JPS5959197A - Preparation of coenzyme q10 - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To prepare coenzyme Q10 efficiently, by cultivating a bacterium capable of producing coenzyme Q10 in the presence of a nonionic surface active agent. CONSTITUTION:A bacterium such as Pseudomonas diminute ATCC 11568 belonging to the genus Pseudomonas, Achrobacterium, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, etc., capable of producing coenzyme Q10, is cultivated in the presence of 0.01-0.15, preferably 0.03-0.07wt% nonionic surface active agent shown by the formula (m, m', and n are any integers), preferably one having a structure wherein (m+m') is 1-30, and n is 25-40 at 25-40 deg.C at 5-9pH, and coenzyme Q10 is collected from the culture mold.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵法による補酵素ＱＩＧの製造法に関する
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing coenzyme QIG by fermentation.

補酵素Ｑ１ｏはユビキノン１０とも呼ばれ、下等動植物
から高等動物に至るまで広く生物組織中に存在し、末端
の電子伝達系の構成成分として、生物体内におけるエネ
ルギー代謝に重要な生理的役割を有し、その薬理機能と
して、高血圧症、冠状動脈硬化症、弁膜症などに伴なう
狭心症状、うつ血症状全改善することなどが知られ、そ
れらの治療薬として実用に供されている。□ 従来、発酵法による補酵素Ｑ、。の製造法に関しては、
各種の細菌、酵母、糸状菌全培養し、菌体中から補酵素
Ｑ、。全採取する方法が報告されているが、いずれも菌
体中の補酵素ＱＩＯ含有量が低いために、補酵素Ｑ、ｏ
　ｋ工業的かつ安価に生産することが困難であった。Coenzyme Q1o, also called ubiquinone 10, is present in a wide range of biological tissues, from lower animals and plants to higher animals, and plays an important physiological role in energy metabolism within living organisms as a component of the terminal electron transport chain. However, its pharmacological function is known to completely improve angina and depressive symptoms associated with hypertension, coronary artery sclerosis, valvular heart disease, etc., and it is put into practical use as a therapeutic agent for these diseases. □ Conventionally, coenzyme Q is produced by fermentation method. Regarding the manufacturing method of
All kinds of bacteria, yeast, and filamentous fungi are cultured, and coenzyme Q is extracted from the fungi. Methods have been reported in which whole cells are collected, but in both cases the coenzyme QIO content in the bacterial cells is low.
k It was difficult to produce industrially and inexpensively.

そこで、本発明者らは、補酵素Ｑ＋ｏ　ｋ工業的に、よ
り有利に生産するため、菌体中の補酵素Ｑ１ｏ含有箪ヲ
さらに増大せしめる方法一ついて研究を行なった結果、
補酵素Ｑｌｏの生産能を有する微生物を、下記一般式で
示される非イオン界面活性剤の存在下で培養することに
より、菌体内の補酵素Ｑ１ｏ含量を顕著に増加させ得る
ことを見出し、本発明を完成した。Therefore, the present inventors conducted research on a method for further increasing the amount of coenzyme Q1o contained in bacterial cells in order to industrially produce coenzyme Q+o more advantageously.
It has been discovered that by culturing a microorganism capable of producing coenzyme Qlo in the presence of a nonionic surfactant represented by the following general formula, the content of coenzyme Q1o within the microorganism can be significantly increased, and the present invention completed.

ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２０）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２）　ｎ　（Ｃ
Ｈ２ＣＨ２０）ｍ／　ＨＣＨ。HO(CH2CH20)m(CH2CH2)n(C
H2CH20)m/HCH.

（式中、ｍ、ｎ、ｍ’は任意の整数を表わす。）本発明
においては、補酵素Ｑ、。の生産能を有する微生物とし
て、例えば、シュードモナス属に属するシュードモナス
・デイミニュータ、シュードモナス°デニトリフィカン
ス、シュードモナス・シュイルキリエンシス々と、アグ
ロバクテリウム属に属するアグロバクテリウム・ツメフ
ァシェンスなど、ロドスピリラム属に属するロドスピリ
ラム・ルフラムなど、ロドシュードモナス属に属するロ
ドシュードモナス・カブシュラータ、ロドシュードモナ
ス・スフェロイデス、ロドシュードモナス・パルストリ
スなど、いずれの菌株を用いても、上記非イオン界面活
性剤の添加効果が見られる。(In the formula, m, n, and m' represent arbitrary integers.) In the present invention, coenzyme Q. Examples of microorganisms that have the ability to produce The effect of adding the above-mentioned nonionic surfactant can be seen no matter which strain is used, such as Rhodospirillum ruflam, Rhodopseudomonas cavusulata, Rhodopseudomonas sphaeroides, and Rhodopseudomonas palustris belonging to the Rhodopseudomonas genus.

本発明における微生物の培養に用いる培地としては、炭
素源、窒素源、無機塩、ビタミン々どの微量要素をほど
よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいず
れも使用できる。すなわち、炭素源としては有機酸、ア
ルコール類、炭化水素類、糖類、油類など、窒素源とし
てはアンモニア態窒素、硝酸態窒素、有機窒素などが用
いられる。As the medium used for culturing the microorganisms in the present invention, either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains an appropriate amount of trace elements such as carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, and vitamins. That is, as a carbon source, organic acids, alcohols, hydrocarbons, sugars, oils, etc. are used, and as a nitrogen source, ammonia nitrogen, nitrate nitrogen, organic nitrogen, etc. are used.

また、その他カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩
、リン酸塩などの無機塩類および金属類の硫酸塩あるい
は硝酸塩彦どが用いられる。これらの培地に、一般式 ％式％ （式中、ｍ、ｍ’、ｎは任意の整数を表わす。）で示さ
れる非イオン界面活性剤、例えばプロノン（日本油脂製
品）などを添加して培養を行なうが、その非イオン界面
活性剤は（ｍ　十ｍ勺が１〜３０、ｎが２５〜４０の構
造のものが良く、例えばプロノン２０１．２０４（いず
れも日本油脂製品）などが使用される。その至適の添加
濃度は口１口１〜０．１５％で、より好１しくけ０．０
３〜０．０７チ添加して培養を行なう。In addition, inorganic salts such as potassium salts, sodium salts, calcium salts, phosphates, and metal sulfates or nitrates are also used. A nonionic surfactant represented by the general formula % (where m, m', and n represent arbitrary integers), such as pronone (NOF product), is added to these media for cultivation. The nonionic surfactant is preferably one with a structure in which m is 1 to 30 and n is 25 to 40, such as Pronone 201 and 204 (both products of NOF). The optimum addition concentration is 1 to 0.15% per mouthful, more preferably 0.0% per mouthful.
Culture is carried out by adding 3 to 0.07 h.

培養温度は２５〜４０℃が適当で、ｐＨは５〜９で培養
するのが好捷しい。The appropriate culture temperature is 25-40°C, and the pH is preferably 5-9.

培養終了後は、常法どおり、例えば連続式遠心分離機あ
るいはドラムフィルターを用いて集菌し、抗酸化剤存在
下でケン化後、有機溶剤（例えば、メタノール、クロロ
ホルム、ヘキサンなト）で抽出し、シリカゲルによるカ
ラムクロマトグラフィーによって精製することにより、
精製補酵素Ｑ＋。After culturing, collect bacteria using a conventional method such as a continuous centrifuge or drum filter, saponify in the presence of an antioxidant, and extract with an organic solvent (e.g., methanol, chloroform, hexane, etc.). and purified by column chromatography on silica gel.
Purified coenzyme Q+.

を得ることができる。can be obtained.

培地中に存在する上記非イオン界面活性剤の補酵素Ｑ１
ｏの生産に及はす影響を、各種菌株を用いて調べた実験
例全以下に示す。Coenzyme Q1 of the above nonionic surfactant present in the medium
The effects on the production of O were investigated using various strains. All experimental examples are shown below.

実施例 グルコース２チ、グリセリン２チ、ペプトン１チ、酵母
エキス０．３％、塩化ナトリウム０．２チ（ｐＨ６，８
）から成る培地に、さらにプロノン２０４を０．０５チ
添加し、この培地１０　、ｑ　ｔｎｌを含む５０〇−容
フラスコに、表１に示した各菌株全移植し、＝　５− ３２℃で７２時間振盪培養を行なった。Example 2 parts glucose, 2 parts glycerin, 1 part peptone, 0.3% yeast extract, 0.2 parts sodium chloride (pH 6,8
) was further added with 0.05 μl of Pronone 204, and all of the strains shown in Table 1 were transplanted into a 500-volume flask containing 10 μl of this medium. A shaking culture was performed for hours.

※ 値はプロノン２０４無添加を１００とした相対比率を示
す。* Values indicate relative ratios with no pronone 204 added as 100.

この結果から、表１に示したいずれの菌株においても、
プロノン２０４は補酵素Ｑ、ｏ含量を増加させることが
わかる。From this result, in any of the strains shown in Table 1,
It can be seen that pronone 204 increases the content of coenzyme Q, o.

次に、表２に示した各種非イオン界面活性剤の　６− 補酵素Ｑ、。の生産に及ぼす影響を調べた実験例を以下
に示す。Next, 6-coenzyme Q of various nonionic surfactants shown in Table 2. An example of an experiment investigating the effect on production is shown below.

実施例 実験例１と同じ培地に各種非イオン界面活性剤（日本油
脂製品）　ｉ　０．０５　％添加して、実験例１と同様
にしてロドシュードモナス・スフェロイデスＡｓ−１０
５６３株（微工研菌寄第５２５２号）を移植培養を行な
った。Examples Rhodopseudomonas sphaeroides As-10 was grown in the same manner as in Experimental Example 1 by adding 0.05% of various nonionic surfactants (NOF products) to the same medium as in Experimental Example 1.
563 strain (Feikoken Bacteria No. 5252) was transplanted and cultured.

示す。show.

この結果から、各種非イオン界面活性剤の中でもプロノ
ン２０４が補酵素Ｑ１゜の生産には顕著な効果を示して
いることがわかる。These results show that among various nonionic surfactants, pronone 204 has a remarkable effect on the production of coenzyme Q1°.

次に、表３に示した一般式ＨＯ（ＣＨ，ｃＨ２ｏ）ｍ（
ＣＨ。Next, the general formula HO(CH,cH2o)m(
CH.

ＣＨＯ）　Ｈ（ＣＨ２０Ｈ２０）ｍ’Ｈ（ｍ　、　ｍ’
　、　ｎは任意の整数をＣＨ。CHO) H(CH20H20)m'H(m, m'
, n is any integer.

表わす）で示される非イオン界面活性剤の補酵素Ｑ＋ｏ
の生産に及ばず影響を調べた実験例を以下に示す。Coenzyme Q+o of the nonionic surfactant represented by
An example of an experiment in which the impact on production was investigated is shown below.

実施例 実験例１と同じ培地に、上記一般式金有する非イオン界
面活性剤（日本油脂製品）ｉｎ、０５％添加して、実験
例１と同様にしてロドシュードモナス・スフェロイデス
Ａｓ−１０５６５株（微工研菌寄第５２５２号）全移植
培養を行なった。EXAMPLES Rhodopseudomonas sphaeroides strain As-10565 (minimal (Koken Bacillus No. 5252) Whole transplant culture was performed.

この結果から、プロノン２０１、プロノン２０４が補酵
素Ｑｓｏの生産には顕著な効果を示していることがわか
る。すなわち、（ｍ十ｍ’）が１〜６０、ｎが２５〜４
０の構造のものが補酵素Ｑ、。含量の増加に効果がある
。This result shows that pronone 201 and pronone 204 have a remarkable effect on the production of coenzyme Qso. That is, (m10m') is 1 to 60, and n is 25 to 4.
The structure of 0 is coenzyme Q. Effective in increasing content.

界面活性剤ｐ菌体内補酵素Ｑｒｏ含量に及ばず影響０非
イオン界面活性剤無添加を１００とした相対比率を示す
。Surfactant p has no effect on the coenzyme Qro content in the bacteria, and the relative ratio is shown with 100 being no nonionic surfactant added.

次に、非イオン界面活性剤プロノン２０４（日本油脂製
品）添加濃度を変化させて、補酵素Ｑ、。の生産に及ぼ
す影響を調べた実験例を図面に示す。Next, by changing the concentration of nonionic surfactant Pronone 204 (NOF product), coenzyme Q was added. The figure shows an example of an experiment in which the effect of this on production was investigated.

この結果から、プロノン２０４添加濃度が０．０１９− ％’ｆｒ超えると補酵素Ｑ１゜含量が急激に増大し、０
．０１〜０．１．５　％の範囲でその促進効果が特に太
きく、０．０３〜０．０７　％がよシ至適である。From this result, when the concentration of pronone 204 added exceeds 0.019-%'fr, the content of coenzyme Q1° increases rapidly;
．． The promoting effect is particularly strong in the range of 0.01 to 0.1.5%, and the optimum range is 0.03 to 0.07%.

実施例１ 実験例１と同じ培地にプロノン２０４（日本油脂製品）
ｉｏ、０５％添加して、２０を容培養槽に培地１１２７
入れ、シュードモナス・デニトリフィカンス（ＡＴＣＣ
１３８ｔ５７）を移植後、３００ｒｐｍ。Example 1 Pronone 204 (NOF product) was added to the same medium as in Experiment 1.
io, add 0.5% and add 20% medium to the culture tank 1127
Pseudomonas denitrificans (ATCC)
138t57), 300 rpm.

０．５　ｖｖｍ、　　３２℃で７２時間培養後、生成し
た補酵素Ｑ＊ｏ　ｋ常法によりケン化抽出し定量した。After culturing at 32° C. for 72 hours at 0.5 vvm, the produced coenzyme Q*ok was saponified and extracted using a conventional method and quantified.

同時に対照区としてプロノン２０４無添加培養も行なっ
た。その結果は表４に示すとおりである。At the same time, a culture without the addition of pronone 204 was also carried out as a control group. The results are shown in Table 4.

表　　　４ −１０− をらにプロノン２０４添加区菌体を常法によりケン化、
エタノールにより抽出後、シリカケルカラムでクロロホ
ルム：ベンゼン（９５：５）で溶出後、エタノール晶析
して補酵素Ｑ、。３０Ｉｎ９の結晶を得た。才だ、対照
区からも同様にして２２ｍｇの結晶を得た。Table 4 -10- After saponifying the pronone 204-added bacterial cells by a conventional method,
After extraction with ethanol, eluting with chloroform:benzene (95:5) using a silica gel column, and crystallizing with ethanol to obtain coenzyme Q. Crystals of 30In9 were obtained. Similarly, 22 mg of crystals were obtained from the control plot.

実施例２ 実施例１と同様にして、アグロバクテリウム・トウ、メ
ファシエンス（ＩＦＯ３０５８）を移植後、培養を行々
い、同様にして定量した。その結果は表５に示すとおり
である。Example 2 In the same manner as in Example 1, Agrobacterium tow and mefaciens (IFO3058) were transplanted, cultured, and quantified in the same manner. The results are shown in Table 5.

表　　５ 実施例３ 実施例１と同様にして、ロドスピリラム・ルブラム（Ｉ
ＦＯ３９８６）を移植後、培養全行ない、同様にして定
量した。その結果は表６に示すとおりである。Table 5 Example 3 Rhodospirillum rubrum (I
After transplantation of FO3986), all cultures were carried out and quantified in the same manner. The results are shown in Table 6.

表　　　６ 実施例４ 実施例１と同様にして、ロドシュードモナス・スフェロ
イデスＡｓ−１０４Ｍ３株（微工研菌寄第５２５２号）
を移植後、培養全行ない、同様にして定量した。その結
果は表７に示すとおりである。Table 6 Example 4 In the same manner as in Example 1, Rhodopseudomonas sphaeroides As-104M3 strain (Feikoken Bacteria No. 5252) was grown.
After transplantation, all cultures were cultured and quantified in the same manner. The results are shown in Table 7.

表　　７ 従来、発酵法による補酵素Ｑ、ｏの製造において、本発
明のような一般式で示される非イオン界面活性剤の存在
が、菌体中の補酵素Ｑ、。の含有量を増大せしめること
は全く知られておらず、これは本発明者らによりはじめ
て見出されたものでアリ、工業的に容易に安価に収率良
く多量の補酵素Ｑ＋ｏ’ｅ製造することを可能にした。Table 7 Conventionally, in the production of coenzyme Q, o by a fermentation method, the presence of a nonionic surfactant represented by the general formula as in the present invention has caused coenzyme Q, o in the bacterial cells. It has not been known at all that the content of coenzyme Q+o'e can be increased, and this was discovered for the first time by the present inventors. made it possible.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

図面は培地中のプロノン２０４濃度と菌体中の補酵素Ｑ
、。含量の関係を相対比率（無添加を１００とする）で
示したグラフである〇 ＝　１３　＝ −１２− 金々°１閘牡The figure shows pronone 204 concentration in the medium and coenzyme Q in the bacterial cells.
,. This is a graph showing the relationship between contents in relative proportions (with no additives set as 100).

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）補酵素Ｑ＋ｏの生産能を有する微生物を、一般式 （式中、ｍ、ｍ’、ｎは任意の整数を表わす。）で示さ
れる非イオン界面活性剤の存在下で培養すること全特徴
とする補酵素Ｑ１ｏの製造法。(1) Cultivating a microorganism capable of producing coenzyme Q+o in the presence of a nonionic surfactant represented by the general formula (where m, m', and n represent arbitrary integers). Characteristic method for producing coenzyme Q1o. （２）補酵素Ｑ＋ｏの生産能を有する微生物がシュード
モナス属、アグロバクテリウム属、ロドスピリラム属、
ロドシュードモナス属に属する微生物である特許請求の
範囲第１項記載の補酵素Ｑ、。の製造法。(2) Microorganisms that have the ability to produce coenzyme Q+o include Pseudomonas, Agrobacterium, Rhodospirillum,
The coenzyme Q according to claim 1, which is a microorganism belonging to the genus Rhodopseudomonas. manufacturing method. （３）非イオン界面活性剤の（ｍ十ｍ′）が１〜３０、
ｎが２５〜４０であり、その添加濃度が０．０１〜０．
１５％である特許請求の範囲第１項または第２項記載の
補酵素Ｑ＋ｏの製造法。(3) nonionic surfactant (m10m') is 1 to 30,
n is 25 to 40, and the addition concentration is 0.01 to 0.
15% of coenzyme Q+o according to claim 1 or 2.