JPS59501497A - 不安定に遺伝されたプラスミドの安定化法 - Google Patents
不安定に遺伝されたプラスミドの安定化法Info
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- JPS59501497A JPS59501497A JP58503065A JP50306583A JPS59501497A JP S59501497 A JPS59501497 A JP S59501497A JP 58503065 A JP58503065 A JP 58503065A JP 50306583 A JP50306583 A JP 50306583A JP S59501497 A JPS59501497 A JP S59501497A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
不安定に遺伝されたプラスミドの安定化法この発明は、遺伝子及びその産生物を
製造するための組換えDNAの技術分野で有用なプラスミドの安定化法に関する
。
技術背景
大部分の天然のプラスミドがたとえ選択圧(8・Laotian pressu
re)(プラスミドを保持するこれら微生物だけが成育するのを保証するファク
ター、−例として抗生物質に対する耐性を伝達する遺伝子を有するプラスミドの
場合の栄養培地中の抗生物質がある)がなくても維持し続けるということは、プ
ラスミド維持機能が発現されて、これらの染色体外性要素(ertraohra
moaomalelement)が高効率で存続しつづけるの3保証しているこ
とを示唆している。このプラスミド維持機能は主として、細胞中のプラスミド1
度を調節する遺伝子コントロールΦサーキットを含む複製遺伝子で構成されてい
る。成長′a胞中てこの複製コントロール・システムは、プラスミドのコピー数
を監視し、プラスミド複製の確率を増減させることによって平均値からの偏差を
修正する。しかし、いずれの複製コントロール・システムも、プラスミドの著し
く少ないコピーもしくはひとつだけのコピーしかもたない細脆が生成するのを防
止できない。したがってかような細胞からプラスミドのない娘細胞が生成する可
能性があるということは明白である。この問題は勿論、低いコピー数のプラスミ
ドについて最も重大なことである。さらに細胞***時のプラスミド分子の受身分
配(pUsive diat、ribution)によって、ある程度の頻度で
プラスミドのない細胞が生成することは避けられない。細胞からのプラスミド分
子の喪失は不可逆なので、かような不安定な状態の結末は、最終的には全集団に
プラスミドがなくなるということである。
細胞***時のプラスミドの不規則分配(raz+dam distributi
on)のみならず、他のファクターが、プラスミド維持のためのセレクションな
しで培養される細胞の培養物からのプラスミドの喪失速度に影響を与えるときが
ある。例えばいくつかのプラスミドは2つの新たに複製された分子を分解するた
めに特定の組換えシステムを要する(Austin at al、、 0811
25.1981 pp、 729〜56)。
分解しなければマルチマー(multimar)が形成され(組合わされて)、
このようにして、たとえ高いコピー数のプラスミドでさえも娘細胞への分配の段
階で低コピー数のプラスミドとして出現Tることがある。というのはプラスミド
のない細胞が生成する確率は、マルチマー構造体に組合わされるプラスミド分子
の数が増すにつれて増大するからである。組換えDNA技術にしばしばみられる
もうひとつの現象は、DMAフラグメントを挿入したために安定なりローニング
ベクター(olomngマeator)が不安定なハイブリッドプラスミドに変
換する現象である。そしてこのDNAフラグメントが存在すると、プラスミドコ
ピー数の減少を起こすか又は細胞成長を消極的に妨害する有害な産物を生成する
。
かような場合はすべて、プラスミドの分R(s@gregation)と喪失が
、外部からでは容易に制御できない頻度(高頻度もしくは低頻度)で起こる。
天然プラスミド、特に低コピー数プラスミドが安定なのは、その*製コントロー
ル・システムに加つるに、第2セツトの維持機能が存在し、これが細胞***時の
プラスミド分子の規則的な分配番ζ櫃極的に関与しているということを示唆して
いる。かような機能は分配機能(partitio社邸funation)と呼
称されている。例えば、Msaaook st al、、 0ell 20.1
980. n、 529〜42 +N0rdstr′6m et al 、*
l闘社64 * 1980 + W −332〜49 i 5ee−’t al
、+Flag妃d 7.1982.卯、163〜79の研究は、これらの機能が
少なくとも一部分がプラスミド自体によって(par部位(par regio
nり中に〕暗号とされているということを示した。かくして、ある種のプラスミ
ド欠失変異株は、通常の野生型複裂挙励な行うにもかかわらずその安定な維持性
もしくは遺伝を失ない、プラスミドの安定性を保証する特定の機能が除去された
ことを示したのである(上記Nordstri;m et al、の文献多照)
。
組換えDMA技術におけるベクターとして用いられる多くのプラスミドは、野生
gHプラスミドに比べて多量のDNA E除去されているので、これらプラスミ
ドは不安定に遺伝されやTい。
このことは、プラスミドが不安定なことによって結局プラスミドが細胞から完全
になくなりかついずれの場分ちプラスミドに暗号化された遺伝子の産物の相対状
1が減少するので、重大問題を揚起する。この問題は特に、セレクション・プレ
ッシャー例えは抗生@質の雰囲気下での微生物の培養は通常実施不可能でしかも
環境面刀)らみて少なくとも好ましくないことが多く、その微生物は多改世代
にわたって培養される、大規模生産時に特に著しい。少コピーl田胞で存在する
にすきないベクターは、不安定に遺伝されそれ故刑胞から失われやすい。プラス
ミドの相対的安定性を保証する比較的高いコピー数′5:通常有するプラスミド
でも、そのプラスミドに本来間しない(not naturally re−1
ated i本来存在していない)遺伝子ご有するDIJAフラグメントがその
中に挿入されると不安定になることが知られている。
発明の開示
この発明は、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子が挿入
されて保持され、加つるに分配機能を発揮するDNAフラグメントが挿入されて
保持されているプラスミドに関する。@浦人される”という用語は、その単一も
しくは複式の遺伝子又はDMAフラグメントが、目的とするプラスミドの岨豆で
工管呈中の一段階でプラスミドに導入されたことを意味する。
これに関連して、1分配機能”という用語は、細胞***時のプラスミド分子の定
序分配(ordared uatribution)を確芙に行い、その機能を
表現するプラスミドのタイプによって、ひとつ以上の遺伝子も含有しつるプラス
ミドの部位によって暗号化されている機能を意味する。上記のようにかような部
位は天然に生成する、すなわち野生型プラスミドに見出されるが、P&r+表現
型(phsnotype)を表現Tるすなわち分配遺伝子が存在し、そしてその
プラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子が挿入されて保持されて
いるプラスミドは新規なものであると信じられる。かくして、プラスミドとはよ
生物中に本来存在する染色体外性要素と定義され、その要素はそのもの自体もし
くはその透導体として単離することができる。
この発明のプラスミドは、1人された単一もしくは複数の遺伝子によって直接も
しくは間接に伝達される工業もしくは医学用の広範囲の産物、特にポリペプチド
項、蛋白類もしくはそのフラグメント、酵素類、酵素、頂の反応による多数の非
蛋白産物、ホルモン類のごとき低分子量産物、及び穣酸頌を得ること?目的とす
る組換えDNA技術分野におけるクローニング・ベクター又は産生ベクターとし
て用いることができる。そして真核遺伝子(euk&ryotio gen・)
ことに哺乳2遺伝子が特にM要である。
この発明の好ましい態様盛こよれば、分配機能とは、野生型耐性プラスミドR1
の部位、したかって以下にRjpar部位(Rlpar region)と記載
される部位によって実際に表現される機能である。この発明によって、かような
部位が、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子を保臀する
不安定なR1ミニプラスミドのみならず、そのプラスミドには本来間しない単一
もしくは複数の遺伝子?保有するプラスミドR1以外のしばしば分11Tるプラ
スミドにも、いくらかのもしくは充分な安定性を付与することが見出されたので
ある。特に有益な分配機能のもうひとつの例は、その受容体プラスミド(reo
ipientpla@m1d)に高い安定性を付与する野生型のプラスミドIF
(Seelkeat al、上記文献)に見出されたということである。以下
において、土としてRipa1″機能(R1par ?u閲tion)について
述べられるが、R1pya能に関連する多(の現象は他のpar機能にも適用さ
れ、かつ広い範囲のこの発明の一般思想がR1par機能に限定さf’、flい
ということは理解されるべきである。
プラスミドR1の分配、幾能はいわゆるEaoRl−フラグメントによって発揮
されるということはすでに提示されf: (Nord11Itr’6m5t a
l、 、 Plaemid 4.1980. pp、 332〜49 ’j照)
。この発明に至る研究過程において情くべきことにはit+119kbの長さく
19,000のif、対)’rnするEaoRl−Aフラグメントが、その受
容体プラスミドにPar+表現型を付与する2つのしかも2つだけの異なった部
位からなることか見出されたのである。これらの部位は31;ooRl−Aフラ
グメントの両端に位!しており、冨たEaoRl−Aフラグメント中の他のDN
A配列はいずれも、プラスミドを安定化する機能をなんら有していないと現在信
じられている。このため、この二つの部位をそれぞれpar部位A (par
region A)とpar部位B (par regton B)と命名し、
それぞれpar A及びpar Bと略称した。
小さいフラグメントはプラスミドに挿入しや丁(し力)も得られたプラスミドは
宿主列胞に形質低損しやすいので、できるだけ小さいDNAフラグメントで作動
させるのが有利であることから、この発明はひとつの態様として、プラスミドλ
1のmcoR1フラグメントより短かくてRipari位を有するDIJAフラ
グメントが挿入されてこれを保持するプラスミドを提供するものである。この挿
入されたDBrAフラグメントは通常、その主な要素として!t1par部位入
部位、R1par部位B部位、又はR1par部位八とへ1par4位Bの両者
からなる。このことは、宿主プラスミドに挿入されたDNAフラグメントのすべ
てが実A的に、両方の部位のいずれか一つもしくは両者で構成されていることを
意味する。そのフラグメント上の残りのD?rAは主して適切な制限厘位(re
striction 5ite)を提供するためのものであり、受容体プラスミ
ド上の対応又は1合性制限座位と容易に適合する所望の端部を有するDNAフラ
グメントで提供する。かような端部もリンカ−によって提供できる。しかし、
par ”3位人からなるDNAフラグメント及びpar部位3カ)らなるD1
iAフラグメントは、同じプラスミドに別々lこもしくは連続的に1人できて、
そのプラスミドは、同−DH人フラグメント上にあるpar部位Aとp&r部位
Bとを・雀入することによって表現型ParA” 、ParB+を樹立したプラ
スミドと表現型;こついて同一であるということに留意することが1要である。
例えば、parB部位のごときpar部位をすでにfl持しているプラスミドを
さらに安定化したいならばそのプラスミドは適切な制限酵素で制限して、そして
この制限座位と1・1合性の端部を臀しかつ声部位のごとき他の声部位ご有する
DNAフラグメントを挿入してもよい。また逆の方法丁tわち、すでにparA
部位を有するプラスミドにparB部位を同様にして挿入する方法を採用しても
よい。
したがって臭味あるプラスミドは、R1par部位AとR1%rB部位とからな
る挿入されたDtlAフラグメントが約6 kl)を超えない長さ、侍に約4
ktlを超えない長さ、ことに3 ktl E超えない長さを有するプラスミド
である。挿入されたDNAフラグメントが11par部位Aを有するときは通常
約4 kbを超えない長さ?有し、特に約2.53=b を超えない長さ、こと
に約2 kl)を超えない長さ%qする。挿入されたMAフラグメントがR1p
ar部位Bからなるときは通常約2 kl) ;:超えない長さを有し、特に約
1.5kl)を個えない長さ、ことに約j ktlを超えない長さ’E−Wする
。上記の理由から小さいDNAフラグメントを選択しているがBlooRl−A
フラグメント全体?挿入することによってプラスミドの安定性ご得る可能性ご除
外するものではない。このことは例えば、安定化させるべきプラスミドの大きさ
が余り重要でない場合には許容することができる。フラグメント全体が挿入され
る際は、抗生物質耐相を伝達する遺伝子を持つDliAフラグメントを有するこ
とがスクリーニングするのに有利である。しかしある種の理由からEaoRl−
A フラグメントの大きさを小さくしたい際は、KcoRl−A フラグメント
を制限酵素pstlで部分的に制限するか、又はその大きなフラグメントから各
R1par部位を切除し次いで各部位を同じDNAフラグメントに逐次転、)さ
せ、久いでこOフラグフッ1ド安定化させるべきプラスミド:Cせるなどのごと
き種々の方法で行うことができる。
この発明の原理にしたがって安定化されるプラスミドは、挿入され7:R1pa
r部位によって安定化されるR1 ミニプラスミド(R14ニブラスミドはオリ
ジナルのRlMAの多くが除去され、その結果通常Rj pHu”部位を含有し
ていない)のごとき、挿入された分配部位と本来の関係(mtural r・1
ation)を持つプラスミドであってもよく、又は分配機能と本来の関係を持
たないプラスミドであってもよい。この発明に係る有用で有効な分配機能によっ
て 11p&1”部位によってR1ミニプラスミドを安定化する場合のように本
来の関係にあるプラスミドのみならず、分配機能が本来の関係にないプラスミド
についても充分な安定性を保証しつるということは興味深いことである。後者の
例は、pMBjプラスミドもしくはその透導体やpBR322プラスミドもしく
はその透導体のととき非R1プラスミドにR1par部位を挿入するものである
(これらのプラスミドは通常安定であるが、そのプラスミドと本来関係でない単
一もしくは複数の遺伝子が挿入されると不安定になりやすい)。一方の例は、そ
のプラスミドを宵する用菌を培養中の少なくとも一段階に3いて、低コピー数で
広い宿主域を有するプラスミド類(多くの異なった宿主菌株もしくは植中に複製
できるプラスミド類であり、このクラスのものは2以上のタイプの微生物に複製
しつるいわゆるシャトルベクターを含む)及びその透導体、例えばRK2のとと
さ、低コピー数例えば0.5〜5コピー/a胞を倚するある棟のプラスミドの安
定化にR1par部位を用いる場合である。
R1とは別に、安定化を要する不適合性(iwompatibilit7)グル
ープ−aFlの他のプラスミドには例えばR100とR6が含まれる。不安定な
プラスミド7fi導体の安定化にR1par部位ご用いることもこの発明の範囲
に含まれる。
この発明の安定化法が重要であるプラスミドのひとつの例は条件ランアウェイJ
i製プラスミド(aoncutioml !’un&wa7 repliaat
i−on)である。すなわち、そのプラスミドな有する宿主微生物がある条件下
で培養される際に一定の低いプラスミドコピー数を有し、またそのプラスミドを
有する宿主微生物がある異なる条件で培養される際その復製のコントロールを失
い、そのプラスミドコピー数が、宿主剥胞の成長が停止するまで指数関数的に増
大するプラスミド類である。この発明の安定化法が特に必要なランアウェイ複製
プラスミドは、約3〜5コピー/aaを超えないコピー数を有するランアウェイ
復製プラスミドであり、特にかようなプラスミドはそのプラスミドを有する微生
物がかような低コピー数を保証する条件下で培養されると、約0.5〜1コピー
/細胞を超えないコピー数を有しく0.5という数字は複製頻度が11細胞周期
以下であることを意味すると理屏される)、その宿主微生物がプラスミドコピー
数を英1的に増大Tるのを保証するある異なる条件下で培養されると少なくとも
約500〜1000コピー/m飽の範囲のコピー数な有するランアウェイ復製プ
ラスミドである。
しくは致死性の産物の遺伝情報を指定する外来迩伝子を宿!−#挿入するための
ベクターとして用いるときに望ましいことである。というのは、例えば低温でプ
ラスミド復製速度が低いことからその遺伝子はたとえ表現されるとしても少漬表
現されるだけであるので、細胞は培養の増殖過程で損傷しないままで存続するか
らである。しかし、低温で細胞を培養するがごとき増殖過程の条件下で上記のよ
うに極端に低いコピー数を有するプラスミド中にp&r部位がないと、このプラ
スミドを3〜5コピー数/’[!を超えないような低コピー数?保証Tる条件下
で培養すると3〜5コピー/i胞を超えないコピー数?有Tるプラスミドについ
て約1%/世代の頻度で微生物集団からプラスミドが失われる精巣になる。約0
.5〜1コピー/a胞を超えないコピー数を胃するプラスミド喪失の頻度は約5
%/刑胞/世ラスミドは、ランアウェイ:Jlit秀導Tるのに経済的であるよ
うな朱書培地中の密度にその1胞が到達Tる前に、その細胞から失われてし亘う
ことは明白である。このことは、量産規模の@4に到達するために何百世代もの
納置培養5:要する大量生産の場合に特に明白である。
かようなランアウェイ複製は、そのプラスミドの8コントロール遺伝子(単一も
しくは連数) (mtiマ@ repliaati血aontrol gono
(a):lの上流側(upatreaa)にJ節しうるプo モーター(rag
ulata’ole promoter)を挿入することによって条件付きにす
ることができる(この混染の詳細な記載は、@Flag社da with 0a
ndi−tional Unoontrollsd Repliaation
Behaマ1眞2の標題で本願と同じ日に出願された不d出願人の係続中の出願
にある)。ランアウェイ復製挙jh f W Tるプラスミドとしては多くの異
なるタイプのものであってもよいか、好ましいランアウェイ複製プラスミドはR
1タイプのプラスミドである。
この明NU沓において1安定性1という用語(及び関連用語)は、宿主重砲から
のプラスミドの喪失のlJ!lIF!Lが2X10−’/a胞/世代より少ない
ことを意味するよう意図されている。野生型プラスミドと同様に安定な、すなわ
ち遺伝子の突然変異率のレベルに相当する3X10 /細胞/世代より少ない喪
失頻度を有するプラスミドを得ることは、そのプラスミドに篇機能を組込むこと
によって可能なことは明白である。この後者の喪失頻度(frequemy o
f 1oss、 LP)値は、E!ooRj−^フラグメントの全体がプラスミ
ド中に挿入されたときのようにR1par部位ムとRlpar 部位Bの両方で
プラスミドが安定化される際にみとめられる。
しかし、上記のように、プラスミドR1のPar” 表現型はEe。
R1−Aフラグメントの各々別個のp&r部位に位1している。これらのp&r
部位は各々、安定化機能もしくは分配機能を欠くプラスミドと定義される不安定
なプラスミドに安定化効果を与えることが見出された。Par−表現型のかよう
なプラスミドは通常、調い頻度もしくは低い頻度で宿主細胞から失われる。刀)
<シて、例えばそのpar部位の欠失したプラスミドn1lJ体は、宿主細胞か
ら約1.5 X 10 /細Ill/世代の頻度で失われる。同げに、Par−
表現型のプラスミドル15誘導体は約I X 10−2/罰胞/世代の頻度で失
われ、いくつかのプラスミド’pMBi 0BR322)t7I導体(実施例3
.3に記載した1例のごとき)は約6X10−3/’aiIi!!/flit代
の頻度で失われることかある。逆にparAもしくはparBだけで安定化され
たR1 プラスミドは約I Q −’ / 北tiA /世代のLIF 値ご有
し、これらのpar部位のいずれ刀)を有TるDI人フラグメントが不安定なベ
クターに挿入されると100倍安定化されることfこ相当Tる。対応するp15
s4体についての数値は約8 X 10 (ParA )、 I X 10
(ParB )であり、対応スルpMB1襦4体についての数値は5 X 1O
−5(ParB”)である。parAとparBの部位の両者を有するプラスミ
ドは約10−6/細施/世代の17値すなわち104倍の安定性を有する。容易
に3照するため、異なるオリジンの安定化されたレプリコンと不安定なレプリコ
ンについて得られた結果を第1表に示した。これは各par部位が他のpar部
位と独豆して作動し、そのpar 品位は少なくともR1プラスミドとp15プ
ラスミド?安定化するのにほぼ同等に有効であり、またそれらの作動もしくは効
果は累積的であることを示している。この知見は不安定なプラスミド?安定化す
るのに必要な度合を決定するときに利用できる。余りにも著しい安定化を必要と
しない場合、すなわち安定化されるべきプラスミドが極端に不安定でないと評価
さnr= (10−2/ m胞/世代より小さいLP値を有Tる)場合は、充分
な安定性を得るため、すなわち数百世代にわたる大量生産用細菌集団からプラス
ミドが徐々に失われるのを防止するためには、pari位のひとつを有するDl
iAフラグメントを挿入Tれば充分であろう。一方プラスミドが著しく不安定な
場合は(10よりも大きいII?値とnする)、そのプラスミドの著しい安定性
を保証するためには円方のpar部位部位式1人ことが必要であるか又は少なく
とb−i利であろう。
表 1
異なるレプリコンの喪失i4[(/affid/世代)レプリコンのタイプ 会
「表現型
R11500,61,00,04
p15 100 8.0 0.01 0.01pMB1(pBR322) 60
ND” 0.5 0.11NDはデータなし
これらの測定可能なLP値は、上記定義のタイプのいずれのプラスミドが、遺伝
子産物の4Bにベクターとして使用できて、その結果そのプラスミドには本来存
在しない少なくともひとつの遺伝子を有すべきである場合に利用できる。、刀λ
くしてこの発明は別の態様として、上記特性のいずれか分有するparで安定化
されたプラスミドを有する。18 渭を培誓し次いでそのプラスミドの遺伝子産
物をその細菌培養吻刀)ら収潰する、プラスミドDNAからJ伝子産吻を生産す
る方法を提供するものである。培%目体は、問題のal菌種に最適なことか知ら
れている通常の栄誉場地を含む通常の技術を用いて適切に行われる。その安定化
法について、特定の組成の栄養培地を殖しないということは特筆に値する。また
遺伝子産物の収穫は、製造される特定の遺伝子産物の同一性(アイデンティティ
)と性質、宿生i菌の性質などに適する公知の方法にしたがって行われる。陪従
は、+11菌の少なくとも100世代にわたって続けられる。大−1生産時、細
菌を増殖するのに必要なdIa世代数は100世代?超えてもよい。このような
環境下に3いて、プラスミドのL1値は、プラスミドの漿失が2 X 10 、
/ Mm /世代より小さいように、その中のplLr部位の存在によって選
択される。このL1値はひとつのpar部位だけで通常得ることができる。しか
しいくつかの場合には、10−5/細胞/世代より小さい、特に5X1o /細
廁/世代より小さいプラスミドのLP値な得ることが好ましい。
これらの非常に小さなL?値は、いくつかの例ではひとつだけのpar部位(特
に11par部位B)の挿入によって得ることができるが、通常両方の11pa
r部位の存在が必要である。
この発明は他の態様として上記定義のタイプのプラスミドご有Tる細菌を提供す
るものである。プラスミド維持を保証するのにいずれの特定の突然変異株もしく
は菌株ご必要としないということはこの発明のプラスミド特有の利点である。か
くして、グラム陰性菌のごとくかようなプラスミドを保有しうる到菌の種と菌株
のいずれ分も用いることができる。この発明のプラスミドが複製できてそれらの
安定性を維持できるa菌の特例は大誕菌(エシェリヒア・コリ)である。
さいごにこの発明は主要素としてRjpar部位からなるDNAフラグメントを
提供するものである。これは、宿主プラスミドに挿入されたDNAフラグメント
の丁べてが実質的に両方のp&r部位のいずれかによって構成され、そのDNA
の残りの部分は受容体プラスミドの適合性制限座位への挿入用の適切な制限座位
を備えている。Rj par部位AとR1par部位Bを有Tる挿入されたDN
Aフラグメントは、この原理によって約6 kbを超えない長さであるべきで特
に約4 kklを超えずことに3 kbを超えない長さであるべきである。その
DBiAフラグメントがR1par人を含む際は、通常的4 kbを超えない長
さ分有し、特に約2.5kl+を超えない長さことに約2 kbを超えない長さ
を有Tる。そのDNAフラグメントがR1par部位Bを有する際は、通常的2
kbを超えない長さを有し、特に約1.5kl)を超えない長さことに約1
kt)を超えない長さを有する。制限酵素マツピングによってparA部位が約
1800bp (4基対)の長さの部位に狭められ、p&1″B部位が約900
bpに狭められた、小さくてそれ故に容易に挿入しうるDNAフラグメントが
それらの安定化機能を保持していたということは驚(べき知見である。Par+
表現型全現型に有する単一もしくは連数の遺伝子はさらに小さくすることが可能
である。
Par 表現型分有する:JiWでハイブリッドプラスミド(cona−tru
otion hybri plaaml)について重要な問題は、こ0)R現型
をスクリーニングアジ早(て1=fi早な万、去がないことであった。一般に進
上なハイブリッドプラスミドは、セレクション圧なしてのプラスミドの堵掻甲の
プラスミドの高い安定性ごもたらすPar” i現型によって同定Tることかで
きる。し刀)しこのタイプのスクリーニング法は冗長であり、いずれの4eもそ
の親プラスミドが不安定に遺伝されているさいをこ適切であるに過ぎない。いま
や下記に概説するような別のスクリーニング法か開発さnたのである。
a) parA+フラグメント伸大のためのスクリーニング法parA” tg
侃をともに有している2つの異なるプラスミド(別個の非A@牲グループ刀)ら
の)が同じ」嵐中に存在すると、多分それらプラスミドが細弛中の分配袋直分争
い合うからある頻度で互に排斥し会うものである。(不適合圧)。parによっ
て伝達された不適合性表現型のこのタイプのものはparハイブリッド牙スタス
クリーニングのに利用できる。例えばParA”プラスミドは1aa遺伝子とp
arA+部位ご持つ他のプラスミドを有するΔ1aaエシェリヒア・コリ菌株(
例えば08H50)に形質転換することができる。通常入ってくるプラスミドは
par”で伝達された不適合性ご常在性ParA+プラスミドに対して発揮する
。常在性プラスミドのLaa”表現型によって、かような不適合性は、もし形質
転換I11]Iilが入ってくるプラスミドにだけ認められる壽性僚識(res
istance airker)に基づいて選択されるならば容易に検出される
。一方その常在性プラスミドが存在するか合力)はマ゛ンコン牛イラクドースプ
レー) (!Ac0onksy 1actoseplates)のような指示2
J、 i (indicator 5ubstrates)にスコアされる。か
ようなプレートから新しい同、陳なプレートへ移Tレプリカ平扱法のコロニイは
、LiLQ−amの発生と示す無着色のコロニイとして、常在性プラスミドの移
転のごく低いレベルでも提示する。もうひとつの安定性試験もしくはより広範囲
の不適合性試験か潜在するparA+ハイブリッドプラスミドの性質を試験Tる
のに必要なときかめる。このようにして入って(るプラスミドと常在性プラスミ
ドとの過圧な(ii4@性の)組合わせを行うことによって、工no” (Pa
r”)フラグメントをプラスミドに一人しプラスミドが不安定か安定かTeaや
かにスクリーニングすることが可能である。
b) parB+7ラグメント伸入のためのスクリーニング法まfparB部位
をともに有Tる2つの無縁のプラスミドが互に不=0であることも示されたので
、parA+ハイブリッドの作製について述べられたのと同じスクリーニング法
がparB+ハイブリッドの作製薔こ適合する。
a) parA” 、 B+7ラグメント伸入のためのスクリーニング法Tys
5 Te挿入されたEiaoRl−Aフラグメントは上記記載によってparA
+ハイブリッドとparB+ハイブリッドの両者を移転さTポテンシャルを−f
iTるだけでなく 、parA” 、 parB+7ラグメントを有するプラス
ミドの直接選択(KmR) 8行わせる。かくしてそのフラグメントが大きいに
もかかわらず、極めて/J)数のハイブリッドでも容易に選択される。両方のp
ar+部位からなる小さい方のDliAフラグメントも勿論parA+プラスミ
ドとparB+プラスミドの両者に対して不Jla性を示す。
図面の説明
図面について以下に説明する。
第1〜5図と第7〜17図は各実1例に記載のプラスミドの制限マツプを示す。
第6因はR1からのPstl−Dフラグメントの詳細なマツプ(比例尺に合わせ
て作図されていない)を示し、及び第18図は異なるp&r部位を有する異なる
タイプのレプリコン;t par−レプリコンと比・咬した安定性曲線3示す。
、41−5図と’347−17図には各実施例に記載のプラスミドの直線状制限
マツプが示され、そのマツプに、プラスミドの表現型と遺伝子型とが親プラスミ
ドを示T水平線の上に示されている。か(してparAはプラスミドの維持を保
証するプラスミドR1の部位のうちのひとつを示し、parB はプラスミドの
維持を保証するプラスミドR1の他の部位を示す、 1avlはコリシンm1
に対する免疫性を伝達する遺伝子を示す。oriもしくはorL■はプラスミド
復製のオリジンを示す。blaはアンピシリンに対する耐性の遺伝情報を指定す
る遺伝子を示す。工RはTnS上の逆方向反復構造な示す。KmRはカナマイシ
ン耐性を示す。OmRはクロラムフェニコール耐性を示す。Aplはアンピシリ
ン耐性を示す。To はテトラサイクリン耐性な示To repAはR1複製に
必要な蛋白の合成の遺伝情報ご指定する遺伝子を示す。1aaZ、 1aaY及
び1acAは伸入されたlaaオペロンを示し、その1aeZはβ−ガラクトシ
ダーゼの遺伝情報す指定し、1aO’rはパーミアーゼのコ樗伝情@を指定し、
1aoAはトランスアセチラーゼの遺伝情報を指定する。repA−1aaZは
repA4伝子と1aQZ J伝子間の融合体(?usiOn) f示す。co
pBはrepAプロモーター(R1プラスミドの)からの転写を抑制Tるポリペ
プチドのゴ→伝情報を指定する遺伝子?示す。a opAはRepA−RNAの
翔訳を抑制するRM人分子の遺伝情報を指定Tる遺伝子を示す。CI。5.はλ
PRプロモーターの活性を制御する感熱住人リプレッサー合成の遺伝情報を指定
する遺伝子な示す。PdO2はdeoプロモーターを示す。矢印は転写の方向を
示し、三角形はDNAの1申入を意味Tる。フィルドイン部分とブランク部分は
挿入された遺伝子ご示す。点諜は欠失を示す。
水平線の下により限酵素に対Tる座位が示され、EはKooRlを意味し、Pは
Pstlを意味する。3.は第1図と第5図を除いてBamHI f 意味し、
これらの図に詔いて1″!15DNAを除いてElはBa11を意味する。H,
はHpalを意味する。R7はIItooRvを意味する。B2はBgll[’
?意味し、S工はS&lI ′?:意味する。
R3はH1瑣lを意味し0は01alを意味する。
第6図に右いて、Pstl−Dフラグメントがさらにマツピングされた。水平線
より上の数字は制限座位間の4基対の数を示す。
水平線の下に、制限酵素のための座位が示され、R工はRealを、PはPst
l e、H,はHpaJ yi:示す。
第18図に、実施例に$いて作製され試、倹され7’:Etl、p15及びpB
R322それぞれの透4体の安定性曲壕が示す。各曲線は100世代以上i疏け
た少な(とも2つの孜体場%吻について平均したものを示す。この1力)ら、p
arAとparBの両方?含むプラスミドは著しく安定に遺伝されていることか
分力)る。またparBだけを含むプラスミド及びparAだけで安定化された
ミニ−R1プラスミドの場合も同様である。
Par−プラスミドの曲線から、一定の】失速度のために、予想と2つに、プラ
スミドを保有する細胞の頻度か最初から指数函数的に減少することが分かる。後
の段階で、プラスミド保有細胞の頻度はプラスミドのないa胞の成長速度かわ丁
刀)に早くなったことから明らかにより急運に減少している(実巌で示す)。
点線はこのより早い成長速度についてJ整され長失の芙際の頻度を示す曲線を示
す。
対照的に、表現型面にPar−でめるプラスミド@は、すなわちR1プラスミド
は1.5X10 /iB記/世代の頻度で、p15プラスミドは1x10 /a
胞/世代の頻度で、いくつかのpBR622プラスミド類(実M3.3に記載の
例〕は6X10 /細IIg/世代の頻度で喪失する。事実、p15j’ar−
:A導体とpBR322Par−j!’J体の喪失頻度は、これらのベクターの
コピー数を考慮すると着くほど誦い。例えばp15のコピー数は15−207細
肥のオーダーであり、プラスミドが二項分布すると仮定するなら10−9/細B
4/世代の喪失速度が予想される。そnにもかかわらず高い喪失速度がisさ4
るのは、p15レプリコンが、多分1oxP[の分解機能(1億ト11ks r
esolution f’unation)を欠いているので、raoA依存の
コーインテグノイト(reaA dependentaoinQgrates)
@形成Tるという事実(Aust、in et &1. 、0eLl 25゜
1
1981、 pp、 729〜56)によって容易に説明される。またpBR3
22考導体はコーインテグレイトを形成Tることが知られており、そしてコピー
数か例えは大きなりローン化されたフラグメント(large clon@d
frap@d)のために4少すると、pなり不安定になる。
原料と方法
用いたエシェリヒア争コリに一12J株は03H50である(Δpr。
−1ao、 rpaL i J、 Miller : &1psrtments
話MO160ul&r Genetice、 OoldSprig Hark
+or、 New York、 1972 参照〕。いくつかのプラスミドとバ
クテリオファージを使用した(第2表)。
用いた実験技術は鑞生吻逮伝字(J、 Miuer目呻grim・nts江:J
olacular Genetiag、 Co1d s′priq Barbe
r、 Now Yark、 1972)及び遺伝子操作(Davia、 Eat
steiz> and Roth : A mxmsl for goneti
o enginae−rh< ;Aavanoed Baatsriaニーne
tics、 0olcL 8prlxhg 1iarbor、 Rent Yo
rk。
198のの各分野に用いられるa4技術である。
すべての細胞は、0.2%グルコースと1μfillのチアミンを含有するI、
Ba地(Berts社、 J、 Baat 62.1951. p、 293)
又は0.2%グルコースと1%カサミノ11!コ補充したA+Bミニマル培地(
Qlark am 141φm、 J、 Mo1. Biol、 23.196
7、 p、 99)中で培養した。
用いたプレートは]、IB ill地と1.5%の寒天を含有するLムプレート
である。
マツコンキイラクトース指示プレートは製造メーカー(DirOO)が推せんT
るとおりにしてrF−裂した。そしてX−galプレートは、20−40μyノ
ーの5−ブロモ−4−クロロ−インドリル−β−D−ガラクトシドを、0.2
%のグルコースと1μfedのチアミン蕾補充したA”Bミニマル培地に添加す
ることによって作製した。
yJ理化学的方法
透明な溶解物(1y8atfl)は01evrsll ancL He1i朋k
i、 Proc、 Natl、Aaad。
3o1.USA 62.1969. pp、 1159〜661こ記4の方法に
したがって作製された。
プラスミドDNAの小規模製造はBirnboim at al、、 Nuol
、AaidsRell、 7.1979. pp、 1513−23の方法で行
った。
ブラスミドシHAの大規模製造と分析は、St眞鴎aaa鳳玉o11m。
朧l、 B1oohe+o、 113.1981. p、 181にしたがって
dye boyanl dansit7graaient ae:ntrifu
gationを用いて行った。
DNA調製吻のポリアクリルアミドゲル′へ気泳劾法とアガロースゲル−気隊s
OJ ’6による分針は侍に′Aolin and ZJcrdstri:im
、 −thodgin Plaami、d B1010g7. Oc@佃aσn
i=、ersit71982に記載のと29にして行った。
制限エンドヌクレアーゼ類は、製造メーカー(Boehringer 。
Mannhsim or Biolabs、 New 4ahd)の戊明−1に
したがって67℃で由いた。二1及び三重のダイジェスト(digest)は、
最低の環14度を要する酵素で開始し次の前案2添加する前に模衝ン反を添加し
てa襲することζこよって行った。
エクソヌクレアーゼBIL131での処理は次のように行った。
0.1M位のBa131を50μmの線状DNAに温和し、試゛科として1分、
2分、4分、8分、16分、32分及び60分後に6Q mMコDTA 47
iこ採取しフニノーノνで抽出しエタノールで沈設とし、次いで20μ//TF
li:段倫液に傅反慈11ぎせた。20μgの半2を適切な制限b#素でダイジ
ェストし、アガロースゲル電気泳動性1こ付して欠失したDNAの欠失都の平均
サイズを測定した。一方の半t1こは過切なリン刀−を添加し、その混賃吻を過
動のT4DIIA IJガーゼとともに48侍間遠箱反応に付した。
制限されたプラスミドDNk OJ M m反応は、プラントエンドの連結反″
6を除いては裂漬メー7一の存てんするとおりGこ、過剰のT4DIJAリガー
セこATP−r:添加して行つに。
微生物学的方法
分配試’J (part、ioning +、5st) l 、 Lao ベク
ターの作製によって、葬選択的マツコン牛イ・ラクトースル−トもしくはX−g
alプレートエに単にストリークすることに風ってプラスミドのP堪r+表現型
の測定が可能になった。これらのプラスミドモスミドのない細胞は−ai表現型
を有し、誤希色コロニーとして出曳する。
分配試l9il:(Lao−プラスミドに用いるン;湛沢プレート(抗生物質を
含有するプレート)からのコロニーをもうひとつの選択プレート上にストリーク
しに。このプレートから、ひとツ0)コロニイをLAプレート上にストリークし
単果落を形成させた。このLAプレートpらの約10のコロニイを1−の0.9
%N&04中に懸濁させ、10 と10 とのそれぞれの希釈率まで希釈した。
0.1dづつの10−4希択仮と10−5希訳孜ごLA7’レート上にひろげた
。こ几らのル−トかう50 コロニィの1万性パターン(弱い;6゛ス定性か予
想される際は200コロニイ)は−■冗選択プL/−ト上で試験された。次いで
表失系並(L”J渭)が式:
%式%)
(式ぞ、νはプラスミドモスミドす、る訓j+Jの詔7zであり、ひとつのコロ
ニイが27は代、、/)、p3に成長する′と、ざ定しでいる)に法づいて計算
される。この方法に、9胃’Aの)ト元計的揺動(sta−tia:1oal
fluctuation) :;’大きいここでδ)る。
分配試−9I:Lac″プラスミドとLac−プラスミドの安定性の疋を法。ひ
とつの完全コロニイ(comp1at+3 c*lq邸)を選択プレートpら採
Rし、I K& ;、) 0 、9 ;1+ f(aCg rこ再、3濁して1
0− i=B 膿/iの、温度と丁、:1゜その10−3.;R’沢液の2XO
,1Mを2 X 10 xiのI、B層地へのj到Mに用い、3’J”Cで及劾
ぎt、了から培1された。約5 ’X 1(li” :、酊・・addの、岨&
上」二こイ3いて、ぞの堵]q加ま1[!’@トi0’ iiト1c4ji沢E
J’L fコ。10” 2if ’j<iu) D、LJ (5X103d胞
)か祈しいLB層地の10ゴに依値するのに用いられ、1058釈、&はマツコ
ンキー「ラクトースプレート上曇こひろげ1こ。
そしてこ几らのプレートf 7.Q ”(て−夜44t した。5X 10 /
1dから5×102/、?Zへの希釈は・創立・つ20計代(2F0)+と相当
する。その結果ひとつの希釈り1ら欠の、h沢までのプラスミド呆有訓胞の頻度
の麦比は、増2゛立I/)20工戊の間に起こる麦化唾こ相当する。より一段h
′グに、電1jf 4.を仄のように計算することができる。
(式中ν、とν2:ま亡、tどイ’L1i/工1文びy2註代後(υプラスミド
保有罰胞の頻度であり、LPは丑失頻度/旧胞/世代である。
そのiも欠のようになる。
この式ご用いることによって、最初に接種するa@数の揺動が原因の誤差は回避
される。この式のより面便な近似式は、LLF =l!l (ν、/ν2)/C
124,) である。
不適合性試験
抑大されたpar部位牙有Tると信じられるプラスミドは、同じpar部位?有
し、他の点では適合性のレプリコンが互いに不適合性であり選択圧がないと2つ
のうちのいずれかが喪失するに至るという観察事実を利用することによってスク
リーニングされた。この試験は、試験すべきプラスミドな他のプラスミドを保有
する細菌株に形質転換し、両プラスミドご二重選択プレート上で選択することに
よって行われる。二重選択プレート(2つの異なる抗生@質′5:有するプレー
ト)上にストリークした後、不適合性が定性的もしくは定速的に測定される。
不迩當性の定性試験のために、二重選択プレートからのコロニイをI+Aプレー
ト上にストリークし単集落(単コロニイ)ご形成させた。このプレートから得た
約10のコロニイを0.9%N&Ql溶液の0.1−に溶解し10 と10 の
それぞれに希釈した。10 希釈液と10 希釈液の0.1dづつe TJAプ
レート上にひろげた。これらのプレートから、50コロニイ(モジくは弱い不適
合性が予想される際は200コロニイ)が適切な選択プレート上で試験された。
Laa+プラスミドが検体中に含まれでいる場合、マツコンキイ・ラクトースプ
レートが選択プレート上でのレプリカプレート法の代りに用いられる。3I+F
LQ+プラスミドの場合、そのスクリーニングはか(して、サスペクトされたp
ar+プラスミドを、Laa+表現型表現型子伝達ar+ハイブリッドプラスミ
ドごすでに有する菌株に形質転換することによって行われる。プラスミド不適合
性及びその結果入ってくるプラスミドの特定のPar+表現型のプルーフは、マ
ツコンキイプレート上のLaa−コロニーをスクリーニングし常在性h?プラス
ミドが不安定化されたことを示Tことによって容易に検出される。このスクリー
ニング手順の1例が実施例4に記載されている。
不適合性の定1測定は、上記のごとく異種のプラスミド集団を樹立した後のLa
o+プラスミドの喪失頻度を測定することによって行われる。そのTJF値は1
分配試験M”に記載されたのと同様にして測定した。
遺伝子技術
細菌の形質転換は、0ohen et al、、 Proa、 Natl、Ao
acL、 S01. UBA62、1972. PI)、 2110−2114
にしたがって行われ、低い形質転換頻度が予想されるとき、コンピテント′a胞
の氷上に2けるDNAでの処理ご数時間延長し、熱ショックの後、その細胞を再
び氷上で5〜30分間冷却するという改変がなされた。この処理によって形質転
換頻度が著しく増加した。
バクテリオファージλによる感染は0.2%のマルトースを補充したLB培地中
で(λ受容体であるmalB蛋白分透導するため)振盪しながら一夜10d(D
培養物を培養することによって行った。その′a胞モ0.9%Nap/溶液で洗
浄し2dの0.01 MMyS04 中に再録濁し1時1間培養した。λ懸濁物
の希釈吻(10°、10−1.1O−2)牙作裂し、そのファージ希R液の0.
1:df用いてfi譲旧胞の;牙層液の0.2dに感染させた。この1感染混合
吻の10°、10−1及び10−2希釈液?遺沢プレート上にひろげた。
Ta2 (K♂)2有するプラスミドごトランスポーズさせるためのソースはフ
ァージλb221;:Tn5であり、その付着品位が削除されていたので、それ
は溶原化できず、そのファージの41. ta液が、トランスポジション(tr
ansposition)の望ま几るプラスミド含;に澗胞に感染させるために
用いられた。、洒染は上記のようにして行われ、カナマイシン尉性踊譲が選択さ
れた。数千のKmRコロニーが採1反され、これらの10 希釈該J)0.1ゴ
を用いて1QQm I+B X4Jiこ、妾種した。層撞−勿は一夜;イ4され
、この刻す品、昆せ、!男からプラスミドDNAが製造され、Ei、 0oli
K 12艷味asn50をカナマイシン4d性に形ftM’&するのに用いら
れた。
第 2 −&
プラスミドとファージ
pKN184 Nordgtri6m et al、、 Plasmia 4.
1980. p、 322、ps?2124 3o et zl、、 Mo1.
Gen、 Gonet、 142.1975 pp−239−49゜pGA46
An and Fr1easn、 J、 hat、 140.1979. P
p、 400−407゜第 2 衰 (涜幻
pxhsai °、1clix Qt al、、、T、x=t、138. 17
97. pTl、70−79゜pF1403−11 1ラスミドテの基本的レプ
リコンからのAlul−Naelフラグメント;pMGi403のSr!Ial
J位;こ」入しくOas&dP、ban et al、 、 、T、 Bac
t、 143.1980. p。
971)、プラスミド7のE遺伝子とp!(01403の1 & CZ i;:
i云子閂に融合セ呂させて組立てられた。
p)TP34 ?rentki et al、、Gene 17. 1982.
pp、189−96゜PMO9030aaaaban et al、、 tT
、 Baet、 143.1980. p、 971゜pKNi5.52 ?、
1ol−1n qt al、、J、Fact、138. 1979. rrp、
70−7ヲ。
pvH1424P、 Valentir+−Hansshにより、プラスミドp
VH17−:J);lのjooプロモーターを有する5au3Aフラグメン)
(va13n:in→hnaen at IQ、、 BMBO、T、。
1982、317) 8、プラスミドpM01403のBamH工厘泣:こ(O
aaaazba:x qt am、 op、 ait、、 971) 4?r入
することによって1−豆てら几た。
p3に3104 M、りasadaban iこより、lacプロモーターとp
BA i 3”+p 7からの通訳イニシェーション部位と′f:@むPvui
[フラグメント(Messiq et al、。
IhxalelCAcids Ree、 9.1981.309)を、pMO1
403のsmaIff1位に挿入し、次いでl A Q Zセグメント間の耐応
組換えご行うことによって組立てられた。
9
5N 2 表 (侵き)
bBR322Bolivar at al、、 Gem52.1977、 p、
95゜nMBlBetLach et al、、 Fed、 proC,35
,1976、り1:1.2037−43゜λb221 i:Ta2 Bsrg、
D、 L、 ”n田5rtion and 5xcisian of the
tra−MpQsa’blG bqQb resistanee deten
nimnt Ta2 ’in DNA InsertionEnements、
nasmi+is and Epismeg(ed、 A、 L Bukhar
i at R1,)。
FDλ4D@ny8@7 andWillettg、 1. Baat、 12
6.1976、1)、 166゜−I施例1
R1から得られるgo oR1−AフラグメントへのTa5(KffiR)の挿
入プラスミドpKNi84 、すなわちプラスミドp!1llF2124と、プ
ラスミドu1 (Mordgtr’cim at tx、、 Plagml J
、 1980. p、 322)からの19kb !naoR1−Aフラグメン
ト(7e、rム部位とparB部位を持つ)とで構成されたプラスミドを有する
E、 0oli K−12菌株08H50の細胞21原料と材料”の項で述べた
ようにしてバクテリオファージλb211FlTn5の”I!f!1液で1染さ
せた。200 PI/−のカナマイシン含有のLAプレート上でカナフィシン耐
性を選択した後、コロニーを採取し混合した。これらの10−2希釈液の0.1
ydを用いて100dのLB j@地に接種した。その培養物を一夜培養した。
その培養物から得られたプラスミドDNAを用いて、2COμf/−のカナマイ
シン含有のプレート上でカナマイシン耐性を選択するL QOli K−12菌
株に形質転換した。
このようにして、カナマイシンに対する耐性モ伝達し、約5kb (5000塩
M対〕に相当するファージDNAの挿入されたプラスミドpotr1が見出され
た。このプラスミドは、プラスミドDNAを作製しアガロースゲル上で分析する
ことによって測定される大きさが34 kbのひとつの分子−纏を有し、またK
mRlApR,P&rA 及びP&rBの表現型を有する。
プラスミドDNAはpollから作製され、そしてそのプラスミドは、そのプラ
スミドDNAを精製し単一もしくは復致の制[艮酵素で切断し得られたフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動性で分析することによって、制限酵素でマツピン
グされた(第1図参照)。このようにして、pKN184のEaoRl−A フ
ラグメントに挿入されたλ: : Tn5 フラグメントはに!IIRのi伝情
報を指定する遺伝子を有Tることが同定されまたそのフラグメントの位濯が41
図に示すように決定された。プラスミドpOU1は他の分析やプラスミド組立て
にもj−Jいられた。
L 0O1i 03H50/pOU1の菌株は、ドイツの(Deutsohe
SaamllxWon Mikroorgmamen、 Grlaebaoh−
stra8ge s、 >34oo Gcittingon 、以下DξMと略
称)に寄託番号(Aaeasionyjli) 2712で寄託されている。
実施例2
par+7ラグメントのクローニングに有用なプラスミドの組立て
プラスミドpJL99(Light and Mo1in、 Mo1. G@n
、 (hand、 184.1981゜pp、 56−61)は、プラスミドR
1からのrepA 遺伝子とlaoオペロンとの融合体を臀し、そのプラスミド
はLaa+表現型全現型する。 r e p A−1aC?/1合体を有するP
stJ−8ailフラグメントはpJL99から切り収られてp15レプリコン
であるpGA46に挿入され(An and F’riessn、 J、 Ba
ot、 140.1979.19p、 400−407)、プラスミドpJL1
24か組立てられる。このプラスミドのマツプ牙第2図に示す。プラスミドp、
TL124もマツコンキイラクトース指示プレート上にLaa+表現型全現型す
る。しかしpJL 124のPsti座位に、プロモーター活性とわずかにもし
くは全くもたないDNAフラグメントを11.41人すると、repA プロモ
ーターの活性をEIJ害し、これらのハイブリッドはマツコンキイのラクトース
指示プレート上にLaa+とじてもはや出現しないということが見出された。し
かしより鋭敏なX−gal 指示プレート上で、形質減少するがそのハイブリッ
ド中で全く抑制されているわけではないということを指示するLao+である。
それ故にpJ’L124は、ハイブリッドプラスミドがマツコンキイラクトース
指示プレート上でI+ao−形質転換細胞として容易に検出されるから、I’s
tiフラグメント牙クローンするのに用いることができる。さらにpJL124
は、p15レプリコンでありしたがって不安定なので(このプラスミドは、その
プラスミドの喪失した細胞がセレクション圧なしでラクトース指示プレート上に
無着色のコロニイを形成するから容易に検出される)、PJL124を安定化し
うるpat、I フラグメントはX−gal プレート上でスクリーニングでき
る。
したがってpstI−par+フラグメントを車4Tる手順は次の工程でズ成さ
れる。
リ pat、Iで制限され7.:pJL124と他のプラスミドrJ)らのPa
tlフラグメントとの連結反応
2)クロラムフェニコール含有のマツコンキイーラクトースプレート上でブレー
ティングTる08H50への形質転換3) X−gal指示プレート上のLao
”J現型の安定した遺伝の代りにマツコンキイーラクトースプレート上のLaa
−とじて出現するクロンの試験(1原料と方法2の項参照)=、aoll 0S
H50/1)、T!1124誦株はDSMニ寄託番号276oで寄託されている
。
す6厖例3
不安定なプラスミド;2 p&rA部位とparB部位とで安定化Tる方法
1、 ミニ−R1レプリコン
プラスミドPOU71 (DSM奇託番号2471 )、TjゎちプラスミドR
1の基本的レプリコン、ファージKDλ、2>らのλP8プロモーターと01.
57 レプレッザー遺伝子、Tn3トランスポゾンからのβ−ラクタマーゼの遺
伝情報を指定する遺伝子及び特異なgaoRl 鷹位(potT71 の組立て
に関する詳細な記載は、” Plaamida with Condition
alυnaontroLled Replioation Behaviour
’というS題で本:顛と同じ日に出自された不願出願人の関連出願中にある)
とυ)らなZ、プラスミドpKN1562 のランアウェイ復製3樽体2Zao
a1 で制限した。そしてpotr1刀)らの1ooR1−A:+Tn57ラグ
メント(実施例1多照)ご挿入した。次いで連給反応、i、oolli、:株0
8H50への形質転換、50μf/rllのカナマイシン含有のLAプレート上
でのカナマイシン尉性細胞の選択が行われた。
これら形質転換細胞は、50μl/−のカナマイシン含有のLAプレート上にス
トリークし42℃で培−if’Tることによって、pOU71のランアウェイa
mRE4 型についてのスクリーニングがなされた。ランアウェイ楓裂プラスミ
ド含有a胞は、これら条件下では最後にはa[を停止する。このようにしてプラ
スミドpOυ71−184が同定され、こnは25.5 kbの大きさで、Pa
rA”、ParB”、ApRlKmRの表現4fMする。
このプラスミドは実施例1に記載のようにして制限酵素でマツピングを行った(
第3図参照)。その制限マツプからEo oR1−A : : Tn5フラグメ
ントがpOU71のEooRI座位に正しく挿入されていることか分、0)る。
このプラスミドを有Tる細胞は、選択圧なしで、Tなゎち抗生@質を含むプレー
ト上で培養することなしで、LA プレート上で100世代場誓8れた。1原料
と方法”に記載の方法(分配試験II)の方法にしたがってそのa飽ご測定した
ところ、プラスミドを喪失していないことが観察された。一方、 pot771
は同様な条件下で培養された細胞から1%/世代の頻度で喪失した。P < I
、r pOTJ71−184 ハ約10−’ / MU /世代(D9失頻度で
安定に遺伝されていることが測定された。
E、 0o1108H50/potT71−184 (Dim株は、寄託4号2
763テDsMに寄託されている。
2、p15レプリコン
Par−p15レプリコンであるプラスミドpJX+124 (%:9例2)川
)?制限淋紫Pstlで1所し、Pstl −(’部分的に制限されたプラスミ
ドP11184 (実施列1姿魚ンと混合さ4を次いで運、吉反応に寸した。こ
の連−1吉反!5混合吻は、50μfedのクコラムフェニコール含iのマツコ
ン牛イラクドース看示板上でクロラムフエニコールタ・付性を選択すSコ、 C
a1.菌株0SH50に形スミ喚されに。
1以上のPet lフラグメントを泣つpJLi24を再する細胞(:¥lI2
苔照)は、X−91プレート上Laa“表現型の安定した4伝eこついて試dが
なされた。安定にコ」伝したプラスミドのひとつかparA部位とparB部位
の両吉Ti:ffすることが分力・つπ。
このプラスミドpOσ2は24 kbのサイズで、C♂、La O”、ParA
”、PhrB+の表現型を有する。
このグラスミドはA施例11こ記載のようにして制御d d 4でマツプ比さ几
た(第4121参照)。この痢限マツプからpstiフラグメントがECl0R
I−Aフラグメントつ)ら削1余されていることか分2ノ)る。
このプラスミドを有する紹砲シュ、;A大王なしで100旨代X−g+−1プレ
ート上で成胃した6poσ2ζこは、0.5〜1多/佃威/世代の頻度で細胞か
ら喪失するpJL124と対照的に10 /JIia / fA代より小さいL
P 須で安定して遺伝されていることが測定さ几た。
1B、 0oli O8■50/′pOU2 r’AQは寄託番号2713でD
SMに寄託されている。
3.1iBiレプリコン
プラスミドpF’1403−11 (第2表参照)はプラスミドアからの遺伝子
とlaaオペロンとの励合渾ご有するpBR322の不安定に遺伝された誘導体
(pMBi レプリコン)である。このプラスミドはA p s w & e
” 表現型を伝達する。プラスミドpo11からのEcoRl−A:;Tn5フ
ラグメント(実施例1)?、上記ノペ伝子−n 9EのTぐ上流【こある(ir
aediately upstream)プラスミドpF1403−11の特異
なEQORl 座位に伸入し、次いで連結反応と、5μf/!dのアンピシリン
含有のフ゛レート上でAPRe、50μfed のカナマイシン含有のプレート
上でKmRを、マツコン牛イ指示プレート上でI+aa+をそれぞn選択するE
、0e117株08H50への形質転換を行つん。
、4られたプラスミドpOUjOは実施例1に記載と1司様にして剰:rl E
?素でマツプ化しく !85 囚a照)、EooRl−A::Tn5フラグメン
トの挿入か禿認された。このプラスミドは54 kbの大ささでありKm”、A
pP′、Lao” 、ParA”、 ParB”の表現型を−NTる。
このプラスミドは笑凡例3.1に記載したのと同様にして安定な遺伝について試
験した。その結果、pOUiQ が10/細胞/は代より小さいIII!値で安
定に遺伝されており、−万IIF1403−11は6×1a lt代の頻度で細
胞刀)ら喪失していることが示された。
E、 0oli 03a5i1/poff10 G!寄託a号2714 rDs
M in寄託されている。
実Ivi列4
nJI+1247i:安定化するF!coR1−AフラグメントからノPstI
7ラグメントのクローニング
EooRl−Aフラグメントを多数の制限酵素で制限し、得られた物理的地図ご
第1図に示した。この図から分更るように、このフラグメントは多数のPstl
フラグメントで構成されている。
Par” 表現型を伝達するフラグメントの大きさを小さくするために、スクリ
ーニングベクターpJL 124中の1以上のPat)フラグメント上に多分保
有されるpar部位をサブクローンする(aU−balons)することを試み
た(実施例2#照)。正しい表現型−マツコンキイラクトースプレート上のLa
o−と選択圧なしでの安定した遺伝−で多数のクローンを分析した結果、Pat
I−Dフラグメント(第1図多照)がこの表現型を伝達していること?示した。
他のいずれの単一のP日t17ラグメントもpJL124 f安定化することは
できなかった。1.8kk+のpstlフラグメント中に位置する、pJI+1
24安定化の原因である部位をparB と名付けた。
さらにPstl−Dフラグメツ12分析するために、このフラグメントをpOU
93 に生成する、pBR322のbla i伝子牛の特異なPstl座位にク
ローンされた(茅7図参照、このプラスミドは寄託番号2724でD8Mに寄託
されている)。このプラスミドのマツピングによって、そのPstl−Dフラグ
メントが3つのRsai座位5:有することが示された(第6図参照)。Rsa
l はプラントエンドを生成し、それ故にその900 bp Real フラグ
メントが次のようにしてプラスミドpHP34のSmaI座位(Pren−tk
i ot al、、 Qene 17.1982.1Mp、 189−96)に
挿入された。po[r93がRsalで制限され、Sm&lで制限されたpi(
P34と混合され、次いで連結反応に付された。連結反応混合物は丁でにプラス
ミド、)OH94(表現型的にbaa+とParB+であるp15の誘4体、第
81A谷照、このプラスミドは寄託番号2725号でDSMに寄託されている)
?有し、50μf1mgのアンピシリン含有のプレート上でアンピシリン、対性
を選択しているに、0oli菌株に形A互換した。
異なるプラスミドに保有されているparB”部位≦こよって表現される不適合
性によって、p OH24は、表現型がparB+である他のプラスミドがE、
aoli a胞に導入されると失われる。したがってマツコンキイプレート上
にその細胞テストリークし、無看色コロニー(Laa”)−iスクリーニングす
ることによって正しい挿入と形質耘侠訓側を選択Tることか可能になる。900
bpRealフラグメントご含むことが見出されたひとつの不適合性プラスミ
ドpHP34 :A4体をpOTr13 と命名した。このプラスミドは5.3
kbのサイズで、次の表現型ToR,ApRSParE” f有する。
このプラスミドを実施例1に記載したのと同様にして制限酵素によってマツピン
グした(第9図参照)。このマツピングによってP、sal フラグメントは、
pHP34のSma l座位が2つのEeoR1座位の側にあるので900
bp EiooR1フラグメントに変換された。
E、 0O11osa50/pOU13のm&は寄託ミリ2716号でDSMに
寄託されている。
pOU13からの900 bp EaoR1フラグメントが、oat d伝子(
affiRの遺伝情報全指定する遺伝子)中に特異なEcoRl 座位?有する
、ApR,OnRランアウェイミニR1誘1体であるpOUlolのKcoRI
座位:こ(poσ101の組立ての説明は” PlasmldJwith 0
onditional trncontrouea Repiication
Behauiour ’の標領で本畑と司じ日に出願された太朝出謔人の・史辿
出、串中にある。)R3人され、8.2kbの大きさでCms、 ApR,pa
rB+の表現型?有するプラスミドpOU14 ’E!立てた。
このプラスミドと実施例1に記載したのとユ司碌にして硼j限酵諧によってマツ
プ「ヒした(第10図346)。
このプラスミドは実施p43.1に記載したのと同様にして安定な」伝について
試1夜した。その嫡果、30 ℃に2いてpotlr14はi X 10−’
/訓胞/は代より小さいLF燗を有し安定に遺伝され、−万potr 101
は1渇/叶代の頻度で:ftl Kgから失わnることか示された。
B、 Oo1土08H50/1)Oσ1’、t”f+^は寄託命号2717でD
SMに寄託さnている。
尖711iしlj 5
parB フラグメントによるミニ−R1プラスミドの安定化プラスミドpOU
90 、すなわちプラスミドR1の基本的レプリコン、ファージ■λ4からのλ
PRプロモーターとC1,5ワ リプレッサー、閣トランスポゾンからのβ−ラ
クタマーゼの遺伝情報全指定するj伝子、及びpKM 184 からの!!1c
oR1−Aフラグメントつ)らなる、pKN1562のランアウェイay 秀s
体(pOU90の+l立ての詳二FIYA説明は、@Plasm工m with
0oniiti*m1UnOOntl”01led Repiication
Behaviour ’ Q; $ 5で本願と、司じ日に出願されπ不1A
tB−人の闇連出藁中にある)にはp工kT i 84Ω1らの2ooR1−A
フラグメントが挿入されているか、このプラスミド’1saliで制限し連結反
応に付してプラスミドpOU61 を作製した。このプラスミドごマツコンキイ
プレート上でLaど表現型を選択するB、 tloli 0SH504株に形質
庶洟さぜた。
pOU61を実施例1に記載したのと同様にして1ダ1限;4素でマツピングし
た(茅11 図参照)。この制限地図からpOU61はその右端部にparB部
位を待つs、6kbのサイズのEOORl−Aフラグメントを有することが分か
る。このプラスミドは安定な遺伝について実施例3.1に記載しπのと同様)こ
して試ネタした。
その結果、 pOT161はlX1o /細胞/世代よりも小さいLIF値を有
し安定に遺伝されていることご示した。
K、 0oli 08H50/pot+617inは奇託脅号2723でDSM
に寄託されている。
実施例6
parllフラグメントによるプラスミドpF1403−11の安定化プラスミ
ドpOσ1(実施例1参照)を8dllで制限し、Sal lですでに制限され
たプラスミドplF1403−11と混合し、次いで連結反応に付し、マツコン
牛イラクドース指示プレート上アンピシリン耐性コロニーを選択TるE、 0o
li IR株08150 に形質私憤した。これらLao+クローンのい(つか
で、原料と方法の項に記載したのと同様にして、マツコンキイプレート上でIa
o”表現型が安定に遺伝されているものをスクリーニングした。
この安定に遺伝されたプラスミドを実施例1に記載しtのと同様にして制御Ji
酵素で地図化しT−(第12 図参照)。この制限地図から、このプラスミドは
parB 16aか入っているpOUlの3a11 フラグメント?有している
ことが分かる。p?1403−11とpotTl 27’らの3al lフラグ
メントで、I#I成されるこのプラスミドf pOUl2 と命名した。こnは
16kbの大きさで、ParB”、IIaO+、ApRの表現型を仔する。pO
[2は5 X 10−5/ qtfliJ /世代より小さいIiF値をnし安
定に1伝されていた。
x、 0oli G3H3O/pO(T12i1株は寄託j号2715でDSM
に寄託さnている。
実施例7
parAフラグメントによるp151ラスミドの安定化プラスミドpMO903
(Oasadaban et am、、 J、 13aot、 14.3.19
80. p。
971) ’E: EcoRlで制限し、ブラスミ〆pOU43 ($ 15
rA参照、Di9M寄託番号2720)211’xらの、parA 4位を有す
るEcoRl フラグメント企挿入し、次いで連結し、K、 0oli菌体0i
9H50に形頁転換した。得られたプラスミドはpOυ45 と命名され、13
.4ktlのサイズでParA”、Laa−、ApR,KmRの表現型を=rる
。
このプラスミドを実施例1に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した(第
14図参照)。この制限地図たら、parA部位が、その挿入によって不活化さ
れる1aa fペロン中に挿入されたことが分かる。
原料と方法の項に記載したのと同様にして安定性な菰イしたところ、このプラス
ミドか8X10 /刑Ea/世代のIIF j厘で安定に遺伝されていることが
分かつた。−万pMO903は1%/咄砲/世代のLFI直を有Tる。
w、 0o11 osaso/potr、as哨株は寄託i号2721号でDS
Mに寄託されているう
実施例8
parA部位によるミニ−R1プラスミドの安定化pOU43からのKaoR1
フラグメント牙、ミニ−R1プラスミド(7) pot782 (DSM寄託去
号2482号〕薔こ挿入した。このプラスミドはプラスミドR1の基本的レプリ
コン、ファージMDλ4からのλPRプロモーターとCIリプレッサー通遺伝、
Ta2)ランスポゾンからのβ−ラクタマーゼの遺伝情報を指定する遺伝子、p
VH1424からのdsoプロモーターと1aoZ遺伝子のアミノターミナh
4 (aminotsrmlnal end) 、及びpsKs104刀)らの
残余のlac 、tペロンと刀)らなる( potra2組立ての詳細な説明は
、” Pl&5m1ds vdth Oo吐tional Unaontrol
led R11pliO&tiOn Behaviour ’の標」で本願と同
じ日に出願された本願出願人の関連出願中にある)。プラスミドpOU82はA
pRとLao+表現型を伝達し1、KaoR1フラグメントをクローンするのに
n用である特異なz6o11座位分有する。このプラスミドは選択圧なしで1%
1世代の@度で喪失される。
2.41cbのICaoR1フラグメントが1配同に挿入されたプラスミドをp
OU47 と命名した。このプラスミドは 14kt)のサイズで、ParA”
、Lap” 、ApRの表現型を有する。
pOU47 ’E”冥1列1に記載したのと同様にして制限酵素で地図化した(
第15.鎖嘗照)。
E、0O1i QSH50/pOU47 ”、i株は寄託−f号2722号でD
AMに寄託されている。
P a r A 9位を・釘するKcoR1フラグメント云、エクソヌクレアー
ゼBa131 lこよって40Q bpまでさらに小さくしに0この削除処理は
、pOU47の特異なりamHl 座位:2:中j用し、“1坑1斗と方法”の
項に記載したのと向碌にして打った。組立てられたプラスミドはpOU472と
命名された。このプラスミドは13kl) のサイズでParA”、I+aa”
、ApRの表現型を有する。
pOU472ご実施例1に記載したのと同様にして制限酵素でマツピングした(
第16図多照)。この制限マツプ刀)らpOU472はBa131での削除によ
って生成した2、[] kl)のl:aoRl フラグメントを汀することか分
、0)る。
1ノ京會と方法”の項に記載したのと同様lこして安定性を試験しe 漬g44
、このプラスミドつ1全par入部位が2.0 ):b EcoR1フラグメン
トに含スれていることを、X味し安定に退任されていることが分かった。
E、 0oll 03H50/pOU472菌株は寄託j号2726号でDSM
に寄託されている。
実施例9
parA i4位を有するミニ−R1プラスミドの組立てプラスミドpoσ90
(実施例5参照)を、 Bawl(lで切断しモして3au3Aで部分的に切断
してIa oR1−A フラグメントの一部を切りとり、左端の6 kl+が保
持され連結反応に付された。
得られたプラスミドのpOU91 はE、 JOli−株O6′11501こ形
質転換された。pOU91 +i +i3.75 kbのサイズでPar” 、
Ap”、Laa+の表置、型を・nする。このプラスミド牙実施例1のi記載と
同様にして制限酵素で地図化された(弔17図参照)。
プラスミド安定性は、pOU9 i含有)b凰を(苅魚としてpOU82含倭U
laを用い)マツコン千イブレート上選択圧なしで30“Cで25世代培Aする
ことによって測定された。pOυ91で形質転換され7:細胞は赤いコロニーを
化成したか(Laa”) 、一方pOU82で形質転換された3I+3は赤と日
の両方のコロニーを生成し、これは選択がない期間はpOU82 がいくつかの
細胞から失われたこと牙示す。
K、 aolx asH1porsq1a株は寄託i号2483でDSMに寄託
されている。
芙」例10
parA”、parB+ミニ−11プラスミドの組立てプラスミドpOU82
(実施例8ン照)がri、aoRiで洒Aiさn1次いでparA部位を有する
、pov43からのA OOR1フラグ2ント(実施例7と第13図参照)が浦
入ざ几る。この1coR1フラグメントは、エクソヌクレアーゼEa131 に
よって左端部のsoo 、bpが切りとられ、ひとつの F;aoRlを有して
いる。このプラスミドの特異的EtooR1座位に、pQff1+ D)らの1
coR1フラグメント(実施例4と第り図挙照)が挿入される。得られたプラス
ミドは、ParA”、 ParB+の表現型を伝;Jするが、次いでプラスミド
pOU94 なすでに宵しているXi、 0O1i閑株03k150に形質互換
でき、またこのpOU8ノ 透導体は、マツコアキイラクトース指示プレート上
で培ろ1すると、このプラスミドのみを有する1冗胞のコロニーが中心品に赤色
を呈し、周縁部が無色を呈すること?1味する弱いIIaa+表現型を伝達する
こと以外は、実A例4に記載したのと美質的に+oj様にスクリーニングできる
。
実施例11
parA1parB+ミニ−R1プラスミドの組立てプラスミドpOU61 (
実施例5套照)をI!f+)oRi で哨限し、parA 9位を有する、pO
σ43からの EaoRl 7ラグメントヲ14人し連線した。得られたプラス
ミドは、ParA” 、ParB“表現型ご伝達するか、丁でにプラスミドpQ
U2を仔するBi、 0oli d抹osasoに含y耘侠でさそして冥:、百
ゾ441こ記1の方a菰こ対応するしかたでスクリーニングでさる。所ミの1ラ
スミドごイTる■11aのコロニーはマツコン午イラクドースプレート上でJ着
色コロニー(Laa−)として出現Tる。
(この明;13連及び請求の範囲ご通じて、par−、Pzr−、par+又は
Par+はイ〒別に指示がない場合、 parとParの用語は分配機能の表現
を意味Tる。)
−、i 区
所■旦
補正書の写しく翻訳文)促出店
(待+iT法第184条の7第1項ン
昭8159年5月16El
特許庁長官 若杉 和夫 殿
1、国際出願番号 PCT/DK83/’000862 発明の名称 不安定に
遺伝されたプラスミドの安定化法3、特許出願人
住 所 デンマーク、ディケイ−1700コペンハーゲン ライ、ハルムトルペ
ット 2つ
名 称 エイ、ニス アルフレッド l\レンツン代表者 ニールセン、エイチ
ブイ
国 籍 デンマーク
4、代理人〒530
住 所 大阪市北区西天満5丁目1−3クォーター・ワンビル6、添付書類の目
録
(1)補止Bの写しく翻訳文) 1通
請求の範囲
1、そのプラスミドに本来間しない挿入された単一もしくは複数の遺伝子と分配
機能を表視する挿入されたDliAフラグメントとを有するプラスミド。
2、分配機能か11 par部位で発揮される請求の範囲第1項のプラスミド。
3、DNAフラグメントか、その王な要素として、 R1par f!B位ム、
RI par N位B、又はR1par部位ムとR1par部位Bの両者からな
る請求の1曲部2XJ4のプラスミド。
4゜R1par %位ムと11parg位Bとからなる挿入されたDNAフラグ
メントが約6 kbt−超えない長さ、特に14kbを超えない長さ、ことに3
kbを超えない長さを有する請求の@−′m6項のプラスミド。
5、Rj par 5位ムからなる挿入されたDJiム7ラグメントが約4 k
bを超えない長さ、特に約2.5 kbを超えない長さ、ことに約2 kbを超
えない長さを有Tる請求の範囲第3項のプラスミド。
6、R1par部位Bからなる挿入されたDlrlツムグメントが約2 kk%
特に約1.5kbt−超えない長さ、ことに約1kbを超えない長さを有Tる請
求の@囲I83項のプラスミド。
7、仇住q?A箕耐性を伝達する進伝子を追加して有する請求の範囲第1〜6項
のいずれかのプラスミド。
8、分配機能を発揮する挿入されたDNA 7ラグメントかない場合、不安定1
こ遺伝される請求の範囲第1〜7項のいずれかのプラスミド。
9、p15プラスミドもしくはその誘導体、又は高いコピー液で宿主範囲の広い
プラスミドもしくはその通導体である請求の範囲第8項のプラスミド。
10、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは複数の遺伝子からなるDN
AフラグメントをflTることから、不安定に遺伝される請求の範囲第8項のプ
ラスミド。
11、9BR322プラスミドもしくはその通導体のごと!pMB1プラスミド
もしくはその誘導体である請求の範囲410項のプラスミド。
12、そのプラスミドを有する細菌を培薄中の少なくとも一段階に2いて、低い
コピー数を有する請求の範囲第8項のプラスミ ド。
13、約0.5〜5コピー/釧胞のコピー数N−HTる請求の範囲第12項のプ
ラスミド。
14、 R1とその通導体を含む不適合性グループエmaIPlの1ラスミド、
1とその誘導体、及び低コピー数で宿主範囲の広いプラスミドとその、$14体
から選択される請求の範囲第12積もしくは第13項のプラスミド。
15、条件ランアウェイa!1プラスミドである請求の範囲第12項もしくは4
13項のプラスミド。
16、そのプラスミドを有する宿主錆生物がある棟の条件下で培養される嘩約3
〜5コピー/a胞を超えないコピー数を有し、その宿主産生物がある檀の;4!
なる条件下で培養される際少なくとも約500〜1000コピーl細胞の範囲の
コピー数を有Tる請求の範囲第15項のプラスミド。
17、ひとつの温度で約3〜5コピー/a9を超えないプラスミドコピー数を有
し、そしてより高温では少なくとも約5oo〜1000 コピーl細胞の範囲の
プラスミドコピー数を有する請求の@1第16項のプラスミド。
18、約3〜5コピー/佃膿を超えないプラスミドコピー数が約0.5〜1コピ
ーl洲胞の1@囲にある請求の範囲第16項もしくは417項のプラスミド。
19、sgBL、つるプロモーターがそのプラスミドに単一もしくはにi数の本
来の遺伝子の上流側に一浦入された請求の範囲第1.16.17又は1B4Aの
プラスミド。
20.11−tMプラスミドである請求の範vB第16〜18項のいずれかのプ
ラスミド。
21、プラスミドR1のIaoRl−Aフラグメントより埴カ(カっR1par
部位と含む、挿入されたDNAフラグメントをI=ITるプラスミド。
η、揮入されたDNAフラグメントがRi par部位A、 R1par部位B
、又はRjpari位人とRj par部位3との両者からなる請求の@曲@2
1項のプラスミド。
23、 DNAフラグメントが、その生な要素として、Rj par 14位人
、Rlpal” ali位B、又はRlpar 4位AとRi par :J4
位Bとの両者とからなる請求のat!1422項のプラスミド。
24、11par部位ムとR1par部位Bとがらする・申入されたDNAフラ
グメントが約6 kbを超えない長さ、待に約4 ktl牙超えない長さ、こと
に3 kb f−超えない長さを有Tる請求4
の@聞第23項のプラスミド。
25、 R1par部位Aからなる挿入されたDIiAフラグメントが約4 k
kl を超えない長さ、特に約2.5kt)rt超えない長さ、ことに約2 k
tl を超えない長さを仔Tる請求の@開渠23項記載のプラスミド。
26、 Rlpar 55位Bからなる挿入されたnNA 7ラグメントが約2
kb f超えない長さ、特(こ約1.5kbを超えない長さ、ことに約1 k
kl を超えない長さを有する請求の範囲第23項のプラスミド。
27、前記請求の@囲のいずれかのプラスミドを有する細菌。
28、グラム鴎性菌である請求の範囲′427項の細菌。
29、エシェリヒア・コリである請求のgA囲第28項のMB菌。
犯、請求の範囲第1〜20項又は第21〜26項のいずれかのプラスミドを有す
る細菌を啼イし、そのプラスミドの遺伝子f物をその′@繭壇−吻がら得る、プ
ラスミドDNAの遺伝子産物の″A遣方法。
31、 J!婁が、細菌の少なくとも100世代行ゎnる請求の範囲第30項の
方法。
32、プラスミドの喪失が2 X 10−’ /硼胞1世代より少ない請求の範
囲第30項の方法。
33、プラスミドの喪失が 10−’/細t、3/世代より少ない請求の範囲第
32 項の方法。
馴、プラスミドの喪失が5X10−’/(社)胞/世代より少ない請求の範囲第
33項の方法。
5、王な要素としてR1par部位からするDNAフラグメント。
36、その主な要素に、R1par部位人、R1par部位B、又はRj pa
r部位人とR1par部位Bとの両者を有する請求の範囲第35項のDNAフラ
グメント。
37、 R1par部位AとR1par部位Bとからなり、そして約6kl+を
超えない長さ、特に約4kbを超えない長さ、ことに3kbi超えない長さをも
つ請求の範囲第36項のDNAフラグメント。
38、 R1par部位人からなり、約4kbを超えない長さ、特に約2.5k
bを超えない長さ、ことに約2kbi超えない長さを有する請求の範囲第36項
のDNAフラグメント。
39、11 par部位Bからなり、約2に’b を超えない長さ、特に約1.
5kbを超えない長さ、ことに約j kbを超えない長さを有する請求の範囲第
36項のDNAフラグメント。
40、挿入されたpar部位をWTると思われるプラスミドを、同じpar部位
を有しかつ適当な培地上で認識しつる表現型を伝達する他の無関係のプラスミド
をすでに有する′a菌に形質゛転換し、その形質転換された細菌を前記培地上で
培養し、そしてpar部位の正しい挿入な表現型の喪失として同定する、プラス
ミド中のpar部位の正しい挿入をスクリーニングする方法。
41、認識しつる表現型が抗生物耐性である請求の範囲第40項の方法。
42、認識しつる表現型がI+ao+である請求の範囲第40項の方法。
43、前記他のプラスミド上のpar部位がparムである請求の範囲第40項
の方法。
44、前記他のプラスミド上のpar部位がparBである請求の範囲下40項
の方法。
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.そのプラスミドに本来間しない挿入された単一もしくは復数の遺伝子と分配 機能ご表現する挿入されたDMAフラグメントとを有するプラスミド。 2、分配機能がR1par部位で発揮される請求の範囲第1項のプラスミド。 3、DNAフラグメントか、その主な要素として、R11)&r 部位A% R 1par部位B、又はR1par部位Aと11par部位Bの両者からなる請求 の範囲第2項のプラスミド。 4.1i par部位AとR1par部位Bとからなる挿入されたDNAフラグ メントが約6 kbi超えない長さ、特に約4 kbを超えない長さ、ことに3 kl+を超えない長さを有する請求の範囲第3項のプラスミド。 5、R1par部位Aからなる挿入されたDNAフラグメントが約4 kbを超 えない長さ、特に約2.5 kl)を超えない長さ、ことに約2 kl)を超え ない長さをWT”る請求の範囲′I43項のプラスミド。 6、RI Tl&r部位Bからなる挿入されたM人フラグメントが約2k15. 特に約1.5ktlを超えない長さ、ことに約1kbを超えない長さを有する請 求の範囲第3項のプラスミド。 7、抗生gJ質耐性を伝達する遺伝子を追加して有する請求の範囲第1〜6項の いずれかのプラスミド。 8、分配機能を発揮する挿入されたDNAフラグメントがなむ1場合、不安定に 遺伝される請求のkA囲第51〜7項し1ずれかのプラスミド。 9、pi5プラスミドb I、 <はその透導体、又は高いコピー数で宿主範囲 の広いプラスミドもしくはその誘導体である請求の範囲第8項のプラスミド。 10、そのプラスミドには本来間しない単一もしくは@L数の遺伝子からなるD NAフラグメントモnすること力)ら、不安定に遺伝される請求の足囲′48項 のプラスミド。 11、 pBR322プラスミドもしくはその誘導体のごときpMB1プラスミ ドもしくはその透導体である請求の範囲第10項のプラスミド。 12、そのプラスミドを有する線菌を4A中の少なくとも一段階に2いて、低い コピーaご有する請求の範囲第8項のプラスミド。 13、約0.5〜5コピーl細飽のコピー数を有する請求の範囲第12項のプラ スミド。 14、 R1とその透導体を含む不適合性グループエnalFlのプラスミド、 ?とその透導体、及び低コピー数で宿主範囲の広いプラスミドとその誘導体から 選択される請求の範囲第12項もしくは第13項のプラスミド。 15、条件ランアウェイ復製プラスミドである請求の範囲g412項もしくは第 13項のプラスミド。 16、そのプラスミドを有する宿主微生物がある種の条件下で培養される際約3 〜5コピー/m胞を超えないコピー数を有し、その宿主微生物がある種の異なる 条件下で培養される際少なくとも約500〜1000コピーl″a胞の範囲のコ ピー数を有する請求の範囲第15項のプラスミド。 17.ひとつの温度で約3〜5コピー/細胞を超えないプラスミドコピー数′I twし、そしてより高温では少な(とも約500〜1000 コピー/a胞の範 囲のプラスミドコピー数を有する請求の範囲第16項のプラスミド。 18、約3〜5コピー/細胞を超えないプラスミドコピー数が約0.5〜1コピ ーl細胞の範囲にある請求の範囲第16項もしくは第17項のプラスミド。 19、−節しつるプロモーターかそのプラスミドに単一もしくは複数の本来の遺 伝子の上流側暑こ挿入された請求の範囲第1.16.17又は18項のプラスミ ド。 20、11−型プラスミドである請求の範囲第16〜18項のいずれかのプラス ミド。 21、プラスミドR1のEooRl−Aフラグメントより短刀)くかつRlpa r @位を含む、挿入されたDNAフラグメント企有Tるプラスミド。 22、f4人されたDNAフラグメントがR1par部位A、 R1par部位 B、又はRj par部位AとRi p&r部位Bとの両者からなる請求の範囲 ′S21項のプラスミド。 23、 DNAフラグメントが、その主な要素として、R1par 部位人、R 1)ar部位B、又はR1par部位ムとR1par部位Bとの両者とからなる 請求の範囲第22項のプラスミド。 24、11par部位ムとR1par部位Bとρ)らなる挿入されたDNAフラ グメントが約6 kl)を超えない長さ、特に約4 kt+を超えない長さ、こ とに3 kbを超えない長さを有Tる請求の範囲@23項のプラスミド。 25、 R1par部位Aからなる挿入されたDNAフラグメントが約4kbを 超えない長さ、特に約2.5 kbを超えない長さ、ことに戸21【bを超えな い長さご有する請求の範囲第23項配本のプラスミド。 26、 R1par部位3からなる挿入されたDNAフラグメントが約2kbを 超えない長さ、特に約1.5kbを超えない長さ、ことに約1kl)i超えない 長さを有する請求の範囲第23項のプラスミド。 2、特許請求の範囲のいずれかのプラスミドを有する細菌。 28、グラム陰性菌である請求の範囲第27項の細菌。 29、エシェリヒア・コリである請求の範囲第28項の細菌。 30、。−請求の範囲第1〜20項又は第21〜26項のいずれD)のプラスミ ドを有Tる細菌を培礎し、そのプラスミドの遺伝子産物?その訓禰培)吻力1ら 得る、プラスミドDNAの〕バ伝子厘物の製造方法。 31、培養が、細菌の少なくとも100世代行われる請求の範囲第30項の方法 。 32、プラスミドの喪失が2X10 /aFrFI/世代より少ない請求の範囲 第31項の方法。 33、プラスミドの喪失が 10 /Mfhra/世代より少ない請求の範囲$ 32項の方法。 34、プラスミドの喪失か5X10 /m胞/世代よつ少ない請求の範囲第33 項の方法。 35、主な要素としてRi par部位力)らなるDNAフラグメント。 56、その上7j 4 %に、R1par 部位A、Ri par耶位B1又は R1par品位人とRi par部位Bとの両番を有する請求の範囲第 35項 ゛のDNAフラグメント。 37、 R1par部位AとF11par部位Bとからなり、そして約6kbを 超えない長さ、持に約4 kbで超えない長さ、こと1こ3kk+を超えない長 さをもつ。請求の範囲第66項のDNAフラグメント。 38、R1par;J泣Aからなり、約4 kbを超えない長さ、待に約2.5 k’o tiえない長さ、ことに約2 kb牙詔えない長さ2有する。請求の 和1第36項のp :iAフラグメント。 39、 RI par J位B7J)らtフ、約2kb+i、iえない長さ、特 に約1.3kbをζBえない長さ、ことjこ約1kbを望えない長さをHする請 求の・mmS 36項のD1iAフラグメント。
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