JPS5952164B2 - グルコサミノグルカン誘導体、その製造法およびそれを有効成分とする抗脂肪血症剤 - Google Patents
グルコサミノグルカン誘導体、その製造法およびそれを有効成分とする抗脂肪血症剤Info
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- JPS5952164B2 JPS5952164B2 JP56095156A JP9515681A JPS5952164B2 JP S5952164 B2 JPS5952164 B2 JP S5952164B2 JP 56095156 A JP56095156 A JP 56095156A JP 9515681 A JP9515681 A JP 9515681A JP S5952164 B2 JPS5952164 B2 JP S5952164B2
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はへバリンを激しく脱硫酸化し、ついでその生成
物を充分にヘミスクシニル化してえられる誘導体、その
製造法およびそれを含有する抗脂肪血症剤に関する。
物を充分にヘミスクシニル化してえられる誘導体、その
製造法およびそれを含有する抗脂肪血症剤に関する。
該誘導体は実質土ほとんど抗凝血活性(1W9あたわ0
.05USP単位未満)を示さず、現在治療学土重要で
ある抗脂肪血症活性を示す。
.05USP単位未満)を示さず、現在治療学土重要で
ある抗脂肪血症活性を示す。
それゆえ本発明の誘導体は脂肪血症の治療にとくに好適
である。種々のプロテオグリカン類やグルコサミノグル
カン類の生理学的な重要性は、その実際の生理学的役割
や作動のメカニズムが充分にあるいは部分的にすら解明
されていないにもかかわらず、古くから認識されてきて
いる。
である。種々のプロテオグリカン類やグルコサミノグル
カン類の生理学的な重要性は、その実際の生理学的役割
や作動のメカニズムが充分にあるいは部分的にすら解明
されていないにもかかわらず、古くから認識されてきて
いる。
本明細書において以後使用する用語はジエイ・エフ・ケ
ネデイ(J.F.Kenrledy)の著書CPrOt
eOglycans$IOlOgicalChemic
alAs−PectsinHumanLifel,St
udiesinOrganicChemistry,.
VOl2、ElsevierScientificPu
bllshingCOmpany,AOlsterda
m−0xf0rd一M、1979)で使用されている用
語に準拠した。
ネデイ(J.F.Kenrledy)の著書CPrOt
eOglycans$IOlOgicalChemic
alAs−PectsinHumanLifel,St
udiesinOrganicChemistry,.
VOl2、ElsevierScientificPu
bllshingCOmpany,AOlsterda
m−0xf0rd一M、1979)で使用されている用
語に準拠した。
高い薬効を有する種々の天然または合成のグルコサミノ
グルカン類としては、たとえばへバリンや硫酸デキスト
ランなどが知られている。へバリンはエル・ビ一・ジヤ
ツクス(L.B.Jaquas)の論文6Hepari
n,.an01ddrugwithanewparad
ign1、Science,2O6,528(1979
》またはフイ・フイ・カツカ一(V.V.Kakkar
)およびデイ一・ピ一・トーマス(]).P.ThOm
as)らの著書(1Heparin1Chem1str
yar1d011nica!Usage−Acadsm
icPress..LOndOn−NYll976)で
論じられているよらに広範囲の血管内凝血症などの過剰
凝血症の治療や血栓塞栓症の予防または治療に用いられ
、さらにジエイ・エフ・ケネデイ、エル・ビ一・ジヤツ
クス、フィ・フィ・カツカ一らのそれぞれの前記引用文
献またはアール・パオレツテイ(R.PaOletti
)、エス・カルカー(S.Karger)編、エス・ア
イテムパーク(S.Eisemberg)の著書(“L
ipOprOtsinMst−AbOllsmO、Pr
OgressinBiOchemicalPharm一
AcOlOgylO!15−Basel,l979)で
論じられているように脂質血症の治療に古くから用いら
れてきている。後者のように特殊な病理学的症状のばあ
い、へバリンの治療学上の使用はたとえ少量の投与量で
あつても長期間をかけて行なわれる。
グルカン類としては、たとえばへバリンや硫酸デキスト
ランなどが知られている。へバリンはエル・ビ一・ジヤ
ツクス(L.B.Jaquas)の論文6Hepari
n,.an01ddrugwithanewparad
ign1、Science,2O6,528(1979
》またはフイ・フイ・カツカ一(V.V.Kakkar
)およびデイ一・ピ一・トーマス(]).P.ThOm
as)らの著書(1Heparin1Chem1str
yar1d011nica!Usage−Acadsm
icPress..LOndOn−NYll976)で
論じられているよらに広範囲の血管内凝血症などの過剰
凝血症の治療や血栓塞栓症の予防または治療に用いられ
、さらにジエイ・エフ・ケネデイ、エル・ビ一・ジヤツ
クス、フィ・フィ・カツカ一らのそれぞれの前記引用文
献またはアール・パオレツテイ(R.PaOletti
)、エス・カルカー(S.Karger)編、エス・ア
イテムパーク(S.Eisemberg)の著書(“L
ipOprOtsinMst−AbOllsmO、Pr
OgressinBiOchemicalPharm一
AcOlOgylO!15−Basel,l979)で
論じられているように脂質血症の治療に古くから用いら
れてきている。後者のように特殊な病理学的症状のばあ
い、へバリンの治療学上の使用はたとえ少量の投与量で
あつても長期間をかけて行なわれる。
しかし、この長期間にわたる投与によつて患者の血液の
凝固能が減少してしまうという危険が生じる。そのため
、血液の凝固性を減少させると考えられている活性をへ
バリンの抗脂肪血症活性から除外しようとする試みがな
されてきている。それらは、たとえばへバリンの構造を
適当に変換する方法または市販のへバリンのフラクネー
シヨンによる方法などによつている。これら血液の凝固
性を減少させる活性は生体内において、グルコサミノグ
ルカン特異酵素と錯体を形成することに関係があるので
はないかということが現在一般的に認識され、また明ら
かにされてきつつある。これらの錯体形成の効果は、た
とえばへバリンなどの抗脂肪血症活性に関して酵素がそ
の活性を高めること、または酵素の触媒機能を高め循環
血液中(ここでは酵素がはじめに血管壁に送られる)で
酵素が自由に動けるようにすることのいづれかであろう
と考えられている。以上が前記文献で論ぜられている、
とくにリポプロテ,インリパーゼ(以下,LPLという
)−ヘバリン錯体に訃いて典型的にみられる現象であり
、またグルコサミノグルカンが有する抗脂肪血症を説明
するために用いられているメカニズムである。
凝固能が減少してしまうという危険が生じる。そのため
、血液の凝固性を減少させると考えられている活性をへ
バリンの抗脂肪血症活性から除外しようとする試みがな
されてきている。それらは、たとえばへバリンの構造を
適当に変換する方法または市販のへバリンのフラクネー
シヨンによる方法などによつている。これら血液の凝固
性を減少させる活性は生体内において、グルコサミノグ
ルカン特異酵素と錯体を形成することに関係があるので
はないかということが現在一般的に認識され、また明ら
かにされてきつつある。これらの錯体形成の効果は、た
とえばへバリンなどの抗脂肪血症活性に関して酵素がそ
の活性を高めること、または酵素の触媒機能を高め循環
血液中(ここでは酵素がはじめに血管壁に送られる)で
酵素が自由に動けるようにすることのいづれかであろう
と考えられている。以上が前記文献で論ぜられている、
とくにリポプロテ,インリパーゼ(以下,LPLという
)−ヘバリン錯体に訃いて典型的にみられる現象であり
、またグルコサミノグルカンが有する抗脂肪血症を説明
するために用いられているメカニズムである。
これら錯体の性質に関しては多くの疑問点があるが、明
言できることはその活性が相互作用によつているという
ことであり、一般に異議なく受け入れられている。該相
互作用は試験管内ではほとんどへバリンのイオン的な性
質によつて卦b(前記文献中、ジエイ・エフ・ケネデイ
の著書の173頁およびエル・ビ一・ジヤツクスの論文
参照)、生体内ではへバリンの高次アニオン構造による
イオン的な性質またはほとんど半極性的な性質によつて
いる。へバリン中には種々のスルフアミド基(N−スル
フエート基)およびスルフオエステル基(0ースルフエ
ート基)が存在し、スルフアミド基はスルJャIエステル
基にくらべてよシ酸加水分解をうけやすい(前記ジエイ
・エフ・ケネデイの著書229頁、アイ・ダニシエフス
キ一(1.Danis−Hefski)、エイチ・ビ・
アイバ一(H.B.Eiber)、ジエイ・ジエイ・カ
ール(J.J.Carr)らの論文(Arch.BlO
chsm.BiOphys.、90,114(1960
))訃よびケイ・エイチ・タイヤ一(KOH.Meye
r)、デイ一・イ一・シユバルツ(D.E.Schwa
rts)らの論文(He!V.Chim.Actal3
3、1651(1950))参照)。
言できることはその活性が相互作用によつているという
ことであり、一般に異議なく受け入れられている。該相
互作用は試験管内ではほとんどへバリンのイオン的な性
質によつて卦b(前記文献中、ジエイ・エフ・ケネデイ
の著書の173頁およびエル・ビ一・ジヤツクスの論文
参照)、生体内ではへバリンの高次アニオン構造による
イオン的な性質またはほとんど半極性的な性質によつて
いる。へバリン中には種々のスルフアミド基(N−スル
フエート基)およびスルフオエステル基(0ースルフエ
ート基)が存在し、スルフアミド基はスルJャIエステル
基にくらべてよシ酸加水分解をうけやすい(前記ジエイ
・エフ・ケネデイの著書229頁、アイ・ダニシエフス
キ一(1.Danis−Hefski)、エイチ・ビ・
アイバ一(H.B.Eiber)、ジエイ・ジエイ・カ
ール(J.J.Carr)らの論文(Arch.BlO
chsm.BiOphys.、90,114(1960
))訃よびケイ・エイチ・タイヤ一(KOH.Meye
r)、デイ一・イ一・シユバルツ(D.E.Schwa
rts)らの論文(He!V.Chim.Actal3
3、1651(1950))参照)。
このことは多くの実験事実から推論されてきたことであ
)、とりわけ鉱酸を用いたスルフアミド基の加水分解が
進行するにつれて、抗凝血活性が減少し、抗脂肪血症活
性の発現が次第に明らかにな)、最終的に全N−スルフ
エートおよびわずかの0−スルフエートが加水分解され
ることにより両方の活性が完全に消滅するという事実か
ら推論されてきた(前記ジエイ・エフ・ケネデイの著書
229頁、エス・エス・ステーパラ(S.S.Stiv
ala)、工ル・ユアン(L.Yuan)、ジエイ・エ
ールリツヒ(J.Ehrlich)、ピ一・エイ・リベ
ルテイ(P.A.Liberti)らの論文(Arch
.BiOchem.BiOphys.l22,32(1
967))、エス・エス・ステーパラ、ピ一 ・エイ・
リベルテイらの論文(Arch.BiOchem.Bi
Ophys.、122、40、(1967))およびエ
ス・エン・ステーパラ、エム・ヘルプスト(M{.He
rbst)、オ一・クラッドキー(0.Kratky)
、アイ・ビルツ(1.Piltz)ちの論文(Arch
.BiOchem− BiOphys・127,795
(1968)参照)。該加水分解生成物にピリジン−S
O3またはトリエチルアミン−SO3を反応させてN−
スルフエート基を再生させることによりこれらの活性が
定性的におよび定量的に再生できることが報告されてい
る(前記ジエイ・エフ・ケネデイの著書230頁および
エル・レビイ(L.Levy)、エフ・ジエ不ペトラセ
ック(V.J.Petracek)らの論文(PrOc
・SOc.Exp.BiOl.Med.、109,9.
01(1962))参照)。
)、とりわけ鉱酸を用いたスルフアミド基の加水分解が
進行するにつれて、抗凝血活性が減少し、抗脂肪血症活
性の発現が次第に明らかにな)、最終的に全N−スルフ
エートおよびわずかの0−スルフエートが加水分解され
ることにより両方の活性が完全に消滅するという事実か
ら推論されてきた(前記ジエイ・エフ・ケネデイの著書
229頁、エス・エス・ステーパラ(S.S.Stiv
ala)、工ル・ユアン(L.Yuan)、ジエイ・エ
ールリツヒ(J.Ehrlich)、ピ一・エイ・リベ
ルテイ(P.A.Liberti)らの論文(Arch
.BiOchem.BiOphys.l22,32(1
967))、エス・エス・ステーパラ、ピ一 ・エイ・
リベルテイらの論文(Arch.BiOchem.Bi
Ophys.、122、40、(1967))およびエ
ス・エン・ステーパラ、エム・ヘルプスト(M{.He
rbst)、オ一・クラッドキー(0.Kratky)
、アイ・ビルツ(1.Piltz)ちの論文(Arch
.BiOchem− BiOphys・127,795
(1968)参照)。該加水分解生成物にピリジン−S
O3またはトリエチルアミン−SO3を反応させてN−
スルフエート基を再生させることによりこれらの活性が
定性的におよび定量的に再生できることが報告されてい
る(前記ジエイ・エフ・ケネデイの著書230頁および
エル・レビイ(L.Levy)、エフ・ジエ不ペトラセ
ック(V.J.Petracek)らの論文(PrOc
・SOc.Exp.BiOl.Med.、109,9.
01(1962))参照)。
その理由はその操作によりへバリンの高次アニオン性が
再生され、酵素−ヘバリンイオン性錯体を形成しうる能
力が再生されるからである(前記のエス・エス・ステー
パラの論文参照)。しかし、レビイはへバリンのN−ス
ルフエートの33%以上を鉱酸によつて加水分解したば
あい.解重合の開始および(または)0−スルフエート
の加水分解によるものと考えられる種々の非可逆的な変
化を受けた生成物が生じ、そのため再び硫酸化反応(S
ulfatatiOn)を行なつてもその本来の活性を
復活させることはできないと述べている。いいかえれば
、き’びしい条件下での加水分解ののちにえられる生成
物は構造的にかなク異なつたものに変化して、それ自体
不活性となつてしまうため、該生成物にスルフエート基
を再生させることはできず、そのため抗凝血活性のない
酵素(変換された)へバリン錯体を形成せしめるのに充
分なイオン性が再生されない。ジエイ・エフ・ケネデイ
またはフィ・フィ・カツカ一は前記文献において同様の
実験を行なつており、レビイの行なつた実験と同じ結果
をえている。
再生され、酵素−ヘバリンイオン性錯体を形成しうる能
力が再生されるからである(前記のエス・エス・ステー
パラの論文参照)。しかし、レビイはへバリンのN−ス
ルフエートの33%以上を鉱酸によつて加水分解したば
あい.解重合の開始および(または)0−スルフエート
の加水分解によるものと考えられる種々の非可逆的な変
化を受けた生成物が生じ、そのため再び硫酸化反応(S
ulfatatiOn)を行なつてもその本来の活性を
復活させることはできないと述べている。いいかえれば
、き’びしい条件下での加水分解ののちにえられる生成
物は構造的にかなク異なつたものに変化して、それ自体
不活性となつてしまうため、該生成物にスルフエート基
を再生させることはできず、そのため抗凝血活性のない
酵素(変換された)へバリン錯体を形成せしめるのに充
分なイオン性が再生されない。ジエイ・エフ・ケネデイ
またはフィ・フィ・カツカ一は前記文献において同様の
実験を行なつており、レビイの行なつた実験と同じ結果
をえている。
凝血性型の酵素およびへバリンからえられる錯体ならび
にLPLおよびへバリンからえられる錯体の性質に関す
る論理的な説明のための仮説は静電気的な性質すなわち
アニオン的な性質にもとづいているが、これら2つの錯
体の性質には違いがある。事実、たとえばLPLおよび
ヘパリンによつてえられる錯体はLPL自体の活性に比
べて多少高い好脂性を有している。以上に述べた問題点
からつぎの結論にいたつている。
にLPLおよびへバリンからえられる錯体の性質に関す
る論理的な説明のための仮説は静電気的な性質すなわち
アニオン的な性質にもとづいているが、これら2つの錯
体の性質には違いがある。事実、たとえばLPLおよび
ヘパリンによつてえられる錯体はLPL自体の活性に比
べて多少高い好脂性を有している。以上に述べた問題点
からつぎの結論にいたつている。
(1)現在市販さわている種々の抗脂肪血症剤の脂肪分
解酵素活性はそれが含有する有効成分,すなわちへパリ
ンまたはそれよ杉もスルフエート基を多く有する天然誘
導体もしくは少なく有する天然物誘導体によつて発現し
ている。
解酵素活性はそれが含有する有効成分,すなわちへパリ
ンまたはそれよ杉もスルフエート基を多く有する天然誘
導体もしくは少なく有する天然物誘導体によつて発現し
ている。
これらの物質が脂肪血症の治療のために長期間にわたつ
て投与されたばあい、凝血性の低下による危険が生ずる
が、その危険性を低減せしめるためには、これらの物質
が有する抗凝血性を低減しなければならない。(2)天
然物から変換され、へパリン自体の典型的な構造や性質
が失なわれていない新規なグルコサミノグルカン誘導体
を開発し、しかもそのばあいえられる誘導体のアニオン
性はほとんど維持されていなければならない。
て投与されたばあい、凝血性の低下による危険が生ずる
が、その危険性を低減せしめるためには、これらの物質
が有する抗凝血性を低減しなければならない。(2)天
然物から変換され、へパリン自体の典型的な構造や性質
が失なわれていない新規なグルコサミノグルカン誘導体
を開発し、しかもそのばあいえられる誘導体のアニオン
性はほとんど維持されていなければならない。
(3)これらの誘導体をうるために用いる出発物質とし
てはヘパリンそれ自体のみが可能であり、それに種々の
範囲で脱硫酸反応を生ぜしめ、スルフエート基よりもイ
オン化しにくい官能基(例えばカルボキシル基)をチツ
素原子土に導入してイオン的な性質を再生せしめる。
てはヘパリンそれ自体のみが可能であり、それに種々の
範囲で脱硫酸反応を生ぜしめ、スルフエート基よりもイ
オン化しにくい官能基(例えばカルボキシル基)をチツ
素原子土に導入してイオン的な性質を再生せしめる。
これらの誘導体はリポプロテインリパーゼと同様な活性
を示し、一方抗凝血活性がかなク低減している。そのた
めにこれらの誘導体をヒトの治療に用いたばあい凝血性
の低下の危険性がより低減される。しかし前述したよう
にN−スルフエートの加水分解またはチツ素原子土のア
ニオン性官能基の加水分解は33〜35%を超えるべき
ではない。その理由は極端に好脂性で、アニオン性が低
すぎる性質を有する再構成された(RecOnstit
uted)最終生成物はLPLと錯体を形成させるのに
は適当でないからである。
を示し、一方抗凝血活性がかなク低減している。そのた
めにこれらの誘導体をヒトの治療に用いたばあい凝血性
の低下の危険性がより低減される。しかし前述したよう
にN−スルフエートの加水分解またはチツ素原子土のア
ニオン性官能基の加水分解は33〜35%を超えるべき
ではない。その理由は極端に好脂性で、アニオン性が低
すぎる性質を有する再構成された(RecOnstit
uted)最終生成物はLPLと錯体を形成させるのに
は適当でないからである。
これらの観測結果にもとづいてかなわ多くの研究が行な
われている。
われている。
なかんづくアイ・ビ一・クツシング(1.B.Cush
ing)の加水分解されたヘパリンのN−サクシニル誘
導体に関する研究は注目すべきである(米国特許第31
18816号明細書(発明の名称:N−サクシニルヘパ
リンおよびその製法、特許権者:アボツト・ラボラトリ
ーズ(AbbOttLabs)、出願日:1964年1
月21日)参照)。該特許のクレームのもつとも重要な
点は、レビ一の研究と同様に、出発物質ヘパリンのN−
スルフエート基の3570を超えない範囲でN−サクシ
ニル基を導入することである。このクレームもまたN−
スルフエート基の3570以上を加水分解した生成物を
サクシニル化した誘導体はその脂肪分解酵素的活性が極
度に減少するという立場をとつている。その理由はへバ
リンのN−スルフエートの35%以上を加水分解したの
ちN−サクシニル化してえられる化合物がわずかにしか
アニオン的な性質を示さず、そのためLPLと変換され
たヘパリンの活性錯体が形成されなくなるからである。
長くとも3時間で0.086規定の希塩酸を用いるとい
う酸加水分解の条件はO−スルフエートやN−アセチル
が加水分解されないでN−スルフエートのみを加水分解
した生成物をうるための条件を満足している。この最適
であると考えられている加水分解によつてえられる生成
物はつぎにベンゼZおよび重炭酸水素ナトリウムの存在
下にサクシニルクロライドと反応させて、サクシニル化
に供することによ)、LPLと錯体を形成せしめるのに
充分なイオン性を有するN−サクシニルヘバリンを形成
することができる。そのため該加水分解生成物は血漿中
の溶解度が低下し相当する抗脂肪血症活性のみを発現す
る。しかしながら、この活性は抗トロンビンとの相互作
用を可能にするには充分でない。そのため凝血現象にお
けるヘパリン特有の抑止活性は失なわれてしまう。いい
かえれば、前記米国特許第3118816号明細書に開
示されている方法ではヘパリンの抗凝血活性を充分に除
去せしめることができない。該特許明細書のクレーム5
は希酸を用いることを開示しており、また実施例では0
.086モル/tを超えない濃度の鉱酸を用いることが
開示されている。このようにしてえられる生成物が高い
脂肪酸分解酵素活性を有していることから、前述の研究
者たちによつてなされてきた方法、考え方が正しいこと
が実証される。しかし、残存する抗凝血活性(1ηあた
シ8〜10USP単位)が出発物質であるヘパリンに較
べて減少したとはいえ、該生成物を長期間にわたつてヒ
トの病気の治療に用いた場合、凝血作用が低減される危
険がまつたくないといえるほどではない。ケイ・ナガサ
ワ(K.Nagas一Avva)らは最近の文献(J.
BiOchem.、81,989(1979))におい
てN−スルフエートを種々の度合で(さらには高い度合
でずら)加水分解したヘパリンはそのもとの抗凝血活性
を62〜79?維持しているということを報告している
が、これは前述のレビイやステーパラらの研究によつて
えられた結果ならびに本発明でえられる結果とは明らか
に対照的である。しかし、ナガサワらの行なつた加水分
解反応の条件は室温下でジメチルスルホキサイドおよび
メタノールを用いる方法であう、本発明で用いる加水分
解の条件(ナガサワらの方法とは異なる鉱酸濃度でかつ
室温よりも高い温度)とは異なる条件下で行なわれてい
るということは心にとめておく必要がある。
ing)の加水分解されたヘパリンのN−サクシニル誘
導体に関する研究は注目すべきである(米国特許第31
18816号明細書(発明の名称:N−サクシニルヘパ
リンおよびその製法、特許権者:アボツト・ラボラトリ
ーズ(AbbOttLabs)、出願日:1964年1
月21日)参照)。該特許のクレームのもつとも重要な
点は、レビ一の研究と同様に、出発物質ヘパリンのN−
スルフエート基の3570を超えない範囲でN−サクシ
ニル基を導入することである。このクレームもまたN−
スルフエート基の3570以上を加水分解した生成物を
サクシニル化した誘導体はその脂肪分解酵素的活性が極
度に減少するという立場をとつている。その理由はへバ
リンのN−スルフエートの35%以上を加水分解したの
ちN−サクシニル化してえられる化合物がわずかにしか
アニオン的な性質を示さず、そのためLPLと変換され
たヘパリンの活性錯体が形成されなくなるからである。
長くとも3時間で0.086規定の希塩酸を用いるとい
う酸加水分解の条件はO−スルフエートやN−アセチル
が加水分解されないでN−スルフエートのみを加水分解
した生成物をうるための条件を満足している。この最適
であると考えられている加水分解によつてえられる生成
物はつぎにベンゼZおよび重炭酸水素ナトリウムの存在
下にサクシニルクロライドと反応させて、サクシニル化
に供することによ)、LPLと錯体を形成せしめるのに
充分なイオン性を有するN−サクシニルヘバリンを形成
することができる。そのため該加水分解生成物は血漿中
の溶解度が低下し相当する抗脂肪血症活性のみを発現す
る。しかしながら、この活性は抗トロンビンとの相互作
用を可能にするには充分でない。そのため凝血現象にお
けるヘパリン特有の抑止活性は失なわれてしまう。いい
かえれば、前記米国特許第3118816号明細書に開
示されている方法ではヘパリンの抗凝血活性を充分に除
去せしめることができない。該特許明細書のクレーム5
は希酸を用いることを開示しており、また実施例では0
.086モル/tを超えない濃度の鉱酸を用いることが
開示されている。このようにしてえられる生成物が高い
脂肪酸分解酵素活性を有していることから、前述の研究
者たちによつてなされてきた方法、考え方が正しいこと
が実証される。しかし、残存する抗凝血活性(1ηあた
シ8〜10USP単位)が出発物質であるヘパリンに較
べて減少したとはいえ、該生成物を長期間にわたつてヒ
トの病気の治療に用いた場合、凝血作用が低減される危
険がまつたくないといえるほどではない。ケイ・ナガサ
ワ(K.Nagas一Avva)らは最近の文献(J.
BiOchem.、81,989(1979))におい
てN−スルフエートを種々の度合で(さらには高い度合
でずら)加水分解したヘパリンはそのもとの抗凝血活性
を62〜79?維持しているということを報告している
が、これは前述のレビイやステーパラらの研究によつて
えられた結果ならびに本発明でえられる結果とは明らか
に対照的である。しかし、ナガサワらの行なつた加水分
解反応の条件は室温下でジメチルスルホキサイドおよび
メタノールを用いる方法であう、本発明で用いる加水分
解の条件(ナガサワらの方法とは異なる鉱酸濃度でかつ
室温よりも高い温度)とは異なる条件下で行なわれてい
るということは心にとめておく必要がある。
以上に本発明の従来技術を述べた。
本発明者らは前記米国特許第3118816号明細書に
開示されている方法またはレビイの方法に較べてよりき
びしい条件下(すなわち0.33規定の塩酸を用い10
0℃で6時間)でヘパリンを加水分解し、ついでその生
物学的に不活性となつた加水分解生成物をコハク酸無水
物訃よび水酸化ナトリウムを用いて充分にサクシニル化
することによつてえられる生成物が抗凝血活性をほとん
ど有しておらず(0.05USP単位/M9)、しかも
治療学的に充分な坑脂肪血症活性を有しているという驚
くべき事実を見出し、本発明を完成するにいたつた。す
なわち本発明はヘパリンのN−スルフエート基数に対し
1070未満のN−スルフエート基数を有し、2糖類単
位あたFOO.6ようも高いヘミーサクシニツク単位を
有する式;(式中、Nfmは8〜15である)で示され
るグルコサミノグルカ/誘導体およびその製造法に関す
る。
開示されている方法またはレビイの方法に較べてよりき
びしい条件下(すなわち0.33規定の塩酸を用い10
0℃で6時間)でヘパリンを加水分解し、ついでその生
物学的に不活性となつた加水分解生成物をコハク酸無水
物訃よび水酸化ナトリウムを用いて充分にサクシニル化
することによつてえられる生成物が抗凝血活性をほとん
ど有しておらず(0.05USP単位/M9)、しかも
治療学的に充分な坑脂肪血症活性を有しているという驚
くべき事実を見出し、本発明を完成するにいたつた。す
なわち本発明はヘパリンのN−スルフエート基数に対し
1070未満のN−スルフエート基数を有し、2糖類単
位あたFOO.6ようも高いヘミーサクシニツク単位を
有する式;(式中、Nfmは8〜15である)で示され
るグルコサミノグルカ/誘導体およびその製造法に関す
る。
前記式は、フィ・フィ・カツカ一(V.V.Ka一Kk
ar)およびデイ・ビ一・トーマス(D.P.Th−0
mas)編、「ヘパリンーケミストリ アンド クリニ
カル ユーシツジ(Heparin−Chemistr
yaldClinicalUsage月、アカデミツク
プレス社発行(1976年)の11頁にジエイ・キズ(
J.Kiss)が記載しているヘパリンの式二(式中、
m+nは8〜15である)で示される繰返し単位に基づ
いて示してある。
ar)およびデイ・ビ一・トーマス(D.P.Th−0
mas)編、「ヘパリンーケミストリ アンド クリニ
カル ユーシツジ(Heparin−Chemistr
yaldClinicalUsage月、アカデミツク
プレス社発行(1976年)の11頁にジエイ・キズ(
J.Kiss)が記載しているヘパリンの式二(式中、
m+nは8〜15である)で示される繰返し単位に基づ
いて示してある。
本発明の加水分解はヘパリン中のすべてのNーサクシニ
ル基と一部のO−サクシニル基を加水分解するのに充分
な酸の濃度と反応時間の条件下で行なわれる。
ル基と一部のO−サクシニル基を加水分解するのに充分
な酸の濃度と反応時間の条件下で行なわれる。
そのつぎに行なうサクシニル化によつてその生物学的活
性およ物理化学的性質が再生された生成物をうることが
できる。生成物中の2糖類単位はヘパリンの2糖類単位
、すなわちα一L−イズロン酸−2−0−スルフエート
およびα一D−グルコサミノ一2−N−スルフエート一
6−O−スルフエートの1,4結合したものまたはβ−
D−グルクロン酸}よびα−D−グルコサミノ一2−N
−アセチル−6−0−スルフエートの1,4結合したも
のが一部変化したものであつた(ヘパリンの構造につい
てはアール・ダブリユ・ジエーンロツ(R.W.Jea
nlOz)の著書(1琵p一ArinStructur
e,.FurlctiOnandOlinicalIm
pricatiOnsl)またはアール・エイ・ブラツ
ドシヨウ(R.A.Bradshw)およびエス・ウエ
スラー(S.Wessler)らの論文(Adv.Ex
pl.Med.BlOl.52,3(1974))参照
)。生成物中にはヘミーサクシニツク単位(Henli
−Succinicunit)が1つの2糖類単位あた
)1.2単位まで導入されている。これに対し、クツシ
ングによつて報告されている方法によれば、この値は出
発物質のヘパリンがそのN−スルフオニル基の35%を
加水分解された場合に最大値を与えるが、わずかに0.
6である。本発明のサクシニル誘導体の抗凝血活性は出
発物質として用いたヘパリンの種類によつて異なるが、
いずれも17Vあたう0.05USP単位よ)も低く、
ほとんど失なわれているといつてよい。
性およ物理化学的性質が再生された生成物をうることが
できる。生成物中の2糖類単位はヘパリンの2糖類単位
、すなわちα一L−イズロン酸−2−0−スルフエート
およびα一D−グルコサミノ一2−N−スルフエート一
6−O−スルフエートの1,4結合したものまたはβ−
D−グルクロン酸}よびα−D−グルコサミノ一2−N
−アセチル−6−0−スルフエートの1,4結合したも
のが一部変化したものであつた(ヘパリンの構造につい
てはアール・ダブリユ・ジエーンロツ(R.W.Jea
nlOz)の著書(1琵p一ArinStructur
e,.FurlctiOnandOlinicalIm
pricatiOnsl)またはアール・エイ・ブラツ
ドシヨウ(R.A.Bradshw)およびエス・ウエ
スラー(S.Wessler)らの論文(Adv.Ex
pl.Med.BlOl.52,3(1974))参照
)。生成物中にはヘミーサクシニツク単位(Henli
−Succinicunit)が1つの2糖類単位あた
)1.2単位まで導入されている。これに対し、クツシ
ングによつて報告されている方法によれば、この値は出
発物質のヘパリンがそのN−スルフオニル基の35%を
加水分解された場合に最大値を与えるが、わずかに0.
6である。本発明のサクシニル誘導体の抗凝血活性は出
発物質として用いたヘパリンの種類によつて異なるが、
いずれも17Vあたう0.05USP単位よ)も低く、
ほとんど失なわれているといつてよい。
それはヘパリンそのものの抗凝結活性が1臂あたシ15
0〜180USP単位であることから明言できる。本発
明の物質にはそのほかに以下にあげる性質がある。(1
)出発物質として種類の異なるヘパリンを用いたとして
も生成物は一定の等電位フオーカリゼーシヨン(IsO
electrOfOcaJjzalOn)を有する。
0〜180USP単位であることから明言できる。本発
明の物質にはそのほかに以下にあげる性質がある。(1
)出発物質として種類の異なるヘパリンを用いたとして
も生成物は一定の等電位フオーカリゼーシヨン(IsO
electrOfOcaJjzalOn)を有する。
さらに、該生成物は前記米国特許明細書に開示されてい
る生成物にくらべて平均のアニオン性の度合が小さい。
該アニオン性の度合は加水分解時間およびN−サクシニ
ル化の度合によつて異なる。クツシングの方法によつて
えられる生成物もまた加水分解の時間の違いによつて異
なる性質を示すが、しかしそれらの生成物はいずれも本
発明の誘導体と同様な等電位集中は示さない(第1図参
照)。第1図に示されるように、吸収帯のパターンが異
なるだけでなく、同じ発色方法でえられる色の強度も本
発明の誘導体からえられる色の方が薄いことから、本発
明の誘導体は着色剤との親和性の小さい、従来のサクシ
ニル誘導体とは構造の異なる物質であることがわかる。
る生成物にくらべて平均のアニオン性の度合が小さい。
該アニオン性の度合は加水分解時間およびN−サクシニ
ル化の度合によつて異なる。クツシングの方法によつて
えられる生成物もまた加水分解の時間の違いによつて異
なる性質を示すが、しかしそれらの生成物はいずれも本
発明の誘導体と同様な等電位集中は示さない(第1図参
照)。第1図に示されるように、吸収帯のパターンが異
なるだけでなく、同じ発色方法でえられる色の強度も本
発明の誘導体からえられる色の方が薄いことから、本発
明の誘導体は着色剤との親和性の小さい、従来のサクシ
ニル誘導体とは構造の異なる物質であることがわかる。
(2)本発明の誘導体は以下に述べるように一定の電気
泳動特性を有している。
泳動特性を有している。
さらに、該酸導体は出発物質として用いたヘパリンのみ
ならずクツシングの方法によつてえられる誘導体に較べ
てその酸性度は低い。クツシングの方法によつてえられ
る誘導体の酸性度はその加水分解時間によつてかなb異
なるが、とくに加水分解の度合が低いものについては酸
性度の違いがよりはつきクしている。(3)本発明の誘
導体の構造は、後述するように、水素核磁気共鳴吸収ス
ペクトル(IH−NMR)および13c−核磁気共鳴吸
収スペクトル(13c−NMR)によつて分析されるが
、それによるとチツ素原子土のみならず部分的に酸素原
子土にもサクシニル化されていることがわかる。
ならずクツシングの方法によつてえられる誘導体に較べ
てその酸性度は低い。クツシングの方法によつてえられ
る誘導体の酸性度はその加水分解時間によつてかなb異
なるが、とくに加水分解の度合が低いものについては酸
性度の違いがよりはつきクしている。(3)本発明の誘
導体の構造は、後述するように、水素核磁気共鳴吸収ス
ペクトル(IH−NMR)および13c−核磁気共鳴吸
収スペクトル(13c−NMR)によつて分析されるが
、それによるとチツ素原子土のみならず部分的に酸素原
子土にもサクシニル化されていることがわかる。
前述したように、このサクシニル化の度合は1つの2糖
類単位あたク1.2個のヘミーサクシニツク単位である
。これに対しクツシングの方法によつてえられるサクシ
ニル化物を同じ方法で分析したばあい、サクシニル化の
度合は最大でも1つの2糖類単位あたVO.6個のへミ
ーサクシニツク単位でしかない。(4) (一定の抗脂
肪血症活性) 種類の異なるヘパリンを出発物質として用いても、えら
れる生成物の脂肪分解酵素活性はもとのヘパリンの活性
の約50%(平均値)である。
類単位あたク1.2個のヘミーサクシニツク単位である
。これに対しクツシングの方法によつてえられるサクシ
ニル化物を同じ方法で分析したばあい、サクシニル化の
度合は最大でも1つの2糖類単位あたVO.6個のへミ
ーサクシニツク単位でしかない。(4) (一定の抗脂
肪血症活性) 種類の異なるヘパリンを出発物質として用いても、えら
れる生成物の脂肪分解酵素活性はもとのヘパリンの活性
の約50%(平均値)である。
またその活性値はクツシングの方法( 2.5〜3時間
の加水分解反応を特徴とする)でえられる誘導体の活性
値と比較した場合も約50%であつた。しかしながら、
クツシングの方法でえられる誘導体の抗凝血活性は8〜
IOUSP単位/W9であり、本発明の誘導体に較べる
とはるかに高い。また、これらの誘導体は両方とも該脂
肪分解酵素活性の有効時間はヘパリンに較べるとかなク
延長されている。(5)本発明の誘導体の急性毒性値(
LD5O値)は出発物質として用いたヘパリンまたはク
ツシングの方法によつてえられる誘導体のいずれにもま
さる。
の加水分解反応を特徴とする)でえられる誘導体の活性
値と比較した場合も約50%であつた。しかしながら、
クツシングの方法でえられる誘導体の抗凝血活性は8〜
IOUSP単位/W9であり、本発明の誘導体に較べる
とはるかに高い。また、これらの誘導体は両方とも該脂
肪分解酵素活性の有効時間はヘパリンに較べるとかなク
延長されている。(5)本発明の誘導体の急性毒性値(
LD5O値)は出発物質として用いたヘパリンまたはク
ツシングの方法によつてえられる誘導体のいずれにもま
さる。
具体的な数値で比較すると、ラツトを用い、静脈内投与
して測定したLD,O値は、本発明の誘導体では3.4
9/ K’体重であるのに対し、出発物質として用いた
ヘパリンのナトリウム塩では0.9〜 1.09/ K
9体重であり、クツシングの方法でえられる誘導体は2
.39/ 4体重であつた。つぎに本発明の誘導体の製
造例およびその性質の測定方法について述べる。
して測定したLD,O値は、本発明の誘導体では3.4
9/ K’体重であるのに対し、出発物質として用いた
ヘパリンのナトリウム塩では0.9〜 1.09/ K
9体重であり、クツシングの方法でえられる誘導体は2
.39/ 4体重であつた。つぎに本発明の誘導体の製
造例およびその性質の測定方法について述べる。
なお、つぎの製造例でうることができる本発明のグルコ
サミノグルカン誘導体は以下、GGMという。製造例 (GGMの製造) 冷却管、撹拌棒およびチツ素ガス導入管を付した3tの
フラスコ中にチツ素気流を逐次導入して不活性雰囲気下
で操作ができるようにした。
サミノグルカン誘導体は以下、GGMという。製造例 (GGMの製造) 冷却管、撹拌棒およびチツ素ガス導入管を付した3tの
フラスコ中にチツ素気流を逐次導入して不活性雰囲気下
で操作ができるようにした。
ついで該フラスコ中に2tの蒸留水およびヘパリンのナ
トリウム塩2009を加えた。この混合物を室温下で撹
拌して均一溶液とし、ついで2N−HCtの400mt
を加えた。この反応液をチツ素ガスをパプリングする方
法によつて脱気し、さらにチツ素雰囲気下に保つたまま
沸騰水の水浴土で6時間反応させた。つぎに室温にまで
放冷したのち、氷浴中で反応液を冷却しながら水酸化ナ
トリウムの冷飽和水溶液を滴下してPHを8.5に調節
した。反応液の温度を5〜10℃の範囲に保ちつつ、コ
ハク酸無水物400gを滴下し、そのときPHを約8に
保つために水酸化ナトリウム水溶液を同時に滴下した。
滴下終了後、反応液のPHを7.4〜7.5に調節した
。さらに冷却下で反応液を30分間撹拌し、ついで反応
液の3倍容量の95%エタノールを加えることにより沈
澱をえた。該沈澱は初期において油状であつたが、放置
しておくと固体状となつた。該沈澱は吸引ろ過した後風
乾した。該沈澱はさらに蒸留水3tで再び溶解し、公称
カツトーオフ(NOminalcut−0ff)の60
0ダルトン(DaltOn)を有する透析膜を用いて透
析された水中にサクシン酸ナトリウムがみられなくなる
まで透析した。最後に水溶液を凍結乾燥し、GGM2O
O9を針状晶としてえた。囚 等電位フオーカリゼーシ
ヨン 等電位フオーカリゼーシヨンの測定はピ一・ジ一・リゲ
ツテイ(P.G.Righetti)およびイ一・ギア
ナツツア(E.Gianazza)らの方法に従つて行
なつた(B.B.A.、532,137(1978)参
照)。
トリウム塩2009を加えた。この混合物を室温下で撹
拌して均一溶液とし、ついで2N−HCtの400mt
を加えた。この反応液をチツ素ガスをパプリングする方
法によつて脱気し、さらにチツ素雰囲気下に保つたまま
沸騰水の水浴土で6時間反応させた。つぎに室温にまで
放冷したのち、氷浴中で反応液を冷却しながら水酸化ナ
トリウムの冷飽和水溶液を滴下してPHを8.5に調節
した。反応液の温度を5〜10℃の範囲に保ちつつ、コ
ハク酸無水物400gを滴下し、そのときPHを約8に
保つために水酸化ナトリウム水溶液を同時に滴下した。
滴下終了後、反応液のPHを7.4〜7.5に調節した
。さらに冷却下で反応液を30分間撹拌し、ついで反応
液の3倍容量の95%エタノールを加えることにより沈
澱をえた。該沈澱は初期において油状であつたが、放置
しておくと固体状となつた。該沈澱は吸引ろ過した後風
乾した。該沈澱はさらに蒸留水3tで再び溶解し、公称
カツトーオフ(NOminalcut−0ff)の60
0ダルトン(DaltOn)を有する透析膜を用いて透
析された水中にサクシン酸ナトリウムがみられなくなる
まで透析した。最後に水溶液を凍結乾燥し、GGM2O
O9を針状晶としてえた。囚 等電位フオーカリゼーシ
ヨン 等電位フオーカリゼーシヨンの測定はピ一・ジ一・リゲ
ツテイ(P.G.Righetti)およびイ一・ギア
ナツツア(E.Gianazza)らの方法に従つて行
なつた(B.B.A.、532,137(1978)参
照)。
該方法は7%T、1%LKBを2.5〜 4,含むポリ
アクリルアミドゲル、1%LKBを3〜5%含むポリア
クリルアミドゲルおよび0.1%LKBを3.5〜10
%含むポリアクリルアミドゲルを用いて等電位フオーカ
リゼーシヨンを測定するために用いられる。以下に述べ
る各試料を8M−尿素水溶液に溶かし、試料濃度を20
mfi/Mtとした。
アクリルアミドゲル、1%LKBを3〜5%含むポリア
クリルアミドゲルおよび0.1%LKBを3.5〜10
%含むポリアクリルアミドゲルを用いて等電位フオーカ
リゼーシヨンを測定するために用いられる。以下に述べ
る各試料を8M−尿素水溶液に溶かし、試料濃度を20
mfi/Mtとした。
えられる試料溶液をホワツトマン紙(3MM)にそれぞ
れ等量ずつ(250μg)塗布した。このものを12W
100Vmax、温度9℃で3時間半展開し、発色は2
%酢酸に溶解したトルイジンを用いて行つた。えられた
等電位フオーカリゼーシヨン状態図を第1図に示すが、
1および2の番号を付した部分はいずれもGGMの25
0μ9を試料として用いた場合の等電位フオーカリゼー
シヨンである(ただし、1の番号を付した部分に用いた
GGMはその原料として用いたヘパリンのナトリウム塩
の抗凝血活性が165USP単位/1!1fのものであ
勺、2の番号を付した部分に用いたGGMはその原料に
用いたへ?くリンの抗凝血活性が178USP単q巧の
ものである)。3または4の番号を付した部分は抗凝血
活性の165USP単位/Wiを有するヘパリンのナト
リウム塩をクツシングの方法でそれぞれ30分間または
180分間加水分解したのちサクシニル化してえられる
誘導体の250μ9を試料として用いた場合の等電位フ
オーカリゼーシヨンである。
れ等量ずつ(250μg)塗布した。このものを12W
100Vmax、温度9℃で3時間半展開し、発色は2
%酢酸に溶解したトルイジンを用いて行つた。えられた
等電位フオーカリゼーシヨン状態図を第1図に示すが、
1および2の番号を付した部分はいずれもGGMの25
0μ9を試料として用いた場合の等電位フオーカリゼー
シヨンである(ただし、1の番号を付した部分に用いた
GGMはその原料として用いたヘパリンのナトリウム塩
の抗凝血活性が165USP単位/1!1fのものであ
勺、2の番号を付した部分に用いたGGMはその原料に
用いたへ?くリンの抗凝血活性が178USP単q巧の
ものである)。3または4の番号を付した部分は抗凝血
活性の165USP単位/Wiを有するヘパリンのナト
リウム塩をクツシングの方法でそれぞれ30分間または
180分間加水分解したのちサクシニル化してえられる
誘導体の250μ9を試料として用いた場合の等電位フ
オーカリゼーシヨンである。
5の番号を付した部分は2,3および4の番号を付した
部分に用いた試料を製造するための出発原料であるヘパ
リンのナトリウム塩(抗凝血活性165USP単位/即
)の250〜を試料として用いた場合の等電位フオーカ
リゼーシヨンである。
部分に用いた試料を製造するための出発原料であるヘパ
リンのナトリウム塩(抗凝血活性165USP単位/即
)の250〜を試料として用いた場合の等電位フオーカ
リゼーシヨンである。
(8)電気泳動特性
第2図に示した電気泳動特性はつぎの条件下で測定した
。
。
0.1M−バリウムアセテート溶液(PH5.8)に浸
漬したセルロースアセテート膜(SepraphOre
一Gelmanl5.5cr!L×11cm)を用い、
試刺3μ9を原点にスポツトしたのち、室温下に40で
4時間電気泳動を行なつた。
漬したセルロースアセテート膜(SepraphOre
一Gelmanl5.5cr!L×11cm)を用い、
試刺3μ9を原点にスポツトしたのち、室温下に40で
4時間電気泳動を行なつた。
つぎにアルシヤン・ブルー(AlcianB!Ue)1
50′V,957Oエタノール100rrtおよび0.
5M一酢酸ナトリウム溶液(PH5.8)100mtか
らなる呈色液を用いて呈色させた。このものは5%酢酸
で脱色することができた。
50′V,957Oエタノール100rrtおよび0.
5M一酢酸ナトリウム溶液(PH5.8)100mtか
らなる呈色液を用いて呈色させた。このものは5%酢酸
で脱色することができた。
ダイアフアニゼーシヨン(DiafanizallOn
)は酢酸15容量70、メタノール84容量70、トル
エン0.5容量%卦よびアセトン0.5容量70からな
る混合物を用いて1分間行なつた。第2図に示す電気泳
動の特性パターン図においてA,bおよびdで示したス
ポツトはそれぞれ異なる種類の市販ヘパリンからえられ
るGGMに相当するスポツトである。
)は酢酸15容量70、メタノール84容量70、トル
エン0.5容量%卦よびアセトン0.5容量70からな
る混合物を用いて1分間行なつた。第2図に示す電気泳
動の特性パターン図においてA,bおよびdで示したス
ポツトはそれぞれ異なる種類の市販ヘパリンからえられ
るGGMに相当するスポツトである。
cで示したスポツトはクツシングの方法(加水分解時間
:2.5時間)によつてえられる誘導体(抗凝血活性:
10USP単Q77V/に相当する。第3図に示した電
気泳動特性はつぎの条件下で測定した。
:2.5時間)によつてえられる誘導体(抗凝血活性:
10USP単Q77V/に相当する。第3図に示した電
気泳動特性はつぎの条件下で測定した。
0.05M−トリフルオロ酢酸に水酸化ナトリウムを加
えてPHを3に調節した溶液に浸漬したセルロースアセ
テート膜(SepraphOre−Gelnlan,5
.5(1X11C!IL)を用い、試料3μ9を原点に
スポツトしたのち室温下に45Vで3時間電気泳動を行
なつた。
えてPHを3に調節した溶液に浸漬したセルロースアセ
テート膜(SepraphOre−Gelnlan,5
.5(1X11C!IL)を用い、試料3μ9を原点に
スポツトしたのち室温下に45Vで3時間電気泳動を行
なつた。
ついで、前述した方法と同じ方法で呈色およびダイアフ
アニゼーシヨンを行なつた。第3図に示す電気泳動の特
性パターン図に卦いて、bで示したスポツトは抗凝血活
性160USP単位/巧を有するヘパリンに相当し、a
で示したスポツトはそのヘパリンから本発明の方法でえ
られるGGMに相当する。cまたはdで示したスポツト
は同種のヘパリン(抗凝血活性160USP単位/巧)
を用い、クツシングの方法によつてそれぞれ加水分解時
間を30分間または180分間としたのちサクシニル化
してえられる誘導体に相当する。(0130?NMRス
ペクトル分析 130−NMRスペクトル分析は25.2MHzの13
0−、、分析機を用い、ジオキサン−重水溶媒に溶かし
て行なつた。
アニゼーシヨンを行なつた。第3図に示す電気泳動の特
性パターン図に卦いて、bで示したスポツトは抗凝血活
性160USP単位/巧を有するヘパリンに相当し、a
で示したスポツトはそのヘパリンから本発明の方法でえ
られるGGMに相当する。cまたはdで示したスポツト
は同種のヘパリン(抗凝血活性160USP単位/巧)
を用い、クツシングの方法によつてそれぞれ加水分解時
間を30分間または180分間としたのちサクシニル化
してえられる誘導体に相当する。(0130?NMRス
ペクトル分析 130−NMRスペクトル分析は25.2MHzの13
0−、、分析機を用い、ジオキサン−重水溶媒に溶かし
て行なつた。
またジオキサンを内部標準として用い、測定結果はPp
mで表わした(ジ一・ガツテイ(G.Gatti)、ビ
一・ガス(B.Casu)、ジ一・ケイ・パーマ一(G
.K.Hanler)}よびエイ・エス・バーリン(A
.S.Perlin)らの論文(MacrOmOlec
ules,l2,lOOl(1979))参照)。(イ
)GGMの130−NMRスペクトル分析GGMまたは
ヘパリンのサトリウム塩を同じ条件下で測定した13C
−NMRスペクトルのそれぞれを比較した。
mで表わした(ジ一・ガツテイ(G.Gatti)、ビ
一・ガス(B.Casu)、ジ一・ケイ・パーマ一(G
.K.Hanler)}よびエイ・エス・バーリン(A
.S.Perlin)らの論文(MacrOmOlec
ules,l2,lOOl(1979))参照)。(イ
)GGMの130−NMRスペクトル分析GGMまたは
ヘパリンのサトリウム塩を同じ条件下で測定した13C
−NMRスペクトルのそれぞれを比較した。
えられたシグナルおよび両者のシグナルの違いをつぎに
示す。(1)サクシン酸残基のCOO−の炭素原子に相
当する新しいシグナルが181.8(Ppm、以下同様
)にみられた。
示す。(1)サクシン酸残基のCOO−の炭素原子に相
当する新しいシグナルが181.8(Ppm、以下同様
)にみられた。
(2)サクシン酸残基のCONHの炭素原子に相当する
新しいシグナルが177にみられた。
新しいシグナルが177にみられた。
(3)イズロン酸のCOOHの炭素原子に相当するシグ
ナルが176.7にみられ、これはヘパリンに訃いてみ
られるシグナルと一致した。
ナルが176.7にみられ、これはヘパリンに訃いてみ
られるシグナルと一致した。
(4)グルクロン酸の1位の炭素原子に相当する小さな
シグナルが102にみられ、これはヘパリンにおいてみ
られるシグナルと一致した。
シグナルが102にみられ、これはヘパリンにおいてみ
られるシグナルと一致した。
(5)イズロン酸の1位の炭素原子に相当するシグナル
が100にみられ、これはヘパリンにおいてみられるシ
グナルと一致した。
が100にみられ、これはヘパリンにおいてみられるシ
グナルと一致した。
(6) N−サクシニル・グルコサミンの1位の炭素原
子に相当する新しいシグナルが95.3にみられた。
子に相当する新しいシグナルが95.3にみられた。
一方、出発物質であるヘパリンに特有のグルコサミン・
N−スルフエートの1位の炭素原子に相当する97.7
のシグナルが消失した。(7) N−サクシニル・グル
コサミンの2位}よび4位の炭素原子ならびにイズロン
酸の2位の炭素原子に相当する一連の新しいシグナルが
72〜76にみられた。これらのシグナルはヘパリンに
おいては互いに集まつて単一の強いシグナlルであつた
。(8) N−サクシニルグルコサミンの3位および5
位の炭素原子ならびにイズロン酸の3位および5位の炭
素原子に相当する2本のシグナルが70および71にみ
られ、これはヘパリンの同二じ位置の炭素原子に相当す
るシグナルと同じであつた。
N−スルフエートの1位の炭素原子に相当する97.7
のシグナルが消失した。(7) N−サクシニル・グル
コサミンの2位}よび4位の炭素原子ならびにイズロン
酸の2位の炭素原子に相当する一連の新しいシグナルが
72〜76にみられた。これらのシグナルはヘパリンに
おいては互いに集まつて単一の強いシグナlルであつた
。(8) N−サクシニルグルコサミンの3位および5
位の炭素原子ならびにイズロン酸の3位および5位の炭
素原子に相当する2本のシグナルが70および71にみ
られ、これはヘパリンの同二じ位置の炭素原子に相当す
るシグナルと同じであつた。
(9) N−サクシニルグルコサミンの6位の炭素原子
に相当するシグナルが67にみられ、それはヘパリンの
N−スルフオニルグルコサミンの65位の炭素原子に相
当するシグナルと同じであつた。
に相当するシグナルが67にみられ、それはヘパリンの
N−スルフオニルグルコサミンの65位の炭素原子に相
当するシグナルと同じであつた。
UO)N−サクシニルグルコサミンの2位の炭素原子に
相当する新しいシグナルが54.5にみられた。一方、
ヘパリンのN−スルフオニルグルコサミンの2位の炭素
原子に相当する58。8のシグナルが消失した。
相当する新しいシグナルが54.5にみられた。一方、
ヘパリンのN−スルフオニルグルコサミンの2位の炭素
原子に相当する58。8のシグナルが消失した。
U1) GGW)−CH2COO−および−CH,℃0
−NH一に相当する2本の新しいシグナルがそれぞれ3
3.0訃よび33.5にみられた。
−NH一に相当する2本の新しいシグナルがそれぞれ3
3.0訃よび33.5にみられた。
(ロ)クツシングの方法(加水分解時間:180分間)
でえられる誘導体の130?NMRスペクトル分析クツ
シングの方法(加水分解時間:180分間)でえられる
誘導体(以後、C−180という)のの130−NlR
スペクトルは前述(イ)のGGMの130−NMRスペ
クトル測定結果のうち(1)〜(5)、(9)およびU
1)で示したシグナルと同じシグナルを有している。
でえられる誘導体の130?NMRスペクトル分析クツ
シングの方法(加水分解時間:180分間)でえられる
誘導体(以後、C−180という)のの130−NlR
スペクトルは前述(イ)のGGMの130−NMRスペ
クトル測定結果のうち(1)〜(5)、(9)およびU
1)で示したシグナルと同じシグナルを有している。
グルコサミン残基の1位の炭素原子に相当するシグナル
(前言I2(6)で述べたシグナル)に関して、C−1
80はGGMでみられたN−サクシニルーグルコサミン
に特徴的なシグナルはみられずN一スルフオニルーグル
コサミンに特徴的なシグナルが存在していた。
(前言I2(6)で述べたシグナル)に関して、C−1
80はGGMでみられたN−サクシニルーグルコサミン
に特徴的なシグナルはみられずN一スルフオニルーグル
コサミンに特徴的なシグナルが存在していた。
このことからC−180はNースルフオニル基が充分に
加水分解されていないままにサクシニル化されたもので
あ勺、N−スルフエート基とN−サクシニル基の両方を
含有しているものであることがわかる。N−スルフオニ
ル基またはN−サクシニル基を有するグルコサミンの3
位、4位}よび5位の炭素に相当するシグナルおよびイ
ズロン酸の2位、3位、4位および5位に相当するシグ
ナルは70付近訃よび76付近に集まつている。
加水分解されていないままにサクシニル化されたもので
あ勺、N−スルフエート基とN−サクシニル基の両方を
含有しているものであることがわかる。N−スルフオニ
ル基またはN−サクシニル基を有するグルコサミンの3
位、4位}よび5位の炭素に相当するシグナルおよびイ
ズロン酸の2位、3位、4位および5位に相当するシグ
ナルは70付近訃よび76付近に集まつている。
それゆえC−180はヘパリンのシグナルパターンとG
GMのシグナルパターンの中間的なシグナルパターンを
有しているといえる(前言αイ)の(7)および(8)
参照)。さらには、C−180にはヘパリンに特有の5
8.8のシグナルがみられるが、GGMに特有の54.
5のシグナルはみられないJ前記イ)の0鯵照)。(ハ
)クツシングの方法(加水分解時間:30分間)でえら
れる誘導体の130?NMRスペクトル分析クツシング
の方法(加水分解時間:30分間)でえられる誘導体(
以後、C−30という)の130−NMRスペクトルは
C−180の13C−NMRスペクトルとほぼ同じシグ
ナルパターンを示すがややサクシニル化の度合が低いこ
とを示している。
GMのシグナルパターンの中間的なシグナルパターンを
有しているといえる(前言αイ)の(7)および(8)
参照)。さらには、C−180にはヘパリンに特有の5
8.8のシグナルがみられるが、GGMに特有の54.
5のシグナルはみられないJ前記イ)の0鯵照)。(ハ
)クツシングの方法(加水分解時間:30分間)でえら
れる誘導体の130?NMRスペクトル分析クツシング
の方法(加水分解時間:30分間)でえられる誘導体(
以後、C−30という)の130−NMRスペクトルは
C−180の13C−NMRスペクトルとほぼ同じシグ
ナルパターンを示すがややサクシニル化の度合が低いこ
とを示している。
すなわち、C−180と同じ化学シフトのシグナルを示
すが、前記(イ)の(1)および(2)で述べたシグナ
ルに相当するシグサルの強共の(3)で述べたシグナル
に相当するシグナルの強度に対する割合はGGM}よび
C−180のそれようも低く、それゆえC−30はC−
180に較べるとサクシニル化の度合が低いといえる。
前記(イ)の(≦),(4),(5),(9)および(
社)で述べたシグナルに相当するシグナルはGGM訃よ
びC−180と一致した。
すが、前記(イ)の(1)および(2)で述べたシグナ
ルに相当するシグサルの強共の(3)で述べたシグナル
に相当するシグナルの強度に対する割合はGGM}よび
C−180のそれようも低く、それゆえC−30はC−
180に較べるとサクシニル化の度合が低いといえる。
前記(イ)の(≦),(4),(5),(9)および(
社)で述べたシグナルに相当するシグナルはGGM訃よ
びC−180と一致した。
N−スルフオニルーグルコサミンの1位の炭素原子に相
当するシグナルが97.7にみられ、その強度はN−サ
クシニルヘバリンの1位0炭素原子に相当する95.3
のシグナルに較べて弱い。そのためC−30のサクシニ
ル化の度合が低いことが再確認される(前記(イ)の(
6)参照)。さらには、N−スルフオニル基またはN−
サクシニル基を有するグルコサミンの3位、4位および
5位の炭素に相当するシグナルおよびイズロン酸の2位
、3位、4位および5位に相当するシグナルのパターン
(前記(イ)の(7?よび(8)参照)からC−30は
ヘパリンとC−180の中間的な性質を有していること
がわかつた。N−サクシニルグルコサミドの2位の炭素
に相当するシグナルが54.5にみられるが、その強度
はN−スルフオニルグルコサミドの2位の炭素に相当す
る58.8のシグナルの強度に較べて弱い(前言αイ)
のUI参照)。
当するシグナルが97.7にみられ、その強度はN−サ
クシニルヘバリンの1位0炭素原子に相当する95.3
のシグナルに較べて弱い。そのためC−30のサクシニ
ル化の度合が低いことが再確認される(前記(イ)の(
6)参照)。さらには、N−スルフオニル基またはN−
サクシニル基を有するグルコサミンの3位、4位および
5位の炭素に相当するシグナルおよびイズロン酸の2位
、3位、4位および5位に相当するシグナルのパターン
(前記(イ)の(7?よび(8)参照)からC−30は
ヘパリンとC−180の中間的な性質を有していること
がわかつた。N−サクシニルグルコサミドの2位の炭素
に相当するシグナルが54.5にみられるが、その強度
はN−スルフオニルグルコサミドの2位の炭素に相当す
る58.8のシグナルの強度に較べて弱い(前言αイ)
のUI参照)。
(D) 1ョ一NMRスペクトル分析
1H?NMRスペクトルはパリアンXL−100型の1
00MHZ−11i−NMRスペクトル分析機を用いて
測定し、GGM.C−30およびC−180のそれぞれ
のサクシニル化の度合を評価した。
00MHZ−11i−NMRスペクトル分析機を用いて
測定し、GGM.C−30およびC−180のそれぞれ
のサクシニル化の度合を評価した。
その評価の方法は、2糖類単位あたbに含まれる2個の
カルボン酸性の水素原子のシグナル強度(すなわち1つ
はイズロン酸に相当し、もう1つはN一サクシニルグル
コサミドに相当する)}よびヘミ・サクシニル基(一凸
−CH,CH!COO−)の4つの水素原子のシグナル
強度の間の関係から算出することによつている。えられ
た結果についてつぎに述べる。(1) GGMのサクシ
ニル化の度合は1.2ヘミーサクシニツク単位/2糖類
単位である。
カルボン酸性の水素原子のシグナル強度(すなわち1つ
はイズロン酸に相当し、もう1つはN一サクシニルグル
コサミドに相当する)}よびヘミ・サクシニル基(一凸
−CH,CH!COO−)の4つの水素原子のシグナル
強度の間の関係から算出することによつている。えられ
た結果についてつぎに述べる。(1) GGMのサクシ
ニル化の度合は1.2ヘミーサクシニツク単位/2糖類
単位である。
(2) C−30のサクシニル化の度合は0.2ヘミー
サクシニツク単位/2糖類単位である。
サクシニツク単位/2糖類単位である。
(3) C−180のサクシニル化の度合は0.6ヘミ
サクシニツク単位/2糖類単位である。
サクシニツク単位/2糖類単位である。
以上の特性試験およびスペクトル分析から、本発明の誘
導体がクツシングの方法によつてえられる誘導体にくら
べてスルフエート基の加水分解訃よびサクシニル化の度
合がかなク高いものであることがわかる。
導体がクツシングの方法によつてえられる誘導体にくら
べてスルフエート基の加水分解訃よびサクシニル化の度
合がかなク高いものであることがわかる。
つぎに本発明の誘導体の毒性試験および薬理学的活性に
ついて述べる。
ついて述べる。
囚 急性毒性試験
GGMの急性毒性試験は2種類の実験動物(アルビノ・
スイス・マウス(オス、平均体重22±1f1)および
アルビノ・ウイスタ一・ラツト(オス、平均体重180
±109))を用い、静脈内投与、腹腔内投与および経
口投与による方法で行なつた。
スイス・マウス(オス、平均体重22±1f1)および
アルビノ・ウイスタ一・ラツト(オス、平均体重180
±109))を用い、静脈内投与、腹腔内投与および経
口投与による方法で行なつた。
これらの投与に使用するキャリヤ一としては生理溶液を
用いた。えられた結果をつぎに示す。アルビノ・スイス
・マウス 静脈内投与:LD5O=3414T1!I!/り体重ア
ルビノ・ウイスタ一・ラツト静脈内投与:LD5O=2
400.2Tf1f/り体重腹腔内投与:LD5O〉3
500巧/!体重経口投与:LD,O〉5000巧゛/
り体重これに対し、クツシングの方法でえられる誘導体
のLD,O値はマウスを用いて試験したところ約230
0mf/!であつた。
用いた。えられた結果をつぎに示す。アルビノ・スイス
・マウス 静脈内投与:LD5O=3414T1!I!/り体重ア
ルビノ・ウイスタ一・ラツト静脈内投与:LD5O=2
400.2Tf1f/り体重腹腔内投与:LD5O〉3
500巧/!体重経口投与:LD,O〉5000巧゛/
り体重これに対し、クツシングの方法でえられる誘導体
のLD,O値はマウスを用いて試験したところ約230
0mf/!であつた。
(8)抗コレステリン過剰血症活性および抗トリグリセ
ラード過剰血症活性GGMの抗コレステリン過剰症活性
および抗トリグリセラード過剰血症活性はトリトン(T
ritOn:WR−1339)によつて生ぜしめたコレ
ステリン過剰血症およびトリグリセラード過剰血症につ
いて行なうエス・ガラツチニ(S.Garattini
)、ピ一●モルプルゴ一(P.mOrpurgO)1ア
一A′1ゞオレツチ(R.PaOietti)らの方法
(Arm.FOrsch、9,206(1959)参照
)訃よびイ一・マルモ(E.MarmO)、イ一・ラム
パ(E.Lampa)らの方法(ArchivOper
leScienめMediche、132p(3),8
3(1975)参照)にしたがつて評価した。
ラード過剰血症活性GGMの抗コレステリン過剰症活性
および抗トリグリセラード過剰血症活性はトリトン(T
ritOn:WR−1339)によつて生ぜしめたコレ
ステリン過剰血症およびトリグリセラード過剰血症につ
いて行なうエス・ガラツチニ(S.Garattini
)、ピ一●モルプルゴ一(P.mOrpurgO)1ア
一A′1ゞオレツチ(R.PaOietti)らの方法
(Arm.FOrsch、9,206(1959)参照
)訃よびイ一・マルモ(E.MarmO)、イ一・ラム
パ(E.Lampa)らの方法(ArchivOper
leScienめMediche、132p(3),8
3(1975)参照)にしたがつて評価した。
実験動物は無作為抽出した体重190〜2109のオス
のアルビノ・ウイスタ一・ラツトを用いた。
のアルビノ・ウイスタ一・ラツトを用いた。
該実験動物をいくつかのグループに分け、1つのグルー
プにはキヤリヤ一として用いる生理溶液のみを2mtA
9体重投与し、ほかのグループには(1)生理溶液およ
びトリトン2007!!f/Kf体重または、(2)生
理溶液、トリトンに加えてGGMを第1表に示す投与方
法、投与量で投与した。
プにはキヤリヤ一として用いる生理溶液のみを2mtA
9体重投与し、ほかのグループには(1)生理溶液およ
びトリトン2007!!f/Kf体重または、(2)生
理溶液、トリトンに加えてGGMを第1表に示す投与方
法、投与量で投与した。
トリトンは12時間絶食した(水は自由に与えた)ラツ
トに静脈内投与するが、その投与量は200η/!であ
る。拮抗質として用いるGGMはトリトン投与の2時間
前卦よび2時間後に腹腔内投与または経口投与した。ト
リトン投与と2回目のGGM投与の期間中に動物に餌を
与え、そののち食物を取v除いた(水は自由に与える)
。トリトン投与から12時間経過後、実験動物の心臓か
ら注射器を用いて血液を採取し、血中のトリグリセラー
ド訃よびコレステリン濃度を測定した。トリグリセラー
ド濃度の測定はエム・エツグシユタイン(M.Eggs
tein)によるトリグリセラードを酒精カリでケン化
したのち、酵素学的に測定する方法によつた(Klln
.Wsc抽.、44,262(1966)参照)。コレ
ステリンの測定はピ一・ロシユラフ(P.ROsh!A
v)らの方法にしたがつて行なつた(Z..Klln.
Chem.Klin.BiOchem.、12,403
(1974)参照)。えられた結果を第1表に示す。ト
リトンを200TI9を静脈内投与して過脂肪血症を誘
発せしめ、好脂肪性のギヤリヤーを用いたほかは前述の
方法と同様にして実験を行ない、血中トリグリセラード
濃度訃よび血中コレステリン濃度を測定した。
トに静脈内投与するが、その投与量は200η/!であ
る。拮抗質として用いるGGMはトリトン投与の2時間
前卦よび2時間後に腹腔内投与または経口投与した。ト
リトン投与と2回目のGGM投与の期間中に動物に餌を
与え、そののち食物を取v除いた(水は自由に与える)
。トリトン投与から12時間経過後、実験動物の心臓か
ら注射器を用いて血液を採取し、血中のトリグリセラー
ド訃よびコレステリン濃度を測定した。トリグリセラー
ド濃度の測定はエム・エツグシユタイン(M.Eggs
tein)によるトリグリセラードを酒精カリでケン化
したのち、酵素学的に測定する方法によつた(Klln
.Wsc抽.、44,262(1966)参照)。コレ
ステリンの測定はピ一・ロシユラフ(P.ROsh!A
v)らの方法にしたがつて行なつた(Z..Klln.
Chem.Klin.BiOchem.、12,403
(1974)参照)。えられた結果を第1表に示す。ト
リトンを200TI9を静脈内投与して過脂肪血症を誘
発せしめ、好脂肪性のギヤリヤーを用いたほかは前述の
方法と同様にして実験を行ない、血中トリグリセラード
濃度訃よび血中コレステリン濃度を測定した。
第2表にはキヤリヤ一としてトウイーン(Tween)
を用いた結果を示し、第3表にはキヤリヤ一としてトリ
グリセラードを用いた結果を示す。(0リポプロテイン
分解酵素活性(エジオル試験)本発明の誘導体のリポプ
ロテイン分解酵素活性は平均体重190±109のオス
のアルビノ・ウイスタ一・ラツトを用い、ビアンチニ(
Bianch一Ini)らの方法(11!Bianch
ini.G.Guidi.B.Osima,lBlOO
dLevelsOftheClearingFactO
rAftErAdOlinistratiOnOfaN
aturalGlucurOnOglucOsamin
OglycanlBiOchem.Expl.BlOl
.、X,(N.3)、1972.参照)にしたがつて行
なつた。
を用いた結果を示し、第3表にはキヤリヤ一としてトリ
グリセラードを用いた結果を示す。(0リポプロテイン
分解酵素活性(エジオル試験)本発明の誘導体のリポプ
ロテイン分解酵素活性は平均体重190±109のオス
のアルビノ・ウイスタ一・ラツトを用い、ビアンチニ(
Bianch一Ini)らの方法(11!Bianch
ini.G.Guidi.B.Osima,lBlOO
dLevelsOftheClearingFactO
rAftErAdOlinistratiOnOfaN
aturalGlucurOnOglucOsamin
OglycanlBiOchem.Expl.BlOl
.、X,(N.3)、1972.参照)にしたがつて行
なつた。
また実験動物は無作為抽出して6つのグループに分け、
普通に餌を与えた。(1)単投与したときの活性と時間
の関係本発明の誘導体またはクツシングの方法でえられ
る誘導体(抗凝血活性10USP単位ノη)からなる薬
剤をそれぞれ10巧/り体重および生理溶液を5mt/
K9体重実験動物に静脈内投与した。
普通に餌を与えた。(1)単投与したときの活性と時間
の関係本発明の誘導体またはクツシングの方法でえられ
る誘導体(抗凝血活性10USP単位ノη)からなる薬
剤をそれぞれ10巧/り体重および生理溶液を5mt/
K9体重実験動物に静脈内投与した。
つぎに5分後、10分後、20分後、40分後、60分
後および90分後のそれぞれ前もつて決めておいた時間
ごとに実験動物にエーテルで麻酔をかけ、前もつてシリ
コネート(Siliα墳Ate)しておいた乾燥注射器
を用いて心臓から5mtずつの血液を採取した。採取し
た血液は20%クエン酸溶液0.28mtを含む目盛つ
き遠心分離管にすみやかに加え、4000回転で15分
間遠心分離し、清浄な血漿を分離した。一方、前もつて
淵過して安定化しておいたリポストレート(LipOs
tratO(EdiOl−CalbiOc一Hem))
の0.1870脂質エマルジヨン1mtを含む試験管を
各試刺に対して用意しておいた。
後および90分後のそれぞれ前もつて決めておいた時間
ごとに実験動物にエーテルで麻酔をかけ、前もつてシリ
コネート(Siliα墳Ate)しておいた乾燥注射器
を用いて心臓から5mtずつの血液を採取した。採取し
た血液は20%クエン酸溶液0.28mtを含む目盛つ
き遠心分離管にすみやかに加え、4000回転で15分
間遠心分離し、清浄な血漿を分離した。一方、前もつて
淵過して安定化しておいたリポストレート(LipOs
tratO(EdiOl−CalbiOc一Hem))
の0.1870脂質エマルジヨン1mtを含む試験管を
各試刺に対して用意しておいた。
この試験管内に試相の血漿2mtを1分間かけて加え、
30秒後に試刺液の600nmにおける光学的濃度を分
光光学的に測定し(そのときの光学的濃度(通常は約0
.700A)を100と定める)、ついで15分後の光
学的濃度を測定した。リポプロテイン分解酵素活性は光
学的濃度の減少値(Δ%)によつて評価した。本発明の
誘導体10mf/!体重を投与したばあい、該活性は投
与の5分後に最大値の−2770に達した。
30秒後に試刺液の600nmにおける光学的濃度を分
光光学的に測定し(そのときの光学的濃度(通常は約0
.700A)を100と定める)、ついで15分後の光
学的濃度を測定した。リポプロテイン分解酵素活性は光
学的濃度の減少値(Δ%)によつて評価した。本発明の
誘導体10mf/!体重を投与したばあい、該活性は投
与の5分後に最大値の−2770に達した。
一方クツシングの方法でえられる誘導体の10ワ/!体
重を投与した場合該活性は投与の10分後に最大値の−
50%に達した。いずれの場合でも投与の40分後には
その活性はみられなくなつた。2)投与量と活性の関係 つぎにGGMの投与量に対する活性の関係を調べた。
重を投与した場合該活性は投与の10分後に最大値の−
50%に達した。いずれの場合でも投与の40分後には
その活性はみられなくなつた。2)投与量と活性の関係 つぎにGGMの投与量に対する活性の関係を調べた。
実験はラツトに静脈内投与する前記(1)の方法に準拠
して行ない、GGMの投与量を1匹のラツトあたう0.
2mf,0.371!Fl,O.6ワ、0.8巧、1即
、2巧、3巧、5哩と段階的に換えてラツトに投与した
。投与ののち5分後にラツトを殺生し、前記1)と同じ
方法でその活性値(Δ%)を測定した。投与量と活性値
(Δ%)をプロツトしてえられる曲線から求めたGGM
のED5O値は1疋のラツトあた)2.37!1fi、
すなわち11.5mf/!体重であつた。また最小有効
投与量は1匹のラツトあたBO.75Tl9、すなわち
3.75巧/Kf体重であつた。これらの試験結果のみ
からは本発明の誘導体の治療学的指数は550〜170
0であう、クッシングの方法でえられる誘導体の治療学
的指数700〜2300よシもすぐれていないといえる
。
して行ない、GGMの投与量を1匹のラツトあたう0.
2mf,0.371!Fl,O.6ワ、0.8巧、1即
、2巧、3巧、5哩と段階的に換えてラツトに投与した
。投与ののち5分後にラツトを殺生し、前記1)と同じ
方法でその活性値(Δ%)を測定した。投与量と活性値
(Δ%)をプロツトしてえられる曲線から求めたGGM
のED5O値は1疋のラツトあた)2.37!1fi、
すなわち11.5mf/!体重であつた。また最小有効
投与量は1匹のラツトあたBO.75Tl9、すなわち
3.75巧/Kf体重であつた。これらの試験結果のみ
からは本発明の誘導体の治療学的指数は550〜170
0であう、クッシングの方法でえられる誘導体の治療学
的指数700〜2300よシもすぐれていないといえる
。
また、抗脂肪血症活性についてGGMとクツシングの方
法でえられる誘導体を比較した場合、GGMの活性はク
ツシングの方法でえられる誘導体の活性の半分でしかな
い。
法でえられる誘導体を比較した場合、GGMの活性はク
ツシングの方法でえられる誘導体の活性の半分でしかな
い。
すなわちクツシングの方法でえられる誘導体の有効投与
量は0.5〜51!9/に9体重であり、最適な投与量
は1〜371!f/KP体重(1人のヒトに対しては約
70〜2101)である。抗脂肪血症活性を発現せしめ
るに必要なGGMの非経口投与の場合の最適投与量は2
〜10巧/K9体重、すなわちヒト1人あたb約140
〜700〜で)る。これらの結論はトリトZによつて誘
発せしめた脂肪血症に対する前述の試験結果から導き出
した。しかしながら抗凝血活性を比較した場合、クツシ
ングの方法によつてえられる誘導体の抗凝血活性は10
USP単位/Mfであり、これに対しGGMの抗凝血活
性はわずかに0.05{JSP単位/ワである。これら
の活性値をヒト1人あた)の有効投与量に対して換算し
た場合、クツシングの方法でえられる誘導体は約700
〜2100USP単位である。そのため本発明の誘導体
の長所は凝血性の低下の危険が非常に少なく、とくに長
期間にわたつて脂肪血症の治療に用いられた場合の該危
険が低減されるということにある。さらにGGMは経口
投与によつても血中トリグリセラード濃度およびコレス
テリン濃度を低下せしめることが可能であるため、経口
投与による脂肪血症の治療が可能になるという長所を有
する。
量は0.5〜51!9/に9体重であり、最適な投与量
は1〜371!f/KP体重(1人のヒトに対しては約
70〜2101)である。抗脂肪血症活性を発現せしめ
るに必要なGGMの非経口投与の場合の最適投与量は2
〜10巧/K9体重、すなわちヒト1人あたb約140
〜700〜で)る。これらの結論はトリトZによつて誘
発せしめた脂肪血症に対する前述の試験結果から導き出
した。しかしながら抗凝血活性を比較した場合、クツシ
ングの方法によつてえられる誘導体の抗凝血活性は10
USP単位/Mfであり、これに対しGGMの抗凝血活
性はわずかに0.05{JSP単位/ワである。これら
の活性値をヒト1人あた)の有効投与量に対して換算し
た場合、クツシングの方法でえられる誘導体は約700
〜2100USP単位である。そのため本発明の誘導体
の長所は凝血性の低下の危険が非常に少なく、とくに長
期間にわたつて脂肪血症の治療に用いられた場合の該危
険が低減されるということにある。さらにGGMは経口
投与によつても血中トリグリセラード濃度およびコレス
テリン濃度を低下せしめることが可能であるため、経口
投与による脂肪血症の治療が可能になるという長所を有
する。
つぎに臨床実験のデータをあげ、本発明の誘導体の治療
学的な効果をさらに詳しく説明する。
学的な効果をさらに詳しく説明する。
ボランテイアとなつた健康体を有するヒトを以下4つの
グループに分け、それぞれ絶食させたのち、以下に述べ
る量のGGMを蒸留したアピロゲン水(ApirOge
nH2O)6mtに溶カルて靜脈内に投与した。(グル
ープ 1) 25〜55才のヒト6名(男性3名、女性3名)投与量
:90mf(1.3〜1.6ワ/K′体重)(グループ
)35〜50才の男性6名 投与量:100mf(1.3〜1.51/り体重)(グ
ル=プ I[)1回目の投与後、3週間を経過したグル
ープと同じ男性6名投与量:3007!9(3.9〜4
.5巧/!体重)(グループ )50〜60才のヒト6
名(男性4名、女性2名)投与量:150119(1.
9〜2.877?/!体重)GGMを投与する直前に採
血し、そのときの時間を0とした。
グループに分け、それぞれ絶食させたのち、以下に述べ
る量のGGMを蒸留したアピロゲン水(ApirOge
nH2O)6mtに溶カルて靜脈内に投与した。(グル
ープ 1) 25〜55才のヒト6名(男性3名、女性3名)投与量
:90mf(1.3〜1.6ワ/K′体重)(グループ
)35〜50才の男性6名 投与量:100mf(1.3〜1.51/り体重)(グ
ル=プ I[)1回目の投与後、3週間を経過したグル
ープと同じ男性6名投与量:3007!9(3.9〜4
.5巧/!体重)(グループ )50〜60才のヒト6
名(男性4名、女性2名)投与量:150119(1.
9〜2.877?/!体重)GGMを投与する直前に採
血し、そのときの時間を0とした。
そののち5分後、10分後、30分後および60分後に
採血した。採血した血液をクエン酸溶液とともに遠心分
離(3000rpm.15分間)してえられる血漿 5
(PartIyOnlntOt♂b!00d)について
試験を行なつた。
採血した。採血した血液をクエン酸溶液とともに遠心分
離(3000rpm.15分間)してえられる血漿 5
(PartIyOnlntOt♂b!00d)について
試験を行なつた。
脂肪分解酵素活性(光学的濃度)は前述のエジオル試験
による方法で測定し、血漿中のフリーグリセリン濃度(
MmOl/t)、非エステル化脂肪酸5(NEFA)濃
度(ミリ当量/t)および凝血時間(PTT,単位:秒
)は通常の臨床検査方法によつて測定した。
による方法で測定し、血漿中のフリーグリセリン濃度(
MmOl/t)、非エステル化脂肪酸5(NEFA)濃
度(ミリ当量/t)および凝血時間(PTT,単位:秒
)は通常の臨床検査方法によつて測定した。
第4表にグループlのヒトからえられた結果の平均値を
示す。
示す。
第4表からつぎのことがわかる。
(1)脂肪分解酵素活性の最良値はGGM投与から5分
後にすでにみられ、そのときめ600nmにおけるエジ
オルの混濁度は33.6%減少している(Δ弊=−33
.670)。
後にすでにみられ、そのときめ600nmにおけるエジ
オルの混濁度は33.6%減少している(Δ弊=−33
.670)。
(2)フリーグリセリン濃度はGGM投与から5分後に
200%以上の増加がみられ、60分後には再び低くな
るが、それでも初期(0分)にくらべれば高い。
200%以上の増加がみられ、60分後には再び低くな
るが、それでも初期(0分)にくらべれば高い。
(3) NEFA濃度はGGM投与から5分後に約10
070の増加がみられる。
070の増加がみられる。
第5表にグループのヒトからえられた結果の平均値を示
す。
す。
第5表からつぎのことがわかる。
(1) GGM投与から5分後に、脂肪分解酵素活性の
最良値(Δ?=−24%)、フリーグリセリンの最高濃
度(約150%増加)およびNEFAの最高濃度(約1
20%増加)がみられる。
最良値(Δ?=−24%)、フリーグリセリンの最高濃
度(約150%増加)およびNEFAの最高濃度(約1
20%増加)がみられる。
(2)凝血時間はいずれの採血時間においてもほとんど
一定であつた。第6表にグループのヒトからえられた結
果の平均値を示す。
一定であつた。第6表にグループのヒトからえられた結
果の平均値を示す。
第6表からつぎのことがわかる。
(1)ヒトひとクあたクにGGM3OOl!fを投与し
た場合、投与から10分後に脂肪分解酵素活性の最良値
(Δ?=−49%)、フリーグリセリンの最高濃度(約
300%増加)およびNEFAの最高濃度(約4507
0増加)がみられる。
た場合、投与から10分後に脂肪分解酵素活性の最良値
(Δ?=−49%)、フリーグリセリンの最高濃度(約
300%増加)およびNEFAの最高濃度(約4507
0増加)がみられる。
また60分後に訃いてもGGMが有効に作用しているこ
とを表わす数値を示している。第7表にグループのヒト
かられた結果の平均値を示す。
とを表わす数値を示している。第7表にグループのヒト
かられた結果の平均値を示す。
第7表から、GGMはグループのヒトにもグループ1,
およびのヒトに対する効果と同じ効果があることがわか
る。
およびのヒトに対する効果と同じ効果があることがわか
る。
さらにグループ,およびのヒトに対して、りヒト・グラ
ム(1ipid0gram:β−リボプロテイン、プレ
一β−リポプロテインおよびキロミクイン)を比濁法に
よつて測定し、測定値はTllf/血清100mtで表
わした。
ム(1ipid0gram:β−リボプロテイン、プレ
一β−リポプロテインおよびキロミクイン)を比濁法に
よつて測定し、測定値はTllf/血清100mtで表
わした。
それらの結果をつぎに述べる。(グループ1)
GGM投与直前のβ−リポプロテインの値は425〜4
50であつたが、投与から10分後には250未満に減
少し、60分後には250〜300となつた。
50であつたが、投与から10分後には250未満に減
少し、60分後には250〜300となつた。
これに対しプレ一β−リポプロテインおよびキロミクロ
ンの値はほとんど一定に保たれたままであつた(それぞ
れ270〜280訃よび11.7〜12.2)。(グル
ープ) β−リポプロテイyの値はGGM投与から10分後には
120に減少し、60分後には150〜220となつた
。
ンの値はほとんど一定に保たれたままであつた(それぞ
れ270〜280訃よび11.7〜12.2)。(グル
ープ) β−リポプロテイyの値はGGM投与から10分後には
120に減少し、60分後には150〜220となつた
。
プレ一β−リポプロテイン}よびキロミクロンの値に目
立つた変化はなかつた。(グループ)β−リポプロテイ
yの値はGGM投与の直前に190〜220であつたが
、投与から10分後には120〜130となり、60分
後もその値を維持していた。
立つた変化はなかつた。(グループ)β−リポプロテイ
yの値はGGM投与の直前に190〜220であつたが
、投与から10分後には120〜130となり、60分
後もその値を維持していた。
プレ一β−リポプロテインの値はほとんど変化しておら
ず、キロミクロンの値はわずかに減少した。
ず、キロミクロンの値はわずかに減少した。
第1図はGGM,C−30およびC−180の等電位フ
オーカリゼーシヨンの状態図、第2図はGGMおよびク
ツシングの方法でえられる誘導体の電気泳動特性パター
ン図、第3図はGGM、ヘパリン、C−30およびC−
180の電気泳動特性パターン図である。
オーカリゼーシヨンの状態図、第2図はGGMおよびク
ツシングの方法でえられる誘導体の電気泳動特性パター
ン図、第3図はGGM、ヘパリン、C−30およびC−
180の電気泳動特性パターン図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 ヘパリンのN−スルフェート基数に対し10%未満
のN−スルフェート基数を有し、2糖類単位あたり0.
6よりも高いヘミーサクシニツク単位を有する式;▲数
式、化学式、表等があります▼ (式中、n+mは8〜15である)で示されるグルコサ
ミノグルカン誘導体。 2 2糖類単位あたり1.2のヘミーサクシニツク単位
を有する特許請求の範囲第1項記載のグルコサミノグル
カン誘導体。 3 0.5USP単位/mgよりも小さい抗凝血活性を
有する特許請求の範囲第1項記載のグルコサミノグルカ
ン誘導体。 4 0.1規定以上の強酸を用い、室温よりも高い温度
でヘパリンを加水分解し、ついて7よりも高いpH条件
下で無水コハク酸と反応せしめることからなるヘパリン
のN−ススルフエート基数に対し10%未満のN−スル
フェート基数を有し2糖類単位あたり0.6よりも高い
ヘミーサクシニツク単位を有する式:▲数式、化学式、
表等があります▼ (式中、n+mは8〜15である)で示されるグルコサ
ミノグルカン誘導体の製造法。 5 前記加水分離を70〜100℃の温度で3時間より
も長い時間行なうことを特徴とする特許請求の範囲第4
項記載の製造法。 6 前記加水分解を0.5規定以上の強酸を用いて行な
うことを特徴とする特許請求の範囲第4項記載の製造法
。 7 無水コハク酸と加水分解生成物の重量比を1:1〜
1:5にしてなる特許請求の範囲第4項記載の製造法。 8 ヘパリンのN−スルフェート基数に対し10%未満
のN−スルフェート基数を有し、2糖類単位あたり0.
6よりも高いヘミーサクシニツク単位を有する式:▲数
式、化学式、表等があります▼ (式中、n+mは8〜15である)で示されるグルコサ
ミノグルカン誘導体を有効成分とする抗脂肪血症剤。 9 非経口投与に好適な形態に製剤してなる特許請求の
範囲第8項記載の抗脂肪血症剤。 10 グルコサミノグルカン誘導体の投与量が0.5〜
40mg/Kg体重となるように製剤してなる特許請求
の範囲第9項記載の抗脂肪血症剤。11 経口投与に好
適な形態に製剤してなる特許請求の範囲第8項記載の抗
脂肪血症剤。 12 グルコサミノグルカン誘導体の投与量が30〜3
00mg/Kg体重となるように製剤してなる特許請求
の範囲第11項記載の抗脂肪血症剤。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT22851A/80 | 1980-06-18 | ||
IT22851/80A IT1140999B (it) | 1980-06-18 | 1980-06-18 | Glicosaminoglicani modificati dotati di attivita' antilipemica e privi di attivita' anticoagulante |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS57102903A JPS57102903A (en) | 1982-06-26 |
JPS5952164B2 true JPS5952164B2 (ja) | 1984-12-18 |
Family
ID=11201157
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56095156A Expired JPS5952164B2 (ja) | 1980-06-18 | 1981-06-18 | グルコサミノグルカン誘導体、その製造法およびそれを有効成分とする抗脂肪血症剤 |
Country Status (21)
Country | Link |
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JP (1) | JPS5952164B2 (ja) |
AR (1) | AR227317A1 (ja) |
AU (1) | AU531118B2 (ja) |
BE (1) | BE889275A (ja) |
DE (1) | DE3123806A1 (ja) |
DK (1) | DK267681A (ja) |
ES (1) | ES503199A0 (ja) |
FI (1) | FI811832L (ja) |
FR (1) | FR2485019A1 (ja) |
GB (1) | GB2078768B (ja) |
GR (1) | GR75703B (ja) |
IE (1) | IE51273B1 (ja) |
IT (1) | IT1140999B (ja) |
LU (1) | LU83435A1 (ja) |
NL (1) | NL8102947A (ja) |
NO (1) | NO812055L (ja) |
PH (1) | PH17676A (ja) |
PT (1) | PT73214B (ja) |
SE (1) | SE8103677L (ja) |
ZA (1) | ZA814047B (ja) |
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IT1188184B (it) * | 1985-08-14 | 1988-01-07 | Texcontor Ets | Sali ammonici quaternari di polisaccaridi ad attivita' ipocolesterolemizzante |
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-
1981
- 1981-06-11 SE SE8103677A patent/SE8103677L/xx not_active Application Discontinuation
- 1981-06-12 FI FI811832A patent/FI811832L/fi not_active Application Discontinuation
- 1981-06-15 GB GB8118383A patent/GB2078768B/en not_active Expired
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- 1981-06-17 IE IE1341/81A patent/IE51273B1/en unknown
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