JPS596897A - 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 - Google Patents
固定化酵素を用いた生体成分の定量法Info
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- JPS596897A JPS596897A JP11808982A JP11808982A JPS596897A JP S596897 A JPS596897 A JP S596897A JP 11808982 A JP11808982 A JP 11808982A JP 11808982 A JP11808982 A JP 11808982A JP S596897 A JPS596897 A JP S596897A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素を用いた生体成分の定量法に関する
。
。
従来、生体成分、例えば血清中に微量〈存在する胆汁酸
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によって直１− 液検出することが困難な場合に＃′ｉ、酵素の触媒作用
を利用して、被測定成分と酵素の存在下に反応する反応
物を予め加えておいた試料液を固定化＃素が充填された
カラムに導き、そこで被測定成分と反応物を反応（せ還
元型補酵素を生成させ、これを蛍光検出器により検出し
、試料液中に含まれる被測定成分の量を算出することが
行われている。
等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成分を例えば蛍光
光度計等の検出器によって直１− 液検出することが困難な場合に＃′ｉ、酵素の触媒作用
を利用して、被測定成分と酵素の存在下に反応する反応
物を予め加えておいた試料液を固定化＃素が充填された
カラムに導き、そこで被測定成分と反応物を反応（せ還
元型補酵素を生成させ、これを蛍光検出器により検出し
、試料液中に含まれる被測定成分の量を算出することが
行われている。
例えば胆汁酸の定量においては、予めニコチン酸アミド
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ十と略す）を加え
た試料液を、酵素３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーセ（以下３ｏｌ−Ｈ８Ｄと略す）が固定化された
担体が充填された固定化酵素カラムに通してそこで胆汁
酸とＮＡＤ十とを反応させ、その結果、胆汁酸と等モル
量の蛍光物質ＮＡＤ）Ｉを生成させて該ＮＡＤＨを蛍光
光度計で検出するか、又は、上記で発生させたＮＡＤＨ
をレサズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用によっ
てＮＡＤＫ酸化させると同時にレサズリンを還元させて
蛍光物質であ２− るレゾルツインを生成させ、該レゾルフィンの蛍光を測
定することが行われている。
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ十と略す）を加え
た試料液を、酵素３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーセ（以下３ｏｌ−Ｈ８Ｄと略す）が固定化された
担体が充填された固定化酵素カラムに通してそこで胆汁
酸とＮＡＤ十とを反応させ、その結果、胆汁酸と等モル
量の蛍光物質ＮＡＤ）Ｉを生成させて該ＮＡＤＨを蛍光
光度計で検出するか、又は、上記で発生させたＮＡＤＨ
をレサズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用によっ
てＮＡＤＫ酸化させると同時にレサズリンを還元させて
蛍光物質であ２− るレゾルツインを生成させ、該レゾルフィンの蛍光を測
定することが行われている。
しかしながら生体試料中には種々の酵素、例えば胆汁酸
分析の場合には乳酸脱水素酵素が含まれており、かかる
酵素がカラム内で還元型補酵素を生成し、本来検出器で
検出されるべきでないにも拘らず検出されて被測定成分
の測定値に対して正の誤差を与える原因となる。したが
って乳酸脱水素酵素のような、生戚試粁中の、被測定成
分に対する妨害酵素を予じめ不活性化しておくことが要
求されてきた。
分析の場合には乳酸脱水素酵素が含まれており、かかる
酵素がカラム内で還元型補酵素を生成し、本来検出器で
検出されるべきでないにも拘らず検出されて被測定成分
の測定値に対して正の誤差を与える原因となる。したが
って乳酸脱水素酵素のような、生戚試粁中の、被測定成
分に対する妨害酵素を予じめ不活性化しておくことが要
求されてきた。
このため従来から妨害酵素の不活性化のために、を
生体試料ゞ系外において一々希釈し犬凌を加熱したり、
妨害酵素を不活性化するための薬剤を生体試料に混合す
ることが行なわれてきた。しかし実験室的な規模で行な
う場合はとも角、大体の検体を処理するような場合には
人手、手間が掛りすぎる欠点があった。
妨害酵素を不活性化するための薬剤を生体試料に混合す
ることが行なわれてきた。しかし実験室的な規模で行な
う場合はとも角、大体の検体を処理するような場合には
人手、手間が掛りすぎる欠点があった。
本発明の要旨は、被測定成分を含む生体試Ｎ液を固定化
酵素を入れたカラムに導入し、カラム３− 内で固定化酵素と生体試料液を接触させて被測定成分の
反応を生じさせ、反応生成物である還元型補ｒ４＃８を
検出器で測定することにより被測定成分量を定量する方
法において、前記カラムに生体試料液を導入する前に生
体試料液を加熱槽に導き被測定成分に対する妨害酵素を
熱処理により予じめ不活性化しておくことを特徴とする
、固定化酵素を用いた生体成分の定量法に存する。
酵素を入れたカラムに導入し、カラム３− 内で固定化酵素と生体試料液を接触させて被測定成分の
反応を生じさせ、反応生成物である還元型補ｒ４＃８を
検出器で測定することにより被測定成分量を定量する方
法において、前記カラムに生体試料液を導入する前に生
体試料液を加熱槽に導き被測定成分に対する妨害酵素を
熱処理により予じめ不活性化しておくことを特徴とする
、固定化酵素を用いた生体成分の定量法に存する。
次に本発明固体化酵素を用いた生体成分の定量法につい
て図面を参照しながら史に詳細に説明する。
て図面を参照しながら史に詳細に説明する。
１ｉ１緩衝液槽であり、槽内の緩衝液には酵素の作用に
より被測定成分と反応しうる成分、例えば胆汁酸分析の
場合はＮＡＤ十等が加えられている。２は低圧定流量ポ
ンプであり、緩衝液を定流量で送液するために設けられ
る。
より被測定成分と反応しうる成分、例えば胆汁酸分析の
場合はＮＡＤ十等が加えられている。２は低圧定流量ポ
ンプであり、緩衝液を定流量で送液するために設けられ
る。
３は被測定成分を含む生体試料の注入器であり、注入器
３内で生体試料と緩衝液とが合流する。
３内で生体試料と緩衝液とが合流する。
生体試料と緩衝液はコイル状の流通管路４を流４−
通する間に両者が均一に混合された生体試料液となる。
５は加熱槽で套り、流通管路４はこの加熱Ｗｉ５に導か
れて生体試料液が熱処理される。
れて生体試料液が熱処理される。
熱処理は生体試料中に含有される検出目的外の還元型補
酵素を生成するような妨害酵素、例えば胆汁酸分析の場
合は乳酸脱水素酵素等を不活性化すゐために施されるも
のであり、約７０℃付近の温度に加熱され石のが好まし
い。又、熱処理効果を向上させるために加熱槽５内Ｋ１
通管路６もコイル状になされている。加熱槽５により熱
処理が施された生体試料液は次いで流通管路７を通過さ
れる。この流通管路７ｉｔ、管の内径が細くなっており
、加熱槽５での加熱により流通する生体ＩＫＰＦ液中に
気泡が生じないように背圧をかけ、又加熱槽５を通過す
ることにより加熱された生体試料液を放冷するために設
けられてｉる。
酵素を生成するような妨害酵素、例えば胆汁酸分析の場
合は乳酸脱水素酵素等を不活性化すゐために施されるも
のであり、約７０℃付近の温度に加熱され石のが好まし
い。又、熱処理効果を向上させるために加熱槽５内Ｋ１
通管路６もコイル状になされている。加熱槽５により熱
処理が施された生体試料液は次いで流通管路７を通過さ
れる。この流通管路７ｉｔ、管の内径が細くなっており
、加熱槽５での加熱により流通する生体ＩＫＰＦ液中に
気泡が生じないように背圧をかけ、又加熱槽５を通過す
ることにより加熱された生体試料液を放冷するために設
けられてｉる。
次いで生体試料液は固定化酵素を入れたカラム８に導入
され、カラム８内で固定化酵素と生体試料液を接触させ
る。生体試料液はカラム８内Ｓ − で酵素と接触することによりその触媒作用を受け、被測
定成分が液中の反応成分と反応して反応生成物である還
元型補酵素を生成する。還元を補酵素を生成した生体試
料液社、カラム８を出た後検出器９に達し、還元型補酵
素の定量が行なねれる。そして還元型補酵素の量から生
体試料中の被測定成分の量を求めることができる。
され、カラム８内で固定化酵素と生体試料液を接触させ
る。生体試料液はカラム８内Ｓ − で酵素と接触することによりその触媒作用を受け、被測
定成分が液中の反応成分と反応して反応生成物である還
元型補酵素を生成する。還元を補酵素を生成した生体試
料液社、カラム８を出た後検出器９に達し、還元型補酵
素の定量が行なねれる。そして還元型補酵素の量から生
体試料中の被測定成分の量を求めることができる。
検出器９によシ還元型′Ｓ酵素の定量が行なわれた生体
試料液は系外に排出される。
試料液は系外に排出される。
本発明方法によれば、カラムに生体試料液を導入する前
に生体試料液を加熱槽に導き被測定成分に対する妨害酵
素を熱処理によシ予じめ不活性化しておくことにより、
生体試料中に含有される妨害酵素により被測定成分が検
出目的外の還元型補酵素を生成することがないものとな
り、精度よく被測定成分の定量が出来るものとなる。
に生体試料液を加熱槽に導き被測定成分に対する妨害酵
素を熱処理によシ予じめ不活性化しておくことにより、
生体試料中に含有される妨害酵素により被測定成分が検
出目的外の還元型補酵素を生成することがないものとな
り、精度よく被測定成分の定量が出来るものとなる。
実施例
ｍｉ約ｓｏミクロンのセルロース徽粒子會担体として用
い、該微粒子５−にイオン交換水５ｄ。
い、該微粒子５−にイオン交換水５ｄ。
２Ｍ次酸ナトリクム水溶液１０ｍを加えて撹拌６一
１−だのち、これに予めシアン化ブロマイドｇｆＩｔ−
濱解したアセトニトリル１ｍを加え、激しく撹拌しつつ
９０秒間反応させた。こうして活性化させたセルロース
徽粒子をすばやくａＩＭ択酸緩衡液（ＰＨ９，５）、イ
オン交換水及びＱ５Ｍの塩化ナトリウムを含む（ＩＩＭ
次酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）で洗浄したのち、３ｆｆ−
Ｈ８Ｄ４４〜を溶解させた１１５Ｍの塩化ナトリウム′
に含むａ１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ牧５）５−を加え、室瓢
で２時間撹拌して反応させた。
濱解したアセトニトリル１ｍを加え、激しく撹拌しつつ
９０秒間反応させた。こうして活性化させたセルロース
徽粒子をすばやくａＩＭ択酸緩衡液（ＰＨ９，５）、イ
オン交換水及びＱ５Ｍの塩化ナトリウムを含む（ＩＩＭ
次酸緩衝液（Ｐ Ｈ９，５）で洗浄したのち、３ｆｆ−
Ｈ８Ｄ４４〜を溶解させた１１５Ｍの塩化ナトリウム′
に含むａ１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ牧５）５−を加え、室瓢
で２時間撹拌して反応させた。
次に上記の処理により３α−Ｈ５Ｄを固定化した微粒子
表面上なお存在する活性点をブロックするため、（ＬＯ
５９６の２−メルカプトエタノールを含む（ＬＩＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ＰＨ＆Ｏ）中で４℃で８時開反応させ
た。
表面上なお存在する活性点をブロックするため、（ＬＯ
５９６の２−メルカプトエタノールを含む（ＬＩＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ＰＨ＆Ｏ）中で４℃で８時開反応させ
た。
かくして得られた酵素同定化微粒子をａ５Ｍの塩化ナト
リウムを含むａ１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨＦＬＯ）、イオン
交換水及び（Ｌ５Ｍの塩化ナトリウムを含むＱＩＭ駅酸
緩衝液（ＰＨ９，５）で繰シ返し洗浄したのち、長さ１
ＯＱｓ＊ｍ、内径４−７− のカラムに充填し、固定化酵素充填カラムを用意した。
リウムを含むａ１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨＦＬＯ）、イオン
交換水及び（Ｌ５Ｍの塩化ナトリウムを含むＱＩＭ駅酸
緩衝液（ＰＨ９，５）で繰シ返し洗浄したのち、長さ１
ＯＱｓ＊ｍ、内径４−７− のカラムに充填し、固定化酵素充填カラムを用意した。
上記のようにして得たカラムを第１図のカラム８として
用い、１／中にＮＡＤ＋１９９９を含むａ１Ｍピロリン
酸緩衝液（ＰＨ９，５）を緩衝液槽ｌに入れ、次いで低
圧定流量ポンプ２でα５ｍｌ／分の流量で送液し、送液
が安定した時点で健康人の血清α０１ｙｆｆｌを注入器
３から注入した。血清と緩衝液は管径がα８１Ｉｊｌの
コイル状の流通管路４を通過する間に混合され約１０倍
に稀釈された。次いで加熱槽５に管径がａ８ＩＩｇのコ
イル状の流通管路６を通過する間に、加熱槽５内の７０
℃の熱水により約１分間の熱処理が施され、血清中に存
在する乳酸脱水素酵素等の検出目的外の還元型補酵素を
生成する妨害酵素が不活性化された。
用い、１／中にＮＡＤ＋１９９９を含むａ１Ｍピロリン
酸緩衝液（ＰＨ９，５）を緩衝液槽ｌに入れ、次いで低
圧定流量ポンプ２でα５ｍｌ／分の流量で送液し、送液
が安定した時点で健康人の血清α０１ｙｆｆｌを注入器
３から注入した。血清と緩衝液は管径がα８１Ｉｊｌの
コイル状の流通管路４を通過する間に混合され約１０倍
に稀釈された。次いで加熱槽５に管径がａ８ＩＩｇのコ
イル状の流通管路６を通過する間に、加熱槽５内の７０
℃の熱水により約１分間の熱処理が施され、血清中に存
在する乳酸脱水素酵素等の検出目的外の還元型補酵素を
生成する妨害酵素が不活性化された。
更に管径がα２５ ｍ＋１１の流通管路７を通過し、放
冷された後、蛍光検出器により励起波長３６０１ｍ、蛍
光波長４６０ｎｍで検出対象となる還元型補酵素が測定
された。
冷された後、蛍光検出器により励起波長３６０１ｍ、蛍
光波長４６０ｎｍで検出対象となる還元型補酵素が測定
された。
８−
クツデオキシコール酸を標準試料として検量線を作製し
、試料血清の血中総胆汁酸量を求めると５μモル／ｊで
あった。又比較のために加熱槽５を使用しなめ状態で測
定した血中総胆汁酸量Ｆｉ７μモル／ｌであった。
、試料血清の血中総胆汁酸量を求めると５μモル／ｊで
あった。又比較のために加熱槽５を使用しなめ状態で測
定した血中総胆汁酸量Ｆｉ７μモル／ｌであった。
この結果は熱処理がされない場合ｉｔ、試料血清中に還
元型補酵素を生成するような妨害酵素により２μモル／
ｌの正の誤差を生ずることを示している。
元型補酵素を生成するような妨害酵素により２μモル／
ｌの正の誤差を生ずることを示している。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明方法における生体成分の定量装置の概要
図である。 符号の説明 ｌ緩衝液槽、２定流量ポンプ、−３・注入器、４．６．
７流通管路、５加熱槽、８カラム、９検出器 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 膝 沼 基 利 ９−
図である。 符号の説明 ｌ緩衝液槽、２定流量ポンプ、−３・注入器、４．６．
７流通管路、５加熱槽、８カラム、９検出器 特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 膝 沼 基 利 ９−
Claims (1)
- り被測定成分を含む生体試料液を固定化酵素を入れたカ
ラムに導入し、カクム内で固定化酵素と生体試料液を接
触させて被測定成分の反応音生じさせ、反応生成物であ
る還元型補酵素を検出器で測定することＫより被測定成
分量を定量する方法において、前記カラムに生体試料液
を導入する前に生体試料液を加熱槽（導き被測定成分に
対する妨害酵素を熱処理により予じめ不活性化しておく
ことを特徴とする、固定化酵素を用いた生体成分の定量
法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11808982A JPS596897A (ja) | 1982-07-06 | 1982-07-06 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11808982A JPS596897A (ja) | 1982-07-06 | 1982-07-06 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS596897A true JPS596897A (ja) | 1984-01-13 |
Family
ID=14727717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11808982A Pending JPS596897A (ja) | 1982-07-06 | 1982-07-06 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS596897A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5935846A (en) * | 1995-06-20 | 1999-08-10 | Schumacher; Johannes | Device for determining the activity of enzymes in liquids |
| EP0995803A2 (en) * | 1998-10-20 | 2000-04-26 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Sample treating kit and sample treating method using the same for analysis with a biosensor |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5444597A (en) * | 1977-09-14 | 1979-04-09 | Shimadzu Corp | Measuring method of bile acids |
| JPS5638200A (en) * | 1979-09-06 | 1981-04-13 | Hitachi Plant Eng & Constr Co Ltd | Solid-liquid separating method for anaerobic digestive slurry |
| JPS56169596A (en) * | 1980-05-29 | 1981-12-26 | Shimadzu Corp | Biochemical analysis using immobilized enzyme column |
-
1982
- 1982-07-06 JP JP11808982A patent/JPS596897A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5444597A (en) * | 1977-09-14 | 1979-04-09 | Shimadzu Corp | Measuring method of bile acids |
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| US6171851B1 (en) | 1995-06-20 | 2001-01-09 | Johannes Schumacher | Process and device for determining the activity of enzymes in liquids, or the concentration and/or activity of inhibitors in liquids |
| EP0995803A2 (en) * | 1998-10-20 | 2000-04-26 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Sample treating kit and sample treating method using the same for analysis with a biosensor |
| EP0995803A3 (en) * | 1998-10-20 | 2001-11-07 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Sample treating kit and sample treating method using the same for analysis with a biosensor |
| US6867002B2 (en) | 1998-10-20 | 2005-03-15 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Sample treating kit and sample treating method using the same for analysis with a biosensor |
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