で比活性の商いγ型インターフェロンヶ得ろことが
できた。これは実施例5と本実施例に示される方法の組
合わせが異なる5ut)popu ja t i on
が別々に分離可能であり、γ型インターフェロンの
精製に極めて秀れていることを示している。
尚、これら(実施例5と6)の精製法は無血消培地乞用
いてγ型インターフェロンヲ産生じた場合(23) に特に有用であり1通常の血清培地7用いた場合は混在
タンパク質の除去は困難であった。
いてγ型インターフェロンヲ産生じた場合(23) に特に有用であり1通常の血清培地7用いた場合は混在
タンパク質の除去は困難であった。
図1は本発明の方法に有効なγ型インターフェロンの精
製例ケ示すフローシートである。 図2は本発明の無血清培地においてスタフィロコッカス
・エンテロトキシンBとOK4ろ2によるγ型インター
フェロンの相乗的誘導7示すグラフである。 図6は実施例1で得た粗γ型インターフェロン溶液のマ
トリックスブルーA・カラムクロマトグラフィーによる
分離パターンヶ示す図である。 図4は第6図のマトリックスブルーA・カラム吸着画分
(MBll)のConA・セファローズノノラムク・ロ
マトグラフイーによる分離パターン7示す図である。 図5は実施例1で得た粗γ型インターフェロン彪液のレ
マゾールブルーカラムクロマトグラフィーによる分離パ
ターンケ示す図である。 図6は本発明方法により誘導された和γ型イン(24) ターフエロン溶液のクロマトフオーカシング法による分
離パターンを示す図である。 図7は実施例5で得たレマゾールブルーカラム非吸着画
分(R−1)のマ) IJツクスプルーA・カラムクロ
マトグラフィーによる分離パターンヶ示す図である。 特許出願人 サン トリ −株式会社3−′−“。 代理人 弁理士 湯浅恭三・′、−1゛′−フ !゛ (外4名) (25) 手続補正書 特許庁長官 若杉和夫 殿 1、事件の表示 昭和57年特許願第193146 号2、発明の名称 ヒトγ型インターフェロンの製造方法 6、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称(190)サントリー株式会社 4、代理人 5、補正の対象 明細書の〔特許請求の範囲〕と〔発明の詳細な説明〕の
欄6、補正の内容 別紙の通り (別紙) (1) 特許請求の範囲を下記の通り訂正する。 「1) 無血清培地を用いて、ヒト白血球、単核球、リ
ンパ芽球、白血病細胞または牌臓細胞等を、スタフィロ
コッカス・エンテロトキシンBおよび0K432(ピシ
バニール)をγ型インターフェロン誘導体として添加し
、培養することによりヒトγ型インターフェロンを高生
産せしめ、分離・精製することを特徴とするヒトγ型イ
ンターフェロンの製造方法。 2) レマゾールブルー・アガロース・カラム、マトリ
ックスブルーA・カラム、またはコンカナバリンAカラ
ムクロマトグラフィーの1または2以上を用いて、ヒト
γ型インターフェロンを分離・精製することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項記載の製造方法。 γ型インターフェロンを分離・精製することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項記載の製造方法。」(1) (2)明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後2
3 ヒト白球系 ヒト白血球系4 10
白血球 単核球5 6 例たば、
例えば6 7 白血球 単核
球8 4 誘動能 誘導能9 17
約16% 約20%9 18 約64%
約60%10 6 約2.3% 約2% 10 8 約61.7% 約、60%11 2
0 製精 精製12 12 A種
4種l 4 4 Joh、n5o
nらが Johnsonらの15 8 10n
M 10mM19 16 5a(J7
Na(J20 11 フォーカッシ
ン フオーカシンググ 20 14 リバツファー ポリバッファー
20 14 PBS PBE20
15 フォーカッシン フオーカシンググ 21 1 液出 溶出2116〜17
ウルトロア ウルト口2117−18
ゲルバーミニ−ゲルパーミエーシシシン シ
ン 22 2 液出 溶出22 8〜9a
インターフエ インターフェロンロン 26 15 組合才つせが 組合わせにより2
3 16 5ubpopuj ationsubp
opulation
製例ケ示すフローシートである。 図2は本発明の無血清培地においてスタフィロコッカス
・エンテロトキシンBとOK4ろ2によるγ型インター
フェロンの相乗的誘導7示すグラフである。 図6は実施例1で得た粗γ型インターフェロン溶液のマ
トリックスブルーA・カラムクロマトグラフィーによる
分離パターンヶ示す図である。 図4は第6図のマトリックスブルーA・カラム吸着画分
(MBll)のConA・セファローズノノラムク・ロ
マトグラフイーによる分離パターン7示す図である。 図5は実施例1で得た粗γ型インターフェロン彪液のレ
マゾールブルーカラムクロマトグラフィーによる分離パ
ターンケ示す図である。 図6は本発明方法により誘導された和γ型イン(24) ターフエロン溶液のクロマトフオーカシング法による分
離パターンを示す図である。 図7は実施例5で得たレマゾールブルーカラム非吸着画
分(R−1)のマ) IJツクスプルーA・カラムクロ
マトグラフィーによる分離パターンヶ示す図である。 特許出願人 サン トリ −株式会社3−′−“。 代理人 弁理士 湯浅恭三・′、−1゛′−フ !゛ (外4名) (25) 手続補正書 特許庁長官 若杉和夫 殿 1、事件の表示 昭和57年特許願第193146 号2、発明の名称 ヒトγ型インターフェロンの製造方法 6、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称(190)サントリー株式会社 4、代理人 5、補正の対象 明細書の〔特許請求の範囲〕と〔発明の詳細な説明〕の
欄6、補正の内容 別紙の通り (別紙) (1) 特許請求の範囲を下記の通り訂正する。 「1) 無血清培地を用いて、ヒト白血球、単核球、リ
ンパ芽球、白血病細胞または牌臓細胞等を、スタフィロ
コッカス・エンテロトキシンBおよび0K432(ピシ
バニール)をγ型インターフェロン誘導体として添加し
、培養することによりヒトγ型インターフェロンを高生
産せしめ、分離・精製することを特徴とするヒトγ型イ
ンターフェロンの製造方法。 2) レマゾールブルー・アガロース・カラム、マトリ
ックスブルーA・カラム、またはコンカナバリンAカラ
ムクロマトグラフィーの1または2以上を用いて、ヒト
γ型インターフェロンを分離・精製することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項記載の製造方法。 γ型インターフェロンを分離・精製することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項記載の製造方法。」(1) (2)明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後2
3 ヒト白球系 ヒト白血球系4 10
白血球 単核球5 6 例たば、
例えば6 7 白血球 単核
球8 4 誘動能 誘導能9 17
約16% 約20%9 18 約64%
約60%10 6 約2.3% 約2% 10 8 約61.7% 約、60%11 2
0 製精 精製12 12 A種
4種l 4 4 Joh、n5o
nらが Johnsonらの15 8 10n
M 10mM19 16 5a(J7
Na(J20 11 フォーカッシ
ン フオーカシンググ 20 14 リバツファー ポリバッファー
20 14 PBS PBE20
15 フォーカッシン フオーカシンググ 21 1 液出 溶出2116〜17
ウルトロア ウルト口2117−18
ゲルバーミニ−ゲルパーミエーシシシン シ
ン 22 2 液出 溶出22 8〜9a
インターフエ インターフェロンロン 26 15 組合才つせが 組合わせにより2
3 16 5ubpopuj ationsubp
opulation
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)無血清培地ケ用いて、ヒト白血球、リンパ芽球、白
油病細胞または牌臓細胞等馨、スタフィロコッカス・エ
ンテロトキシンBオヨヒ0K462(ビシバニール)乞
γ型インターフェロン誘導体として添加し、培養するこ
とによりヒトr型インターフェロンを高生産せしめ、分
離、精製することを特徴とするヒトr型インターフェロ
ンの製造方法。 2)レマゾールブルー・アガロース−カラム。 マトリックスブルーA・カラム、またはコンカナバリン
Aカラムクロマトグラフィーの1または2以上を用いて
、ヒトγ型インターフェロンを分離。 精製することを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の
製造方法。 6)クロマトフオー力ツシング法により、ヒトγ型イン
ターフェロンを分離、精製することを特(1) 徴とする特許請求の範囲第1項記載の製造方法つ
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19314682A JPS5982095A (ja) | 1982-11-02 | 1982-11-02 | ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19314682A JPS5982095A (ja) | 1982-11-02 | 1982-11-02 | ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5982095A true JPS5982095A (ja) | 1984-05-11 |
Family
ID=16303045
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19314682A Pending JPS5982095A (ja) | 1982-11-02 | 1982-11-02 | ヒトγ型インタ−フエロンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5982095A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6169799A (ja) * | 1984-09-14 | 1986-04-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | インタ−フエロンの精製法 |
-
1982
- 1982-11-02 JP JP19314682A patent/JPS5982095A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6169799A (ja) * | 1984-09-14 | 1986-04-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | インタ−フエロンの精製法 |
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