JPS5955185A - ５−ブロモ及び５−ヨ−ドデオキシウリジンに対して特異的なモノクロ−ナル抗体を分泌するハイブリド−マ並びに細胞増殖測定用試薬 - Google Patents
５−ブロモ及び５−ヨ−ドデオキシウリジンに対して特異的なモノクロ−ナル抗体を分泌するハイブリド−マ並びに細胞増殖測定用試薬Info
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- JPS5955185A JPS5955185A JP58151450A JP15145083A JPS5955185A JP S5955185 A JPS5955185 A JP S5955185A JP 58151450 A JP58151450 A JP 58151450A JP 15145083 A JP15145083 A JP 15145083A JP S5955185 A JPS5955185 A JP S5955185A
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- cell
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- C07K—PEPTIDES
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡ合成の測定プロセスに使用される物質、
よシ詳細には５−ブロモデオキシウリジン（Ｂｒｄ Ｕ
ｒｄ ）及びヨードデオキシウリジン（ＩｄＵｒｄ）に
特異的な抗体を産生ずる生きた細胞の製造、及び融合ハ
イブリッド細胞による前記化合物に特異的なモノクロー
ナル抗体の製造に係る。
よシ詳細には５−ブロモデオキシウリジン（Ｂｒｄ Ｕ
ｒｄ ）及びヨードデオキシウリジン（ＩｄＵｒｄ）に
特異的な抗体を産生ずる生きた細胞の製造、及び融合ハ
イブリッド細胞による前記化合物に特異的なモノクロー
ナル抗体の製造に係る。
バイブＩＪ Ｑドーマ細胞は細胞増殖を測定するだめの
純粋試薬として使用される抗体を産生ずる。
純粋試薬として使用される抗体を産生ずる。
細胞複製が行なわれているが否かを判断するため及び薬
物、ホルモン等に対する細胞の応答を検査するためにＤ
ＮＡ合成が測定される。 。
物、ホルモン等に対する細胞の応答を検査するためにＤ
ＮＡ合成が測定される。 。
細胞複製を検出するためには通常は、・［：’Ｈ，）
−チミジン又は別のＤＮＡ前駆物質がＩ）ＮＡに取込ま
れたことを示せばよい。
−チミジン又は別のＤＮＡ前駆物質がＩ）ＮＡに取込ま
れたことを示せばよい。
これはオートラジオグラフィー又はシンチレーションカ
ウント法によって検出される。これらの方法については
、Ｔａｙｌｏｒ等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
ウント法によって検出される。これらの方法については
、Ｔａｙｌｏｒ等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
本国、４３ ： １２２（１９５７）及びＲ，１３ａｓ
ｅｒｇａ及びり、 Ｍａｌａｍｕｄ、 Ａｕｔｏｒａｄ
ｉｏｇｒｌａｐｂＦ ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、 ハーバ−、ニューヨーク（
１９６９）、に記載されている。
ｅｒｇａ及びり、 Ｍａｌａｍｕｄ、 Ａｕｔｏｒａｄ
ｉｏｇｒｌａｐｂＦ ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、 ハーバ−、ニューヨーク（
１９６９）、に記載されている。
オートラジオグラフィーの方法では、 ［１Ｈ） −Ｉ
）ＮＡが取込まＪｔだ顕微鏡スライドを写真乳剤のスラ
イドに軍ねる６崩壊トリチウムが放出する粒子に乳剤が
露光されるまで十分な期間乳剤担持スラ、、イドを岬持
する。これには通常数日間ｆ！：要し数週間の長さに亘
ることも有り得る。
）ＮＡが取込まＪｔだ顕微鏡スライドを写真乳剤のスラ
イドに軍ねる６崩壊トリチウムが放出する粒子に乳剤が
露光されるまで十分な期間乳剤担持スラ、、イドを岬持
する。これには通常数日間ｆ！：要し数週間の長さに亘
ることも有り得る。
スライドを写真的に現像すると崩壊トリチウムから発し
た放射線による乳剤の′かぶり（ｆｏｇｇｉｎｇ）″空
観察される。この放射線のため、Ｔ）ＮＡ中に［’Ｈ：
１−チミジン金取込んだ細胞があるところのみ乳剤中の
銀粒子が可視化される。従うて、集団全体の中の１）Ｎ
Ａ合成細胞の割合ｆ：顕微鏡で測定七得る。
た放射線による乳剤の′かぶり（ｆｏｇｇｉｎｇ）″空
観察される。この放射線のため、Ｔ）ＮＡ中に［’Ｈ：
１−チミジン金取込んだ細胞があるところのみ乳剤中の
銀粒子が可視化される。従うて、集団全体の中の１）Ｎ
Ａ合成細胞の割合ｆ：顕微鏡で測定七得る。
細胞当シに合成された放射性ＤＮＡの・鼠は各細胞上・
の銀粒子を数えることによう電はけ定量的１に測定□さ
れ得る。 酢・ ′ □１）ＮＡ
合成を測定するための別の方法では、・・ＤＮＡ前駆物
質の同位元素取込みの・量が測定される。該前駆物質と
して例えば［’Ｈ］・−チミジン、〔ｌ′Ｃ〕−チ・ミ
ジンもしくは〔１２！Ｉ〕ヨードデオキシウリジン、又
はＤＮＡ前駆物質であシ且つＤＮＡに容易に取込まれる
他のヌクレオシドがある。多数の細胞のＤＮＡ？＃抽出
し、処理し、次に液体シンチレーションスペクトロメー
タで計数する。 ニオ−トラジオグラフ
ィーは個々の細胞中での複製を測定するために使用され
る方法であシＪ取込まれた放射能のシンチレーションカ
ウントは放射能の総量のみが測定される。″ノ々ヅチ°
′方法である。
の銀粒子を数えることによう電はけ定量的１に測定□さ
れ得る。 酢・ ′ □１）ＮＡ
合成を測定するための別の方法では、・・ＤＮＡ前駆物
質の同位元素取込みの・量が測定される。該前駆物質と
して例えば［’Ｈ］・−チミジン、〔ｌ′Ｃ〕−チ・ミ
ジンもしくは〔１２！Ｉ〕ヨードデオキシウリジン、又
はＤＮＡ前駆物質であシ且つＤＮＡに容易に取込まれる
他のヌクレオシドがある。多数の細胞のＤＮＡ？＃抽出
し、処理し、次に液体シンチレーションスペクトロメー
タで計数する。 ニオ−トラジオグラフ
ィーは個々の細胞中での複製を測定するために使用され
る方法であシＪ取込まれた放射能のシンチレーションカ
ウントは放射能の総量のみが測定される。″ノ々ヅチ°
′方法である。
従って、集団に於ける細胞複製の頻度を測定することは
できない。更に指摘すべきは、オードラジオグラフイニ
及びシンチレーションカウントの双方の技術・はいずれ
も放射性同位元素の使用を必要とすることである。
できない。更に指摘すべきは、オードラジオグラフイニ
及びシンチレーションカウントの双方の技術・はいずれ
も放射性同位元素の使用を必要とすることである。
、このた怜放射線障害の危険がちシ、取扱い及び処分−
声慎軍な配慮が必要である。
声慎軍な配慮が必要である。
チミジ、ン、９イ腔、±的類似体たる５−ヨードブオキ
、クンジｌ 、ｒ 及、、０−５−プ・モ、デオｉシウ
リジンを使用し、てＤＮＡ合成のプ四セ斯測豐すること
も可能である。細胞にはこれらの化合物がチミジンに見
えるので通常はチミジンの代シにＤＮＡに取込まれ訂’
Ｈｕｇｈｅｓ ＃’Ｆ。□九ｒｏｅ、 ２３ ： ６
４０”（１９６４）、、１． ■
・参照。
、クンジｌ 、ｒ 及、、０−５−プ・モ、デオｉシウ
リジンを使用し、てＤＮＡ合成のプ四セ斯測豐すること
も可能である。細胞にはこれらの化合物がチミジンに見
えるので通常はチミジンの代シにＤＮＡに取込まれ訂’
Ｈｕｇｈｅｓ ＃’Ｆ。□九ｒｏｅ、 ２３ ： ６
４０”（１９６４）、、１． ■
・参照。
従うぞ、ＤＮＡのｄｅ ｎｏｖａ合或は、塩基類似体の
取込みを前記したような同位元素Ｃ２’ Ｉ ｄＵｒｄ
）を用いるなんらかの方法で測定するか、又はＤＮＡ
密度の増加を測定する（ Ｌａｒｋ等Ｂｉｏｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈ）’ｓ。
取込みを前記したような同位元素Ｃ２’ Ｉ ｄＵｒｄ
）を用いるなんらかの方法で測定するか、又はＤＮＡ
密度の増加を測定する（ Ｌａｒｋ等Ｂｉｏｃｈｉｍ、
Ｂｉｏｐｈ）’ｓ。
Ａｃｔａ、 ７６、９−２４．１９６３ ）ことによっ
てモニターされ得る。ＤＮＡ密度の増加を測定するには
例、えば成るねのＬ）ＮＡ結合染料のケイ光の消滅又は
増、加が測定される。これに関してはＬａｔＬ Ｐｒｏ
ｃ。
てモニターされ得る。ＤＮＡ密度の増加を測定するには
例、えば成るねのＬ）ＮＡ結合染料のケイ光の消滅又は
増、加が測定される。これに関してはＬａｔＬ Ｐｒｏ
ｃ。
□・Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 （米国）７０
： ３３９５（１９７３）及びＳｗａｒｔｚｃｉｎｄ
ｒｕｂｅｒ 、Ｅｘｐ＝ Ｃｅ ＩＦ、、 Ｒｅｓ 、
′ｉ （）９：・４３９．（１９，７７）に記載され
ているー ・ 。
： ３３９５（１９７３）及びＳｗａｒｔｚｃｉｎｄ
ｒｕｂｅｒ 、Ｅｘｐ＝ Ｃｅ ＩＦ、、 Ｒｅｓ 、
′ｉ （）９：・４３９．（１９，７７）に記載され
ているー ・ 。
Ｂ ｒｄ Ｕ ｒｃＪ及びＩｄＵｒｄに特異的な抗、体
はウサ、ギで産生された（ ５ａｖｉｃｋｔ等−、Ｓｃ
１．ｅｎｃｅ１７４ニア０（１９７７））。 該研究１
に於いてウサ、ギは１、該塩：基に特異的な抗体を産生
す・る５−プロぞウラシル。
はウサ、ギで産生された（ ５ａｖｉｃｋｔ等−、Ｓｃ
１．ｅｎｃｅ１７４ニア０（１９７７））。 該研究１
に於いてウサ、ギは１、該塩：基に特異的な抗体を産生
す・る５−プロぞウラシル。
・５−ヨードブロモウラシル・及び６−メチルアデノシ
ンのラフ血清アルブミン・結合体で免疫された。
ンのラフ血清アルブミン・結合体で免疫された。
これらの抗体を使用して変性ＤＮＡ中の５−ブロモウラ
シルと６一メ升ルアデノジン、・ど、を□、免疫化学的
・に倹肝した。この種の抗体は免疫細胞化学手段及び流
動血球計算法による哺乳□類細□胞沖のＤＮＡ複製の検
出にも適用されたゆ前者に□関しては・’Ｇｔａトｚｎ
ｅｒ等のＥｘｐ、 Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、、、９５’ ：
’８’８ ’（１９７５）及びＪ、 ’Ｈ１ｍｔｏＣ
１ｉｅｍ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 ２４ ： ３４ （
１９７６）。
シルと６一メ升ルアデノジン、・ど、を□、免疫化学的
・に倹肝した。この種の抗体は免疫細胞化学手段及び流
動血球計算法による哺乳□類細□胞沖のＤＮＡ複製の検
出にも適用されたゆ前者に□関しては・’Ｇｔａトｚｎ
ｅｒ等のＥｘｐ、 Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、、、９５’ ：
’８’８ ’（１９７５）及びＪ、 ’Ｈ１ｍｔｏＣ
１ｉｅｍ、 Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 ２４ ： ３４ （
１９７６）。
後者に関してはＧｒａｔｚｎｅｒ及びＬｅｔ ｆ、 Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ−１：３８′５（１９ｉ１）参照− ウサギソ鼓生された抗体は有効ではあるが、抗体とチミ
ジンとの交差反応が生じるため免疫夛イ先決には余シ有
賜でない。伺故なら、交差反応種′
□。
ｙｔｏｍｅｔｒｙ−１：３８′５（１９ｉ１）参照− ウサギソ鼓生された抗体は有効ではあるが、抗体とチミ
ジンとの交差反応が生じるため免疫夛イ先決には余シ有
賜でない。伺故なら、交差反応種′
□。
の完全な除去が難しいからである。
リ ・ ′ □
チミジンと反応せずブロモデオキシウリジンのみと反応
する最適抗体濃度を得るためには正確な滴、
１： ・ 箆が、必町あ、ることか知見された・本発明のｙ′り、
−ナル抗坏はブロモデオキシウリジン又はヨニドデオキ
シウリジンのみと反応する。いかなる抗体濃度でテスト
してもチミジンとの交差反応は全、く観察されなかった
゛。従ってモノクローナル抗：体・は、滴定を必要とす
ること無く信号対雑音比（・ＢｒｄＵｒｄを取込んだＤ
・ＮＡのケイ光強度対コント″−ニー・ルづ強□度）′
がはるかに大きいという利点を有する。 、、、
。
する最適抗体濃度を得るためには正確な滴、
１： ・ 箆が、必町あ、ることか知見された・本発明のｙ′り、
−ナル抗坏はブロモデオキシウリジン又はヨニドデオキ
シウリジンのみと反応する。いかなる抗体濃度でテスト
してもチミジンとの交差反応は全、く観察されなかった
゛。従ってモノクローナル抗：体・は、滴定を必要とす
ること無く信号対雑音比（・ＢｒｄＵｒｄを取込んだＤ
・ＮＡのケイ光強度対コント″−ニー・ルづ強□度）′
がはるかに大きいという利点を有する。 、、、
。
本発明は、５−ブロモデオキシウリジン及び５−ヨード
デオキシウリジンに特異的な抗体を生きた約］胞中で産
生ずる方法、及びより詳細には、前記化合物に婢異的な
キラクー−ナル抗体を融合ハイブリドーマ細胞から製造
すΣ方法に係名。
デオキシウリジンに特異的な抗体を生きた約］胞中で産
生ずる方法、及びより詳細には、前記化合物に婢異的な
キラクー−ナル抗体を融合ハイブリドーマ細胞から製造
すΣ方法に係名。
培養又はｉｎ ｖｉｖｏ士前記め如き融合細胞にょシ産
生された抗体ｒｒｉｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで細胞増殖を検出する□ために使用され得る。ま苑、
抗体は、前記の如き塩基を含有するＤＮＡセグメントヲ
単離するため、又は、ケイ光、ブライトフィールド（ｂ
ｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ ）もしくは電子顕微鏡でＩ）
ＱＡ複製を焦疫学的に検出スるために使用され得る。
生された抗体ｒｒｉｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで細胞増殖を検出する□ために使用され得る。ま苑、
抗体は、前記の如き塩基を含有するＤＮＡセグメントヲ
単離するため、又は、ケイ光、ブライトフィールド（ｂ
ｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ ）もしくは電子顕微鏡でＩ）
ＱＡ複製を焦疫学的に検出スるために使用され得る。
（以下余白）
要約すれば本発明は、連続セルライン（ｃａｎｔ １ｎ
ｕｏｕｓｃｅｌｌ １ｉｎｅ）、を使、用して動物から
採取された抗体産生細胞の融合によって抗ＢｒｄＵｒｄ
抗体及び抗１、ｄＵｒｄ抗体を産生じ、次に適当なハイ
ブリッド細胞を選択し、その後に所望の抗体を製造収集
する、方法に係る。
ｕｏｕｓｃｅｌｌ １ｉｎｅ）、を使、用して動物から
採取された抗体産生細胞の融合によって抗ＢｒｄＵｒｄ
抗体及び抗１、ｄＵｒｄ抗体を産生じ、次に適当なハイ
ブリッド細胞を選択し、その後に所望の抗体を製造収集
する、方法に係る。
本発明は、ネズミの形質細胞腫細胞（ｍｕｒｉｎｅｐ、
Ｉａｓ、ｒｈａｃｙｔ：ｏｒｎａ ｃｅｌｌ ） （
ＳＰ ２．／Ｑ）と、５−ヨードウリジンと卵アルブミ
ンとの結合体に対する免疫を与えたマウスの牌細胞との
融合によシ得られる。、該融合後に１つの特異型抗体即
ち塩基類似体５−ヨードウリジン及び５−ブロモウリジ
ンに特異的な免疫グロブリンを有意量で分泌するハイブ
リドーマ細胞のクローンを選択し、限定希釈とアガロー
ス中でのコロニー形成とによって更にクローニングした
。前記類似体はチミジンの代シにＤＮＡ中に取込まれる
ことができるので、細胞ＤＮＡ中での前記類似体のプラ
ス検出は、細胞がＤＮＡを合成しておシ従って複製過程
にあることを示す指標となり得る。
Ｉａｓ、ｒｈａｃｙｔ：ｏｒｎａ ｃｅｌｌ ） （
ＳＰ ２．／Ｑ）と、５−ヨードウリジンと卵アルブミ
ンとの結合体に対する免疫を与えたマウスの牌細胞との
融合によシ得られる。、該融合後に１つの特異型抗体即
ち塩基類似体５−ヨードウリジン及び５−ブロモウリジ
ンに特異的な免疫グロブリンを有意量で分泌するハイブ
リドーマ細胞のクローンを選択し、限定希釈とアガロー
ス中でのコロニー形成とによって更にクローニングした
。前記類似体はチミジンの代シにＤＮＡ中に取込まれる
ことができるので、細胞ＤＮＡ中での前記類似体のプラ
ス検出は、細胞がＤＮＡを合成しておシ従って複製過程
にあることを示す指標となり得る。
ハイブリドーマ細胞によシ産生されるモノクロナル抗体
は培地から回収され、細胞中のヨード−及び／又はブロ
モデオキシウリジンを検出するための純粋試薬として杷
用され得や。モイ、イ、・オル抗体は、ケイ光分子苓は
酵素によって直、竺゛標識″されてもよく又は標識され
た第２抗体又は同様の分子を用いて間接に検出されても
よい。免疫ケイ１ １１
１ １ １光法又は酵素結合免疫吸
着検定法（ｅｎｚｙｍｅ −１ｉｎｋｅｄ ｉｍｒｎｕ
ｎｏａｂｓｏｒ’ｂａ。ｔ ａｓ’ｓａ’ｙ’、ＥＬ’
ＩＺＡ ）によつで、結合した抗体の存在系検出され得
る。
は培地から回収され、細胞中のヨード−及び／又はブロ
モデオキシウリジンを検出するための純粋試薬として杷
用され得や。モイ、イ、・オル抗体は、ケイ光分子苓は
酵素によって直、竺゛標識″されてもよく又は標識され
た第２抗体又は同様の分子を用いて間接に検出されても
よい。免疫ケイ１ １１
１ １ １光法又は酵素結合免疫吸
着検定法（ｅｎｚｙｍｅ −１ｉｎｋｅｄ ｉｍｒｎｕ
ｎｏａｂｓｏｒ’ｂａ。ｔ ａｓ’ｓａ’ｙ’、ＥＬ’
ＩＺＡ ）によつで、結合した抗体の存在系検出され得
る。
上記の本発明方法は□、放射性トレニザーたるトリチウ
ム標識チミジンの使用によるｔ＞Ｎへ合成□の検出と同
様であるが、同・位体を全く便用しない。
ム標識チミジンの使用によるｔ＞Ｎへ合成□の検出と同
様であるが、同・位体を全く便用しない。
ｔ＋等価方法たるオートラジオグラソイ−に比較すると
免疫学的手段が極めて迅速である。即ちオートラジすグ
ラフィー、では数日乃牟轄、週間を要する検出を数時間
以下で行なうことができる。
免疫学的手段が極めて迅速である。即ちオートラジすグ
ラフィー、では数日乃牟轄、週間を要する検出を数時間
以下で行なうことができる。
本発明の産生物及び方法について種々の用途及び応用が
可能である。本発明は更に、ＤＮＡ合成及び一般に細胞
増殖を検出するために塩基類似体に特異的な抗体・をＤ
ＮＡに組込む方法を含む。これらの抗体は更に、化学療
法の効果、例えば腫瘍増殖に対する放射線又は薬物の効
果を免疫ケイ光・法又はＥＬ・ＩＳＡ法の如き免疫学的
手段によってモニタす、るために使用され得る。
可能である。本発明は更に、ＤＮＡ合成及び一般に細胞
増殖を検出するために塩基類似体に特異的な抗体・をＤ
ＮＡに組込む方法を含む。これらの抗体は更に、化学療
法の効果、例えば腫瘍増殖に対する放射線又は薬物の効
果を免疫ケイ光・法又はＥＬ・ＩＳＡ法の如き免疫学的
手段によってモニタす、るために使用され得る。
これらの抗体は更に、組織不適合性を検出するために、
例えば混合リンフ３球培地（ＭＬＣ）中での移植不適合
を免疫学的に検出すべく使用され得る。
例えば混合リンフ３球培地（ＭＬＣ）中での移植不適合
を免疫学的に検出すべく使用され得る。
本発明の抗体は更に、電子顕微鏡法、免疫ケイ先決又は
・酵素結合抗体法（ｅｎｚｙｍｅ −ｃｏｕｐｌｅｄａ
ｎｔ １ｂｂｄ、ｙ ・：ｍｅｔ％ｏｄ ）によるＤＮ
Ａ合成の１ｎｓｌｔｕ検出に、も使用され得る。これら
の抗体は、流動血球計算法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｇｍｅｔ
ｒｙ ）、又は、例えばδライ、ド上・で行なわれ時に
はイメージサイ）・メトリー（Ｉｒｒｉａｇｅ’ ｃ’
ｙｔｏｍｅｔｒｙ’）とも相称される別の自動血球計算
法に特に適してＪる。 ″本発明の新規な抗体
は斐に、染色体の特性決定のため及θ染色体め□ゼグン
ントの履腫に−して有用であり、及びン文はｉ定染払抹
の同定手段ｉして又は染色体複製め変化によって示さ五
る筈め特定の遺伝的症候群を面別す暮ｉ−として有用上
ある。 ：′−１ 抗Ｂｒｄ’［Ｊｒｄ抗体□又は別め塩基類似体抗体あ使
用に関−ｊ名方法を含む技楕を角いたー物の同定も□本
廃明の範囲一に合’ｉ Ｘｈｌ’る。本発明は更に、Ｄ
ＮＡ、 合成速度の変異もしくは焚化支は糾（胞の動
態（ｋｉＩｌｌｅｔｉｅｉ ）め変ｊヒを極用するため
の新規な抗体の使用をも含む。”□ ゝ 特定のウィルス感染症を極用する永めウィルス遺伝子を
検出すべく、Ｔ） Ｎ””Ａ −１’ ｂ−プに対する
免疫ケイ晃うイルを含むＢｒｄＵｒｄ含有のゝ゛プロー
ブＩ）ＮＡとのハイブリダイゼーションによってＤＮＡ
配洒を績出する′：ｊ５法、配勿ｊ薯−検−出す）彷編
又はＤＮＡ竜気泳動法及びｉｎ ５ｉｔｕ位置決定法（
ｉｏ’ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）に上る義ヲ検出する方法
もまた本廃明は意図してい机′□ −□ 未発明のキノクロナル抗体を使用してＤＮＡ１蓚復ｉ合
成の検出が可能であるように、新たに複製された特定め
ＤｆｑＡ配列を精製するため、抗体結合樹力旨又は鉤の
物質を用いるアフイニテイクロマトグラフイニによって
１）ＮＡを単離することも旬能であ木。ＢｒｃｉＵｒｄ
含有プローブの使用によ□るメジ↓ンジャーｂＮＡの細
胞学的検出も本発明の範囲内に含量れる。
′□本文中では以下の用語及び略号が使用されて
いる。 □ ＩｄｔＪｒｄ ”−＝５−ヨードデオキシウリジン１
３ｒｄＵＭ ” ＝＝ ５−ブロモデオキシウリジンＥ
ＬＩＳへ′ −酵素結合免疫吸着検定法ＭＬＣ’＝混混
合９フ７９ 、 ｌＵｒｄ −ヨー１ウリ、：）ンＩ） １３
Ｓ −ＩＪン酢塩．緩衝生理食塩水ＨＡ．７ｒ
ｔｐｅｄｉｕｍ ＝ 、ｅ． ｄ＝ ％す７．ｆ７．
５．チミジ．ン、メ、、ト．トと：キ．−ｊＴ）竺地 ＢＳＡ −ウく血清．不“、ど、ゾ。
・酵素結合抗体法（ｅｎｚｙｍｅ −ｃｏｕｐｌｅｄａ
ｎｔ １ｂｂｄ、ｙ ・：ｍｅｔ％ｏｄ ）によるＤＮ
Ａ合成の１ｎｓｌｔｕ検出に、も使用され得る。これら
の抗体は、流動血球計算法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｇｍｅｔ
ｒｙ ）、又は、例えばδライ、ド上・で行なわれ時に
はイメージサイ）・メトリー（Ｉｒｒｉａｇｅ’ ｃ’
ｙｔｏｍｅｔｒｙ’）とも相称される別の自動血球計算
法に特に適してＪる。 ″本発明の新規な抗体
は斐に、染色体の特性決定のため及θ染色体め□ゼグン
ントの履腫に−して有用であり、及びン文はｉ定染払抹
の同定手段ｉして又は染色体複製め変化によって示さ五
る筈め特定の遺伝的症候群を面別す暮ｉ−として有用上
ある。 ：′−１ 抗Ｂｒｄ’［Ｊｒｄ抗体□又は別め塩基類似体抗体あ使
用に関−ｊ名方法を含む技楕を角いたー物の同定も□本
廃明の範囲一に合’ｉ Ｘｈｌ’る。本発明は更に、Ｄ
ＮＡ、 合成速度の変異もしくは焚化支は糾（胞の動
態（ｋｉＩｌｌｅｔｉｅｉ ）め変ｊヒを極用するため
の新規な抗体の使用をも含む。”□ ゝ 特定のウィルス感染症を極用する永めウィルス遺伝子を
検出すべく、Ｔ） Ｎ””Ａ −１’ ｂ−プに対する
免疫ケイ晃うイルを含むＢｒｄＵｒｄ含有のゝ゛プロー
ブＩ）ＮＡとのハイブリダイゼーションによってＤＮＡ
配洒を績出する′：ｊ５法、配勿ｊ薯−検−出す）彷編
又はＤＮＡ竜気泳動法及びｉｎ ５ｉｔｕ位置決定法（
ｉｏ’ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）に上る義ヲ検出する方法
もまた本廃明は意図してい机′□ −□ 未発明のキノクロナル抗体を使用してＤＮＡ１蓚復ｉ合
成の検出が可能であるように、新たに複製された特定め
ＤｆｑＡ配列を精製するため、抗体結合樹力旨又は鉤の
物質を用いるアフイニテイクロマトグラフイニによって
１）ＮＡを単離することも旬能であ木。ＢｒｃｉＵｒｄ
含有プローブの使用によ□るメジ↓ンジャーｂＮＡの細
胞学的検出も本発明の範囲内に含量れる。
′□本文中では以下の用語及び略号が使用されて
いる。 □ ＩｄｔＪｒｄ ”−＝５−ヨードデオキシウリジン１
３ｒｄＵＭ ” ＝＝ ５−ブロモデオキシウリジンＥ
ＬＩＳへ′ −酵素結合免疫吸着検定法ＭＬＣ’＝混混
合９フ７９ 、 ｌＵｒｄ −ヨー１ウリ、：）ンＩ） １３
Ｓ −ＩＪン酢塩．緩衝生理食塩水ＨＡ．７ｒ
ｔｐｅｄｉｕｍ ＝ 、ｅ． ｄ＝ ％す７．ｆ７．
５．チミジ．ン、メ、、ト．トと：キ．−ｊＴ）竺地 ＢＳＡ −ウく血清．不“、ど、ゾ。
Ｅｒｌａｎｇｅｒ及び１３ｅｉｓｅｒの方法、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ。
．Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ’． Ｓｃｉ． ５□： ６ ｓ −”ｔ ｉ
（”、９６’，１ ’）米品，ヶおい、キキリア高分
子藁型的には卵アルゾせ□ンにプロ□モ□ウリ″ジン（
Ｂｉ［’ｒｄ）又は−ｒ−：’ Ｆ ’ｒ；””リジン
（ｌＵｒｄ）を′結合した。・該文献の記載内容を本明
細壱東に含めるものとする。１このプロセスでは２００
μＶ．の前記結今体でマウスに些、疫を与．え：る、べ
ぐ、等容のフ・イ・ド完全アジ、−１−、、ント．と．
共．％．乳．雫婆を胛成し１′？．、、、Ｉ，、に腹膜
注射また・曇瞥不空全７．イ゛パントを用いた注射剤を
２週間毎に投力し、最後に牌細胞融合の３日前に生理食
塩水中のＩｊＪｒｄ−卵アルブミン注射剤を尾静脈に投
与した。Ｑｅｆｔｅｒ等のＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅ１ｌ
Ｑｅｎｅｔｉｃｓ， ３巻 ２３１（１９７７）に記載
の方法によシ、ポリ、、エチレングリコール（３０チ）
を使用して免疫マウスの牌細胞と連続形質細胞腫セルラ
インＳＰ・２１０ Ａｒ １ ４ 。
（”、９６’，１ ’）米品，ヶおい、キキリア高分
子藁型的には卵アルゾせ□ンにプロ□モ□ウリ″ジン（
Ｂｉ［’ｒｄ）又は−ｒ−：’ Ｆ ’ｒ；””リジン
（ｌＵｒｄ）を′結合した。・該文献の記載内容を本明
細壱東に含めるものとする。１このプロセスでは２００
μＶ．の前記結今体でマウスに些、疫を与．え：る、べ
ぐ、等容のフ・イ・ド完全アジ、−１−、、ント．と．
共．％．乳．雫婆を胛成し１′？．、、、Ｉ，、に腹膜
注射また・曇瞥不空全７．イ゛パントを用いた注射剤を
２週間毎に投力し、最後に牌細胞融合の３日前に生理食
塩水中のＩｊＪｒｄ−卵アルブミン注射剤を尾静脈に投
与した。Ｑｅｆｔｅｒ等のＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅ１ｌ
Ｑｅｎｅｔｉｃｓ， ３巻 ２３１（１９７７）に記載
の方法によシ、ポリ、、エチレングリコール（３０チ）
を使用して免疫マウスの牌細胞と連続形質細胞腫セルラ
インＳＰ・２１０ Ａｒ １ ４ 。
（ Ｍ＝ Ｓｈｕｌｍａｒ・等， Ｎａｔｕｒｅ ２７
６、： ２６９ （１９７８） ）とを融・食でせた。
６、： ２６９ （１９７８） ）とを融・食でせた。
牌細胞の調製及び融合はＫｏｐｒｏｗｓｋｉ．等によっ
て米国特許第４，１７２，１２４号及び同第４，１９６
，２６５号にも記載されている。該米国特許の記載内容
を本明細１−中に含めるものとする。
て米国特許第４，１７２，１２４号及び同第４，１９６
，２６５号にも記載されている。該米国特許の記載内容
を本明細１−中に含めるものとする。
牌細胞／セルライン融合によシ得られた細胞を１、５チ
の・修生血清を含有するダルイツコ（ １）ｕ １ｂｅ
ｃｃｏ ）の最小必須培地（ ＧＩＢＣＯ ）を含む４
つのミクロ、カルチャープレート（各々９６ウエル、Ｃ
０８ＴΔ１も）にブレーティングした。ノ・、イブリッ
ド細胞を選択すべく、融合及びブレーティングの２４時
間後にヒポ、：キサンチシ・とチミジンとメトトレキセ
ートとを含む培地（、Ｉ：（Ａ’Ｉ’培地）を各ウェル
に添加する。
の・修生血清を含有するダルイツコ（ １）ｕ １ｂｅ
ｃｃｏ ）の最小必須培地（ ＧＩＢＣＯ ）を含む４
つのミクロ、カルチャープレート（各々９６ウエル、Ｃ
０８ＴΔ１も）にブレーティングした。ノ・、イブリッ
ド細胞を選択すべく、融合及びブレーティングの２４時
間後にヒポ、：キサンチシ・とチミジンとメトトレキセ
ートとを含む培地（、Ｉ：（Ａ’Ｉ’培地）を各ウェル
に添加する。
次いでインキュベーションを約↓０日間継続する。
５乃至６日後にコロニーが始吟て肉眼で茜える。
コロニーを含むウェルから取出した細胞を２４ウエルの
ミクロカルチャープレート（移Ｑ２これらのプレートと
９６ウエルのプレ、−トとから揮散した培地を酵素結合
免疫吸着検定法（！ Ｌ 工Ｓ、Ａ、：：’で検定した
。ＥＬＩ！１３Ａアッセ、イは、ＢＲＬコーポレーショ
ンのハイブルラインズ・ニューズレター（ＢＲＬ）１：
５．５ページ（１９８０年１２月）に示されたアッセイ
と同様である。ＥＬＩ８Ａプロセスでは、ポリ塩化ビニ
ルプレートに、マウス、の、免疫に使用したキャリアと
仲異なるキャリアに結合されたハプテン結合物例えばヨ
ードウリジ／−、ｌ３ＳＡ（ウシ血清アルブミン）をウ
ェルａ、Ｃ５００ｎｒｃ７）濃度で塗布し、同時にウェ
ル当シ１９μｌのカルボジイミド、即ちノ々イオラツド
（Ｂｉｏｒａｄ ） コーポレーションからＥＩ）Ａ
Ｘとして商品化されている１−エチル−３（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドを炭酸ナトリウム緩
衝液を用いて竺布した。プレートを４ｐ″ｖ１晩ブンヤ
、ユベート、１、卒（≦、′！１３Ｓ−７４回洗浄し、
残留活性基を結合スる冬め、に阜温マ、ｇ、、；ＭのＮ
Ｈ４Ｃｌによ＃）３０分間処理した。マイクロクイター
プレートのウェルを盗にリン酸塩輯衝生理食塩卒（Ｐ、
１３８ 、）で洗浄し、使用するまでは０．０５％のす
） ＩＪウムアジドを含有するＰＨ８中で４℃で保存し
た。
ミクロカルチャープレート（移Ｑ２これらのプレートと
９６ウエルのプレ、−トとから揮散した培地を酵素結合
免疫吸着検定法（！ Ｌ 工Ｓ、Ａ、：：’で検定した
。ＥＬＩ！１３Ａアッセ、イは、ＢＲＬコーポレーショ
ンのハイブルラインズ・ニューズレター（ＢＲＬ）１：
５．５ページ（１９８０年１２月）に示されたアッセイ
と同様である。ＥＬＩ８Ａプロセスでは、ポリ塩化ビニ
ルプレートに、マウス、の、免疫に使用したキャリアと
仲異なるキャリアに結合されたハプテン結合物例えばヨ
ードウリジ／−、ｌ３ＳＡ（ウシ血清アルブミン）をウ
ェルａ、Ｃ５００ｎｒｃ７）濃度で塗布し、同時にウェ
ル当シ１９μｌのカルボジイミド、即ちノ々イオラツド
（Ｂｉｏｒａｄ ） コーポレーションからＥＩ）Ａ
Ｘとして商品化されている１−エチル−３（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドを炭酸ナトリウム緩
衝液を用いて竺布した。プレートを４ｐ″ｖ１晩ブンヤ
、ユベート、１、卒（≦、′！１３Ｓ−７４回洗浄し、
残留活性基を結合スる冬め、に阜温マ、ｇ、、；ＭのＮ
Ｈ４Ｃｌによ＃）３０分間処理した。マイクロクイター
プレートのウェルを盗にリン酸塩輯衝生理食塩卒（Ｐ、
１３８ 、）で洗浄し、使用するまでは０．０５％のす
） ＩＪウムアジドを含有するＰＨ８中で４℃で保存し
た。
ハイシリドーマ融合プレートのウェルから得た上清を（
ウニ４当１） １００ｐＨの量で） Ｉ’Ｕｒｄ −Ｉ
３ＳＡ金含（マイクロタイ：タープレートのウェルに添
加し４ｐで１時間インキュベーションヘイブリドーマ融
合の上清をウェルから洗浄し、β−ガラクトシダーゼに
結合したヒツジ又はヤギの抗マウス、’、、ＩｇＧｔ−
添加し、室温で２時間インキュベートした。０．５％の
トウイーン２０と１．５ ｍＭ （Ｄ ＭｇＣ６ｚと２
ｍＭ、のメルカプトエタノールとを含有するりン酸塩緩
衝生理食塩水の溶液でプレートを再度洗浄し、β−ガラ
クトシダーゼ基質を添加してプレートを更に１時間イン
キュベートした。β−ガラクトシダーゼ基質は５０ｍ’
Ｍのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，２中に希釈したｐ−ニトロ
フヱニルーガラクトシドと１．５ ｍＭ （７１） Ｍ
ｇ（Ｊ２とから構成されていた。
ウニ４当１） １００ｐＨの量で） Ｉ’Ｕｒｄ −Ｉ
３ＳＡ金含（マイクロタイ：タープレートのウェルに添
加し４ｐで１時間インキュベーションヘイブリドーマ融
合の上清をウェルから洗浄し、β−ガラクトシダーゼに
結合したヒツジ又はヤギの抗マウス、’、、ＩｇＧｔ−
添加し、室温で２時間インキュベートした。０．５％の
トウイーン２０と１．５ ｍＭ （Ｄ ＭｇＣ６ｚと２
ｍＭ、のメルカプトエタノールとを含有するりン酸塩緩
衝生理食塩水の溶液でプレートを再度洗浄し、β−ガラ
クトシダーゼ基質を添加してプレートを更に１時間イン
キュベートした。β−ガラクトシダーゼ基質は５０ｍ’
Ｍのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，２中に希釈したｐ−ニトロ
フヱニルーガラクトシドと１．５ ｍＭ （７１） Ｍ
ｇ（Ｊ２とから構成されていた。
０．５Ｍのに２ＣＯ３の添加後、□プレートは黄色にな
る。これは抗ＩＴＪｒｄ抗体の存在を意味するプラス反
応を示す。定量は４１５ｎｍでの光度計測に・よって行
なった。融合ウェルからのプラスの細胞を限界希釈によ
って再度クローニングし、次にアガロース中単−細胞を
シレーティングして再度クローニングした。コロニーを
別のフラスコ又はプレートに移した。
る。これは抗ＩＴＪｒｄ抗体の存在を意味するプラス反
応を示す。定量は４１５ｎｍでの光度計測に・よって行
なった。融合ウェルからのプラスの細胞を限界希釈によ
って再度クローニングし、次にアガロース中単−細胞を
シレーティングして再度クローニングした。コロニーを
別のフラスコ又はプレートに移した。
細胞系を単層増殖させｆｃ、９．６ウエルのマイクロタ
イターウェルに対してもＥＬＩ８Ａアッセイを実施した
。１０μＭのＢｒｄＵｒｄを含有する培地又は含有しな
い培地で細胞を約２４時間増殖させ、次に７０チエタノ
ールで固定した。この場合、１）ＮＡ中ニ取込まれたブ
ロモデオキシウリジンを含有する細胞を□、０．０７□
ＮａＯＨで２分間処理してＩ＞ＮＡを変性してから検定
した。次にプレートを洗ってＮａＯＨを□除去し、上清
培地を添加し、ＩｔＪ−ＢＳＡ含有のＥＬＩ８Ａプレー
トに対してウェルを前記の如く処理した。
イターウェルに対してもＥＬＩ８Ａアッセイを実施した
。１０μＭのＢｒｄＵｒｄを含有する培地又は含有しな
い培地で細胞を約２４時間増殖させ、次に７０チエタノ
ールで固定した。この場合、１）ＮＡ中ニ取込まれたブ
ロモデオキシウリジンを含有する細胞を□、０．０７□
ＮａＯＨで２分間処理してＩ＞ＮＡを変性してから検定
した。次にプレートを洗ってＮａＯＨを□除去し、上清
培地を添加し、ＩｔＪ−ＢＳＡ含有のＥＬＩ８Ａプレー
トに対してウェルを前記の如く処理した。
前記ＥＬＩＳＡ法によショートウリジン−８，Ａ、と反
応する抗体を産生じたハイブリドーマ融合の、クローン
を組織培養フラスコで増殖した。典型的実験では、前記
の如きフラスコから得た培地を飽和硫酸アンモニウム（
最終濃度５０％）で沈殿させて裸存した。沈殿物をリン
酸塩緩衝生理食□″塩水（ｐＢｓ）に透析した。次に従
来のプロセス、例えば４フイニテイクロマトグラフイー
を用いて抗体を精製する。又は濃縮培地として使用すべ
く抗本文中でＴ３４４と相称きれるマウスハイシリド
□−マカルチャーはアメリカン□・タイプ・カルチャ゛
□ −・・レフ九・に寄託去ｉキおシ□、ＡＴＣＣ受入
れ番号１１．８−８１５０と指定されている。このセル
ラインは抗ＢｒｄＵｒｄ抗体を産生じ得る。セルライア
は液体窒素中で凍−れ仝のが適やである。
応する抗体を産生じたハイブリドーマ融合の、クローン
を組織培養フラスコで増殖した。典型的実験では、前記
の如きフラスコから得た培地を飽和硫酸アンモニウム（
最終濃度５０％）で沈殿させて裸存した。沈殿物をリン
酸塩緩衝生理食□″塩水（ｐＢｓ）に透析した。次に従
来のプロセス、例えば４フイニテイクロマトグラフイー
を用いて抗体を精製する。又は濃縮培地として使用すべ
く抗本文中でＴ３４４と相称きれるマウスハイシリド
□−マカルチャーはアメリカン□・タイプ・カルチャ゛
□ −・・レフ九・に寄託去ｉキおシ□、ＡＴＣＣ受入
れ番号１１．８−８１５０と指定されている。このセル
ラインは抗ＢｒｄＵｒｄ抗体を産生じ得る。セルライア
は液体窒素中で凍−れ仝のが適やである。
本発明のプロセスは細胞培養法に限定されない。
、、 モノクロナル抗体の別の製法としては、ハイブリ
ドーマ細胞を組織適合性の免疫調節 （ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐ？”ｏｍｉｓｅ’ｄ・）動物に
注射する。
ドーマ細胞を組織適合性の免疫調節 （ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐ？”ｏｍｉｓｅ’ｄ・）動物に
注射する。
例えばＢＡＬＢ／ｃ マウスからのハイブリッド及びＢ
Ａ’Ｌ １３ ／Ｃマ□ウスから誘導さ五る荊質細胞
腫細胞の場合、ｉ動物ｍ’ｎＡＬＢ’／ｃマウスである
。
Ａ’Ｌ １３ ／Ｃマ□ウスから誘導さ五る荊質細胞
腫細胞の場合、ｉ動物ｍ’ｎＡＬＢ’／ｃマウスである
。
腹水癌を生じさ姦て動物の孟清及び腹水中に極めて・多
量の抗体を産生じ、これを採取し、公知技術□を用いて
抗体を単層ｍする乙ともできる。
量の抗体を産生じ、これを採取し、公知技術□を用いて
抗体を単層ｍする乙ともできる。
前記のＥＩ、ＩＩＳ、Ａ法を用いたハプテン阻害によっ
てクローンの初期特性決定を行たった。６つのクローン
から得た上清培地を、詳細に分析した。連続希釈し１次
培地をウェル当シ５０ ｐ ｙのＩｄＵｒｄと共にゼイ
クロタイターウェルに添加した。可溶ヌクレオシド類似
体は抗体ｉ製動に結合す兎ためにＩｕ ｒｄ −”Ｂ’
Ｓ Ａ と競合した□。しかし乍らチミジンはクロー
ンＢ４４抗体と組番しなかった。この′
。
てクローンの初期特性決定を行たった。６つのクローン
から得た上清培地を、詳細に分析した。連続希釈し１次
培地をウェル当シ５０ ｐ ｙのＩｄＵｒｄと共にゼイ
クロタイターウェルに添加した。可溶ヌクレオシド類似
体は抗体ｉ製動に結合す兎ためにＩｕ ｒｄ −”Ｂ’
Ｓ Ａ と競合した□。しかし乍らチミジンはクロー
ンＢ４４抗体と組番しなかった。この′
。
ことは該抗体がＩｄ［Ｊｒｄに特異的であることを示す
。結果を第１図に示す。、、、この方法でデスルた〒、
つのクローンの？衝、の３つが同様の結果を示した。
。結果を第１図に示す。、、、この方法でデスルた〒、
つのクローンの？衝、の３つが同様の結果を示した。
これらのクローンや産生物を更に、前叩の如くＥＬ、Ｉ
、ＳＡ法によｇ 、 Ｂ、ｒ ｄ Ｕ ｒ、ｄ、含有の
細胞単層に対・してテ・ストした。β４４クローンはＢ
ｒｄ’［Ｊｒｄを取込んだ核と反応したが床置：換の１
：コントロール核と反応し々かった。：′婢細：胞と’
Ｓ Ｐ ′２／’０形質細胞腫細胞とを融合した１７０
個めクロ゛ニンのうちの２４個から得た上清ｉ工Ｕ′−
ＢＳＡ゛結合に関してプラスであった。
、ＳＡ法によｇ 、 Ｂ、ｒ ｄ Ｕ ｒ、ｄ、含有の
細胞単層に対・してテ・ストした。β４４クローンはＢ
ｒｄ’［Ｊｒｄを取込んだ核と反応したが床置：換の１
：コントロール核と反応し々かった。：′婢細：胞と’
Ｓ Ｐ ′２／’０形質細胞腫細胞とを融合した１７０
個めクロ゛ニンのうちの２４個から得た上清ｉ工Ｕ′−
ＢＳＡ゛結合に関してプラスであった。
：１・ 、１′−□
、（以下余白）、１
１ ：
１− □１ 、 ・、 ′ １つのクローンＢ４４を選択し、限定希釈によシアガロ
ース中で更にクローニングし、細胞につ、、いて、免疫
学的スクリ□−ニングを行なった。細胞のＤＮＡ中のＢ
ｒｄＵｒｄに特異的に結合するＢ４４上清・の能力を形
質細胞腫細胞についてテスト、シた。ダ・ルヘツコの最
・小必須培、地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）の１ 、：、
０ 、 ｌｔＭ ＯＢｒｃｌＵｒｄ ＋ｌ ｉ ｐＨ・
のＦｄＵｒｄ中で細胞を２時間インキュベートし、メタ
ノール／酢酸（３：１）中で固定し、顕微鏡スライドに
塗抹し、空気乾燥・ し、・０．０７Ｎ・のＮａＯＨ中
で２分間変性上た。次に、ハイブリドーマ細胞からの・
Ｂ４４上清培地の透析５０ ｆｂ （ＮＨ４）１８０４
沈殿物（２０ｆｆｌｆ／ｗＬｔ）を種々、の希釈度で希
釈したものと共にスライドを６０分間イン牛ネペートし
た。 、 ・これらを５分、間で２回
洗浄し、７Ｖレスじインｔを結合したヤギ抗マウス免疫
グ・四ブ□リン（Ｃａｐｐｅｌ ） と共にインキュベ
ートし、５％ヤギ血清を含むリン酸塩、緩衝生理食・塩
水（Ｐ Ｂ Ｓ’ ）で３０分間で１＝４゜に希釈し、
ＰＢＳで再度洗浄する。次に細胞を工ｔフルオレセンス
オシティクスで観察シた。ＢｒｄＵｒｄを含まない培地
中で増殖したコントロール細胞と核の非複製領域とはケ
イ光励起下で殆んど肉眼で１えヵヵ、つぇｔ − ＤＮＡの局部合成に関与した細胞はＢｒｄｔｊ’ｒｄを
取込んだ部位にのみクイ光を示した。
１− □１ 、 ・、 ′ １つのクローンＢ４４を選択し、限定希釈によシアガロ
ース中で更にクローニングし、細胞につ、、いて、免疫
学的スクリ□−ニングを行なった。細胞のＤＮＡ中のＢ
ｒｄＵｒｄに特異的に結合するＢ４４上清・の能力を形
質細胞腫細胞についてテスト、シた。ダ・ルヘツコの最
・小必須培、地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）の１ 、：、
０ 、 ｌｔＭ ＯＢｒｃｌＵｒｄ ＋ｌ ｉ ｐＨ・
のＦｄＵｒｄ中で細胞を２時間インキュベートし、メタ
ノール／酢酸（３：１）中で固定し、顕微鏡スライドに
塗抹し、空気乾燥・ し、・０．０７Ｎ・のＮａＯＨ中
で２分間変性上た。次に、ハイブリドーマ細胞からの・
Ｂ４４上清培地の透析５０ ｆｂ （ＮＨ４）１８０４
沈殿物（２０ｆｆｌｆ／ｗＬｔ）を種々、の希釈度で希
釈したものと共にスライドを６０分間イン牛ネペートし
た。 、 ・これらを５分、間で２回
洗浄し、７Ｖレスじインｔを結合したヤギ抗マウス免疫
グ・四ブ□リン（Ｃａｐｐｅｌ ） と共にインキュベ
ートし、５％ヤギ血清を含むリン酸塩、緩衝生理食・塩
水（Ｐ Ｂ Ｓ’ ）で３０分間で１＝４゜に希釈し、
ＰＢＳで再度洗浄する。次に細胞を工ｔフルオレセンス
オシティクスで観察シた。ＢｒｄＵｒｄを含まない培地
中で増殖したコントロール細胞と核の非複製領域とはケ
イ光励起下で殆んど肉眼で１えヵヵ、つぇｔ − ＤＮＡの局部合成に関与した細胞はＢｒｄｔｊ’ｒｄを
取込んだ部位にのみクイ光を示した。
別の実験では、、よｐ定量的な免疫ケイ光染色法でテス
トした。ＷｉＬ２ヒトリッツｉ芽球細胞をＢｒｄＵｒｄ
含有培地中で短期間インキュベートし、Ｇｒａｔｚｎｅ
ｒ及びＬｅｉｆ、 （：ｙｔｏｍｅｔｒｙ １：：３
８５．１９８１に記載の如く懸濁液中で染色ト冬。該文
献の記、載内容を本１細書冑■“れ宣ｄ← 。
トした。ＷｉＬ２ヒトリッツｉ芽球細胞をＢｒｄＵｒｄ
含有培地中で短期間インキュベートし、Ｇｒａｔｚｎｅ
ｒ及びＬｅｉｆ、 （：ｙｔｏｍｅｔｒｙ １：：３
８５．１９８１に記載の如く懸濁液中で染色ト冬。該文
献の記、載内容を本１細書冑■“れ宣ｄ← 。
′ｆ１光顕微鏡に−１′ズ細胞質月光は竺察されなかっ
た。
た。
次に、流動ｉＩｔ算よ□□い、細胞□分析い。
Ｂｒｄ’Ｕｒｄ ”””Ｃ＠識したｍＬ２ヒドリン・（
芽球細胞の流動血球計算分析の結果を第２図に示す。
芽球細胞の流動血球計算分析の結果を第２図に示す。
ＷｉＬ２細胞は、マサチ千−セツツエ科大学の食物食品
科学部のＷｉｌｌｉａｍ Ｇ、 ’ｘ’ｈｉｉｉｙ ｌ
ｒＪ士よｐ入手し冬。このゾロセスでは各細胞毎のケイ
光の強さを測定、！−同１１１に＝ｌｌ胞４Ｊ５や光散
乱を測定した・光散乱は細胞サイズの指標である。第２
図に於いて各点は細胞数を示すデータポイントである。
科学部のＷｉｌｌｉａｍ Ｇ、 ’ｘ’ｈｉｉｉｙ ｌ
ｒＪ士よｐ入手し冬。このゾロセスでは各細胞毎のケイ
光の強さを測定、！−同１１１に＝ｌｌ胞４Ｊ５や光散
乱を測定した・光散乱は細胞サイズの指標である。第２
図に於いて各点は細胞数を示すデータポイントである。
第２Ａ図及び第２Ｂ図の下縁に沿った点は“ノイズ゛′
を示すので無視さｉる。
を示すので無視さｉる。
細胞を１０μＭのＢｒｄＵｒｄを用いて６分間〕（ルス
処理し、７０％エタノールに固定し、前記方法により
Ｂ・４４カルチヤーの濃縮（６Ｘ）上清培地に懸濁させ
て染色した。第２抗体はＰＢＳ＋５％ヤギ血清で１：Ｂ
Ｏに希釈したフ１１／ｊし、スＣＡン結合ヤ、ギ抗マウ
ス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅ ｌ ）であった。
処理し、７０％エタノールに固定し、前記方法により
Ｂ・４４カルチヤーの濃縮（６Ｘ）上清培地に懸濁させ
て染色した。第２抗体はＰＢＳ＋５％ヤギ血清で１：Ｂ
Ｏに希釈したフ１１／ｊし、スＣＡン結合ヤ、ギ抗マウ
ス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅ ｌ ）であった。
、ＥＰＩＣ８ＩＶ、 （Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎｉｃｓ ）セルソーター（Ｃｅｌｌ ５ｏｒｔｅｒ
）をザ」いて流動血球計算分析を実施した。レーザーを
６５ ｍＷで４８８ｎｔｎに同調さぜた。第２Ａ図はＢ
ｒｄＵｒｄを存在させずにインキュ・べ−］・された１
ｔｉｌｌＬ！！、を示じておシ、第２Ｂ図は１０μＭの
ＢｒｄＵｒｄ中でインキュベートされた細胞を示してい
る。合計でｉ ｏ、ｏ ｏ ｏの細胞を分析した。
′ □ 流量血球計算法によって、ＢｒｄＵｒｄの取込みを示す
には６分間という短時間・の・Ｂｒｄ・Ｕｒｄのパルス
で十分であった。ＢｒｄＵｉｄ、で標識されない細胞は
ＢｒｄＵｒｄで標識された細胞に比較して約１７□０の
ケ□イ光を示した（第２図）。・ ・ □・・
、 ・細胞を濃縮抗体調製物（２０ｆｎｇ／ｍ１．
）と共に染色したとき一流動血球計算法で測定した。Ｂ
ｒｄ’ＬＩｒｄ非標識細胞のケイ光の強さの増加は１チ
未満であった。
ｏｎｉｃｓ ）セルソーター（Ｃｅｌｌ ５ｏｒｔｅｒ
）をザ」いて流動血球計算分析を実施した。レーザーを
６５ ｍＷで４８８ｎｔｎに同調さぜた。第２Ａ図はＢ
ｒｄＵｒｄを存在させずにインキュ・べ−］・された１
ｔｉｌｌＬ！！、を示じておシ、第２Ｂ図は１０μＭの
ＢｒｄＵｒｄ中でインキュベートされた細胞を示してい
る。合計でｉ ｏ、ｏ ｏ ｏの細胞を分析した。
′ □ 流量血球計算法によって、ＢｒｄＵｒｄの取込みを示す
には６分間という短時間・の・Ｂｒｄ・Ｕｒｄのパルス
で十分であった。ＢｒｄＵｉｄ、で標識されない細胞は
ＢｒｄＵｒｄで標識された細胞に比較して約１７□０の
ケ□イ光を示した（第２図）。・ ・ □・・
、 ・細胞を濃縮抗体調製物（２０ｆｎｇ／ｍ１．
）と共に染色したとき一流動血球計算法で測定した。Ｂ
ｒｄ’ＬＩｒｄ非標識細胞のケイ光の強さの増加は１チ
未満であった。
この結果は、Ｂｒｄ、Ｕｔｄ ｍ識細胞が特異的に染色
される血清濃度を得るために慎重な滴定を要したウサギ
のヘテロクローナル抗Ｂｒｄ Ｕｒｄ血清を使用する従
来の研究と対照的である。 □これらの結果より、
ＢｒｄＵｒｄ に特異的なモノクロナル抗体が８１■−
チミジン使用の場合□と同：様に単−細胞中のＤ′ＮＡ
複製を検出するだめの感度の良い方法を□提供すること
が明らかである□。細胞当・・すのケイ光の強さが細胞
に取込まれたＢ’ｒｄＵｒ’ｄの量に直接井関する・こ
とが知見された。従って、モ、ノクロナル抗体による細
胞のケイ光染色を使用して細胞当りのＤＮＡ合成速度を
測定し得る。
される血清濃度を得るために慎重な滴定を要したウサギ
のヘテロクローナル抗Ｂｒｄ Ｕｒｄ血清を使用する従
来の研究と対照的である。 □これらの結果より、
ＢｒｄＵｒｄ に特異的なモノクロナル抗体が８１■−
チミジン使用の場合□と同：様に単−細胞中のＤ′ＮＡ
複製を検出するだめの感度の良い方法を□提供すること
が明らかである□。細胞当・・すのケイ光の強さが細胞
に取込まれたＢ’ｒｄＵｒ’ｄの量に直接井関する・こ
とが知見された。従って、モ、ノクロナル抗体による細
胞のケイ光染色を使用して細胞当りのＤＮＡ合成速度を
測定し得る。
：１本郷明の胛胞、はハイブリッドカルチャ、−を示す
。
。
何故なら、
（ａ） 該細胞が母細胞たる婢細胞及び５Ｐ２１０形
質細胞腫細胞のいずれもが増殖し得ないＨＡ、Ｔ培地中
で増殖すべく選択されたものであり、（ｂ） 細胞が
恐らくは単一細胞から誘導されたコロニーから少くとも
４回クローニングされたものであシ、 （Ｃ） 流動血球計算法で測定すると分析されたハイ
プリドーマ細胞系の細胞当９の平均ＤＮＡ含量が母菌株
のいずれのＤＮＡ含量よりも高く、これによシ初期細胞
融合によって新しい細胞系が創成されたことをはっきり
と示し″Ｃ，ｌ５−９、（ｄ） このハイブリ、ツ下
細胞系が５Ｐ２１０母細胞系と違って５−ブロモデオキ
シウリジン（Ｂｒｄ（Ｊｒｄ）又は５−一−ドデオ、キ
シ♀、リジン（ＩｄＵｒｄ）、に高度に特異的な抗体を
産生じた からである。 ・ 、
質細胞腫細胞のいずれもが増殖し得ないＨＡ、Ｔ培地中
で増殖すべく選択されたものであり、（ｂ） 細胞が
恐らくは単一細胞から誘導されたコロニーから少くとも
４回クローニングされたものであシ、 （Ｃ） 流動血球計算法で測定すると分析されたハイ
プリドーマ細胞系の細胞当９の平均ＤＮＡ含量が母菌株
のいずれのＤＮＡ含量よりも高く、これによシ初期細胞
融合によって新しい細胞系が創成されたことをはっきり
と示し″Ｃ，ｌ５−９、（ｄ） このハイブリ、ツ下
細胞系が５Ｐ２１０母細胞系と違って５−ブロモデオキ
シウリジン（Ｂｒｄ（Ｊｒｄ）又は５−一−ドデオ、キ
シ♀、リジン（ＩｄＵｒｄ）、に高度に特異的な抗体を
産生じた からである。 ・ 、
第１図は、本文中に詳細に１ｍ明した酵素結合免疫吸着
検定法（Ｊ６ＬＩＳＡ）によって示され、た抗ＢｒｄＬ
ｌｒｄ ／ ＩｄＵｒｄ抗体のヨードデオキシウリジン
特異性どチミジン非反応性とを示すグラフでちり、グラ
フ中のｄＴｂｄｔ、ｉチミジン、ＰＢＳはリン酸塩緩衝
生理食塩水、Ｉｄｕはヨードデオキシウリジンを示して
おり、 第２Ａ図及び第２Ｂ図は、ＢｒｄＵｒｄで標識したＷｉ
Ｉ、２ヒト’１）ンパ芽球細胞の流動血球計算分析の結
果を示しており、第２Ａ図のデータは、ＩＪｒｄＵｒｄ
を存在させずにインキュベートした細胞を示しておシ、
第２Ｂ図の７７７７タは１．、、．１０μｊ’ｙ１のＢ
ｒｄＬＪｒｄ中でインキュベートされた細胞を示す。 ・ ：じ 代理人方−士今 月 ノじ 手、絖ネ市゛庄ｐ（ 昭和５８年９ Ｊ］３０１３ ２、発明の名称 Ｅ５−−−７１’、ｌＪモ及び５
−ヨードブＡ４シラリジン１、二対＋４特異的なｔツク
ＬＪ−太ル抗体を分泌りるハイブリドーマ並びに細胞増
ηＩ“ｉ ８！ＩＩ定用試薬 ３、補止をりる后 事イ′１との関係 １＜ｆ Ｉｔ出願人名 称
ユニヴアーシティ・Ａブ・マイアミ４、代 理 人
東宗都新宿区新宿１丁１１１番１４冠 ＩＩ＋ ０．
１ビル５、補ＩＪ：命令のＥ１イ」 自 発６、袖
ｉ［にＪ、り増加づる野川の数 ε３．補正の内容 □ （１）願ｄ７中、出願人の代表ｆ５を別紙の通り補充Ｊ
る。 （２） ｉｔ−、ｊ（図面を別紙の゛通り補元づる。。 （内容□に変史なし） （３３）委イ〔状・法人］名３１１明ｉ１１及び同訳文
を別紙の通り補充づ−る。 尚、同［１イＮ１に（木バｌ（１に関（ノる優り１．楯
Ｔ”Ｊｑ １１１明ｊ！： ｌｉｊ′出占を（；Ｎ山数
しましｌこ。 Ｊ３二１１七し２１；□ＩＦＩｊ ｊ二Ｅ、 ｉｆジシ
１？■餡庁長官 若杉和夫殿 １、串ｆｌの表示 昭和５８年特許願第１５ ’Ｉ
／４５０号２、発明の名利・ １５−ブ［］モ及
び５−ヨードデオキシウリ渉ンに対して特異的な七ツク
ローナル抗体を分泌リ−るハイブリドーマ並びに細胞増
殖測定用試鈷 ３、補正をする者 １１１′１どの関係 特Ｗ１出願人 名 称 ユニヴアーシティ・７１−ｌ・マイアミ４
、代 Ｊｌｌｌ 人 東京都新宿１メ新藺１丁Ｉ
Ｅ１１番１４シｙ、、 １．ＬＩＩＩｌビルｔ ；ｈ
、 ％開５９− ５５１８５２、特許
請求の範囲 （１）５−ブロモウリジン又は５−ヨードウリジンとア
ルブミンキャリア分子との結合体で免□ 疫したマウスの牌細胞とネズミ形質細胞腫細胞との融合
細胞からなり、５−ブロモデオキシウリジン及び５−ヨ
ードデオキシウリジンに対、する抗体を産生ずるハイブ
リッド連続セルラ□イン及び前記融合細胞の培地を含む
組成物二 （２１ネズミ形質細胞腫細胞が形質細胞腫セルラること
′ｆｒＯ特徴とする特許請求の範囲第１項に些載の組成
物。 （３１ｍ合ｉ胞がヒポキサンチン−メトトレキセート−
チミジン（ＨＡＴ）含有培地中にあると、 と全特
徴とする特許請求の範囲第１項又は第′ ２項に記
載の組成物。 、、 （、ｉ＋５−〉言モウリジン又は５−ヨートウ
ＩＪ シンとアルブミンギヤリア分子との結合体で免疫
したマウス牌細胞とミエローマ細胞との融合細胞のハイ
ブリッド連続セルラインが該セルライン用細胞培養培地
下で分泌する抗体を活性成分として含有するＤＮＡ合成
による細胞増殖検出用試薬組成物。 （５）免疫クイ先決によって検出可能なケイ光分子が抗
体に結合していることｆ：特徴とする特許請求の範囲第
４項に記載の試薬組成物。 （６）酵素結合免疫吸着検定法（ＢＬＩ８Ａ ）によっ
て検出可能なケイ光性酵素が抗体に結合していることを
特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の試薬組成物。 （７）次のステップ囚、（Ｂ）及び（ｑ；（Ａ） ％
許請求の範囲第１項に記載のハイブリッド連続セルライ
ン組成物により分泌される抗体と細胞を接触させるステ
ップ、 （１３）分泌された抗体を細胞のＤＮＡ中に取シ込（Ｑ
ＤＮＡ合成の指標として細胞質ＤＮＡ中の抗体の存
在を観察し且つ測定するステップから成る単−細胞中の
ＤＮＡ合成速度の測定方法。 （８）ステップ（５）で使用される抗体にケイ光分子が
結合しており、ステップ（ｑの測定が免疫ケイ光分析に
よって行なわれること’ｅｒａとする特許請求の範囲第
７項に記載の方法。 （９）ステップ（Ａ）で使用される抗体にケイ光性酵素
が結合しており、ステップ（Ｑの測定が酵素結合免疫吸
着検定法（ＥＬＩ８Ａ）によって行なわれることを特徴
とする特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ！１（１１５−ブロモウリジン又は５−ヨードウリジン
の結合体で動物を免疫し、 前記動物由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合
細胞を形成し、 融合細胞をクローニングし、 ５−ブロモデオキシウリジン又は５−ヨートチオキシウ
リジンに対して特異性を示す抗体を産生ずるクローンを
選択する コトカラなる５−ブロモデオキシウリジン又は５−ヨー
ドデオキシウリジン特異的抗体の産生方法０ （１１１腫瘍／抗体産生細胞が牌細胞であることを特徴
とする特許ｉ〜求の範囲第１０項に記載の方法。 （１２＋ 動物がマウスであることを特徴とする特許
請求の範囲第１０項に記載の方法。 （１３） 融合細胞をヒポキサンチン−チミジン−メ
トトレキセート含有培地で培養することを特徴とする特
許請求の範囲第１０項に記載の方法。 （１４）ネズミ形質細胞肝細胞でマウスを免疫し、マウ
ス牌細胞とマウスミエローマ細胞の融合細胞を形成する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の方法
。
検定法（Ｊ６ＬＩＳＡ）によって示され、た抗ＢｒｄＬ
ｌｒｄ ／ ＩｄＵｒｄ抗体のヨードデオキシウリジン
特異性どチミジン非反応性とを示すグラフでちり、グラ
フ中のｄＴｂｄｔ、ｉチミジン、ＰＢＳはリン酸塩緩衝
生理食塩水、Ｉｄｕはヨードデオキシウリジンを示して
おり、 第２Ａ図及び第２Ｂ図は、ＢｒｄＵｒｄで標識したＷｉ
Ｉ、２ヒト’１）ンパ芽球細胞の流動血球計算分析の結
果を示しており、第２Ａ図のデータは、ＩＪｒｄＵｒｄ
を存在させずにインキュベートした細胞を示しておシ、
第２Ｂ図の７７７７タは１．、、．１０μｊ’ｙ１のＢ
ｒｄＬＪｒｄ中でインキュベートされた細胞を示す。 ・ ：じ 代理人方−士今 月 ノじ 手、絖ネ市゛庄ｐ（ 昭和５８年９ Ｊ］３０１３ ２、発明の名称 Ｅ５−−−７１’、ｌＪモ及び５
−ヨードブＡ４シラリジン１、二対＋４特異的なｔツク
ＬＪ−太ル抗体を分泌りるハイブリドーマ並びに細胞増
ηＩ“ｉ ８！ＩＩ定用試薬 ３、補止をりる后 事イ′１との関係 １＜ｆ Ｉｔ出願人名 称
ユニヴアーシティ・Ａブ・マイアミ４、代 理 人
東宗都新宿区新宿１丁１１１番１４冠 ＩＩ＋ ０．
１ビル５、補ＩＪ：命令のＥ１イ」 自 発６、袖
ｉ［にＪ、り増加づる野川の数 ε３．補正の内容 □ （１）願ｄ７中、出願人の代表ｆ５を別紙の通り補充Ｊ
る。 （２） ｉｔ−、ｊ（図面を別紙の゛通り補元づる。。 （内容□に変史なし） （３３）委イ〔状・法人］名３１１明ｉ１１及び同訳文
を別紙の通り補充づ−る。 尚、同［１イＮ１に（木バｌ（１に関（ノる優り１．楯
Ｔ”Ｊｑ １１１明ｊ！： ｌｉｊ′出占を（；Ｎ山数
しましｌこ。 Ｊ３二１１七し２１；□ＩＦＩｊ ｊ二Ｅ、 ｉｆジシ
１？■餡庁長官 若杉和夫殿 １、串ｆｌの表示 昭和５８年特許願第１５ ’Ｉ
／４５０号２、発明の名利・ １５−ブ［］モ及
び５−ヨードデオキシウリ渉ンに対して特異的な七ツク
ローナル抗体を分泌リ−るハイブリドーマ並びに細胞増
殖測定用試鈷 ３、補正をする者 １１１′１どの関係 特Ｗ１出願人 名 称 ユニヴアーシティ・７１−ｌ・マイアミ４
、代 Ｊｌｌｌ 人 東京都新宿１メ新藺１丁Ｉ
Ｅ１１番１４シｙ、、 １．ＬＩＩＩｌビルｔ ；ｈ
、 ％開５９− ５５１８５２、特許
請求の範囲 （１）５−ブロモウリジン又は５−ヨードウリジンとア
ルブミンキャリア分子との結合体で免□ 疫したマウスの牌細胞とネズミ形質細胞腫細胞との融合
細胞からなり、５−ブロモデオキシウリジン及び５−ヨ
ードデオキシウリジンに対、する抗体を産生ずるハイブ
リッド連続セルラ□イン及び前記融合細胞の培地を含む
組成物二 （２１ネズミ形質細胞腫細胞が形質細胞腫セルラること
′ｆｒＯ特徴とする特許請求の範囲第１項に些載の組成
物。 （３１ｍ合ｉ胞がヒポキサンチン−メトトレキセート−
チミジン（ＨＡＴ）含有培地中にあると、 と全特
徴とする特許請求の範囲第１項又は第′ ２項に記
載の組成物。 、、 （、ｉ＋５−〉言モウリジン又は５−ヨートウ
ＩＪ シンとアルブミンギヤリア分子との結合体で免疫
したマウス牌細胞とミエローマ細胞との融合細胞のハイ
ブリッド連続セルラインが該セルライン用細胞培養培地
下で分泌する抗体を活性成分として含有するＤＮＡ合成
による細胞増殖検出用試薬組成物。 （５）免疫クイ先決によって検出可能なケイ光分子が抗
体に結合していることｆ：特徴とする特許請求の範囲第
４項に記載の試薬組成物。 （６）酵素結合免疫吸着検定法（ＢＬＩ８Ａ ）によっ
て検出可能なケイ光性酵素が抗体に結合していることを
特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の試薬組成物。 （７）次のステップ囚、（Ｂ）及び（ｑ；（Ａ） ％
許請求の範囲第１項に記載のハイブリッド連続セルライ
ン組成物により分泌される抗体と細胞を接触させるステ
ップ、 （１３）分泌された抗体を細胞のＤＮＡ中に取シ込（Ｑ
ＤＮＡ合成の指標として細胞質ＤＮＡ中の抗体の存
在を観察し且つ測定するステップから成る単−細胞中の
ＤＮＡ合成速度の測定方法。 （８）ステップ（５）で使用される抗体にケイ光分子が
結合しており、ステップ（ｑの測定が免疫ケイ光分析に
よって行なわれること’ｅｒａとする特許請求の範囲第
７項に記載の方法。 （９）ステップ（Ａ）で使用される抗体にケイ光性酵素
が結合しており、ステップ（Ｑの測定が酵素結合免疫吸
着検定法（ＥＬＩ８Ａ）によって行なわれることを特徴
とする特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ！１（１１５−ブロモウリジン又は５−ヨードウリジン
の結合体で動物を免疫し、 前記動物由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合
細胞を形成し、 融合細胞をクローニングし、 ５−ブロモデオキシウリジン又は５−ヨートチオキシウ
リジンに対して特異性を示す抗体を産生ずるクローンを
選択する コトカラなる５−ブロモデオキシウリジン又は５−ヨー
ドデオキシウリジン特異的抗体の産生方法０ （１１１腫瘍／抗体産生細胞が牌細胞であることを特徴
とする特許ｉ〜求の範囲第１０項に記載の方法。 （１２＋ 動物がマウスであることを特徴とする特許
請求の範囲第１０項に記載の方法。 （１３） 融合細胞をヒポキサンチン−チミジン−メ
トトレキセート含有培地で培養することを特徴とする特
許請求の範囲第１０項に記載の方法。 （１４）ネズミ形質細胞肝細胞でマウスを免疫し、マウ
ス牌細胞とマウスミエローマ細胞の融合細胞を形成する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の方法
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ′（１）５−ブロモウリジン又は５−ヨードウリジンと
アルブミンキャリア分子との結合体で免□ 疫した→し
スの牌細朧とネズミ形質細胞肺細月恒との融合細胞から
かり、５−ブｂ□モナ牙キ□ シラリジン及び５−１
−ドザオ・キクウリジンに対す：る抗体を産生すｔノミ
イｆＩ）４ド連続セルライン及び前記融合細胞の培地を
含む組成物。 （２）ネズミ形質細胞腫細胞が・形質細胞腫セルライン
ＳＰ ２１０ Ａｇ’ｌ’５．ｍ示９魯すれたもの・
□ であることを特徴とする特許請求の範囲第１−
項に記載の組成物。 ＼ （３）＃ｌＩ合細胞がヒポキサンチン−メトトレキセー
ト−チミジン（ＨＡＴ）含有培地中にあることを特徴と
する特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の組成物。 （４）５−ブロモウリジン又は５−ヨードウリジンとア
ルブミンギヤリア分子との結合体で免疫したマウス牌細
胞とミエローマ細胞との融合細胞・ のハイブリッド連
続セルラインが該セルライン用細胞培養培地下で分泌す
る抗体を活性成分とじ七含有するＩ）Ｍ合成による細胞
増殖検出用試薬組成物。′ □ （５）免疫ケイ先決によって検出可能なケイ光分子が抗
体に結合していることを特徴とする特許請求め範・囲第
４′項に記載の試薬組成物６（６箇酵素結合免疫吸着検
定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出可能なケイ光性酵素が
抗体に結合していると：と全特徴とする特許請求の範囲
第４項に記□載の試薬組成物。□ （７）次のステップ（Ａ）、 ＣＢ）及び（Ｃ）；（Ａ
ｌ 特許請求の範囲第１項に記載のハ□イブリツ′□
ド連続セルライン組成物によシ分泌される抗□：１１１
１ 体とに１（１胞を接触させる７テてプ・（Ｂ） 分泌
された抗体を細胞のＤＮＡ中に取シ込壕・せるステップ
、更に、 （（、”） ＤＮＡ合成の指標として細胞質ＤＮＡ中
の抗体の存在を観察し且つ測定するステップ 力・ら成る巣−細胞中のＤＮＡ合成速度の開示方法。 （８）ステップ囚で使用される抗体にケイ光分子が結合
しておυ、ステップ（０９測定が免疫ケイ光分析によっ
て行なわれることを特徴とする特許請求の範囲第７項に
記載の方法。 （９）ステップ囚で使用される抗体にケイ光性酵素が結
合しており、ステップ（０の測定が酵素結合免疫吸着検
定法（ＥＬＩＳＡ）によって行なわれることをｑ′！ｆ
徴とする特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ００）５−ブロモウリジン又は５−ヨードウリジン′：
：の□結合・体で動物を免疫し、 −前躬：動御由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞１ −の融合細胞！形成１・ 融合細胞をクローニングし５ ．５．−ブロモデオキシウリジン又は５−戸−ドブオキ
シウリジンに対して特異性を示す抗体ｌｌｉ生するクロ
ーンを選択する ことからなる５−ブロモデオキシウリジン又は、Ｆ−Ｂ
−ドブ、ｔ 轄’） ’） ：／特−的抗体の産生方法
、。 。 ０１］ 腫瘍／抗体産生細胞が牌細胞であることを特
徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 （Ｉｌ物がマニスであるくとを←とする特許請求の範囲
第１．０項に記載の方法。 。 ０３）融合細胞をヒポキザンチ？−チミジンーメトトレ
キセート含有培地で培養することヲ蒔徴島する特許請求
の範囲第１０項に記載の方法。 （１４）ネズミ形質細胞肺細胞でマウスを免疫し、マウ
ス牌細胞とマウスミエローマ細胞の融合細胞を形成する
ことを特徴とする特許請求の仲囲第１０項に記載の方法
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/409,856 US4529700A (en) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | Hybridoma cells secreting a monoclonal antibody specific for 5-bromo and 5-iodoeoxyuridine and reagents for measuring cellular proliferation |
| US409856 | 1995-03-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5955185A true JPS5955185A (ja) | 1984-03-30 |
Family
ID=23622263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58151450A Pending JPS5955185A (ja) | 1982-08-20 | 1983-08-19 | ５−ブロモ及び５−ヨ−ドデオキシウリジンに対して特異的なモノクロ−ナル抗体を分泌するハイブリド−マ並びに細胞増殖測定用試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4529700A (ja) |
| EP (1) | EP0102228A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5955185A (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4585736A (en) * | 1983-10-18 | 1986-04-29 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Flow cytometric measurement of total DNA and incorporated halodeoxyuridine |
| US5180663A (en) * | 1984-02-13 | 1993-01-19 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Immunochemical assays for human amylase isoenzymes and related monoclonal antibodies, hydridoma cell lines and production thereof |
| US4849352A (en) * | 1984-10-09 | 1989-07-18 | Sullivan John B | Antibody purification process |
| ATE40409T1 (de) * | 1985-08-20 | 1989-02-15 | Apothekernes Lab | Photoimmunologisches testverfahren fuer dns und rns. |
| US4885237A (en) * | 1985-11-15 | 1989-12-05 | Becton, Dickinson And Company | Detection of cellular DNA |
| EP0239405A3 (en) * | 1986-03-28 | 1988-12-07 | The Regents Of The University Of California | Monoclonal antibodies against halodeoxyuridines and hybridoma producing the same |
| FR2596773B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1988-06-24 | Pasteur Institut | Sonde monocatenaire marquee, non radioactive, procede pour sa fabrication et procede de detection d'une sequence nucleotidique determinee a l'aide de cette sonde |
| DE3712786A1 (de) * | 1987-04-15 | 1988-11-03 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur bestimmung von nucleinsaeuren |
| US5053336A (en) * | 1989-07-17 | 1991-10-01 | Regents Of The University Of California | Monoclonal antibodies for the separate detection of halodeoxyuridines and method for their use |
| AT397437B (de) * | 1989-10-25 | 1994-04-25 | Kwizda Fa F Johann | Hybridzellinien zur herstellung monoklonaler antikörper gegen bromnicotinsäure und 1-methyl- 10alpha-methoxydihydrolysergol; antikörper und verfahren zu ihrer herstellung; ihre diagnostischeverwendung und diese antikörper enthaltende diagnostische zusammensetzung |
| DE19649645A1 (de) * | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Hoechst Ag | Mehrfach funktionelles Ligandensystem zur zielzellspezifischen Übertragung von Nukleotidsequenzen |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| WO2006067122A2 (en) | 2004-12-20 | 2006-06-29 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof |
| EP1879921B1 (en) | 2005-05-12 | 2011-04-27 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| EP2027155B1 (en) | 2006-06-06 | 2016-01-27 | Crucell Holland B.V. | Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4196265A (en) * | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
| US4172124A (en) * | 1978-04-28 | 1979-10-23 | The Wistar Institute | Method of producing tumor antibodies |
| US4284412A (en) * | 1979-07-13 | 1981-08-18 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method and apparatus for automated identification and enumeration of specified blood cell subclasses |
-
1982
- 1982-08-20 US US06/409,856 patent/US4529700A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-08-19 JP JP58151450A patent/JPS5955185A/ja active Pending
- 1983-08-19 EP EP83304819A patent/EP0102228A3/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RESEARCH COMMUNICATIONS IN CHEMICAL PATHOLOGY AND PHARMACOLOGY=1978 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4529700A (en) | 1985-07-16 |
| EP0102228A3 (en) | 1986-02-19 |
| EP0102228A2 (en) | 1984-03-07 |
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