JPS5974987A - 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 - Google Patents
解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法Info
- Publication number
- JPS5974987A JPS5974987A JP57184292A JP18429282A JPS5974987A JP S5974987 A JPS5974987 A JP S5974987A JP 57184292 A JP57184292 A JP 57184292A JP 18429282 A JP18429282 A JP 18429282A JP S5974987 A JPS5974987 A JP S5974987A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- yeast
- pgk
- peptide
- utilizing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵母サツカロマイセスの解糖系酵素の１つであ
る３−ホスホグリセロキナーゼ（以下ＰＧＫと略称する
）を支配している遺伝子（オペロン）のプロモーターと
有用な目的ペプチド遺伝子とを結合した酵母菌のベクタ
ーに関する。更に、本発明は上記ＰＧＫを支配している
オペロンのプロモーターを利用して、有用な目的ペプチ
ドを高収率で酵母から生産する方法に関する。
る３−ホスホグリセロキナーゼ（以下ＰＧＫと略称する
）を支配している遺伝子（オペロン）のプロモーターと
有用な目的ペプチド遺伝子とを結合した酵母菌のベクタ
ーに関する。更に、本発明は上記ＰＧＫを支配している
オペロンのプロモーターを利用して、有用な目的ペプチ
ドを高収率で酵母から生産する方法に関する。
これまで遺伝子操作技術を用いて医薬上有用なペプチド
類、例えばソマトスタチン、インスリン、成長ホルモン
、各趣インターフエロン、インフルエンザウイルス並び
に肝炎Ｂウィルス蛋白、サイモンンα１、β−エンドル
フィン、α−ネオエンドルフィン、セクレチン、ウロキ
ナーゼ、プラスミノ−ゲン活性化物質など多くの物質が
微生物又は動物細胞で作られるようになっている。
類、例えばソマトスタチン、インスリン、成長ホルモン
、各趣インターフエロン、インフルエンザウイルス並び
に肝炎Ｂウィルス蛋白、サイモンンα１、β−エンドル
フィン、α−ネオエンドルフィン、セクレチン、ウロキ
ナーゼ、プラスミノ−ゲン活性化物質など多くの物質が
微生物又は動物細胞で作られるようになっている。
これらの多くは宿主として原核細胞（ｐｒｏｋａｒｙｏ
ｌｅ）である大腸菌を用いているが、近年有核細胞（ｅ
ｕｋａｒｙｏｕｔｅ）である酵母を宿主として利用する
ことが注目されている。これは、酵母の培養条件が簡単
であり、***速度が速いこと、安全性が高いこと、特に
サツカロマイセス酵母では遺伝生化学的解析がより多く
なされていることなどの理由による。しかし、酵母にお
ける外来異種ペプチド産生に関する例は少く、α−イン
ターフェロン、ＨＢ肝炎表面抗原蛋白、α−ネオエンド
ルフィンにみられる程度である。
ｌｅ）である大腸菌を用いているが、近年有核細胞（ｅ
ｕｋａｒｙｏｕｔｅ）である酵母を宿主として利用する
ことが注目されている。これは、酵母の培養条件が簡単
であり、***速度が速いこと、安全性が高いこと、特に
サツカロマイセス酵母では遺伝生化学的解析がより多く
なされていることなどの理由による。しかし、酵母にお
ける外来異種ペプチド産生に関する例は少く、α−イン
ターフェロン、ＨＢ肝炎表面抗原蛋白、α−ネオエンド
ルフィンにみられる程度である。
一方、外来異種遺伝子、例えば科学的に合成した遺伝子
、ｍＲＮＡから逆転写酵素によって得られる相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ） 遺伝子、あるいは染色体から適当な処
理によって得られる遺伝子、または酵母内に含まれるが
生産量の少い同種ペプチド遺伝子などを発現させようと
するには、用いる宿主に適したプロモーター領域の存在
が必須である。
、ｍＲＮＡから逆転写酵素によって得られる相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ） 遺伝子、あるいは染色体から適当な処
理によって得られる遺伝子、または酵母内に含まれるが
生産量の少い同種ペプチド遺伝子などを発現させようと
するには、用いる宿主に適したプロモーター領域の存在
が必須である。
プロモーターの良し悪しが目的とするペプチド遺伝子発
現に大きく影響するため、これまで種々のプロモーター
を用いた発現プラスミドベクターの開発が行われてきた
。
現に大きく影響するため、これまで種々のプロモーター
を用いた発現プラスミドベクターの開発が行われてきた
。
しかしながら、報告されている酵母を宿主とする外来遺
伝子の発現ベクターは、大腸菌を宿主とするベクターに
比べ、目的とする外来遺伝子の発現効率は十分とは言え
ない。発明者らは、酵母サツカロマイセスの解糖系を支
配している酵母である３−ホスホグリセロキナーゼ（Ｐ
ＧＫ）が酵母菌体で多量に生産されているのに着目し、
この酵素をコードしているオペロンのプロモーター遺伝
子の利用を考え、研究を進めた。この結果、このプロモ
ーターが酵母での異種または同種のペプチドの生産に非
常に有用であることを見出し、このプロモーターの下流
に異種または同種ペプチド遺伝子を結合した酵母菌のベ
クターを作成し、これを用いて酵母の形質転換を行い、
形質転換の行われた酵母を分離解析することにより本発
明を完成した。
伝子の発現ベクターは、大腸菌を宿主とするベクターに
比べ、目的とする外来遺伝子の発現効率は十分とは言え
ない。発明者らは、酵母サツカロマイセスの解糖系を支
配している酵母である３−ホスホグリセロキナーゼ（Ｐ
ＧＫ）が酵母菌体で多量に生産されているのに着目し、
この酵素をコードしているオペロンのプロモーター遺伝
子の利用を考え、研究を進めた。この結果、このプロモ
ーターが酵母での異種または同種のペプチドの生産に非
常に有用であることを見出し、このプロモーターの下流
に異種または同種ペプチド遺伝子を結合した酵母菌のベ
クターを作成し、これを用いて酵母の形質転換を行い、
形質転換の行われた酵母を分離解析することにより本発
明を完成した。
ザツカロマイセス酵母のＰＧＫ遺伝子は既にＨｉｔｏｚ
ｅｍａｎらによりクローニングされている（Ｈｉｔｚｅ
ｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｌ．，＆ｃａｒｂｏ
ｎ，ｊ．ｊ．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５：１２０７３
（１９８０））。彼らによればＰＧＫ遺伝子は酵母の核
由来ＤＮＡのＨｉｎｄ■で切断される約３．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片に存在し、その断片はさらにＥｃｏＲ１で１ケ
所、Ｓａｌｌで２ケ所、Ｂｇ１■で１ケ所切断される。
ｅｍａｎらによりクローニングされている（Ｈｉｔｚｅ
ｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｌ．，＆ｃａｒｂｏ
ｎ，ｊ．ｊ．Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５：１２０７３
（１９８０））。彼らによればＰＧＫ遺伝子は酵母の核
由来ＤＮＡのＨｉｎｄ■で切断される約３．１ｋｂのＤ
ＮＡ断片に存在し、その断片はさらにＥｃｏＲ１で１ケ
所、Ｓａｌｌで２ケ所、Ｂｇ１■で１ケ所切断される。
又ＰＧＫ遺伝子の５′末端付近およびその上流の１部の
塩基配列がＤｏｂｓｏｎら（Ｄｏｈｓｏｎ、Ｍ．Ｊ．ｅ
ｔ ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０
：２６２５〜２６３７（１９８２））によって示されて
いる。
塩基配列がＤｏｂｓｏｎら（Ｄｏｈｓｏｎ、Ｍ．Ｊ．ｅ
ｔ ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０
：２６２５〜２６３７（１９８２））によって示されて
いる。
また、ＰＧＫプロモーターを用いたγ−インターフェロ
ンの酵母での生産に関し第４回ＧＩＭ（Ｆｏｕｒｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏ
ｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｇａｎｉｓｍｓ： Ｊｕｎｅ ６−１１，１９
８２，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）でＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇ
ｅｎｅｎｔｅｃｈ社）が口頭で発表しているが、詳細な
製造法に関しては開示していない。そこで発明者らは、
以下に述べる方法で独白にＰＧＫ遺伝子をクローニング
しＰＧＫ遺伝子プロモーターが酵母での同種または異種
ペプチドの生産に有効であることを具体的に示すもので
ある。
ンの酵母での生産に関し第４回ＧＩＭ（Ｆｏｕｒｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏ
ｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｇａｎｉｓｍｓ： Ｊｕｎｅ ６−１１，１９
８２，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）でＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇ
ｅｎｅｎｔｅｃｈ社）が口頭で発表しているが、詳細な
製造法に関しては開示していない。そこで発明者らは、
以下に述べる方法で独白にＰＧＫ遺伝子をクローニング
しＰＧＫ遺伝子プロモーターが酵母での同種または異種
ペプチドの生産に有効であることを具体的に示すもので
ある。
以下に本発明により酵母ベクターの作成方法を示す。
まずザツカロマイセス酵母ＸＳ１６−５ｃ株の核ＤＮＡ
を制限酵母Ｈｉｎｄ■で切断する。得られた断片のうち
約３．１ｋｂの長さをもつＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２の
Ｈｉｎｄ■切断点にクローニングした酵母の遺伝子ライ
ブラリー（大腸菌）３０１クローンを得る。次にクロー
ン化された約３．１ｋｂのＤＮＡ断片の内ＥｃｏＲＩで
１ケ所、Ｓａ１Ｉで２ケ所、Ｂｇ１ｌｌで１ケ所切断さ
れるＤＮＡ断片をもつブラスミドを１つ得る。このプラ
スミドをＭａｘｍａｎ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（ＰＮＡＳ
７４：５６０−５６４（１９７７））により塩基配列を
決定し、前述のＨｉｔｚｅｍａｎらおよびＤｏｂｓｏｎ
らの結果との比較することにより目的とするＰＧＫ遺伝
子を有することが確認できる。
を制限酵母Ｈｉｎｄ■で切断する。得られた断片のうち
約３．１ｋｂの長さをもつＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２の
Ｈｉｎｄ■切断点にクローニングした酵母の遺伝子ライ
ブラリー（大腸菌）３０１クローンを得る。次にクロー
ン化された約３．１ｋｂのＤＮＡ断片の内ＥｃｏＲＩで
１ケ所、Ｓａ１Ｉで２ケ所、Ｂｇ１ｌｌで１ケ所切断さ
れるＤＮＡ断片をもつブラスミドを１つ得る。このプラ
スミドをＭａｘｍａｎ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（ＰＮＡＳ
７４：５６０−５６４（１９７７））により塩基配列を
決定し、前述のＨｉｔｚｅｍａｎらおよびＤｏｂｓｏｎ
らの結果との比較することにより目的とするＰＧＫ遺伝
子を有することが確認できる。
このようにしてＰＧＫ遺伝子が挿入されたプラスミドを
特定の制限酵素で切断し、上記遺伝子を含むＤＮＡ断片
を選択マーカーを持つ酵母菌ベクター、好ましくは操作
の便宜上大腸菌−酵母シャトルベクターに挿入する。
特定の制限酵素で切断し、上記遺伝子を含むＤＮＡ断片
を選択マーカーを持つ酵母菌ベクター、好ましくは操作
の便宜上大腸菌−酵母シャトルベクターに挿入する。
次に、このベクター中のＰＧＫ遺伝子にある２つのＳａ
１Ｉ切断点のうちＮ末端側にあるＳａ１Ｉ切断部位に、
読みわく（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が合うように
、予じめ得ている目的はペプチド遺伝子を含むＢａｍＨ
ＩとＳａ１Ｉで切断されたＤＮＡ断片を挿入する。この
ようにして得たＰＧＫ遺伝子および目的ペプチド遺伝子
を含むプラスミドにより酵母を形質転換する。
１Ｉ切断点のうちＮ末端側にあるＳａ１Ｉ切断部位に、
読みわく（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が合うように
、予じめ得ている目的はペプチド遺伝子を含むＢａｍＨ
ＩとＳａ１Ｉで切断されたＤＮＡ断片を挿入する。この
ようにして得たＰＧＫ遺伝子および目的ペプチド遺伝子
を含むプラスミドにより酵母を形質転換する。
目的はプチド遺伝子としては外来性異種ペプチド遺伝子
および酵母内のＰＧＫ遺伝子以外のペプチド遺伝子（同
種ペプチド遺伝子）の両方を含むものとする。
および酵母内のＰＧＫ遺伝子以外のペプチド遺伝子（同
種ペプチド遺伝子）の両方を含むものとする。
ＰＧＫ遺伝子の塩基配列の１部（５′末端付近とその上
流の１部およびアミノ酸配列の２７０番目から４００番
目の配列に担当する塩基配列）がＤｏｂｓｏｎらにより
示されているが全塩基配列が不明なため、その構造遺伝
子部に同種または異種遺伝子を挿入し目的とするペプチ
ドを得ようとする場合工夫を要す（何故なら読みはじめ
からのｆｒａｍｅ（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が合
わなければ目的とするペプチドはえられない）。そこで
ＰＧＫ遺伝子にある２つのＳａｌＩ切断点の内Ｎ末端に
近い方のＳｓｌＩ切断点（ｎ末端より約２４０アミノ酸
残基に相当する部位）に、読みわく（ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）を１つずつずらした３種の目的とする遺伝
子（本発明の実施例ではα−ネオエンドルフィン遺伝子
）をクローニングする。このように読みわくを１つずつ
ずらせば、３種の遺伝子の内１つはＰＧＫ遺伝子の読み
はじめからの読みわくが合ったものが得られる筈である
。事実このようにして、発明者らは実施例に示すように
αＮＥペプチドをＰＧＫペプチドとの雑種蛋白として酵
母内で生産するプラスミドベクター（ｐＹαＮＥ６１−
Ｃ）を得ており、上記の手法が正しいことが実施されて
いる。このようにして得たプラスミドにより酵母を形質
転換し、これを培養することにより目的ペプチドを生産
することができる。
流の１部およびアミノ酸配列の２７０番目から４００番
目の配列に担当する塩基配列）がＤｏｂｓｏｎらにより
示されているが全塩基配列が不明なため、その構造遺伝
子部に同種または異種遺伝子を挿入し目的とするペプチ
ドを得ようとする場合工夫を要す（何故なら読みはじめ
からのｆｒａｍｅ（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が合
わなければ目的とするペプチドはえられない）。そこで
ＰＧＫ遺伝子にある２つのＳａｌＩ切断点の内Ｎ末端に
近い方のＳｓｌＩ切断点（ｎ末端より約２４０アミノ酸
残基に相当する部位）に、読みわく（ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）を１つずつずらした３種の目的とする遺伝
子（本発明の実施例ではα−ネオエンドルフィン遺伝子
）をクローニングする。このように読みわくを１つずつ
ずらせば、３種の遺伝子の内１つはＰＧＫ遺伝子の読み
はじめからの読みわくが合ったものが得られる筈である
。事実このようにして、発明者らは実施例に示すように
αＮＥペプチドをＰＧＫペプチドとの雑種蛋白として酵
母内で生産するプラスミドベクター（ｐＹαＮＥ６１−
Ｃ）を得ており、上記の手法が正しいことが実施されて
いる。このようにして得たプラスミドにより酵母を形質
転換し、これを培養することにより目的ペプチドを生産
することができる。
形質転換された酵母において、ＰＧＫ遺伝子プロモータ
ーが目的ペプチド遺伝子の発現に非常に優れていること
が認められた。
ーが目的ペプチド遺伝子の発現に非常に優れていること
が認められた。
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。
具体的実施例では、目的ペプチド遺伝子としてアルフア
ネオエンドルフィン（αＮＥ）遺伝子を用い、ＰＧＫに
プロモーターＰＧＫ構造遺伝子−αＮＥ遺伝子のような
配列から、ＰＧＫ−αＮＥ雑種蛋白質として目的物質（
αＮＥ）を生産する方法を記しているが、ＰＧＫプロモ
ーターの位置から適当な塩基配列をおいて目的遺伝子、
例えばインターフェロンのようなペプチドをコードする
遺伝子を付加し目的ペプチドを直接生産させることもで
きる。このようにＰＣＫプロモーターは広く外来遺伝子
の発現並びにアルファネオエンドルフィン以外の異種お
よび同種ペプチドの生産にも活用されうるものである。
ネオエンドルフィン（αＮＥ）遺伝子を用い、ＰＧＫに
プロモーターＰＧＫ構造遺伝子−αＮＥ遺伝子のような
配列から、ＰＧＫ−αＮＥ雑種蛋白質として目的物質（
αＮＥ）を生産する方法を記しているが、ＰＧＫプロモ
ーターの位置から適当な塩基配列をおいて目的遺伝子、
例えばインターフェロンのようなペプチドをコードする
遺伝子を付加し目的ペプチドを直接生産させることもで
きる。このようにＰＣＫプロモーターは広く外来遺伝子
の発現並びにアルファネオエンドルフィン以外の異種お
よび同種ペプチドの生産にも活用されうるものである。
実施例
１．ＰＧＫ遺伝子のクローニング（第１図参照）ＰＧＫ
遺伝子はすでにＨｉｔｚｅｍａｎらによりクローニング
されており（Ｒ．Ａ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ，Ｌ．Ｃｌａｒ
ｋｅａｎｄ Ｊ．Ｃａｒｂｏｎ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５５ １２０７３，１９８０）、Ｈｉｎｄ■で切
断される約３．１ｋｂ断片に存在し、ＥＣｏＲ■で１ケ
所、ＳａｌＩで２ケ所、Ｂｇｌ■で１ケ所切断される。
遺伝子はすでにＨｉｔｚｅｍａｎらによりクローニング
されており（Ｒ．Ａ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ，Ｌ．Ｃｌａｒ
ｋｅａｎｄ Ｊ．Ｃａｒｂｏｎ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５５ １２０７３，１９８０）、Ｈｉｎｄ■で切
断される約３．１ｋｂ断片に存在し、ＥＣｏＲ■で１ケ
所、ＳａｌＩで２ケ所、Ｂｇｌ■で１ケ所切断される。
又Ｄｏｂｓｏｎらによってもクローニングされ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１０、２６２５
，１９８２）、塩基配列の一部及びアミノ酸配列の一部
が示されている。そこでＨｉｔｚｅｍａｎらの結果を元
にＨｉｎｄ■切断フラグメントジーンバンクよりの選択
を試みた。
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１０、２６２５
，１９８２）、塩基配列の一部及びアミノ酸配列の一部
が示されている。そこでＨｉｔｚｅｍａｎらの結果を元
にＨｉｎｄ■切断フラグメントジーンバンクよりの選択
を試みた。
サツカロマイセス酵母ＸＳ１６−５Ｃ〔ｃｉｒ°〕（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｏＸＳ
１６−５Ｃ：ＭＡＴａ ｌｅｕ ２ ｈｉｓ３ ｔｒｐ
１（ｃｉｒ°）、サントリー生物医学研究所保存菌株）
を２ｌＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン
、２％グルコース）で３０℃２４時間の培養により得ら
れた菌体を、Ｃｒｙｅｒらの方法（Ｍｅｔｂｏｄ ｉｎ
ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２．３９−４４
，１９７５）に従って総ＤＮＡを分離した。このＤＮＡ
５０μｇを１００単位のＨｉｎｄ■を用いて３７℃、２
時間加温することにより切断した。反応液を０．８％ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、２．９ｋｂから３
．２ｋｂに相当するＤＮＡ断片を得た。一方、０．５μ
ｇのｐＢＲ３２２をＨｉｎｄ■１単位を用いてＴＡ緩衝
液中で３７℃１時間反応させることにより切断した。
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｏＸＳ
１６−５Ｃ：ＭＡＴａ ｌｅｕ ２ ｈｉｓ３ ｔｒｐ
１（ｃｉｒ°）、サントリー生物医学研究所保存菌株）
を２ｌＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン
、２％グルコース）で３０℃２４時間の培養により得ら
れた菌体を、Ｃｒｙｅｒらの方法（Ｍｅｔｂｏｄ ｉｎ
ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２．３９−４４
，１９７５）に従って総ＤＮＡを分離した。このＤＮＡ
５０μｇを１００単位のＨｉｎｄ■を用いて３７℃、２
時間加温することにより切断した。反応液を０．８％ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、２．９ｋｂから３
．２ｋｂに相当するＤＮＡ断片を得た。一方、０．５μ
ｇのｐＢＲ３２２をＨｉｎｄ■１単位を用いてＴＡ緩衝
液中で３７℃１時間反応させることにより切断した。
次にこの両ＤＮＡを２０μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝
液に溶解し、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１５
℃１８時間反応させた。この反応液を供与ＤＮＡとして
常法に従いＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に形質転換しアン
ピシリン耐性クローンを得た。
液に溶解し、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１５
℃１８時間反応させた。この反応液を供与ＤＮＡとして
常法に従いＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に形質転換しアン
ピシリン耐性クローンを得た。
そのうちテトラサイクリンに対して感受性のあるクロー
ンを３０１選び、そのプラスミッドＤＮＡの解析をアル
カリ変性法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ７．６．１９７９）により検討した。Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎらの結果によるとＰＧＫ遺伝子を含む約３．１ｋｂ
の断片にはＥｃｏＲＩ（１ケ所）ＳａｌＩ（２ケ所）Ｂ
ｇｌｌｌ（１ヶ所）の切断点が存在する。
ンを３０１選び、そのプラスミッドＤＮＡの解析をアル
カリ変性法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ７．６．１９７９）により検討した。Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎらの結果によるとＰＧＫ遺伝子を含む約３．１ｋｂ
の断片にはＥｃｏＲＩ（１ケ所）ＳａｌＩ（２ケ所）Ｂ
ｇｌｌｌ（１ヶ所）の切断点が存在する。
３０１クローンについて検耐した結果、上記の制限酵素
切断部位を有するプラスミドを持つクローンが１つ得ら
れた。このクローンのプラスミドをｐＹｐｇｋ３０１と
命名した。
切断部位を有するプラスミドを持つクローンが１つ得ら
れた。このクローンのプラスミドをｐＹｐｇｋ３０１と
命名した。
このｐＹｐｇｋ３０１上にあるＰＧＫ遺伝子の上流に相
当する部分をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法に従って塩
基配列を決定し、Ｄｏｂｓｏｎらにより報告されている
ＰＧＫ遺伝子の上流部分の塩基配列と比較検討し、ｐＹ
ｐｇｋ３０１はＰＧＫ遺伝子を持つことを確認した。こ
のｐＹｐｇｋ３０１によって形質転換された大腸菌Ｋ−
１２株はＥ，ｃｏｌｉ ＳＢＭ １５２と命名し工業技
術院微生物工業研究所（微工研）に寄託し寄託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−６７６３を得ている。
当する部分をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法に従って塩
基配列を決定し、Ｄｏｂｓｏｎらにより報告されている
ＰＧＫ遺伝子の上流部分の塩基配列と比較検討し、ｐＹ
ｐｇｋ３０１はＰＧＫ遺伝子を持つことを確認した。こ
のｐＹｐｇｋ３０１によって形質転換された大腸菌Ｋ−
１２株はＥ，ｃｏｌｉ ＳＢＭ １５２と命名し工業技
術院微生物工業研究所（微工研）に寄託し寄託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−６７６３を得ている。
２． ｐＹＥ２３７プラスミドベクターの作製ｐＹＥ２
３７ ベクターは特許昭５６−１６７６１５号に開示さ
れたｐＹＥ２２７ベクターからＳａｌ■切断点を消失さ
せたプラスミドであり、次のように作製された。
３７ ベクターは特許昭５６−１６７６１５号に開示さ
れたｐＹＥ２２７ベクターからＳａｌ■切断点を消失さ
せたプラスミドであり、次のように作製された。
５μｇのｐＹＥ２２７を１０単位のＳａｌＩを用いＴＡ
緩衝液中での３７℃１．５時間反応させ切断した。
緩衝液中での３７℃１．５時間反応させ切断した。
続いて６５℃で加熱することによりＳａｌＩを失活させ
た後、４種のｄＮＴＰを０．３ｍＭ、２−メルカプトエ
クノールを８０ｍＭとなる様に加え、１単位のＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて３７℃３０分間反応させ、Ｓａ
ｌＩ切断で生じた粘着末端を消失させた。反応終了後フ
エノール抽出を１回行つた後、２容のエタノールでＤＮ
Ａを沈殿させた。
た後、４種のｄＮＴＰを０．３ｍＭ、２−メルカプトエ
クノールを８０ｍＭとなる様に加え、１単位のＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて３７℃３０分間反応させ、Ｓａ
ｌＩ切断で生じた粘着末端を消失させた。反応終了後フ
エノール抽出を１回行つた後、２容のエタノールでＤＮ
Ａを沈殿させた。
ｄｎａ沈殿物を２０μｌのＴ４ＤＮＡリガ−ゼ緩衝液に
溶解後、５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い１５℃１８
時間反応させることにより結合させた。
溶解後、５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い１５℃１８
時間反応させることにより結合させた。
反応液を供与ＤＮＡとして常法に従いＥ，ｃｏｌｉＪＡ
２２１に形質転換し、アンピシリン耐性クローンを得た
。これらのクローンよりＤＮＡを分離し解析し、ｐＹＥ
２２７よりＳａｌＩの切断部位の消失したｐＹＥ２３７
を得た。
２２１に形質転換し、アンピシリン耐性クローンを得た
。これらのクローンよりＤＮＡを分離し解析し、ｐＹＥ
２２７よりＳａｌＩの切断部位の消失したｐＹＥ２３７
を得た。
３。ｐＹＥ１３０１酵母−大腸菌シャトルベクターの作
製（第２図参照） ５μｇのｐＹＥ２３７を２０単位のＨｉｎｄ■を用い切
断したものとｐＹｐｇｋ３０１ ５μｇを２０単位のＨ
ｉｎｄ■を用いて切断後、寒天電気泳動法により３．１
ｋｂのＤＮＡフラグメント（ＰＧＫ遺伝子）を分離・精
製そた物を２０μｌのＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解し、
１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃、１６時間反
応させた。この反応液１０μｌを０．３ｍｌのＣａＣｌ
２処理したＥ．ｃｏｌｉＴＡ２２１に加え形質転換を行
った。形質転換体より常法に従いプラスミドＤＮＡを分
離解析しｐＹＥ１３０２を得た。
製（第２図参照） ５μｇのｐＹＥ２３７を２０単位のＨｉｎｄ■を用い切
断したものとｐＹｐｇｋ３０１ ５μｇを２０単位のＨ
ｉｎｄ■を用いて切断後、寒天電気泳動法により３．１
ｋｂのＤＮＡフラグメント（ＰＧＫ遺伝子）を分離・精
製そた物を２０μｌのＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解し、
１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃、１６時間反
応させた。この反応液１０μｌを０．３ｍｌのＣａＣｌ
２処理したＥ．ｃｏｌｉＴＡ２２１に加え形質転換を行
った。形質転換体より常法に従いプラスミドＤＮＡを分
離解析しｐＹＥ１３０２を得た。
このプラスミドベクターｐＹＥ１３０１によってサツカ
ロマイセス酵母ＸＳ１６−５Ｃ株を形質転換し、形質転
換体をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅＳＢＭ３３１と命名し、微工研に寄託した。
ロマイセス酵母ＸＳ１６−５Ｃ株を形質転換し、形質転
換体をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅＳＢＭ３３１と命名し、微工研に寄託した。
（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−６７６７）４ αＮＥ遺伝
子を挿入したプラスミドベクターｐＹＥＮＥ６１ｃの作
製（第２図参照）５μｇの、ｐＹＥ１３０１を２０単位
のＢａｍＨＩ、２０単位のＳａｌＩで３つの断片に切断
し寒天電気泳動にて分離後、一番大きい断片を寒天より
溶出させ精製した。一方αＮＥ遺伝子を含む断片はｐα
ＮＥ−ＳａｌＩ−ａ，−ｂ，−ｃそれぞれ５０μｇを１
００単位のＢａｍＨＩ、１００単位のＳａｌＩを用いて
切断後、５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法
により分離し、αＮＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片（それぞ
れ４８塩基対、４９塩基対、５０塩基対に相当するＤＮ
Ａ断片）をそれぞれ分離し、精製した３種のαＮＥ遺伝
子を含むＤＮＡ断片およびそれぞれ先のｐＹＥ１３０１
のＨｉｎｄ■断片を２０μｌのＤＮＡリガーゼ緩衝液に
溶解し２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃１６時
間反応させた。この反応液１０μｌを０．３ｍｌのＣａ
Ｃｌ２処理したＥ．Ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に加え形質転
換を行った。得られたアンピシリン耐性形質転換体より
プラスミドＤＮＡを分離し解析し、ｐＹαＮＥ６１−ａ
、−ｂ、−ｃを得た。
子を挿入したプラスミドベクターｐＹＥＮＥ６１ｃの作
製（第２図参照）５μｇの、ｐＹＥ１３０１を２０単位
のＢａｍＨＩ、２０単位のＳａｌＩで３つの断片に切断
し寒天電気泳動にて分離後、一番大きい断片を寒天より
溶出させ精製した。一方αＮＥ遺伝子を含む断片はｐα
ＮＥ−ＳａｌＩ−ａ，−ｂ，−ｃそれぞれ５０μｇを１
００単位のＢａｍＨＩ、１００単位のＳａｌＩを用いて
切断後、５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法
により分離し、αＮＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片（それぞ
れ４８塩基対、４９塩基対、５０塩基対に相当するＤＮ
Ａ断片）をそれぞれ分離し、精製した３種のαＮＥ遺伝
子を含むＤＮＡ断片およびそれぞれ先のｐＹＥ１３０１
のＨｉｎｄ■断片を２０μｌのＤＮＡリガーゼ緩衝液に
溶解し２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃１６時
間反応させた。この反応液１０μｌを０．３ｍｌのＣａ
Ｃｌ２処理したＥ．Ｃｏｌｉ ＪＡ２２１に加え形質転
換を行った。得られたアンピシリン耐性形質転換体より
プラスミドＤＮＡを分離し解析し、ｐＹαＮＥ６１−ａ
、−ｂ、−ｃを得た。
以上得られたプラスミドｐＹＥ１３０１，ｐＹαＮＥ６
１−ａ，−ｂ，−ｃをＢｅｇｇｓ．Ｊ．Ｄ．Ｎａｔｕｒ
ｅ，Ｖｏｌ．２７５、１０４（１９７８）に記載の方法
に従って酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ＸＳ１６−５Ｃ）に形質転換した。得られ
た形質転換体をＹＰＤ（１％イーストエキス、２％ポリ
ペプトン、２％グルコース）培地で３０℃、２４時間振
とう培養後、遠心分離により菌体を回収した。１ｍｌの
培養液から得られた菌体に０．５ｍｌの冷アセトンを加
え、−２０℃で１〜２４時間放置した後、アセトンを真
空下で除いた。この様にして得られた乾燥菌体を５ｍｇ
／ｍｌの臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液に懸濁し、２
４時間暗所で反応させた。この試料を凍結乾燥後０．１
ｍｌの０．１Ｎ酢酸でαＮＥ溶出させ０．１ｍｌの１．
３Ｍのトリス塩酸緩衝液で中和後ラジオイムノアツセイ
（ＲＩＡ）の試料とした。ＲＩＡはＮ．Ｍｉｎａｍｉｎ
ｏ ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ Ｖｏｌ １０２ ２２６（
１９８１）に記載の方法に準じて行った。
１−ａ，−ｂ，−ｃをＢｅｇｇｓ．Ｊ．Ｄ．Ｎａｔｕｒ
ｅ，Ｖｏｌ．２７５、１０４（１９７８）に記載の方法
に従って酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ＸＳ１６−５Ｃ）に形質転換した。得られ
た形質転換体をＹＰＤ（１％イーストエキス、２％ポリ
ペプトン、２％グルコース）培地で３０℃、２４時間振
とう培養後、遠心分離により菌体を回収した。１ｍｌの
培養液から得られた菌体に０．５ｍｌの冷アセトンを加
え、−２０℃で１〜２４時間放置した後、アセトンを真
空下で除いた。この様にして得られた乾燥菌体を５ｍｇ
／ｍｌの臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液に懸濁し、２
４時間暗所で反応させた。この試料を凍結乾燥後０．１
ｍｌの０．１Ｎ酢酸でαＮＥ溶出させ０．１ｍｌの１．
３Ｍのトリス塩酸緩衝液で中和後ラジオイムノアツセイ
（ＲＩＡ）の試料とした。ＲＩＡはＮ．Ｍｉｎａｍｉｎ
ｏ ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ Ｖｏｌ １０２ ２２６（
１９８１）に記載の方法に準じて行った。
その結果を表１に示した。ｐＹαＮＥ６．１−ｃに高い
αＮＥ生産性が見られた。ｐＹαＮＥ６１−ａ，−ｂは
対照としたαＮＥ遺伝子を含まないｐＹＥ１３０１と同
じ程度のラジオイムノ反応性であった。従って読みわく
は、ｐαＮＥ−Ｓａｌ■−ｃのものがＰＧＫのこのＳａ
ｌＩ切断部位と合っていることが判明した。ｐＹαＮＥ
６１−ｃのαＮＥ生産性は単細胞あたり約２００万分子
生産した。これは別途行ったＧＡＰ−ＤＨ遺伝子を用い
た場合とほぼ同程の生産性であった。
αＮＥ生産性が見られた。ｐＹαＮＥ６１−ａ，−ｂは
対照としたαＮＥ遺伝子を含まないｐＹＥ１３０１と同
じ程度のラジオイムノ反応性であった。従って読みわく
は、ｐαＮＥ−Ｓａｌ■−ｃのものがＰＧＫのこのＳａ
ｌＩ切断部位と合っていることが判明した。ｐＹαＮＥ
６１−ｃのαＮＥ生産性は単細胞あたり約２００万分子
生産した。これは別途行ったＧＡＰ−ＤＨ遺伝子を用い
た場合とほぼ同程の生産性であった。
第１図〜第３図はＰＧＫ遺伝子を含みαＮＥ遺伝子を組
込んだプラスミドの構成法を示す図である。 第１図はＰＧＫ遺伝子のクローニングを示す。 第２図はＰＧＫ遺伝子を含みαＮＥ遺伝子を組込んだプ
ラスミドの構成法を示す。 第３図はＰＧＫ遺伝子の３’末端非翻訳部位が付加され
たプラスミドの構成法を示す。 特許出願人 サントリー株式会社 代理人 弁理士 湯 浅 恭 三 （外４名） 手続補正書 昭和５８年１０月１９日 特許庁長官 若杉和夫殿 １．事件の表示 昭和５７年特許願第１８４２９２号 ２発明の名称 解糖系酵素支配遺伝子プロモーター利用酵母発現ベクタ
ープラスミドおよびその利用方法３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称 （１９０）サントリー株式会社 ４代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１番 新大
手町ビル２０６号室（電話２７０−６６４１〜６）氏名
（２７７０）弁理士 湯浅恭三 ５補正の対象 明細書の〔発明の詳細な説明〕と〔図面の簡単な説明〕
の欄図面の第２図と第３図 ６補止の内容 （１）明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後６
４〜５ 前述の・・・ （削除）
および ７ ５〜６ およびアミノ酸 （削除）
配列・・・・に 相当する塩基配 列 １０〜１１ 読みはじめから よみはじめか
らの のｆｒａｍｅ 読みわく
１３ ５ Ｈｉｎｄ■ Ｈｉｎｄ■
１３ ＴＡ■ ＪＡ２２１１４
２ ｐＹαＮＥ６１ｃ ｐＹαＮＥ６１ｃ
１８ Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｅ．ｃｏｌｉ
１７ ８〜９ 第３図は・・・ （削除）
を示す。 （２）図面中第３図を削除し、第２図を添付図面の通り
訂正する。 以上
込んだプラスミドの構成法を示す図である。 第１図はＰＧＫ遺伝子のクローニングを示す。 第２図はＰＧＫ遺伝子を含みαＮＥ遺伝子を組込んだプ
ラスミドの構成法を示す。 第３図はＰＧＫ遺伝子の３’末端非翻訳部位が付加され
たプラスミドの構成法を示す。 特許出願人 サントリー株式会社 代理人 弁理士 湯 浅 恭 三 （外４名） 手続補正書 昭和５８年１０月１９日 特許庁長官 若杉和夫殿 １．事件の表示 昭和５７年特許願第１８４２９２号 ２発明の名称 解糖系酵素支配遺伝子プロモーター利用酵母発現ベクタ
ープラスミドおよびその利用方法３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称 （１９０）サントリー株式会社 ４代理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１番 新大
手町ビル２０６号室（電話２７０−６６４１〜６）氏名
（２７７０）弁理士 湯浅恭三 ５補正の対象 明細書の〔発明の詳細な説明〕と〔図面の簡単な説明〕
の欄図面の第２図と第３図 ６補止の内容 （１）明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後６
４〜５ 前述の・・・ （削除）
および ７ ５〜６ およびアミノ酸 （削除）
配列・・・・に 相当する塩基配 列 １０〜１１ 読みはじめから よみはじめか
らの のｆｒａｍｅ 読みわく
１３ ５ Ｈｉｎｄ■ Ｈｉｎｄ■
１３ ＴＡ■ ＪＡ２２１１４
２ ｐＹαＮＥ６１ｃ ｐＹαＮＥ６１ｃ
１８ Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｅ．ｃｏｌｉ
１７ ８〜９ 第３図は・・・ （削除）
を示す。 （２）図面中第３図を削除し、第２図を添付図面の通り
訂正する。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）３−ホスホグリセロキナーゼを支配している遺伝子
のプロモーターを含み、目的ペプチド遺伝子を酵母中で
発現させるプラスミド。 ２）３−ホスホグリセロキナーゼを支配している遺伝子
のプロモーターと目的ペプチド遺伝子とを含むプラスミ
ドを作製し、このプラスミドにより形質転換された酵似
を培養することにより目的ペプチドを生産する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184292A JPS5974987A (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184292A JPS5974987A (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974987A true JPS5974987A (ja) | 1984-04-27 |
Family
ID=16150771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57184292A Pending JPS5974987A (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5974987A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60248181A (ja) * | 1984-05-23 | 1985-12-07 | Shiseido Co Ltd | 酵母発現ベクタ− |
-
1982
- 1982-10-20 JP JP57184292A patent/JPS5974987A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60248181A (ja) * | 1984-05-23 | 1985-12-07 | Shiseido Co Ltd | 酵母発現ベクタ− |
| JPH0249715B2 (ja) * | 1984-05-23 | 1990-10-31 | Shiseido Co Ltd |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2519023B2 (ja) | インシュリン前駆体 | |
| JP2641457B2 (ja) | 酵母プロモーター | |
| EP0080848B1 (en) | Stabilizing & selecting cells | |
| EP0100561A1 (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
| JPH0757190B2 (ja) | 酵母中でのポリペプチドの発現 | |
| JPH0513630B2 (ja) | ||
| JPS61119192A (ja) | 高等真核生物細胞における非ｂＧＨポリペプチドの発現用の組換えＤＮＡ分子 | |
| JPH0657154B2 (ja) | 所望のポリペプチドを発現させるためのクローニングビーイクル | |
| JPH0759193B2 (ja) | 外来性蛋白質発現用クロ−ニングベクタ− | |
| JPH0767665A (ja) | 成熟インスリンの生産のための遺伝子系 | |
| EP0077689A2 (en) | Method of gene manipulation using an eukaryotic cell as the host | |
| EP0109560A2 (en) | Yeast plasmid vector capable of induced expressing and method of using said plasmid | |
| US4960704A (en) | Modified antibiotic resistance gene | |
| JPH0716432B2 (ja) | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 | |
| JPS5974987A (ja) | 解糖系酵素支配遺伝子プロモ−タ−利用酵母発現ベクタ−プラスミドおよびその利用方法 | |
| EP0135291B1 (en) | A modified antibiotic resistance gene | |
| US5756313A (en) | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin | |
| EP0339567A1 (en) | Expression of Hepatitis B PreS 2 Protein in Methylotrophic Yeasts | |
| JPH07114702B2 (ja) | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 | |
| EP1905836A1 (en) | Recombinant Pichia pastoris strains and process for the production of recombinant human interferon alpha | |
| JP2625379B2 (ja) | 酵母の高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 | |
| WO1990002810A1 (en) | Production of interleukin-2 polypeptides in pichia pastoris yeast cells | |
| JP2766651B2 (ja) | 遺伝子の発現を高める方法 | |
| JP2518862B2 (ja) | 新規プラスミドベクタ― | |
| JP2625379C (ja) |