JPS5966885A - ペニシリウム属菌株の生産するｃｍｃ加水分解酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペニシリウム属の糸＋１：　？Ｒにより生産坏
れてカルボギンメチルセルロース（ＣＭＣ）　−（ｉ　
強力に々日永分解するがアビセルには殆ん、ど作用し２
ない好熱、性の新規な酵素、β−１，４−グリコシドヒ
ドロラーゼに関し、またその製造法に関する。

セルラーゼは食品及び薬品両分野において広く用いられ
ている繊維素分解酵素であシ、セルロースのβ−１・　
４−グリコシド結合を水解し、最終的にはグル、□弓−
スを１成せしめる。　　、　　、Ｉ　　。

′″／′５７、−Ｗ　ｌｊ；　、各種の菌〒、及、、び
′、゛クーリヤによりて生産されるが、一般には、それ
ぞれ異なった活性を有する多斂の酵素よ構成る複合酵素
である。

その中には、結晶蒜セル・−スミ用してその結晶構造を
破壊するＣＩ　　酵素と、ＣＩ　　酵素による分解産物
をセロオリゴ糖に□まで分解するＣＸ　酵素と、更に七
ロオ・リボ糖按〆ルコースにまで分解するｌ−クルコシ
ターセとが区別されているりとのようにセルラー場はｉ
合糸の酵素として、その活性を十分に発現するため、砂
質の優れた個ｋ（Ｄ酵８・を組ｆｉ、□、Ｌ　員７５ｆ
アきオ、オよ、よりゃヵヵセルラーゼ系を構成し得ると
考づ−られる。従って性質の優れた個々の酵素を生産、
収倚することは産業上大いに有用であってい本発明の目
的の１つもその点にある。

上記Ｃ１酵素、Ｃｘ　酵素及びβ−グルコシダーゼは酵
素化学的には基質を取代ることにより分別町；（するこ
とがｒ＋Ｊ能であシ、ｃＸ　酵素０通常ＣＭ′Ｃを基質
にして、遊離して〈Ｚ）グリコゾル残ノ１１の還元：力
によ・す、その活性が測定される。

、本発明者らは、本発明者らに」：って新ら、だに採ａ
’＠’　ｈ　ｃ　糸状ｍ　”＝しＩＪ　ウＡ　、７　Ｉ
Ｊ　−ｐ　ｘ　＞　ｐ　＞ス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
　ｆｒｅｑｕｅｎｔａｎｓ、）と同電された糸状菌が強
力なセルラーゼ系の酵ぶを生産することを見出した。七
〇酵素系を鋭、？′聚倹討１．たｔ吉北、その中に強力
にＣＭ’Ｃを水））了するがアビセルには作用し□ない
好熱件の新規酊車、夛り占シト”ヒドラーゼが含−１１
１−１いることを見出しＪこれを１気にして従って、第
一の本発明の要旨とするところに１、イニ７リウム属に
に１ｊづる糸状菌に□よ□す、宇１１れてカルホキ／メ
チルセルロース（’、、ｃ　ｐ、ｙｒ　ｃ　）　’ｔ　
強力に水１り７す、Ｌ　Ｃ、Ｍ　Ｃ−β−１・　４９す
３　’／　ｌ’、　ヒ！”　ｒｙラーゼであって、しが
も至適ｐｉがＣＭＣを基質にするとｐＨ４，０付近にあ
り、ｐｈｉ　安定性トＬ　テｌｌ、４５０Ｃ１２時間の
処理で１）■１４．０〜７．５で安定てあシ、作用至適
温度は６５°Ｃ＋１近であり、温度安定Ｐ１・とＬ５て
は５０°ｃｔでは安定であるがＢ”’ｏｃ″Ｃでは完全
に失活する性質を示し、さもに本酵素は濾紙崩壊活性を
全く示さＶ、アビセルにも作□用せず、ｃ　ＭＣＫ対し
特異的に作用すること、セロオリゴ・糖に対する作用で
は、セロビオースに８．全く作用しないが、セロトリオ
ース及びセロデトラオースには弱く作用し、ぞれ以」二
のＤＰのセロオリゴ糖には比較的良く作用ず２．こと、
し２かもＰ−ニトロフェニル−β−Ｄ−七ロビオシドに
は全く作用シナイことの井ｆｆ！ＸＩｎ異性を示し、分
子Ｒ−は約３．６万（ＳＤＳポリアクリルアミドディス
ク電気泳動法ニヨる）であり、等電点はｐＩ　３−４９
　（キャリヤーアンフオライト使用の等’ｒ：’ｊ点分
画法点上画法である特性を有プることを性徴とする、Ｃ
ＭＣ−□β−１，４−グリコシドヒドラーゼにある。

本発明の新規’ｐ、、’ｐ索を上述のように他酵素と組
合せることにより、強力なセルラー場複合酵素な檜成し
うろことが期待されるが、を差、本酵素がアビセル等の
結晶性毎ルロースレζは作）１１しないという特性を生
かして、それ以外め成ａ）を氷解・除去１、てセルロー
スを純化・梢クリするごとに応ｊ１１できる。

帖ｆ、第２の本発明１ｄ、、−’！ニゾリウム（４にじ
するＣんＩＣ−β−１，４−グリコシド°ヒドラーゼ４
４＝産菌を培養して、ＣＭＣ−β−１・　４−グリコシ
ドヒドラーゼを生産させ、その培養物から該酵ス（を採
集することを特徴とする、木酔累の製造法に係わる。

本発明のｎ７素の製造に使用嬬れる１・１１１′、（ン
／）−例にｒ、ｔ　、発明者らが南アルプス山１７ｉ　
ｊ１１＋帯にて採ｇ１４１．だ土壌より単離したもので
イニシリウム・フリークエン叉ンスとし、て微工研に寄
託した菌（ｐｐ；ｒｔｐ、’ｒ−・ｐ、　６ｔ＋７）が
ある。： 本閑株の菌学的性質は次の通りである。

１）各種培地における発育状態　・　　　　−・（イ）
　シア４寒天外天培Ｊ＋ｈ　　′速やかに生育し、２５
°Ｃ１２週間で＝１中ニーは直径３　ｃｍ前後になる。

宵緑色で密外ビロード状集落を形成し、・縁辺は白色を
呈する。

裏面ｄ、くずんだ黄色から後シてかン色に変わる；（ロ
）　麦芽寒天培地 速やかに生育し、青緑色で密なビロード状集落を形成す
る。縁辺は白色を呈し２、裏面は明るい褐色から後に暗
褐色に変わる。

２）生理的性質　　　　　　　□ （イ）□生育ｐｍ（ ｐＴ１３．５〜９．５の囲域で生育できるが、生育の至
適はｐ）ｉ６．ｏ〜７．０である。

（ロ）　生育温度 １０°〜４０°Ｃの濡変域で生育するが、２３〜２８°
Ｃに生育至適温桝がある。

３）形態的特徴 分生子柄昧無色で基底菌糸から直中し、非分枝または数
本の分枝を生ずる。

ベニシリはほとんど単輪生体、フイアライドは密に平行
して着生し長さ１０〜１４μ、径２．５〜３μである。

分生子は球形で直径３〜４μでスムース、１００〜２０
０μ程度にカラム様連鎖する。

以上の所見をもとに、ケイ・ピー・レイパ（Ｋ。

ＩＳ、　Ｒａｐｅｒ　）　　およびシー−）　ム（ｔシ
、　１’ｈＯｍ　）著のア・マニュアル・オブ・ザ・４
ニジＩＪ　７　（Ａ　Ｍａ、−ｎｕａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｐｓｎｉｃｉｌｌｉａ　）、１９４９年、ザ・ライＩ
Ｊ　７　Ｊ−ス・アンド・クイルキンス・コアｉｅニー
〔Ｔｈｅ’　Ｗｉ　ｌｌｉＲｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ
　Ｃｏｍｐａｎｙ、バニチモア（＋３ａｌｔ４ｍｏｒ　
）　］　　によって本菌を分スｒ１すＩ＃、　ｔｅｌ、
ベニシ’几ム＠　、単輪生些堕群のペニシリウム・フリ
ークエンタンｙ、　（Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｕｎ　ｆｒｅ
ｑｕｅｎｔａｎｓ　）と同定きれる・　　　　′　　　
　　　　　□木閏（ネを使用１−、てＣＭ　Ｃ−β佳　
４−グリコジルヒドロラーゼを生成、取イリする坏発明
の方法の実施について、以下！／？−詳述する。

先ず＋善に使用する一１１Ｊ　Ｋ　ｔ；］：、当該Ｗ３
　ａが利用しイ得るｉ源、窒ｉ、無（（すＩｏ）および
その他の栄養源が添加さｉする。即ち、炭素ぶとしては
、例えば、（ルコース、　可溶）ｑてＸ７ぷん、：デキ
ストリン、　　コーンミールなどがあシ、窒素源として
はペプトン、　大豆粕、　綿実粕、　小麦フスマ、　コ
ーンスチープリカー等の有抑祠若シ、くけアンモニウム
塩類、硝酸塩類等の無機窒翠化合物が使用される。又、
無機塩類として各種リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩等の化合
物、更に菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン、酵
母エキス、核ｍ等の物質を添加することが有効である。

培養を行うには先ず前培養によって得られる種菌め培養
液を生産培地に接種することが好ましい。

培養は通常２０〜４００Ｃの温度下で行うが、特に２５
〜３０°Ｃが好腟しい温度である培養時間は通常４日〜
２週間である。

培養終了後、固体培養の場合には、水を加えて抽出する
が、液体培養の場合は、酵素が培養液中に遊離してくる
ので、そのまま精製工程に進めることができる。

培養によシ生成した＃素は従来、酵素精製に使用されて
いる公知の方法を組合せ石ことによシ精製される。即ち
、培養液より、濾過又は遠心分離によって菌体及び固型
分を除去し、ｐ液に硫安、硫酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等の水溶性無機埴類を添加して塩析を行ない、更
にイメン交換樹脂、イオン交換セファデックスによる吸
着、□溶出′（、セファデックス１．パイメケ゛ルによ
るケ゛）’　ｔｊ”　過などの通常の酵素精刺法によっ
て木酊累を和ヰコできる。　　　　　　　　・ 本酵素の純品（、−Ｔイネク知“気泳動的に）を、得２
）方法を以下に述べる。、培養物の水抽出液を８０飽和
の４Ｍｊ安で塩析し１．その後アン／’Ｆ−ライ）ＣＯ
−５０のノ１ラムに通液、吸着し７て、ノミツフ、アニ
σＪｐＨ及び＠ｉＫｉ″、な段階的に上昇ギしめて目的
画分、を浴部する。更（にの両分をバイオケ°ルＰ−６
０を用いてケ゛ル濾過を行ない次いで活性画分客ＳＰ−
七ファデツクスＣ−５０のカラムに通液吸焙せしめ−Ｃ
、バッファーのｐＨ及ブ塩９１１度を段階的に上昇して
目的ｉｉＴ＋ｉ分を溶出する。続いて２回目（ｊ−々イ
メケ゛ルＰ−６０によるケ゛ルｐ過を行って活は両分を
回収し、最後にキャリャーアン：ソ］ライト充用いての
等１（１点分画を行い、デイズク箱−気泳！Ｉ！１的に
ｌｉｓ、　−な酵素′Ｉｃ得るうとができる。　　　　
　。

各希製段階における蛋白量、活４４１″、収率、比活性
なξは２例えの：次の表に示す顎ｊυである。

本発明によって得られるＣＭＣ−β−１，４−グリコジ
ルヒドロラーゼめカニ：測測定はソモギー・ネルノン法
によシ以下のごとく行う。即ちｐＴ１４．０の酢酸パラ
ツギ−中、ＣＭＣ（終め度０．２５チ）に酵素を作用さ
せ、反応の結果生じた趙元糖をソモギー・ネルノン法に
より４ｍＬ、、力価を求める。

酵素反応は通常３０°Ｃで打い、この条件下で１μモル
のグルコースに相当□する還元糖を生成する酵累力を１
単位とする。また蛋白質１．ローリ−法によシ定量す為
。　　　　　　□ 本発明で得られるＣＭＣ−β−１，４−グルコシルヒド
ロラーゼの理化学的性質は更に列挙すると、次の通シで
ある。　　　　　□　　　□■　作用及び基質Ｉｒｆ墨
性 本酵素はｐ紙崩壊活性を全く示さず〈アビセルにも作用
せず、ＣＭＣを特異的に水解する。

本酵素はセロビオースには全く作用しないが、セロトリ
オース、′セロット２オースにば弱く作用し、それ以上
のＤＰめセロオリゴ糖には比較的良く作用する。本酵素
はセロ）　ＩＪオースの基’ｌｆ７ナロクｆ’　、％　
ルＰ−ニトロフェニルーβ−Ｄ−セロビオシド（、β−
ＰＮＰＣ，）　ＶＣは全く：作用しない。

セロ４ンクオスに作用さギ、Ｔ生ずる反応生成物のアノ
マー分析、から１．生成物ｔ、ｌ、β型である。

ＣＭＣに対する「：Ｙ＄反応のギネフイ久ス分析により
、本酵素はエンド型のセルラーヤである。

■　反応デボｐｌ＋及びｐＦ１安定件　　　。

ＣＭＣを基質に１．た場合、本酵素の反応至適ｐＨｉ’
ｊ、　４．、　Ｏ付近にあ、る。ｐＨ嫉、、対する安定
性的二つ、いてをまＡ　、５７Ｃ、、２時間、の処理で
はｐ１１５・、　２５−７７．２５の範囲で９０％以上
の残存活性を示す。、ｓ　、６ｃ、、２４時間処理では
ｐＨ５，２５〜７．８０の範囲で９０係以−ヒの残存活
性を示−す。

■　反応至適温度及び温度安定性 ｃ　ｒｔａ　Ｃを基質にした場合、木・酵素の反［”ｒ
ｘ至適温度は６：５６Ｃ付近にちる。１０分間の加Ｆ、
３処理では５０°Ｃま・ではＩＱＯチ活性を保ち、くれ
以上になると活性は次第炉低下し、８０°Ｃτは完。

全、に失活する。

■分子長 Ｓ　Ｄ　Ｓ　ｙＪ！リアクリルアミドグルのディスク電
気泳動法により測定すると、約３．６万の値を得る。但
しバイオーｒルＰ−１００のｒルア過法で測定すると、
約１７，０００　　の値である。

０等１「点 キャリヤアンフオライト（ＬＫＢ社製）を用いた等＠２
点分画法により測定し、ｐ！　３．４９の値を得る。

本発明によるＣ　Ｍ　Ｃ−β−１，４−グリコシルヒｔ
゛ロラーゼは以上のごとき諸性質を有しているが、本酵
素使用の利点を１泰的見地から見ると０）本酵素のＣＭ
Ｃ氷解活性（Ｃｘ　酵素活性）は強力でＣ１酵素及びβ
−グルコシダーゼと組合せることによυ、よシ強力なセ
ルラーゼ系が構成し得る、（２）本酵素は結晶性セルロ
ースには作用しないので、それ以外の成分を氷解・除去
してセルロースの純化・精剃に用いるととができる、（
３）本酵素の至適ｒＦｊＡ度が６５°Ｃと従来のＣＭＣ
加水分解酵素（トリコブルｉ、アスイルギルス等）よシ
も高く、より高温での使用に適していることである。

次に実施例についてオ、発明を説明Ｊるが、本発明はこ
の笑施例によって制限されるものて（弓−を−い。

実施例１ ０．６３％硫酸亜鉛１０−１０．６３チ硫酸第１鉄１０
ゴ、０．６３　％塩化−ｒ　ンｉｆ　ン０．０８　％（
６ｊｉＯＮｆ？−ｆｌ　１０献、２規定塩酸＋００−を
含有して＋ｔＫｒｇｖ製した魚捜塩溶液６７５　ｒｒｆ
、を小麦フスマ／１５０．９に加えてなる培地を５００
−の三角フラスコ１５木に均等（（分注し、１２０’″
Ｃで２Ｑ分間加出殺菌金おこなつプζ０冷却後、？Ｃわ
、に「を株ベニシリクム・フリークエンタンス（Ｐｅｎ
１ｃｉｌ目ｕｍ　ｆｒｅｑｕｅｎｔａｒ＋ｓ　’）（Ｆ
ＩＣＲＭ　−Ｐ　６７＋７　）の培イ９スラン）・より
１白金耳を接種１〜．２８°Ｃで２週間静置培養を・行
なった。

培養終了後、これを室温で３日間風乾し、その後乾燥７
スマ１．？に幻し１ｏｔｒｒｅの水を加えｒ［”ｆ累を
抽出し７た。抽出は室部で６時間行ない、ぞの（々４Ｃ
ｃで１晩放置し、ナイロン布で済過Ｌｆｔ　ｏ炉液を１
２・０００　ｒ、ｐ、ｍ・２０分間遠心分附［７不溶物
を除去し、袴られた上清を粗酵素（１１１出液と（、、
た。

更にζ、本酵素のＭ品を得るため丸、上記抽出液を８０
チ飽和の硫安で塩析し、さらに脱塩後、アンバーライト
ＣＧ−５Ｑのカラムに吸着して、バッファーのｐＨ及び
塩濃度を段階的に上昇せしめて目的画分を溶離した。更
にこの両分をバイオデルＰ　−６０ヲ用いてケ゛ル濾過
を行い、次いでＳＰ−セファデックスＣ−５０のカラム
に吸着して、バッファーのｐＨ及び塩濃度を段階的に上
昇せしめて目的両分を溶出した。続いて２回目のバイオ
ヶ°ルＰ−６０によるケ９ル濾過を行い、最後に、キャ
リヤーアンフオライトを用すでの―市点分両を行った。

以上の精製工穆妬より、ディスク電気泳動的に単一な酵
素を得ることができた。硫安堵析物がら出発しての活性
収ホは５．４チ、比活件は約３０倍上昇し、得られたｍ
紫純品の活性性５４．８Ｕｎｉｔ　　−／ｍｏであった
。

４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペニシリウム属に机する糸状菌によシ生産されてカ
   ルボギンメチルセルロース（ｃＭｃ）Ｔｈ強力に水解す
   るＣＭＣ−β−１，４−グリコシドヒドロラーゼであっ
   て、しかも至適ｐＨがＣＭＣを基質にするとｐＨ４，０
   付近にあり、ｐ１１安定性としでは、４５°Ｃ２２時間
   の処理で囲４．０〜７．５で安定であり、作用至適温度
   は６５’Ｃ付近にあり、ｍ度安定性としては５０ｃＣま
   では安定であるがｇｏ’ｃ。 では完全に失活する性質を葉し、さらに本酵素は濾紙崩
   壊活性を全く示さず、アビ：セルにも作用せず、ＣＭＣ
   に対し特異的に作用すること、セロオリゴ糖に対する作
   用では、セロビオースには全く作用しないが、セロトリ
   オース及び七ロフトラオース、には弱く作、用し、それ
   以上のＤＰのセロオリゴ糖には比較的良く作用すること
   、しかもＰ−ニ）ｏフェニル−７−Ｄ−七ロビオシドに
   は全く作用しない、ことの基質特、１％性を示［７、分
   子量ｔｊ約３．６万（Ｓ　Ｉ）　Ｓ、ｙ３？リアクリル
   アミドディスク雷気泳即ｊ法による）であり、等電点け
   ｐＩ　３，４９　（キャリーミーアンフオライト使用の
   等雷点分画法にλン・）である特憤を有することを特徴
   とする、ＣＭＣ−β−１，４−グリコシド”ヒト９ラー
   ゼ。 ｇ−””ン’Ｊ’７Ａｉｉに鶏するＣＭＣ−β−１，４
   −グリコシドヒドラーゼ牛産菌金培養Ｌ［、ＣＭＣ−β
   −１，４−グリコシドヒドラーゼヲ生産させ、培養物か
   ら該酵素を採集することを４″ｊ徴とする、Ｃ八・ＩＣ
   −β−１，４−グリコ／ドヒドラーセ′の製造法。